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1、(10)授权公告号 CN 102851266 B (45)授权公告日 2014.12.03 CN 102851266 B (21)申请号 201210274173.3 (22)申请日 2012.08.03 C12N 9/26(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 吴敬 陈晟 李祝 陈坚 。
2、(74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有 限公司 11335 代理人 王秀丽 WO 2011/049945 A2,2011.04.28, 全文 . CN 101457230 A,2009.06.17, 全文 . Lin Long-Liu et al.Glutamic acid 219 is critical for the thermostability of a truncated -amylase from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. strain TS-23. World J Microbiol Biotechnol .20。
3、07, 第 24 卷 619-626. 董晨等 . 耐高温 淀粉酶基因在枯草 芽孢杆菌中的高效表达 .应用与环境生物学 报 .2008, 第 14 卷 ( 第 4 期 ),534-538. (54) 发明名称 一株耐热 - 淀粉酶及其基因工程菌的构建 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种 - 淀粉酶及其基因工程菌 的构建方法, 属于基因工程和酶工程领域。 本发明 涉及一种来源于芽孢杆菌属 (Bacillus sp.) 细菌 的 - 淀粉酶编码基因, 其基因序列为序列表中 的 SEQ NO.2。利用该基因构建的重组微生物表达 产生的重组 - 淀粉酶, 其氨基酸序列为序列表 中的 SEQ NO.1。
4、。利用本发明获得的 - 淀粉酶编 码基因构建重组微生物, 可实现 - 淀粉酶的高 效率生产, 具有很好的工业应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李影 权利要求书 1 页 说明书 2 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 序列表5页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102851266 B CN 102851266 B 1/1 页 2 1. 一种耐热 - 淀粉酶, 其特征在其氨基酸序列如 SEQ NO.1 所示。 2. 编码权利要求 1 所述 - 淀粉酶的核苷酸序列, 其特征在于如 SEQ。
5、 NO.2 所示。 3. 含有权利要求 1 所述 - 淀粉酶的基因工程菌。 4. 权利要求 3 所述基因工程菌的构建方法, 其特征在于包括如下步骤 : 1). 化学合成 - 淀粉酶基因 ; 2). 将 - 淀粉酶基因克隆到重组表达载体 ; 3). 将重组表达载体转化到宿主细胞中。 5. 根据权利要求 4 所述构建方法, 其特征在于所述的重组表达质粒载体为 pUC 系列, pET 系列, pT7-7, 或 pGEX 系列中的任意一种。 6. 根据权利要求 4 或 5 所述的构建方法, 其特征在于所述重组表达质粒载体为 pET-20b。 7. 根据权利要求 4 或 5 所述构建方法, 其特征在于所。
6、述的宿主细胞包括 : 细菌, 真菌。 8. 根据权利要求 7 所述构建方法, 其特征在于所述细菌是大肠杆菌。 权 利 要 求 书 CN 102851266 B 2 1/2 页 3 一株耐热 - 淀粉酶及其基因工程菌的构建方法 技术领域 0001 本发明涉及一株 - 淀粉酶基因工程菌及其构建方法, 属于酶工程和基因工程领 域。 背景技术 0002 淀粉酶是能够降解淀粉糖苷键的一类酶的总称。按照水解方式的不同, 主要分为 - 淀粉酶、 - 淀粉酶、 糖化酶、 异淀粉酶和普鲁兰酶。 0003 淀粉作为原料在工业中的应用, 其最主要的方式是将淀粉水解成葡萄糖、 麦芽糖 或者寡糖糖浆。 这些糖浆随后被用。
7、作原料用于如酒精、 有机酸、 氨基酸等工业生产或直接作 为产品用于其他工业领域。目前工业上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法。酶法制糖工艺 一般采用两步法, 第一步用 - 淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精, 第二步用糖化酶将 糊精水解成葡萄糖。- 淀粉酶的作用特点是在淀粉分子链中间将 -1,4 糖苷键切断。 发明内容 0004 本发明所要解决的一个技术问题是提供了一种耐热 - 淀粉酶, 其氨基酸序列如 1)、 或 2) 或 3) 所示 : 0005 1). 其氨基酸序列如 SEQ NO.1 所示 ; 0006 2). 在 1) 所限定的氨基酸序列的基础上经过一个或几个氨基酸残基的取代、 缺少 或添。
8、加, 且具有 - 淀粉酶活性的氨基酸序列 ; 0007 3). 与 1)、 或 2) 所限定的氨基酸序列具有 90% 同源性的, 且具有 - 淀粉酶活性 的氨基酸序列。 0008 所述的 - 淀粉酶的核苷酸序列如 SEQ NO.2 所示。 0009 本发明所解决的另一个技术问题是提供了一株表达 - 淀粉酶的基因工程菌。本 发明所解决的另一个技术问题是提供了一种 - 淀粉酶基因工程菌的构建方法包括如下 步骤 : 0010 1). 化学合成 - 淀粉酶基因 ; 0011 2). 将 - 淀粉酶基因克隆到重组表达载体 ; 0012 3). 将重组表达载体转化到宿主细胞中。 0013 所述的重组表达质。
