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1、(10)申请公布号 CN 102676684 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676684 A *CN102676684A* (21)申请号 201210177199.6 (22)申请日 2012.06.01 C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (71)申请人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府 大道 999 号 (72)发明人 魏华 许恒毅 万翠香 杨友均 徐锋 熊勇华 赖卫华 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (54) 发明名称 同时快速检测食品中活的鼠。
2、伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌的方法 (57) 摘要 本发明属于微生物检测领域， 公开了一种同 时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副 伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的方法。 针对鼠伤 寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌 菌设计特异性引物， 采用叠氮溴化丙锭处理处理 取出死菌的干扰， 最终提取 DNA 做多重 PCR 检测。 本方法和经典的细菌分离、 鉴定和血清学分型方 法相比更快速、 准确。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 。
3、1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏 菌的方法， 其特征在于包含下列步骤 ： (1) 取食物样本， 加缓冲液碾磨制成匀浆液， 离心去除加大的食物残渣， 取上清得菌悬 液， 整过程均为无菌操作 ； (2) 取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶溶液， 使叠氮溴化丙啶 PMA 的终质量浓度为 3 g/mL， 混匀后室温避光培养 3-8min， 卤素灯曝光， 光照交联时样品置于冰上， 交联后的悬 浮液离心， 所得沉淀用沸水浴法提取 DNA ； （3） 所得 DNA 进行 mPCR， 体系包含总。
4、共 10l 反应液， 其中， 4 l 制备的模板 DNA 溶 液， 2 l 5buffer， 每条引物的量是15 pmol， 1U Taq DNA聚合酶;反应条件是 ： 95 10 min， 接着 40 个循环 （94 30 s， 50 30 s， 72 1 min） ， 最后 72 延伸 10 min ； （4） mPCR 反应结束后， 进行目的菌检测分析。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 （1） 所述的缓冲液为 PBS 磷酸盐缓冲液。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 （2） 混匀后室温避光培养 5min。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在。
5、于步骤 （3） 所述引物分别为 ： 从 5 -3 为 fliC-F:TGCGCTGAATGAAATCAACAAC fliC-R:TAGAAACCGTACCATTACCGTC Hat-F:ACTCAGGCTTCCCGTAACGC Hat-R:GCTTCATACAGACCATCTTTAGTTG stgA-F:TGCCAGGTTACGCCACAAACC stgA-R:CGCTGTGGTATCAATCGTGC。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 （4） 所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝 胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若有 636 bp 条带， 则说明有鼠伤寒沙门氏菌， 若有 551 。
6、bp 条带， 则说明有乙型副伤寒沙门氏菌， 若有 354 bp 条带， 则说明有伤寒沙门氏菌菌。 权 利 要 求 书 CN 102676684 A 2 1/5 页 3 同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙 门氏菌、 伤寒沙门氏菌的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物检测领域， 尤其涉及一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门 氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的方法。 技术背景 0002 沙门氏菌属是革兰氏阴性、 兼性厌氧的无芽孢菌。 更具目前的分类， 沙门氏菌属只 包含两个种 ： 邦戈尔沙门氏菌和肠道沙门氏菌， 其中后者包含有 2500 多种血清型， 也是感 染人。
7、和动物最多的。在众多的血清型中， 鼠伤寒沙门氏菌是引起人体食源性致病菌中毒和 胃肠炎的一种重要的致病菌， 主要流行在发展中国家， 并且对于免疫缺陷性个体而言， 如果 感染 该致病菌而未及时治疗则有可能致命。伤寒和副伤寒沙门氏菌主要引起人体的伤寒 热和副伤寒热， 尽管它们已不再发达国家流行， 但是在发展中国家， 例如亚洲和非洲北部地 区， 这些致病菌仍然还在引发严重的疾病。据估计， 在全世界， 每年有 22000 万的沙门氏菌 感染， 其中死亡人数为 20 万。在南亚地区约有四分之一的肠热症是有副伤寒沙门氏菌引 起。 沙门氏菌主要感染居住环境拥挤， 食物和饮水不卫生的人群， 其中使用受污染的食物。
