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1、(10)授权公告号 CN 101671345 B (45)授权公告日 2011.06.15 CN 101671345 B *CN101671345B* (21)申请号 200910114452.1 (22)申请日 2009.09.28 C07D 493/08(2006.01) C07K 14/765(2006.01) C07K 1/113(2006.01) (73)专利权人 桂林医学院 地址 541004 广西壮族自治区桂林市环城北 二路 109 号 (72)发明人 陈旭 杨新平 曾建红 王娟 黄凤香 付明磊 戴平 (74)专利代理机构 桂林市华杰专利商标事务所 有限责任公司 45112 代理。
2、人 罗玉荣 CN 1995056 A,2007.07.11, 全文 . CN 1704417 A,2005.12.07, 全文 . 李莎莎 .2009101144521.STN 检索报 告 .2010, 曾建红等 . 莪术醇的研究进展 .中药 材 .2008, 第 31 卷 ( 第 1 期 ),168-170. 袁文学等 . 莪术醇磷酸酯单钠抗肿瘤实验 研究 .沈阳药学院学报 .1984, 第 1 卷 ( 第 3 期 ),210-213. (54) 发明名称 一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种莪术醇半抗原和人工抗原 及其制备方法， 所制备的莪术醇半抗原的结。
3、构式 为 ： 人工抗原的结构式为 ： 其制备方 法为 ： 本发明以莪术醇为原料， 利用丁二酸酐与 莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯 (Cur-HS)， 得 到人工半抗原， 将莪术醇的半抗原制备成吡啶水 溶液， 然后使之与牛血清蛋白结合， 制备出莪术醇 的人工抗原。本发明合成了莪术醇的半抗原和人 工抗原， 所制备的产品可用于含莪术醇成分样品 的研究， 合成步骤简单， 所需的实验条件温和， 在 常温下就能进行， 产物容易得到， 且产率较高， 有 效， 完全可用于免疫分析中， 为以后人们的研究提 供了方便， 可以满足国内外对其研究的需要。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李莎莎 (1。
4、9)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 CN 101671345 B1/1 页 2 1. 一种莪术醇半抗原， 其特征在于 ： 它以莪术醇为原料， 应用丁二酸酐与莪术醇反应 生成莪术醇琥珀酸单酯制得， 其分子结构式为 ： 2. 一种莪术醇半抗原的制备方法， 其特征在于 ： 该方法步骤如下 ： (1) 取三氯甲烷置于反应瓶， 加入少量无水 MgSO4， 搅拌过夜， 滤去 MgSO4； (2) 取上述滤液， 加入莪术醇和丁二酸酐， 搅拌溶解， 加入适量的 4- 甲基氨基吡啶， 于 65回流， TLC 检测反应进度， 反应结束， 冷却 ； 。
5、(3) 将反应物倾入冰水中， 用乙醚萃取， 合并有机相， 回收有机溶剂， 得莪术醇半抗原粗 品 ； (4) 用石油醚 - 乙酸乙酯进行硅胶柱层析， 得到莪术醇琥珀酸单酯， 即莪术醇丁二酸单 酯， 此即为莪术醇半抗原， 置 4冰箱保存， 所述的石油醚与乙酸乙酯的体积比为 8 1。 3. 一种莪术醇人工抗原， 其特征在于 ： 它以莪术醇为原料， 应用丁二酸酐与莪术醇反 应生成莪术醇琥珀酸单酯制得莪术醇人工半抗原， 用 MS 质谱和 13C-NMR 谱测定半抗原的 结构， 再将莪术醇半抗原制备成吡啶水溶液， 然后再与牛血清蛋白结合制成， 其分子结构式 为 ： 该方法步骤如下 ： (1) 称取莪术醇琥。
6、珀酸单酯， 加入吡啶和 H2O， 搅拌溶解， 所加入的吡啶 H2O 的体积比 为 1 1 ； (2) 称取 BSA， 加入碳酸氢钠缓冲液， 搅拌溶解， 加入 1- 乙基 -3(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺， 将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中， 于室温反应 15 小时 ； (3) 将其反应物装入透析袋， 用纯净水于 4透析， 每 5 小时换水一次， 透析 3 天， 经冷 冻干燥， 得 Cur-HS-BSA， 于 -20下保存。 权 利 要 求 书 CN 101671345 B1/4 页 3 一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种莪术醇半抗原、。
