一株耐热-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201210274173.3

申请日:

20120803

公开号:

CN102851266B

公开日:

20141203

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:

IPC分类号:

C12N9/26,C12N15/56,C12N15/63,C12N1/15,C12N1/19,C12N1/21,C12R1/19

主分类号:

C12N9/26,C12N15/56,C12N15/63,C12N1/15,C12N1/19,C12N1/21,C12R1/19

申请人:

江南大学

发明人:

吴敬,陈晟,李祝,陈坚

地址:

214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号

优先权:

CN201210274173A

专利代理机构:

北京汇信合知识产权代理有限公司

代理人:

王秀丽

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内容摘要

本发明涉及一种α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法,属于基因工程和酶工程领域。本发明涉及一种来源于芽孢杆菌属(Bacillus?sp.)细菌的α-淀粉酶编码基因,其基因序列为序列表中的SEQ?NO.2。利用该基因构建的重组微生物表达产生的重组α-淀粉酶,其氨基酸序列为序列表中的SEQ?NO.1。利用本发明获得的α-淀粉酶编码基因构建重组微生物,可实现α-淀粉酶的高效率生产,具有很好的工业应用前景。

权利要求书

1.一种耐热α-淀粉酶,其特征在其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。 2.编码权利要求1所述α-淀粉酶的核苷酸序列,其特征在于如SEQ NO.2所示。 3.含有权利要求1所述α-淀粉酶的基因工程菌。 4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法,其特征在于包括如下步骤:1).化学合成α-淀粉酶基因;2).将α-淀粉酶基因克隆到重组表达载体;3).将重组表达载体转化到宿主细胞中。 5.根据权利要求4所述构建方法,其特征在于所述的重组表达质粒载体为pUC系列,pET系列,pT7-7,或pGEX系列中的任意一种。 6.根据权利要求4或5所述的构建方法,其特征在于所述重组表达质粒载体为pET-20b。 7.根据权利要求4或5所述构建方法,其特征在于所述的宿主细胞包括:细菌,真菌。 8.根据权利要求7所述构建方法,其特征在于所述细菌是大肠杆菌。

说明书

技术领域

本发明涉及一株α-淀粉酶基因工程菌及其构建方法,属于酶工程和基因工程领域。

背景技术

淀粉酶是能够降解淀粉糖苷键的一类酶的总称。按照水解方式的不同,主要分为α-淀粉 酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。

淀粉作为原料在工业中的应用,其最主要的方式是将淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖或者寡 糖糖浆。这些糖浆随后被用作原料用于如酒精、有机酸、氨基酸等工业生产或直接作为产品 用于其他工业领域。目前工业上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法。酶法制糖工艺一般采用 两步法,第一步用α-淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精,第二步用糖化酶将糊精水解成葡 萄糖。α-淀粉酶的作用特点是在淀粉分子链中间将α-1,4糖苷键切断。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供了一种耐热α-淀粉酶,其氨基酸序列如1)、或2) 或3)所示:

1).其氨基酸序列如SEQ NO.1所示;

2).在1)所限定的氨基酸序列的基础上经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺少或添加, 且具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列;

3).与1)、或2)所限定的氨基酸序列具有90%同源性的,且具有α-淀粉酶活性的氨基 酸序列。

所述的α-淀粉酶的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

本发明所解决的另一个技术问题是提供了一株表达α-淀粉酶的基因工程菌。 本发明所解决的另一个技术问题是提供了一种α-淀粉酶基因工程菌的构建方法 包括如下步骤:

1).化学合成α-淀粉酶基因;

2).将α-淀粉酶基因克隆到重组表达载体;

3).将重组表达载体转化到宿主细胞中。

所述的重组表达质粒载体为为pUC系列,pET系列pT7-7,或pGEX中的任意一种, 其中优选重组表达质粒载体为pET-20b。

所述的宿主细胞包括:细菌,酵母及真菌,也是本发明所要保护的范围。

所述的细菌主要是大肠杆菌包括:E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coli JM109、E.coli  JM109(DE3)、E.coli DH5α中任意一种。

本发明所解决的另一个技术问题是提供一种α-淀粉酶的基因工程菌的发酵生产方法, 37℃,220rpm,摇瓶发酵48小时后,重组α-淀粉酶摇瓶发酵活力达到742U/mL。

利用本发明获得的α-淀粉酶具有良好的稳定性,在95℃下保温4h后还有70%的酶活, 编码基因构建重组微生物,可实现α-淀粉酶的高效率生产,摇瓶发酵48小时后,重组α-淀 粉酶摇瓶发酵活力达到742U/mL,具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1重组α-淀粉酶摇瓶发酵产酶曲线。

