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1、(10)申请公布号 CN 102796733 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796733 A *CN102796733A* (21)申请号 201210303751.1 (22)申请日 2012.08.24 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 四川农业大学 地址 625014 四川省雅安市雨城区新康路 46 号附 1 号 申请人 齐桂年 (72)发明人 齐桂年 陈盛相 李成磊 (54) 发明名称 一种安全快速提取茶树老叶片基因组 DNA 的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种安全快速提取茶树老叶片 基因组 DNA 的方法， 包括以下步骤 ： 。
2、将茶树叶片于 液氮研磨至粉末状， 再加入 800L 预热 DNA 提取 缓冲液， 摇匀后于 65水浴 30min ； 加入 125L 5mol/LKAC， 摇匀后冰浴 20min ； 待反应充分后， 离 心 3min， 将上清液加入吸附柱中并装入收集管， 离心 1min ； 将上述收集管中滤液再次加入吸附柱 中并装入收集管， 离心 1min， 弃废液 ； 向吸附柱加 入 800L 的 70乙醇， 离心 1min， 弃废液 ； 再次 加入 800L 的 70乙醇， 离心 1min， 弃废液 ； 重 新将吸附柱装入收集管中， 离心 3min， 除去剩余 乙醇 ； 取出吸附柱， 于50放置5min 。
3、； 将吸附柱放 入新离心管中， 加入60L TE， 于40放置5min， 离心 3min ； 离心管中液体为提取的茶树基因组 DNA。安全、 快速提取茶树叶片基因组 DNA。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种安全快速提取茶树老叶片基因组 DNA 的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 将茶树叶片于液氮研磨至粉末状， 再加入 800L 预热 DNA 提取缓冲液， 摇匀 后 于 65 水 浴 30min ； 所 。
4、述 DNA 提 取 缓 冲 液 由 1.5 (w/v)SDS(pH 5.5)， 100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)， 40mmol/L EDTA(pH8.0)， 1mol/L NaCl， 2.5 PVP， 10mmol/L - 巯基乙 醇组成 ； 所述茶树叶片为新鲜的茶树老叶片 ； (2) 加入 125L 5mol/LKAC， 摇匀后冰浴 20min ； (3) 待反应充分后， 1.2104r/min 离心 3min， 将上清液加入吸附柱中并装入收集管， 1.2104r/min 离心 1min ； (4) 将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管， 1.2104r/min。
5、 离心 1min， 弃废液 ； (5) 向吸附柱加入 800L 的 70乙醇， 1.2104r/min 离心 1min， 弃废液 ； (6) 再次加入 800L 的 70乙醇， 1.2104r/min 离心 1min， 弃废液 ； (7) 重新将吸附柱装入收集管中， 1.2104r/min 离心 3min， 除去剩余乙醇 ； (8) 取出吸附柱， 于 50放置 5min ； (9) 将吸附柱放入新离心管中， 加入 60L TE， 于 40放置 5min， 1.2104r/min 离心 3min ； 离心管中液体为提取的茶树基因组 DNA。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步。
6、骤 (1) 中， 液氮研磨后迅速加入 DNA 提 取缓冲液。 权 利 要 求 书 CN 102796733 A 2 1/4 页 3 一种安全快速提取茶树老叶片基因组 DNA 的方法 技术领域 0001 本发明涉及的是一种安全快速提取茶树老叶片基因组 DNA 的方法。 背景技术 0002 DNA 分子标记技术是研究茶树起源、 分子演化、 遗传多样性、 品种鉴定的一个重要 工具。而进行这些研究的先决条件是高质量基因组 DNA 的提取。由于茶树叶片富含酚类物 质， 鲜叶中酚类物质含量可达干物质总量的 18 36， 且含有大量的生物碱及其它多种 次生物质， 这就给为 DNA 的提取带来了极大困难， 如。
