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1、(10)授权公告号 CN 102796779 B (45)授权公告日 2013.11.20 CN 102796779 B *CN102796779B* (21)申请号 201210304596.5 (22)申请日 2012.08.24 C12P 13/00(2006.01) C07C 229/08(2006.01) C07C 227/40(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (73)专利权人 南通励成生物工程有限公司 地址 226000 江苏省南通市开发区新兴东路 333 号 (72)发明人 沈宇峰 帅玉英 顾钦青 吴晓花 李佶松 (74)专利代理机构 南通市永通专利事务。
2、所 32100 代理人 葛雷 (54) 发明名称 生物法制备 - 氨基丁酸的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种生物法制备 - 氨基丁酸 的方法， 包括菌体制备、 生产 - 氨基丁酸、 脱色、 电渗析、 制成 - 氨基丁酸粉剂产品或 - 氨基 丁酸晶体产品等步骤。本发明利用游离乳酸菌细 胞催化合成 - 氨基丁酸， 并改进生产工艺， 使 - 氨基丁酸产量提高， 成本降低， 而且还建立了 制备高纯度 - 氨基丁酸的方法。本工艺中反应 体系里不含有碳源、 氮源等培养成分， 相对于发酵 液而言反应液成分简单， 可大幅度提高产品纯度， 同时具有后处理简单、 生产周期短及环境污染小、 成本低等优点。 (。
3、51)Int.Cl. 审查员 刘铮 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102796779 B CN 102796779 B *CN102796779B* 1/1 页 2 1. 一种生物法制备 - 氨基丁酸的方法， 其特征是 ： 包括下列步骤 ： （1） 菌体制备 ： 在培养基中添加 1-30g/L 的谷氨酸钠作为诱导剂， 进行诱导产酶， 接入产胞内谷氨酸 脱羧酶的菌株进行培养 ； 培养条件为 ： 培养温度 25 35， 发酵过程中通过补加碱液进行 pH控制， 。
4、使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内， 培养时间824小时 ； 培养结束后得到菌液 ； 所使用的培养基的组成及以 g/L 计的含量为 ： 葡萄糖 10-30， 酵母膏 5-30， 蛋白胨 5-30， 乙酸钠 0.5-5， 磷酸氢二钠或磷酸氢二钾 0.05-10， 硫酸镁 0.05-10， 硫酸锰 0.05-1， PPE 聚醚消泡剂 0.1-3 ； （2） 陶瓷膜过滤收集菌体 ： 将步骤 （1） 得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体， 膜孔径为 0.05-1m， 得到菌体 ； （3） 生产 - 氨基丁酸 ： 配制 0.01-0.5mol/L pH3-7 的缓冲液， 加入 10-100g/L 菌体细。
5、胞， 分批加入底物谷氨 酸钠， 添加浓度为25g/L， 在反应温度为28-40的条件下， 通过再次发酵来生产-氨基丁 酸， 发酵时间为 10-50h ； 发酵结束后， 通过离心收集清液 ； （4） 将步骤 （3） 得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞， 得到清液 ； （5） 脱色 ： 先将步骤 （4） 得到的清液 pH 调至 7.0-8.0， 然后通过颗粒活性炭柱进行脱色 处理， 收集清液 ； （6）电渗析 ： 采用电渗析去除杂质， 控制料液 pH 为 7.0-8.0， 在电导率下降至 1000s/cm 时， 停止循环， 收集 - 氨基丁酸清液 ； （7） 将步骤 （6） 得到的 -。
6、 氨基丁酸清液， 制成 - 氨基丁酸粉剂产品或 - 氨基丁酸 晶体产品 ； 所述制成 - 氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤 ： （a）真空浓缩 ： 采用三效板式蒸发器进行浓缩， 待料液浓缩至 - 氨基丁酸含量为 80g/L 时， 停止浓缩， 收集浓缩液 ； （b） 喷雾干燥 ： 在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉， 调节固形物质量含量为 5-50%， 进行 喷雾干燥， 制得质量含量为 20-50% 的 - 氨基丁酸粉剂产品 ； 所述制成 - 氨基丁酸晶体产品的方法是 ： 将步骤 （6） 得到的 - 氨基丁酸清液， 经过 离子交换树脂处理 ； 然后将料液 pH 调至 - 氨基丁酸等电点， 通过降。
