技术领域
本发明涉及一种毛蕊异黄酮衍生物及其制备方法和用途，属于药物化学领域。
背景技术
毛蕊异黄酮是从蒙古黄芪中分离得到的重要异黄酮类活性化合物，为典型的植物雌激素，能够与机体的雌激素受体结合，产生雌激素样作用，具有明显的抗氧化、抗骨质疏松、抗肿瘤和免疫调节等作用。毛蕊异黄酮具有由于不良反应小、毒性低、药理作用多样的特点，使得毛蕊异黄酮的相关研究越来越深入。
对毛蕊异黄酮进行适当的改构，可能会明显增强其生物学活性，为以后提高临床疗效发挥更大的药理作用。付学文等以毛蕊异黄酮为底物，对其官能团进行修饰，获取具有抗癌活性的衍生物。毛蕊异黄酮也可以与葡萄糖结合，以毛蕊异黄酮苷的形式发挥药理作用。
发明内容
本发明的目的是以毛蕊异黄酮为底物，用氨基酸进行修饰，以获得具有良好提高免疫力药理活性的化合物并提供其制备方法和用途。
本发明的技术方案如下：
一种毛蕊异黄酮衍生物，具有如下结构A：
其中，R1和R2分别为H，γ-氨基丁酰基焦谷氨酰基硫代脯氨酰基中的一种，且R1和R2不同时为H。
优选地，R1和R2均为γ-氨基丁酰基，焦谷氨酰基或硫代脯氨酰基。
一种所述毛蕊异黄酮衍生物的制备方法，反应方程式为：
其中，Rx为γ-氨基丁酸焦谷氨酸和硫代脯氨酸的一种或两种。
一种所述的毛蕊异黄酮衍生物在制备调节免疫功能的药物中的用途。
本发明合成了一系列毛蕊异黄酮衍生物，并对其进行动物实验，发现其具有潜在的临床应用价值，这不仅具有重要的学术意义还具有广泛的应用前景。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明对进一步说明：
所述毛蕊异黄酮衍生物结构式如下：
实施例1：毛蕊异黄酮-3’-γ-氨基丁酯(化合物A-1)的制备
将Boc保护的氨基丁酸(2.0g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体1.2g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体0.9g，产率：24％。
MS：m/z 370[M+H]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.04(s,1H),8.35(s,1H),8.00(d,J＝8.9Hz,1H),7.12(d,J＝2.0Hz,1H),7.06(m,2H),6.95(s,2H),3.78(s,3H),2.65(m,2H),2.30(t,2H)1.90(m,2H)ppm.13C NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝175.9,163.8,158.0,152.4,146.7,145.7,127.9,125.4,124.9,121.2,118.4,115.3,115.0,110.8,100.7,75.1,56.2,41.4,30.6,25.1.
实施例2：毛蕊异黄酮-7-γ-氨基丁酯(化合物A-2)的制备
将Boc保护的氨基丁酸(2.0g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体1.0g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体0.7g，产率：19％。
实施例3：毛蕊异黄酮-二-γ-氨基丁酯(化合物A-3)的制备
将Boc保护的氨基丁酸(4.0g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体3.0g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(4.4g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体2.3g，产率：50％。
实施例4：毛蕊异黄酮-7-γ-氨基丁酰-3’-焦谷氨酯(化合物A-4)的制备
将焦谷氨酸(1.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将中间体I(4.7g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体4.0g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体3.1g，产率：64％。
实施例5：毛蕊异黄酮-7-γ-氨基丁酰-3’-硫代脯氨酯(化合物A-5)的制备
将Boc保护的硫代脯氨酸(2.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将中间体I(4.7g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体3.3g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体2.0g，产率：42％。
实施例6：毛蕊异黄酮-3’-焦谷氨酯(化合物B-1)的制备
将焦谷氨酸(1.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体1.2g，产率：30％。
实施例7：毛蕊异黄酮-7-焦谷氨酯(化合物B-2)的制备
将焦谷氨酸(1.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温， 搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体1.0g，产率：25％。
实施例8：毛蕊异黄酮-二焦谷氨酯(化合物B-3)的制备
将焦谷氨酸(2.6g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体2.5g，产率：50％。
实施例9：毛蕊异黄酮-7-焦谷氨酰-3’-γ-氨基丁酯(化合物B-4)的制备
将Boc保护的氨基丁酸(2.0g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将B-2(3.9g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体2.9g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体2.2g，产率：45％。
实施例10：毛蕊异黄酮-7-焦谷氨酰-3’-硫代脯氨酯(化合物B-5)的制备