7、酚类物质可引起 DNA 降解、 变色并影响 后续分析， 残存的多糖能抑制 PCR 反应。 0003 目前常见的茶树基因组 DNA 提取方法有 SDS 法及 CTAB 法， 虽然这些方法可以成功 地从茶树幼叶、 成熟叶片提取基因组 DNA， 但是这些提取方法通常使用有毒试剂氯仿 / 苯酚 去除 DNA 上残留蛋白质及其他污染物， 而且这些方法的操作步骤繁琐， 耗时过长， 通常在 3 小时以上。 另外， 由于茶树不同叶龄间次生代谢产物的异质程度都较高， 导致了上述这些提 取方法往往不能很好地应用于茶树老叶片基因组 DNA 提取， 而且目前现有技术还没有专门 针对茶树老叶片基因组 DNA 提取的方法。
8、的报道。 0004 因此， 我们迫切地需要构建一个安全快速提取茶树老叶片基因组 DNA 的方法。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术存在不适合老叶片、 使用有毒试剂及耗时长的缺 点和不足， 针对茶树老叶富含多酚、 多糖的特点， 提供一种安全快速提取茶树老叶片基因组 DNA 的方法。 0006 本发明的技术方案如下 ： 0007 一种安全快速提取茶树老叶片基因组 DNA 的方法， 包括以下步骤 ： 0008 (1) 将 0.3g 茶树叶片于液氮研磨至粉末状， 再加入 800L 预热 DNA 提取缓冲 液， 摇匀后于 65水浴 30min ； 所述 DNA 提取缓冲液由 1.5 (w。
9、/v)SDS(pH 5.5)， 100mmol/ LTris-HCl(pH8.0)， 40mmol/L EDTA(pH8.0)， 1mol/L NaCl， 2.5PVP， 10mmol/L -巯基乙 醇组成 ； 所述茶树叶片为新鲜的茶树老叶片 ； 0009 (2) 加入 125L 5mol/LKAC， 摇匀后冰浴 20min ； 0010 (3) 待反应充分后， 1.2104r/min 离心 3min， 将上清液加入吸附柱中并装入收集 管， 1.2104r/min 离心 1min ； 0011 (4) 将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管， 1.2104r/min 离心 1min， 。
10、弃废液 ； 0012 (5) 向吸附柱加入 800L 的 70乙醇， 1.2104r/min 离心 1min， 弃废液 ； 0013 (6) 再次加入 800L 的 70乙醇， 1.2104r/min 离心 1min， 弃废液 ； 0014 (7) 重新将吸附柱装入收集管中， 1.2104r/min 离心 3min， 除去剩余乙醇 ； 0015 (8) 取出吸附柱， 于 50放置 5min ； 说 明 书 CN 102796733 A 3 2/4 页 4 0016 (9) 将吸附柱放入新离心管中， 加入 60L TE， 于 40放置 5min， 1.2104r/min 离心 3min ； 离心。
11、管中液体为提取的茶树基因组 DNA。 0017 所述的方法， 步骤 (1) 中， 液氮研磨后迅速加入 DNA 提取缓冲液。 0018 茶树老叶富含次生代谢物质， 如酚类物质可引起 DNA 降解、 变色并影响后续分析， 残存的多糖能抑制 PCR 反应。为了消除这些影响， 采取以下做法 ： 改变 DNA 提取缓冲液组 成， 加入 2.5 PVP、 10mmol/L - 巯基乙醇来防止茶树叶片中的多酚化合物氧化褐变， 加 入1mol/L NaCl来增加提取液中DNA的含量 ； 在裂解后， 加入5mol/L KAC去除大量多糖 ； 采用吸附柱特异结合DNA来纯化所提DNA， 进一步控制了所提DNA溶液。
12、中的多糖含量及防 止酚类物质进入所提 DNA 溶液。因此， 本发明的方法可以从茶树老叶片提取高质量的基因 组 DNA， 满足后续的 PCR 分析。 0019 (1) 本发明可以从新鲜茶树老叶片提取高质量的基因组 DNA。 0020 (2) 与已有的 SDS、 CTAB 法相比， 本发明可以通过特异性结合 DNA 的吸附柱纯化 DNA， 消除有毒有害试剂酚 / 氯仿的使用， 保护操作人员的身体安全。 0021 (3) 与已有的 SDS、 CTAB 法相比， 本发明可以快速提取茶树叶片基因组 DNA， 用时 短， 在 2 小时内可以完成， 而已有方法用时 3 4 小时。 附图说明 0022 图 1。
13、 为采用本发明方法提取茶树老叶片 DNA 的电泳图。 0023 图 2 为采用本发明方法提取茶树老叶片 DNA 的 RAPD 电泳图。 0024 图 3 为采用本发明方法提取的茶树老叶片 DNA 的 ISSR 电泳图。 具体实施方式 0025 以下结合具体实施例， 对本发明进行详细说明。 0026 1 材料与方法 0027 1) 材料 0028 新鲜的茶树老叶片采自种植在四川农业大学、 省级名山良种场内 12 个茶树栽培 品种 ( 系 )， 分别为安吉白茶、 青心乌龙、 古蔺牛皮茶、 乌牛早、 蜀永 307、 南江 4 号、 福鼎大白 茶、 黔湄 502、 龙井 43、 蒙山 11 号、 铁观。