7、温结晶， 得到 - 氨 基丁酸晶体产品 ； 所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂， 以去除残留的底物谷氨酸钠， 再经过酸性阳离子交换树脂， 对 - 氨基丁酸进行吸附、 洗脱处理 ； 所述阴离子交换树脂为 D301、 D296 或 201 型强碱或弱碱性阴离子交换树脂 ； 所述阳离子交换树脂是 001 或 D113 型 强酸或弱酸性阳离子交换树脂 ； 结晶采用等电点降温结晶法， 将经离子交换树脂处理后得 到的料液进行结晶或添加乙醇进行结晶， 添加比例为乙醇 ： 料液 =1 10 ： 1（V/V） ； 结晶时 调节溶液 pH 值至 - 氨基丁酸的等电点 7.2， 温度降温范围为 90 5， 晶种的。
8、添加量为 0. 2-10g/L， 搅拌速率为 30-100r/min， 降温速率为 1-10 /h。 权 利 要 求 书 CN 102796779 B 2 1/5 页 3 生物法制备 - 氨基丁酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种制备 - 氨基丁酸的方法。 背景技术 0002 -氨基丁酸 （Gamma-aminobutyric acid， GABA） ， 又称氨酪酸， 是一种天然存在的 非蛋白质组成氨基酸， 广泛分布于原核和真核生物中。 -氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系 统的抑制性传递物质， 具有镇静神经、 促进睡眠、 降低血压、 健脑益智、 延缓衰老、 健肝利肾 等重要的生理功能。 0。
9、003 至今为止， - 氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和生物法两种。常见的化 学合成方法是如以吡咯烷酮作为原料， 经氢氧化钙、 碳酸氢铵水解制得 - 氨基丁酸。化 学合成法成本较高， 得率较低， 并且在生产工艺中使用危险溶剂， 甚至是强腐蚀、 有毒溶 剂。因此， 化学合成法制备的 - 氨基丁酸很难在食品工厂实现， 制品也不能被认为是 一种天然食品添加剂。生物法相比较来说是一种既安全、 成本又低的方法。根据最新专 利报道， 生物法生产 - 氨基丁酸的菌种有 （1） 天然原始菌株， 包括短乳杆菌 （专利号 ZL 200510049187.5） 、 曲霉 （公开号 CN 101302480 B）。
10、 、 植物乳杆菌 （公开号 CN 101928679 A） 、 乳酸菌 （公开号 CN 1243101 C） 或天然食材富集 （公开号 CN 1840672 A） ；（2） 重组菌 ： 大 肠杆菌 （公开号 CN 1298860 C） 、 谷氨酸棒杆菌 （公开号 CN 101945997 A） （3） 诱变菌株 ： 短乳杆菌 （公开号 CN 102174449 A） 。现有方法中， - 氨基丁酸多产生于发酵液中， 由于 发酵液成分复杂， 下游分离纯化过程繁琐， 目标产物的浓度也较低， 这些因素限制了国内工 业化生产， 而关于制备高纯度 - 氨基丁酸更是鲜有报道。 发明内容 0004 本发明的目。
11、的在于提供一种方法简便、 易操作， 效果好的生物法制备 - 氨基丁 酸的方法。 0005 本发明的技术解决方案是 ： 0006 一种生物法制备 - 氨基丁酸的方法， 其特征是 ： 包括下列步骤 ： 0007 （1） 菌体制备 ： 0008 在培养基中添加 1-30g/L 的谷氨酸钠作为诱导剂， 进行诱导产酶， 接入产胞内谷 氨酸脱羧酶的菌株进行培养 ； 培养条件为 ： 培养温度 25 35， 发酵过程中通过补加碱液 进行 pH 控制， 使发酵液 pH 维持在 4.5-7.0 范围内， 培养时间 8 24 小时 ； 培养结束后得到 菌液 ； 0009 （2） 陶瓷膜过滤收集菌体 ： 将步骤 （1。
12、） 得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体， 膜孔 径为 0.05-1m， 得到菌体 ； 0010 （3） 生产 - 氨基丁酸 ： 0011 配制0.01-0.5mol/L pH3-7的缓冲液， 加入10-100g/L菌体细胞， 分批加入底物谷 氨酸钠， 添加浓度为0-30g/L， 在反应温度为28-40的条件下， 通过再次发酵来生产-氨 说 明 书 CN 102796779 B 3 2/5 页 4 基丁酸， 发酵时间为 10-50h ； 发酵结束后， 通过离心收集清液 ； 0012 （4） 将步骤 （3） 得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞， 得到清液 ； 0013 （5） 脱色 ： 。