7、 人工抗原及其制备方法， 属于免疫学技术领域。 背景技术 0002 免疫分析是一种基于抗原抗体抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法， 不仅 可用于测定蛋白质、 酶等大分子物质， 而且还广泛用于测定小分子量的药物， 特别适用于那 些色谱法难以分析的药物， 该法已成为药物分析中一种必不可少的基本检测技术。免疫分 析不仅为临床诊断提供了依据， 在内分泌学、 病毒学、 药理学、 血液学及肿瘤学等研究方面 得以应用， 而且在农业科学、 食品科学、 环境保护、 生态学及法医学等领域的应用也有所进 展。免疫分析具有检测灵敏度高、 特异性强、 前处理简单、 反应速度快、 检测费用低廉， 适于 现场监控和大批。
8、量样品分析的特点。 0003 莪术醇 (curcumol) 又名姜黄环奥醇， 姜黄醇， 属萜类化合物， 是莪术挥发油中的 重要成分。具有抗癌、 抗早孕、 抗病毒、 抗突变、 保肝、 活血化瘀等药理作用。特别是在免疫 分析检测方面具有独特作用， 但莪术醇为小分子天然化合物， 相对分子质量较小， 仅具有反 应原性， 而不具有免疫原性， 因此不能直接采用免疫方法检测， 需要与大分子蛋白等偶联形 成复合物后才能成为完全抗原。 但是小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反 应的功能基团 ( 如氨基， 羧基， 重氮基等 )， 对于含羟基的半抗原需要将其羟基衍生为羧基 再与蛋白质载体交联合成人工抗原。。
9、根据莪术醇结构中存在 C6羟基的特点， 先将莪术醇的 羟基衍生为羧基， 然后再与大分子蛋白偶联形成复合物， 从而成为完全抗原才行。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种莪术醇半抗原和人工抗原 ； 0005 本发明的另一个目的是要提供上述莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法， 所制备 出的产品用于含有莪术醇的中草药的免疫方法研究， 其制备方法合成步骤简单， 实验条件 温和， 产物容易得到， 且产率较高。 0006 实现本发明的技术方案是 ： 一种莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法， 以莪术醇 为原料， 利用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯 (Cur-HS)， 得到莪术醇人工半 抗原， 用。
10、 MS 质谱和 13C-NMR 谱测定半抗原的结构 ； 将莪术醇半抗原制备成吡啶水溶液， 然后 使之与牛血清蛋白结合， 制得莪术醇人工抗原， 即 Cur-HS-BSA， 用 MALDI-TOF-MS 鉴定莪术 醇人工抗原 ； 其反应方程式为 ： 0007 (1) 莪术醇琥珀酸单酯 (Cur.-HS) 0008 说 明 书 CN 101671345 B2/4 页 4 0009 莪术醇 丁二酸酐 莪术醇琥珀酸单酯 0010 (2) 莪术醇人工抗原 Cur.-HS-BSA 0011 0012 莪术醇琥珀酸单酯 牛血清蛋白 莪术醇人工抗原 0013 本发明所述莪术醇半抗原的制备方法步骤如下 ： 001。
11、4 1、 取三氯甲烷置于反应瓶， 加入少量无水 MgSO4， 搅拌过夜， 滤去 MgSO4； 0015 2、 取上述滤液， 加入莪术醇和丁二酸酐， 搅拌溶解， 加入适量的 4- 甲基氨基吡啶， 于 65回流， TLC 检测反应进度， 反应结束， 冷却 ； 0016 3、 将反应物倾入冰水中， 用乙醚萃取， 合并有机相， 回收有机溶剂， 得莪术醇半抗 原粗品 ； 0017 4、 用石油醚 - 乙酸乙酯进行硅胶柱层析， 得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物， 此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯， 置 4冰箱保存 ； 所述石油醚与乙酸乙酯的体积 比为 8 1。 0018 将上述所得产品用 MS 质谱和 。