14、音及英红 2 号。 0029 2)DNA 提取方法 0030 取将 0.3g 茶树老叶片， 加液氮没过叶片表面， 研磨至粉末状， 置于 1.5mL 离心管 中， 再立即加入 800L 预热 DNA 提取缓冲液 (DNA 提取缓冲液由 1.5 (W/V)SDS(pH5.5)， 100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)， 40mmol/L EDTA(pH8.0)， 1mol/L NaCl， 2.5 PVP， 10mmol/ L - 巯基乙醇组成 )， 摇匀后于 65水浴 30min ； 加入 125L 5mol/LKAC， 摇匀后冰 浴 20min ； 待反应充分后， 1.2104r/m。
15、in 离心 3min， 将上清液加入吸附柱中并装入收集 管， 1.2104r/min 离心 1min ； 将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管， 1.2104r/min离心1min， 弃废液 ； 向吸附柱加入800L的70(V/V)乙醇， 1.2104r/min 离心1min， 弃废液。 ； 再次加入800L的70(V/V)乙醇， 1.2104r/min离心1min， 弃废液 ； 重新将吸附柱装入收集管中， 12000r/min 离心 3min， 除去剩余乙醇 ； 取出吸附柱， 于 50放 置5min ； 将吸附柱放入1.5mL新离心管中， 加入60L TE， 于40放置5min， 。
16、1.2104r/min 说 明 书 CN 102796733 A 4 3/4 页 5 离心 3min。离心管中液体为提取的茶树老叶片基因组 DNA。 0031 3)DNA 纯度、 得率及电泳分析 0032 测定茶树老叶片DNA在260nm、 280nm的光密度值， 并分别通过A260、 A260/A280来计算 所提 DNA 的纯度及得率。所提取 DNA 在 0.8琼脂糖凝胶上电泳。 0033 4)PCR 扩增及电泳分析 0034 (1)RAPD-PCR 扩增 0035 PCR 反应体系为 25L， 其中包括 2ng/L DNA， 0.2mol/L 引物 ( 引物序列为 ACCGCGAAGG)。
17、， 2Taq PCR MasterMix(TIANGEN)。PCR 扩增程序为 ： 94预变性 5min， 然后 41 个循环 (94变性 50s， 36退火 40s， 72延伸 90s)， 最后 72延伸 7min。 0036 (2)ISSR-PCR 扩增 0037 PCR 反应体系为 25L， 其中包括 10ng DNA， 0.6mol/L 引物 ( 引物序列为 CTCTCTCTCTCTCTCTCTGG)， 2Taq PCR MasterMix(TIANGEN)。PCR 扩增程序为 ： 94预变性 5min， 然后 41 个循环 (94变性 45s， 45退火 1min， 72延伸 1mi。
18、n)， 最后 72延伸 7min。 0038 RAPD 扩增产物、 ISSR 扩增产物在 2.5琼脂糖凝胶上电泳。 0039 2、 结果与分析 0040 1) 茶树老叶片 DNA 纯度及得率 0041 采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA的A260/A280比值在1.611.86之间， 得率 在 34.18g/g 59.98g/g 之间， 表明所提取 DNA 纯度及产量较高， 见表 1。采用本发明 方法提取的茶树老叶片 DNA 的的分子量大小约为 23kb， 条带清晰、 完整， 而且无可见 DNA 降 解或 RNA 污染， 见图 1。 0042 表 1 12 个茶树品种 ( 系 ) 老叶片 D。
19、NA 的得率及纯度 0043 0044 2)PCR 扩增 0045 采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA为模板， 进行RAPD-PCR、 ISSR-PCR扩增， 条 带清晰， 而且 12 个茶树品种 ( 系 ) 呈现多态性差异， 表明该 DNA 完全适用于后续 PCR 分析， 见图 2 及图 3。 说 明 书 CN 102796733 A 5 4/4 页 6 0046 应当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 CN 102796733 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102796733 A 7 。