13、先将步骤 （4） 得到的清液 pH 调至 7.0-8.0， 然后通过颗粒活性炭柱进行 脱色处理， 收集清液 ； 0014 （6）电渗析 ： 采用电渗析去除杂质， 控制料液 pH 为 7.0-8.0， 在电导率下降至 1000s/cm 时， 停止循环， 收集 - 氨基丁酸清液 ； 0015 （7） 将步骤 （6） 得到的 - 氨基丁酸清液， 制成 - 氨基丁酸粉剂产品或 - 氨基 丁酸晶体产品。 0016 所述制成 - 氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤 ： 0017 （a） 真空浓缩 ： 采用三效板式蒸发器进行浓缩， 待料液浓缩至 - 氨基丁酸含量为 80g/L 时， 停止浓缩， 收集浓缩。
14、液 ； 0018 （b） 喷雾干燥 ： 在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉， 调节固形物质量含量为 5-50%， 进行喷雾干燥， 制得质量含量为 20-50% 的 - 氨基丁酸粉剂产品。 0019 所述制成 - 氨基丁酸晶体产品的方法是 ： 将步骤 （6）得到的 - 氨基丁酸清 液， 经过离子交换树脂处理 ； 然后将料液 pH 调至 - 氨基丁酸等电点， 通过降温结晶， 得到 - 氨基丁酸晶体产品。 0020 步骤 （1） 所述产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株为乳酸菌或希氏乳杆菌。 0021 步骤 （1） 所使用的培养基的组成及以 g/L 计的含量为 ： 0022 葡萄糖 10-30， 酵母膏 5-30， 。
15、蛋白胨 .5-30， 乙酸钠 0.5-5， 磷酸氢二钠或磷酸氢二 钾 0.05-10， 硫酸镁 0.05-10， 硫酸锰 0.05-1， PPE 聚醚消泡剂 0.1-3。 0023 所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂， 以去除残留的底物谷氨酸钠， 再经过 酸性阳离子交换树脂， 对 - 氨基丁酸进行吸附、 洗脱处理。 0024 所述阴离子交换树脂为 D301、 D296 或 201 型强碱或弱碱性阴离子交换树脂 ； 所述 阳离子交换树脂是 001 或 D113 型强酸或弱酸性阳离子交换树脂。 0025 结晶采用等电点降温结晶法， 将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添 加乙醇进行结晶， 。
16、添加比例为乙醇 ： 料液 =0 10 ： 1V/V ； 结晶时调节溶液 pH 值至 - 氨基 丁酸的等电点 7.2， 温度降温范围为 90 5， 晶种的添加量为 0. 2-10g/L， 搅拌速率为 30-100r/min， 降温速率为 1-10 /h。 0026 本发明利用游离乳酸菌细胞催化合成-氨基丁酸， 并改进生产工艺， 使-氨基 丁酸产量提高， 成本降低， 而且还建立了制备高纯度 - 氨基丁酸的方法。本工艺中反应体 系里不含有碳源、 氮源等培养成分， 相对于发酵液而言反应液成分简单， 可大幅度提高产品 纯度， 同时具有后处理简单、 生产周期短及环境污染小、 成本低等优点。 附图说明 00。
17、27 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 0028 图 1 是本发明一个实施例工业化制备过程中 - 氨基丁酸生成曲线。 0029 图 2 是用乳酸菌细胞转化生成 - 氨基丁酸的转化液的氨基酸检测结果。Glu ： 谷 氨酸 ； GABA ： - 氨基丁酸。 说 明 书 CN 102796779 B 4 3/5 页 5 具体实施方式 0030 本发明的 - 氨基丁酸是指 4- 氨基丁酸， 是哺乳动物中枢神经系统抑制性递质。 作为新资源食品， 可添加到饮料、 可可制品、 巧克力和巧克力制品、 糖果、 焙烤食品、 膨化食 品中， 开发新型产品。 0031 实施例 1 ： 0032 一、 菌体培。
18、养 0033 乳酸菌菌种经活化后， 进行一级种子培养， 二级种子培养， 最后进入发酵罐培养， 接种量 3%（V/V， 种子液 / 发酵液） ， 30静置培养 16 h， 发酵过程中通过补加碱液进行 pH 控制， 使发酵液 pH 维持在 4.5-7.0 范围内， 通过 0.6m 陶瓷膜过滤收集菌体。 0034 种子培养基原料以 g/L 计 ： 葡萄糖 10， 酵母膏 5， 蛋白胨 5， 乙酸钠 0.5， 磷酸氢二 钠 （或磷酸氢二钾） 1， 硫酸镁 1， 硫酸锰 1， PPE 聚醚消泡剂 0.1（但不仅限于此消泡剂， 可选 用任何可用于发酵工业的消泡剂） 。 0035 发酵培养基配方以 g/L 。