将Boc保护的硫代脯氨酸(2.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将B-2(3.9g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体1.9g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体2.2g，1.3g，产率：25％。
实施例11：毛蕊异黄酮-3’-硫代脯氨酯(化合物C-1)的制备
将Boc保护的硫代脯氨酸(2.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体1.9g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体1.0g，产率：25％。
实施例12：毛蕊异黄酮-7-硫代脯氨酯(化合物C-2)的制备
将Boc保护的硫代脯氨酸(1.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体1.8g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体1.1g，产率：28％。
实施例13：毛蕊异黄酮-二硫代脯氨酯(化合物C-3)的制备
将Boc保护的硫代脯氨酸(2.6g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将毛蕊异黄酮(2.84g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体2.5g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体1.8g，产率：35％。
实施例14：毛蕊异黄酮-7-硫代脯氨酰-3’-γ氨基丁酯(化合物C-4)的制备
将4-叔丁氧羰基氨基丁酸(2.0g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将C-2(4.2g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体3.2g，将其加入30mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入三氟乙酸(2.2g)，搅拌3小时后，倒入水中，饱和碳酸氢钠溶液调pH＝8，过滤，干燥得固体2.7g，产率：51％。
实施例15：毛蕊异黄酮-7-硫代脯氨酰-3’-焦谷氨酯(化合物C-5)的制备
将焦谷氨酸(1.3g)溶于20mL二氯亚砜中，加热至回流反应2小时，浓缩至干备用。将C-2(4.2g)溶于50mL二甲基亚砜中，降温至0度，加入上述浓缩物，升至室温，搅拌6小时，倒入冰水中，抽滤，干燥，柱层析得固体3.1g，产率：61％。
实施例16：毛蕊异黄酮衍生物对小鼠免疫功能的调节作用
(1)ICR小鼠，雄性，体重18-22g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(动物许可证SCXK2003-0003)，分为16组，每组10只；分笼饲养，笼号1-16号。其中1号笼，灌胃DMSO 1mL，1日1次，连用3天；2-6号笼小鼠分别灌胃化合物A-1至A-5；7-11号笼小鼠分别灌胃化合物B-1至B-5；12-16号笼小鼠分别灌胃化合物C-1至C-5。所有化合物给药剂量为10mg/kg体重，溶于DMSO中灌胃，1日1次，连用3天。
(2)实验观察指标
2.1小鼠脾淋巴细胞增殖试验
ICR小鼠饲喂6天后，称重，颈椎脱臼处死。无菌取脾，制备脾细胞悬液，刀豆蛋白刺激脾淋巴细胞分化增殖，采用MTT比色法测定脾淋巴细胞增殖能力。
2.2NK细胞活性测定
ICR小鼠饲喂6天后，称重，颈椎脱臼处死。无菌取脾，制备脾细胞悬液，以小鼠T细 胞瘤为靶细胞，用乳酸脱氢酶法测定NK细胞活性。
2.3抗体生成细胞水平检测
ICR小鼠饲喂6天后，每鼠腹腔注射2％的绵羊红细胞悬液进行免疫。免疫4天后处死，制备脾细胞悬液，按Jerne改良玻片法计数溶血空斑数。
2.4小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
ICR小鼠饲喂60天后，每鼠腹腔注射20％的鸡红细胞悬液1ml，30min后，颈椎脱臼处死。小鼠仰位固定，腹腔注射生理盐水2ml，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1ml，分滴于2片载玻片上，37℃孵育30min后，丙酮甲醇溶液(1：1)固定，4％Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，蒸馏水漂洗晾干，读片，计数巨噬细胞、吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞数，按下式计算。
吞噬百分比(％)＝(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞数)×100％
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞/巨噬细胞数
(3)实验结果
3.1毛蕊异黄酮衍生物对小鼠免疫细胞的影响结果
表1毛蕊异黄酮衍生物对小鼠免疫细胞的影响(n＝10)
注：(1)上标“a”代表药物组与对照组比较，差异极显著(p<0.01)；
(2)上标“b”代表药物组与对照组比较，差异显著(p<0.05)。
由表1可知毛蕊异黄酮衍生物能够提高小鼠的这些免疫细胞的能力和活性水平；与对照组相比，效果显著(p<0.01或p<0.05)。
3.2毛蕊异黄酮衍生物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响结果
表2毛蕊异黄酮衍生物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(n＝10)
注：(1)上标“a”代表药物组与对照组比较，差异极显著(p<0.01)；
(2)上标“b”代表药物组与对照组比较，差异显著(p<0.05)。
由表2可知毛蕊异黄酮衍生物能够有效提高小鼠的巨噬细胞的吞噬活力；与对照组相比，效果显著(p<0.01或p<0.05)。
(4)实验结论
毛蕊异黄酮衍生物能够有效改善小鼠的体液免疫和细胞免疫水平。