12、13C-NMR 谱测定其结构， 从 Cur-HS 的 MS(APCI)m/ z ： 337.14(M-)， 推出其分子量为 336， 初步认为 Cur-HS 为合成的目标产物 ； 再分别测定 出原莪术醇、 Cur-HS 的 13C-NMR 谱， 比较两者13C-NMR 谱的不同， 发现产物多出 172.48， 169.15， 30.2， 29.13， 共四条谱线， 其中 169.15 为莪术醇成丁二酸单酯后酯羰基碳原子， 172.48 为莪术醇成丁二酸单酯链羧基羰基碳原子， 而 29.13， 30.2 为丁二酸单酯链 中 2 个亚甲基碳原子。结合 MS 的数据， 对原料莪术醇和和合成出的产物碳。
13、谱的化学位移数 据的差异分析表明， 从而确定合成出的产物就是所需要的目标产物 Cur-HS。 0019 本发明所述莪术醇人工抗原的制备方法步骤如下 ： 0020 1、 称取莪术醇琥珀酸单酯， 加入吡啶和 H2O， 搅拌溶解， 所加入的吡啶与 H2O 的体积 比为 1 1 ； 0021 2、 称取 BSA， 加入 PH8.0 的碳酸氢钠缓冲液， 搅拌溶解， 加入 1- 乙基 -3(3- 二甲基 氨基丙基 ) 碳二亚胺 (EDC)， 将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中， 于室温反 应 15 小时 ； 0022 3、 将其反应物装入透析袋， 用纯净水于 4透析， 每 5 小时换水一次， 透。
14、析 3 天， 经 冷冻干燥， 得莪术醇人工抗原 Cur-HS-BSA， 于 -20下保存。 0023 将上述所得产品用 MALDI-TOF-MS 进行鉴定， 其鉴定方法是 ： 0024 (1) 先 配 置 基 质 辅 助 溶 液 ： 将 0.15 三 氟 醋 酸 (TFA)666ul 加 入 到 乙 腈 说 明 书 CN 101671345 B3/4 页 5 (CH3CN)333ul 中， 取 10mg 芥子酸加入到前配的 0.15 TFA-CH3CN 混合液 1ul， 超声波 10-15min 后溶解， 备用 ； 0025 (2)供试品处理 ： 取Cur-HS-BSA， 溶解在8mol/L的。
15、尿素溶液中， 然后将其稀释成浓 度在 1-10pmol/L ； 另称取 BSA0.5mg 溶于水 100ul， 配置成 5mg/ml 的 BSA 水溶液。 0026 (3)MALDI-TOF-MS 测定 ： 各取供试品和基质辅助溶液 1ul， 充分混匀， 吸取混合液 1ul 滴加在镀金样品板上， 室温下晾干后， 送入质谱仪分析。 0027 结合比 ( 偶联物相对分子质量 - 蛋白质相对分子质量 )/ 莪术醇相对分子质量 0028 结合比 (73302.3-66713.4)/336.42 19.6。 0029 根据 MALDI-TOF-MS 图谱， 可以清晰的判断出 Cur-HS 与 BSA 偶。
16、联形成了新的复合 物， 改复合物的相对分子质量约为 73302 ； 对比 BSA 的相对分子质量 66731 以及 Cur-HS 的 相对分子质量 336， 可以求出 Cur-HS-BSA 的结合比 19.6， 本试验中人工合成的半抗原 - 蛋 白复合物Cur-HS-BSA的结合数值较大， 每个载体蛋白分子平均与19.6个半抗原分子结合， 说明半抗原与载体的偶联情况良好， 这为后续的抗莪术醇抗体的制备提供了可靠的实验基 础。 0030 本发明的有益效果 ： 本发明合成了莪术醇的半抗原和人工抗原， 所制备的产品可 用于含莪术醇成分样品的研究， 合成步骤简单， 所需的实验条件温和， 在常温下就能进。
17、行， 产物容易得到， 且产率较高， 有效， 完全可用于免疫分析中， 为以后人们的研究提供了方便， 可以满足国内外对其研究的需要。 附图说明 0031 图 1 为莪术醇 13C-NMR 0032 图 2 为莪术醇琥珀酸单酯 (Cur.-HS)13C-NMR 0033 图 3 为莪术醇琥珀酸单酯 (Cur.-HS)MS(APCI) 0034 图 4 为牛血清蛋白 (BSA) 的 MALDI-TOF-MS 谱图 0035 图 5 为莪术醇人工抗原 (Cur-HS-BSA) 的 MALDI-TOF-MS 谱图 具体实施方式 0036 实施例 1 0037 一种莪术醇人工半抗原的制备方法按如下步骤进行 。