图2重组α-淀粉酶蛋白SDS-PAGE图。

1、发酵液上清;2、破壁上清;3、包涵体;M、标准蛋白分子量。

图3重组α-淀粉酶分批补料发酵产酶曲线。

图4重组α-淀粉酶温度稳定性曲线。

具体实施方式

实施例1:基因工程菌的构建

1、将合成的α-淀粉酶基因片段克隆到pUC57载体上。

2、用于构建大肠杆菌的质粒是pET-20b,带有T7启动子。将pET-20b质粒和带有目的基因 片段的pUC57分别进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切,酶切产物割胶回收后,再用T4连接酶 连接,连接产物转化E.coli JM109感受态细胞,经37℃培养8h,挑转化子在含有30μg/mL 卡那霉素的LB中振荡培养,提取质粒,酶切验证得到的重组表达质粒。

3、将重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)宿主菌,涂布含卡那霉素(30μg/mL)的LB平 板上,37℃培养8h。挑单菌落至液体LB中,37℃培养过夜,获得基因工程菌。

实施例2:含α-淀粉酶基因工程菌的摇瓶发酵

将所述的基因工程菌在LB培养基中37℃液体培养过夜,后接入TB(甘油5g/L,蛋白 胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO412.54g/L,KH2PO42.31g/L)发酵液体培养基中,摇床 培养,转速200rpm,37℃恒温发酵48小时后,离心菌体,收集上清液测定酶活力,重组α- 淀粉酶摇瓶发酵活力达到742U/mL。重组α-淀粉酶产酶曲线见图1,SDS-PAGE电泳图见图2。

实施例3:含α-淀粉酶基因工程菌的分批补料发酵

将所述的基因工程菌在工业级LB培养基中37℃培养8小时后,按10%接种量接入 NBS(New Brunswick Scientific)3L全自动发酵罐,发酵罐初始装入1.1L工业级复合培养基(甘 油8g/L,KH2PO413.5g/L,(NH4)2HPO44g/L,柠檬酸1.7g/L,MgSO40.68g/L,工业级 蛋白胨1g/L,工业级酵母粉2g/L,pH7.1),32℃恒温发酵,维持溶氧在30%左右,利用 氨水控制pH7.0左右。初始阶段培养基中甘油耗尽后,溶氧快速上升,开始指数流加补料液, 控制比生长速率μ=0.2h-1。当菌浓OD600达到15时,一次性添加终浓度为1%(质量体积分数) 甘氨酸。当菌浓OD600达到50时,恒速添流加0.1g/L/h的乳糖进行诱导,整个发酵过程由发 酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集。发酵过程中,菌浓OD600最高可达160,重组α- 淀粉酶摇瓶发酵活力达到1.1万U/mL,重组α-淀粉酶分批补料发酵产酶曲线如图3所示。

实施例4:重组α-淀粉酶在高温下的稳定性

将重组α-淀粉酶用pH6.0的糊精溶液稀释10倍,再加入终浓度为10mM的钙离子,将该体 系置于95℃恒温水浴锅中保温,定时取样测酶活力(具体实验方法参见GB8275-2009)。结果 表明该重组酶具有良好的稳定性,在95℃下保温4h后还有70%的酶活,温度稳定性曲线如 图4所示。

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1、(10)授权公告号 CN 102851266 B (45)授权公告日 2014.12.03 CN 102851266 B (21)申请号 201210274173.3 (22)申请日 2012.08.03 C12N 9/26(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 吴敬 陈晟 李祝 陈坚 。

2、(74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有 限公司 11335 代理人 王秀丽 WO 2011/049945 A2,2011.04.28, 全文 . CN 101457230 A,2009.06.17, 全文 . Lin Long-Liu et al.Glutamic acid 219 is critical for the thermostability of a truncated -amylase from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. strain TS-23. World J Microbiol Biotechnol .20。

3、07, 第 24 卷 619-626. 董晨等 . 耐高温 淀粉酶基因在枯草 芽孢杆菌中的高效表达 .应用与环境生物学 报 .2008, 第 14 卷 ( 第 4 期 ),534-538. (54) 发明名称 一株耐热 - 淀粉酶及其基因工程菌的构建 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种 - 淀粉酶及其基因工程菌 的构建方法, 属于基因工程和酶工程领域。 本发明 涉及一种来源于芽孢杆菌属 (Bacillus sp.) 细菌 的 - 淀粉酶编码基因, 其基因序列为序列表中 的 SEQ NO.2。利用该基因构建的重组微生物表达 产生的重组 - 淀粉酶, 其氨基酸序列为序列表 中的 SEQ NO.1。