19、计 ： 葡萄糖 10， 酵母膏 5， 蛋白胨 5， 乙酸钠 0.5， 谷氨酸钠 1， 磷酸氢二钠 （或磷酸氢二钾） 1， 硫酸镁 1， 硫酸锰 1， PPE 聚醚消泡剂 0.1（但不仅限于此消 泡剂， 可选用任何可用于发酵工业的消泡剂） 。 0036 二、 生产 - 氨基丁酸 0037 采用乳酸菌细胞转化法生产-氨基丁酸， 反应条件为 ： 配制0.01mol/L pH7的醋 酸 - 醋酸钠缓冲液， 加入 20g/L 菌体细胞， 分批加入底物谷氨酸钠， 初始底物浓度 10g/L， 每 4h 添加一次底物， 添加浓度为 5g/L， 总反应底物浓度为 25g/L， 反应温度为 28， 发酵时间 为 。
20、17h。结束后， 通过离心收集清液， 得到含量达 12g/L 的 - 氨基丁酸转化液， 见图 1。 0038 三、 - 氨基丁酸含量的检测 0039 将上述转化液离心后加入等体积 100g/L 的三氯乙酸， 振荡均匀， 再离心 （10,000g， 5 min） ， 清液稀释 2-10 倍， 再经 0.45 m 膜过滤， 进行高效液相分析。采用 ODS C18（4.6250nm） ， 40oC 分析， - 氨基丁酸用外标法定量。 0040 四、 产品制备 ： 0041 过滤除菌 ： 将得到的 - 氨基丁酸转化液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细 胞， 得到清液 ； 0042 脱色 ： 将过滤除菌。
21、后得到的清液 pH 调至 7.0-8.0， 然后通过颗粒活性炭柱进行脱 色处理， 收集清液 ； 0043 电渗析 ： 采用电渗析去除杂质， 控制料液 pH 为 7.0-8.0， 在电导率下降至 1000s/cm 时， 停止循环， 收集 - 氨基丁酸清液 ； 0044 将步骤 （4） 得到的 - 氨基丁酸清液， 制成 - 氨基丁酸粉剂产品或 - 氨基丁 酸晶体产品。 0045 所述制成 - 氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤 ： 0046 （a） 真空浓缩 ： 采用三效板式蒸发器进行浓缩， 待料液浓缩至 - 氨基丁酸含量为 50g/L 时， 停止浓缩 ； 0047 （b） 喷雾干燥 ： 浓缩。
22、液中添加麦芽糊精或淀粉， 调节固形物质量含量为 5-50%， 进 行喷雾干燥， 制得质量含量为 20-50% 的 - 氨基丁酸粉剂产品 ； 0048 所述制成 - 氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤 ： 说 明 书 CN 102796779 B 5 4/5 页 6 0049 （a） 真空浓缩 ： 采用三效板式蒸发器进行浓缩， 待料液浓缩至 - 氨基丁酸含量为 80g/L 时， 停止浓缩， 收集浓缩液 ； 0050 （b） 喷雾干燥 ： 在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉， 调节固形物质量含量为 5-50%， 进行喷雾干燥， 制得质量含量为 20-50% 的 - 氨基丁酸粉剂产品。 0051 所述。
23、制成 - 氨基丁酸晶体产品的方法是 ： 将步骤 （6） 得到的 - 氨基丁酸清液， 经过离子交换树脂处理 ； 然后将料液pH调至-氨基丁酸等电点， 通过降温结晶， 得到纯度 达到 98% 的 - 氨基丁酸晶体产品。 0052 实施例 2 ： 0053 一种生物法制备 - 氨基丁酸的方法， 包括下列步骤 ： 0054 （1） 菌体制备 ： 0055 在培养基中添加谷氨酸钠， 添加量为 1-30g/L（例 1 g/L、 15 g/L、 30 g/L） 的作为 诱导剂， 进行诱导产酶， 接入产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株进行培养 ； 培养条件为 ： 培养温度 25 35 （例 25、 30、 35） ， 。
24、发酵过程中通过补加碱液进行 pH 控制， 使发酵液 pH 维持 在 4.5-7.0 范围内， 培养时间 8 24 小时 （例 8h、 16h、 24h） ； 培养结束后得到菌液 ； 0056 （2） 陶瓷膜过滤收集菌体 ： 将步骤 （1） 得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体， 膜孔 径为 0.05-1m（例 0.05m、 0.5m、 1m） ， 得到菌体 ； 0057 （3） 生产 - 氨基丁酸 ： 0058 配制 0.01-0.5mol/L（例 0.01 mol/L、 0.2 mol/L、 0.5 mol/L） pH3-7（例 3、 5、 7） 的缓冲液， 加入菌体细胞， 菌体细胞加入量为10。