8、是 组成沙门氏菌感染的主要途径， 大约有 95% 的感染是有食用受污染的食物引起的。 0003 目前现存的检测该沙门氏菌的方法主要是通过传统的培养方法。 如(杨瑞军, 生 肉食品中致病菌检测结果分析 J 中国卫生检验杂志 .2009:19（9） 2122-2125)， 传统方法 具有劳动强度高、 耗时、 费用高等缺点。因此需要更快速检测 3 种致病菌的方法。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种简单、 快速、 特异性强、 灵敏度高的能同时检测活的鼠 伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的方法。 该方法可用于食品样本中活 的鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门。
9、氏菌菌的初筛检测， 其操作简便、 结果 客观准确， 避免了现有方法操作繁琐、 费时费力、 成本高昂的缺点。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的， 本发明涉及一种叠氮溴化丙锭处理结合多重 PCR 同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙 门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的方法， 包括如下步骤 ： (1) 取食物样本， 加缓冲液碾磨制成匀浆液， 离心去除加大的食物残渣， 取上清得菌悬 液， 整过程均为无菌操作 ； (2) 取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶 （PMA） 溶液 ， 使 PMA 的终质量浓度为 3 g/ mL， 混匀后室温避光培养 3-8min（优选为 5min） ， 卤素灯曝光。
10、， 光照交联时样品置于冰上， 交 联后的悬浮液离心， 所得沉淀用沸水浴法提取 DNA ； （3） 所得 DNA 进行 mPCR， 体系包含总共 10l 反应液， 其中， 4 l 制备的模板 DNA 溶 液， 2 l 5buffer， 每条引物的量是15 pmol， 1U Taq DNA聚合酶;反应条件是 ： 95 10 min， 接着 94 30 s， 50 30 s， 72 1 min 40 个循环， 最后 72 延伸 10 min ； 说 明 书 CN 102676684 A 3 2/5 页 4 （4） mPCR 反应结束后， 进行目的菌检测分析。 0006 步骤 （1） 所述的缓冲液为 。
11、PBS 磷酸盐缓冲液。 0007 步骤 （3） 所述引物分别为 ： 从 5 -3 为 fliC-F:TGCGCTGAATGAAATCAACAAC fliC-R:TAGAAACCGTACCATTACCGTC Hat-F:ACTCAGGCTTCCCGTAACGC Hat-R:GCTTCATACAGACCATCTTTAGTTG stgA-F:TGCCAGGTTACGCCACAAACC stgA-R:CGCTGTGGTATCAATCGTGC 步骤 （4） 所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若有 636 bp 条 带， 则说明有鼠伤寒沙门氏菌， 若有 551 bp 条带， 则。
12、说明有乙型副伤寒沙门氏菌， 若有 354 bp 条带， 则说明有伤寒沙门氏菌菌。 0008 与现有技术相比， 本发明有如下有益效果 ： 1、 能同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌， 速度快， 可以 在 4 小时内得到结果。 0009 2、 只检测具有致病性的活菌， 效率更高。 0010 3、 本发明设计的特异性引物， 采用特定反应条件， 灵敏度高。可同时、 高效地检测 出该 3 种目的菌， 操作简便， 结果判定简单， 降低了检测成本。 附图说明 0011 图 1 多重 PCR 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌 电泳结果。M ： DL10。
13、00 DNA Marker ； 1 ： 多重 PCR 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门 氏菌、 伤寒沙门氏菌菌 ； 2 ： 多重 PCR 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌 ； 4 ： 多 重 PCR 同时检测伤寒沙门氏菌菌、 乙型副伤寒沙门氏菌 ； 5 ： 多重 PCR 单一检测鼠伤寒沙门 氏菌 ； 6 ： 多重 PCR 单一检测乙型副伤寒沙门氏菌 ； 7 ： 多重 PCR 单一检测伤寒沙门氏菌菌。 0012 图 2 PMA 去除死菌的干扰。 （A） PMA 处理组合方式 ；（B） 多重 PCR 检测结果。各组 中鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的浓度。
14、为 106 CFU/mL。 0013 图 3 多重 PCR 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌 的特异性。 0014 图4多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的 最低检测线。 （a） 鼠伤寒沙门氏菌 ( 泳道 1-7， 4.3106 到 4.3101 CFU/ml), （b） 乙型 副伤寒沙门氏菌 ( 泳道 1-7， 3.7106到 3.7101 CFU/ml),（c） 伤寒沙门氏菌菌 ( 泳道 1-7， 7.2106到 7.2101 CFU/ml)。 具体实施方案 0015 下面结合具体实施例， 进一步阐释本发明， 应理解， 这。
15、些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法， 通常按照常规条 件中的条件， 活按照制造厂商的建议条件， 实施例中涉及的菌株均属于现有技术， 本领域的 技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。 说 明 书 CN 102676684 A 4 3/5 页 5 实施例 0016 步骤 1， 食物样本预处理 称取 1 g 的食物样本， 加入 9ml 的 PBS， 碾磨制成匀浆液， 900 g 离心 5 min， 去除加大 的食物残渣， 取上清 （该过程必须无菌操作） 。 0017 步骤 2， PMA 处理 PMA 溶解于二甲亚砜 ( DMSO) 中， 配制成。