4、。利用本发明获得的 - 淀粉酶编 码基因构建重组微生物, 可实现 - 淀粉酶的高 效率生产, 具有很好的工业应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李影 权利要求书 1 页 说明书 2 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 序列表5页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102851266 B CN 102851266 B 1/1 页 2 1. 一种耐热 - 淀粉酶, 其特征在其氨基酸序列如 SEQ NO.1 所示。 2. 编码权利要求 1 所述 - 淀粉酶的核苷酸序列, 其特征在于如 SEQ。

5、 NO.2 所示。 3. 含有权利要求 1 所述 - 淀粉酶的基因工程菌。 4. 权利要求 3 所述基因工程菌的构建方法, 其特征在于包括如下步骤 : 1). 化学合成 - 淀粉酶基因 ; 2). 将 - 淀粉酶基因克隆到重组表达载体 ; 3). 将重组表达载体转化到宿主细胞中。 5. 根据权利要求 4 所述构建方法, 其特征在于所述的重组表达质粒载体为 pUC 系列, pET 系列, pT7-7, 或 pGEX 系列中的任意一种。 6. 根据权利要求 4 或 5 所述的构建方法, 其特征在于所述重组表达质粒载体为 pET-20b。 7. 根据权利要求 4 或 5 所述构建方法, 其特征在于所。

6、述的宿主细胞包括 : 细菌, 真菌。 8. 根据权利要求 7 所述构建方法, 其特征在于所述细菌是大肠杆菌。 权 利 要 求 书 CN 102851266 B 2 1/2 页 3 一株耐热 - 淀粉酶及其基因工程菌的构建方法 技术领域 0001 本发明涉及一株 - 淀粉酶基因工程菌及其构建方法, 属于酶工程和基因工程领 域。 背景技术 0002 淀粉酶是能够降解淀粉糖苷键的一类酶的总称。按照水解方式的不同, 主要分为 - 淀粉酶、 - 淀粉酶、 糖化酶、 异淀粉酶和普鲁兰酶。 0003 淀粉作为原料在工业中的应用, 其最主要的方式是将淀粉水解成葡萄糖、 麦芽糖 或者寡糖糖浆。 这些糖浆随后被用。

7、作原料用于如酒精、 有机酸、 氨基酸等工业生产或直接作 为产品用于其他工业领域。目前工业上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法。酶法制糖工艺 一般采用两步法, 第一步用 - 淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精, 第二步用糖化酶将 糊精水解成葡萄糖。- 淀粉酶的作用特点是在淀粉分子链中间将 -1,4 糖苷键切断。 发明内容 0004 本发明所要解决的一个技术问题是提供了一种耐热 - 淀粉酶, 其氨基酸序列如 1)、 或 2) 或 3) 所示 : 0005 1). 其氨基酸序列如 SEQ NO.1 所示 ; 0006 2). 在 1) 所限定的氨基酸序列的基础上经过一个或几个氨基酸残基的取代、 缺少 或添。

8、加, 且具有 - 淀粉酶活性的氨基酸序列 ; 0007 3). 与 1)、 或 2) 所限定的氨基酸序列具有 90% 同源性的, 且具有 - 淀粉酶活性 的氨基酸序列。 0008 所述的 - 淀粉酶的核苷酸序列如 SEQ NO.2 所示。 0009 本发明所解决的另一个技术问题是提供了一株表达 - 淀粉酶的基因工程菌。本 发明所解决的另一个技术问题是提供了一种 - 淀粉酶基因工程菌的构建方法包括如下 步骤 : 0010 1). 化学合成 - 淀粉酶基因 ; 0011 2). 将 - 淀粉酶基因克隆到重组表达载体 ; 0012 3). 将重组表达载体转化到宿主细胞中。 0013 所述的重组表达质。

9、粒载体为为 pUC 系列, pET 系列 pT7-7, 或 pGEX 中的任意一种, 其中优选重组表达质粒载体为 pET-20b。 0014 所述的宿主细胞包括 : 细菌, 酵母及真菌, 也是本发明所要保护的范围。 0015 所述的细菌主要是大肠杆菌包括 : E.coli BL21(DE3)、 E.coli W3110、 E.coli JM109、 E.coli JM109(DE3)、 E.coli DH5 中任意一种。 0016 本发明所解决的另一个技术问题是提供一种 - 淀粉酶的基因工程菌的发酵生 产方法, 37, 220rpm, 摇瓶发酵 48 小时后, 重组 - 淀粉酶摇瓶发酵活力达到。