18、： 0038 (1) 称取莪术醇 0.1170g( 即 0.495mmol) 与丁二酸酐 0.12g( 即 1.2mmol) ； 0039 (2) 取 10ml 三氯甲烷置于反应瓶， 加入少量无水 MgSO4， 搅拌过夜， 滤去 MgSO4； 0040 (3) 取上述滤液， 将称好的莪术醇与丁二酸酐加入到滤液中， 搅拌溶解， 加入适量 的 4- 甲基氨基吡啶， 于 65回流， TLC 检测反应进度， 反应结束， 冷却 ； 0041 (4) 将反应物倾入冰水中， 用乙醚萃取， 合并有机相， 回收有机溶剂， 得莪术醇半抗 原粗品 ； 0042 (5) 用石油醚 - 乙酸乙酯进行硅胶柱层析， 得到纯。
19、度较高的莪术醇丁二酯油状物 0.1450g， 产率 87， 此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯 0.431mmol， 置 4冰箱保存， 石油醚 - 乙酸乙酯的体积比为 8 1。 0043 实施例 2 说 明 书 CN 101671345 B4/4 页 6 0044 (1) 称取莪术醇 0.234g( 即 0.99mmol) 与丁二酸酐 0.24g( 即 2.4mmol) ； 0045 (2) 取 20ml 三氯甲烷置于反应瓶， 加入少量无水 MgSO4， 搅拌过夜， 滤去 MgSO4； 0046 (3) 取上述滤液， 将称好的莪术醇与丁二酸酐加入到滤液中， 搅拌溶解， 加入适量 的 4- 甲基。
20、氨基吡啶， 于 65回流， TLC 检测反应进度， 反应结束， 冷却 ； 0047 (4) 将反应物倾入冰水中， 用乙醚萃取， 合并有机相， 回收有机溶剂， 得莪术醇半抗 原粗品 ； 0048 (5) 用石油醚 - 乙酸乙酯进行硅胶柱层析， 得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物 0.29g， 产率 87， 此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯 0.862mmol， 置 4冰箱保存， 石 油醚 - 乙酸乙酯的体积比为 8 1。 0049 实施例 3 0050 一种莪术醇人工抗原的制备方法按如下步骤进行 ： 0051 (1) 称取 4.15mg(12.310-6mol) 莪术醇琥珀酸单酯， 加吡啶与水的。
21、混合液 250ul( 二者体积比为 1 1)， 搅拌溶解 ； 0052 (2) 称取 BSA2.8mg(4.210-5mmol)， 加入 PH8.0 的碳酸氢钠缓冲液 250ul， 搅拌溶 解， 加入1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)4.7mg(24.610-6mol)， 将莪术醇 丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中， 于室温反应 15 小时 ； 0053 (3) 将其反应物装入透析袋， 用纯净水于 4透析， 每 5 小时换水一次， 透析 3 天， 经冷冻干燥， 得 1.60mg 莪术醇人工抗原 Cur-HS-BSA， 产率 52， 于 -20下保存。 0054 实施例 4。
22、 0055 (1) 称取 8.3mg(24.610-6mol) 莪术醇琥珀酸单酯， 加吡啶与水的混合液 250ul( 二者体积比为 1 1)， 搅拌溶解 ； 0056 (2) 称取 BSA5.6mg(8.410-5mmol)， 加入 PH8.0 的碳酸氢钠缓冲液 250ul， 搅拌溶 解， 加入1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)9.4mg(49.210-6mol)， 将莪术醇 丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中， 于室温反应 15 小时 ； 0057 (3) 将其反应物装入透析袋， 用纯净水于 4透析， 每 5 小时换水一次， 透析 3 天， 经冷冻干燥， 得 3.2mg 莪术醇人工抗原 Cur-HS-BSA， 产率 52， 于 -20下保存。 说 明 书 CN 101671345 B1/4 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 101671345 B2/4 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 101671345 B3/4 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 101671345 B4/4 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 。