25、-100g/L （例10 g/L、 50 g/L、 100 g/L） ， 分批 加入底物谷氨酸钠， 添加浓度为 1-30g/L （例 1g/L、 15 g/L、 30 g/L） ， 在反应温度为 28-40 （例 28、 32、 40） 的条件下， 通过再次发酵来生产 - 氨基丁酸， 发酵时间为 10-50h （例 10h、 25h、 50h） ； 发酵结束后， 通过离心收集清液 ； 0059 （4） 将步骤 （3） 得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞， 得到清液 ； 0060 （5） 脱色 ： 先将步骤 （4） 得到的清液 pH 调至 7.0-8.0， 然后通过颗粒活性炭柱进行 。
26、脱色处理， 收集清液 ； 0061 （6）电渗析 ： 采用电渗析去除杂质， 控制料液 pH 为 7.0-8.0， 在电导率下降至 1000s/cm 时， 停止循环， 收集 - 氨基丁酸清液 ； 0062 （7） 将步骤 （6） 得到的 - 氨基丁酸清液， 制成 - 氨基丁酸粉剂产品或 - 氨基 丁酸晶体产品。 0063 所述制成 - 氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤 ： 0064 （a） 真空浓缩 ： 采用三效板式蒸发器进行浓缩， 待料液浓缩至 - 氨基丁酸含量为 80g/L 时， 停止浓缩， 收集浓缩液 ； 0065 （b） 喷雾干燥 ： 在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉， 调节固形物质量。
27、含量为 5-50% （例 5%、 30%、 50%） ， 进行喷雾干燥， 制得质量含量为 20-50% 的 - 氨基丁酸粉剂产品。 0066 所述制成 - 氨基丁酸晶体产品的方法是 ： 将步骤 （6）得到的 - 氨基丁酸清 液， 经过离子交换树脂处理 ； 然后将料液 pH 调至 - 氨基丁酸等电点， 通过降温结晶， 得到 - 氨基丁酸晶体产品。 0067 步骤 （1） 所述产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株为乳酸菌或希氏乳杆菌。 0068 步骤 （1） 所使用的培养基的组成及以 g/L 计的含量为 ： 说 明 书 CN 102796779 B 6 5/5 页 7 0069 葡萄糖 10-30 （例 10。
28、、 20、 30） ， 酵母膏 5-30 （例 5、 20、 30） ， 蛋白胨 .5-30 （例 5、 20、 30） ， 乙酸钠 0.5-5（例 0.5、 3、 5） ， 磷酸氢二钠或磷酸氢二钾 0.05-10（例 0.05、 5、 10） ， 硫酸 镁 0.05-10（例 0.05、 5、 10） ， 硫酸锰 0.05-1（例 0.05、 0.5、 1） ， PPE 聚醚消泡剂 0.1-3（例 0.1、 1、 3） 。 0070 所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂， 以去除残留的底物谷氨酸钠， 再经过 酸性阳离子交换树脂， 对 - 氨基丁酸进行吸附、 洗脱处理。 0071 所述阴离子交。
29、换树脂为 D301、 D296 或 201 型强碱或弱碱性阴离子交换树脂 ； 所述 阳离子交换树脂是 001 或 D113 型强酸或弱酸性阳离子交换树脂。 0072 结晶采用等电点降温结晶法， 将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添 加乙醇进行结晶， 添加比例为乙醇 ： 料液 =0 10 ： 1V/V（例 1:1、 5:1、 10:1） ； 结晶时调节溶 液 pH 值至 - 氨基丁酸的等电点 7.2， 温度降温范围为 90 5（例 90、 40、 5） ， 晶 种的添加量为 0. 2-10g/L（例 0.2 g/L、 5 g/L、 10 g/L） ， 搅拌速率为 30-100r/min， 降温速 率为 1-10 /h（例 1 /h、 5 /h、 10 /h） 。 说 明 书 CN 102796779 B 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796779 B 8 。