10、 742U/mL。 0017 利用本发明获得的-淀粉酶具有良好的稳定性, 在95下保温4h后还有70%的 说 明 书 CN 102851266 B 3 2/2 页 4 酶活, 编码基因构建重组微生物, 可实现 - 淀粉酶的高效率生产, 摇瓶发酵 48 小时后, 重 组 - 淀粉酶摇瓶发酵活力达到 742U/mL, 具有很好的工业应用前景。 附图说明 0018 图 1 重组 - 淀粉酶摇瓶发酵产酶曲线。 0019 图 2 重组 - 淀粉酶蛋白 SDS-PAGE 图。 0020 1、 发酵液上清 ; 2、 破壁上清 ; 3、 包涵体 ; M、 标准蛋白分子量。 0021 图 3 重组 - 淀粉酶分。

11、批补料发酵产酶曲线。 0022 图 4 重组 - 淀粉酶温度稳定性曲线。 具体实施方式 0023 实施例 1 : 基因工程菌的构建 0024 1、 将合成的 - 淀粉酶基因片段克隆到 pUC57 载体上。 0025 2、 用于构建大肠杆菌的质粒是pET-20b, 带有T7启动子。 将pET-20b质粒和带有目 的基因片段的 pUC57 分别进行 Nco 和 Hind 双酶切, 酶切产物割胶回收后, 再用 T4 连接 酶连接, 连接产物转化 E.coli JM109 感受态细胞, 经 37培养 8h, 挑转化子在含有 30g/ mL 卡那霉素的 LB 中振荡培养, 提取质粒, 酶切验证得到的重组。

12、表达质粒。 0026 3、 将重组表达质粒转化 E.coli BL21(DE3) 宿主菌, 涂布含卡那霉素 (30g/mL) 的 LB 平板上, 37培养 8h。挑单菌落至液体 LB 中, 37培养过夜, 获得基因工程菌。 0027 实施例 2 : 含 - 淀粉酶基因工程菌的摇瓶发酵 0028 将所述的基因工程菌在 LB 培养基中 37液体培养过夜, 后接入 TB (甘油 5g/L, 蛋 白胨 12g/L, 酵母膏 24g/L, K2HPO412.54g/L, KH2PO42.31g/L) 发酵液体培养基中, 摇床培养, 转速 200rpm, 37恒温发酵 48 小时后, 离心菌体, 收集上清。

13、液测定酶活力, 重组 - 淀粉酶 摇瓶发酵活力达到 742U/mL。重组 - 淀粉酶产酶曲线见图 1, SDS-PAGE 电泳图见图 2。 0029 实施例 3 : 含 - 淀粉酶基因工程菌的分批补料发酵 0030 将所述的基因工程菌在工业级 LB 培养基中 37培养 8 小时后, 按 10% 接种量接 入 NBS(New Brunswick Scientifi c)3L 全自动发酵罐, 发酵罐初始装入 1.1L 工业级复合培 养基 ( 甘油 8g/L, KH2PO413.5g/L,(NH4) 2HPO44g/L, 柠檬酸 1.7g/L, MgSO40.68g/L, 工业级蛋 白胨1g/L, 。

14、工业级酵母粉2g/L, pH7.1), 32恒温发酵, 维持溶氧在30%左右, 利用氨水控制 pH7.0左右。 初始阶段培养基中甘油耗尽后, 溶氧快速上升, 开始指数流加补料液, 控制比生 长速率 =0.2h-1。当菌浓 OD600达到 15 时, 一次性添加终浓度为 1%( 质量体积分数 ) 甘氨 酸。 当菌浓OD600达到50时, 恒速添流加0.1g/L/h的乳糖进行诱导, 整个发酵过程由发酵罐 控制系统软件进行在线控制和数据采集。发酵过程中, 菌浓 OD600最高可达 160, 重组 - 淀 粉酶摇瓶发酵活力达到 1.1 万 U/mL, 重组 - 淀粉酶分批补料发酵产酶曲线如图 3 所示。

15、。 0031 实施例 4 : 重组 - 淀粉酶在高温下的稳定性 0032 将重组 - 淀粉酶用 pH6.0 的糊精溶液稀释 10 倍, 再加入终浓度为 10mM 的 钙离子, 将该体系置于 95恒温水浴锅中保温, 定时取样测酶活力 ( 具体实验方法参见 GB8275-2009)。结果表明该重组酶具有良好的稳定性, 在 95下保温 4h 后还有 70% 的酶 活, 温度稳定性曲线如图 4 所示。 说 明 书 CN 102851266 B 4 1/5 页 5 0001 0002 序 列 表 CN 102851266 B 5 2/5 页 6 0003 序 列 表 CN 102851266 B 6 3/5 页 7 0004 序 列 表 CN 102851266 B 7 4/5 页 8 0005 序 列 表 CN 102851266 B 8 5/5 页 9 序 列 表 CN 102851266 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102851266 B 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102851266 B 11 。

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