9、粒载体为为 pUC 系列, pET 系列 pT7-7, 或 pGEX 中的任意一种, 其中优选重组表达质粒载体为 pET-20b。 0014 所述的宿主细胞包括 : 细菌, 酵母及真菌, 也是本发明所要保护的范围。 0015 所述的细菌主要是大肠杆菌包括 : E.coli BL21(DE3)、 E.coli W3110、 E.coli JM109、 E.coli JM109(DE3)、 E.coli DH5 中任意一种。 0016 本发明所解决的另一个技术问题是提供一种 - 淀粉酶的基因工程菌的发酵生 产方法, 37, 220rpm, 摇瓶发酵 48 小时后, 重组 - 淀粉酶摇瓶发酵活力达到。
10、 742U/mL。 0017 利用本发明获得的-淀粉酶具有良好的稳定性, 在95下保温4h后还有70%的 说 明 书 CN 102851266 B 3 2/2 页 4 酶活, 编码基因构建重组微生物, 可实现 - 淀粉酶的高效率生产, 摇瓶发酵 48 小时后, 重 组 - 淀粉酶摇瓶发酵活力达到 742U/mL, 具有很好的工业应用前景。 附图说明 0018 图 1 重组 - 淀粉酶摇瓶发酵产酶曲线。 0019 图 2 重组 - 淀粉酶蛋白 SDS-PAGE 图。 0020 1、 发酵液上清 ; 2、 破壁上清 ; 3、 包涵体 ; M、 标准蛋白分子量。 0021 图 3 重组 - 淀粉酶分。
11、批补料发酵产酶曲线。 0022 图 4 重组 - 淀粉酶温度稳定性曲线。 具体实施方式 0023 实施例 1 : 基因工程菌的构建 0024 1、 将合成的 - 淀粉酶基因片段克隆到 pUC57 载体上。 0025 2、 用于构建大肠杆菌的质粒是pET-20b, 带有T7启动子。 将pET-20b质粒和带有目 的基因片段的 pUC57 分别进行 Nco 和 Hind 双酶切, 酶切产物割胶回收后, 再用 T4 连接 酶连接, 连接产物转化 E.coli JM109 感受态细胞, 经 37培养 8h, 挑转化子在含有 30g/ mL 卡那霉素的 LB 中振荡培养, 提取质粒, 酶切验证得到的重组。
12、表达质粒。 0026 3、 将重组表达质粒转化 E.coli BL21(DE3) 宿主菌, 涂布含卡那霉素 (30g/mL) 的 LB 平板上, 37培养 8h。挑单菌落至液体 LB 中, 37培养过夜, 获得基因工程菌。 0027 实施例 2 : 含 - 淀粉酶基因工程菌的摇瓶发酵 0028 将所述的基因工程菌在 LB 培养基中 37液体培养过夜, 后接入 TB (甘油 5g/L, 蛋 白胨 12g/L, 酵母膏 24g/L, K2HPO412.54g/L, KH2PO42.31g/L) 发酵液体培养基中, 摇床培养, 转速 200rpm, 37恒温发酵 48 小时后, 离心菌体, 收集上清。
13、液测定酶活力, 重组 - 淀粉酶 摇瓶发酵活力达到 742U/mL。重组 - 淀粉酶产酶曲线见图 1, SDS-PAGE 电泳图见图 2。 0029 实施例 3 : 含 - 淀粉酶基因工程菌的分批补料发酵 0030 将所述的基因工程菌在工业级 LB 培养基中 37培养 8 小时后, 按 10% 接种量接 入 NBS(New Brunswick Scientifi c)3L 全自动发酵罐, 发酵罐初始装入 1.1L 工业级复合培 养基 ( 甘油 8g/L, KH2PO413.5g/L,(NH4) 2HPO44g/L, 柠檬酸 1.7g/L, MgSO40.68g/L, 工业级蛋 白胨1g/L, 。
14、工业级酵母粉2g/L, pH7.1), 32恒温发酵, 维持溶氧在30%左右, 利用氨水控制 pH7.0左右。 初始阶段培养基中甘油耗尽后, 溶氧快速上升, 开始指数流加补料液, 控制比生 长速率 =0.2h-1。当菌浓 OD600达到 15 时, 一次性添加终浓度为 1%( 质量体积分数 ) 甘氨 酸。 当菌浓OD600达到50时, 恒速添流加0.1g/L/h的乳糖进行诱导, 整个发酵过程由发酵罐 控制系统软件进行在线控制和数据采集。发酵过程中, 菌浓 OD600最高可达 160, 重组 - 淀 粉酶摇瓶发酵活力达到 1.1 万 U/mL, 重组 - 淀粉酶分批补料发酵产酶曲线如图 3 所示。
15、。 0031 实施例 4 : 重组 - 淀粉酶在高温下的稳定性 0032 将重组 - 淀粉酶用 pH6.0 的糊精溶液稀释 10 倍, 再加入终浓度为 10mM 的 钙离子, 将该体系置于 95恒温水浴锅中保温, 定时取样测酶活力 ( 具体实验方法参见 GB8275-2009)。结果表明该重组酶具有良好的稳定性, 在 95下保温 4h 后还有 70% 的酶 活, 温度稳定性曲线如图 4 所示。 说 明 书 CN 102851266 B 4 1/5 页 5 0001 0002 序 列 表 CN 102851266 B 5 2/5 页 6 0003 序 列 表 CN 102851266 B 6 3/5 页 7 0004 序 列 表 CN 102851266 B 7 4/5 页 8 0005 序 列 表 CN 102851266 B 8 5/5 页 9 序 列 表 CN 102851266 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102851266 B 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102851266 B 11 。