16、 0.5 mg/mL 的 PMA 溶液， -20避光保存。取 500 L 制备好的菌悬液置于 1.5 mL 微量离心管中， 加入 3 L 0.5 mg/mL 的 PMA 溶液， 使 PMA 的终质量浓度为 3 g/mL ； PMA 与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养 5 min， 利用500 W的卤素灯曝光5 min， 光照交联时样品置于冰上(避免过热)， 且在距光源20 cm 处， 交联后的悬浮液于 10000 g 离心 5 min， 所得沉淀用于 DNA 的提取。 0018 步骤 3， 基因组 DNA 的提取 经步骤2获得的样品在10000 g， 4 oC条件下离心5 min， 弃上清。
17、， 并小心吸走残余液体， 加入30 l无菌的去离子水100oC煮沸10 min， 待冷却后12000 g， 4 oC条件下离心5 min， 取上清作为 mPCR 反应模板， 制备的模板应立即用于检测。 0019 步骤 4， 选取靶点及设计引物 多重 PCR 之所以难做， 问题的关键是多个靶点扩增条件不兼容。每个靶点都需要两边 的引物同时配合。因此， 本发明分别选取鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门 氏菌菌特异性基因， 采用Oligo7软件设计多重PCR引物， 调整各对引物之间的退火温度， 并 调节引物对之间的扩增配合程度， 使各对引物的退火温度尽量一致， 扩增速度尽量相等。 并 。
18、通过实验来验证多重 PCR 的扩增效果， 选取条件最优的引物对来作为下面检测用引物 （表 1） 。并采用表 2 提供的菌株进行引物特异性验证， 菌株的编号和来源见表 2。 0020 表 2 供试菌株及检测结果 说 明 书 CN 102676684 A 5 4/5 页 6 a JX-CDC, 江西省疾病预防与控制中心， 中国 ；b NCTC, 国家典型菌种保藏中心， 英国 c ATCC, 美国典型菌种保藏中心， 美国 ；d CMCC, 中国药物菌种保藏中心， 中国 步骤 5， mPCR 反应体系及反应参数 本多重 PCR 体系包含总共 10l 反应液， 其中， 4 l 制备的模板 DNA 溶液，。
19、 2 l 5buffer， 每条引物的量是 15 pmol， 1U Taq DNA 聚合酶。反应条件是 ： 95 oC 10 min， 接着 40 个循环 （94 oC 30 s， 50 oC 30 s， 72 oC 1 min） ， 最后 72 oC 延伸 10 min。 0021 步骤 6， mPCR 扩增结果检测 mPCR 反应结束后， 用枪头吸取 5l 反应液， 加到 2% 琼脂糖凝胶的上样孔里， 85 V 电 泳 30 min， 取出凝胶块， 在紫外成像系统中观察电泳条带， 并拍照记录。确定样品中是否有 目的菌的具体标准为 ： 用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果， 若有636 bp条。
20、带， 则说明有鼠 伤寒沙门氏菌， 若有551 bp条带， 则说明有乙型副伤寒沙门氏菌， 若有354 bp条带， 则说明 有伤寒沙门氏菌菌。 说 明 书 CN 102676684 A 6 5/5 页 7 0022 具体的实验结果如下图所示 ： 图 1 多重 PCR 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌电泳 结果。 M ： DL1000 DNA Marker ； 1 ： 多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌 ； 2 ： 多重 PCR 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌 ； 4 ： 多重 PCR 同时检测伤寒沙门氏菌菌、 乙型副。
21、伤寒沙门氏菌 ； 5 ： 多重PCR单一检测鼠伤寒沙门氏菌 ； 6 ： 多重 PCR 单一检测乙型副伤寒沙门氏菌 ； 7 ： 多重 PCR 单一检测伤寒沙门氏菌菌。 0023 图 2 PMA 去除死菌的干扰。 （A） PMA 处理组合方式 ；（B） 多重 PCR 检测结果。各组 中鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的浓度为 106 CFU/mL 图 3 多重 PCR 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的特 异性。 0024 图4多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门氏菌菌的 最低检测线。 （a） 鼠伤寒沙门氏菌 ( 泳。
22、道 1-7， 4.3106 到 4.3101 CFU/ml), （b） 乙型 副伤寒沙门氏菌 ( 泳道 1-7， 3.7106到 3.7101 CFU/ml),（c） 伤寒沙门氏菌菌 ( 泳道 1-7， 7.2106到 7.2101 CFU/ml)。 0025 通过表 2 的供试菌株的测试证明， 实施本发明的检测方法进行检测具有很好的特 异性， 有良好的检测效果。 说 明 书 CN 102676684 A 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 南昌大学 同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、 乙型副伤寒沙门氏菌、 伤寒沙门 氏菌的方法 2012 6 PatentIn versi。
23、on 3.3 1 22 DNA 人工序列 1 tgcgctgaat gaaatcaaca ac 22 2 22 DNA 人工序列 2 tagaaaccgt accattaccg tc 22 3 20 DNA 人工序列 3 actcaggctt cccgtaacgc 20 序 列 表 CN 102676684 A 8 2/2 页 9 4 25 DNA 人工序列 4 gcttcataca gaccatcttt agttg 25 5 21 DNA 人工序列 5 tgccaggtta cgccacaaac c 21 6 20 DNA 人工序列 6 cgctgtggta tcaatcgtgc 20 序 列 表 CN 102676684 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102676684 A 10 2/2 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 102676684 A 11 。