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1、(10)申请公布号 CN 102796682 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796682 A *CN102796682A* (21)申请号 201210276080.4 (22)申请日 2012.08.03 C12N 1/20(2006.01) C07K 1/13(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院放 射与辐射医学研究所 地址 北京市海淀区太平路 27 号 (72)发明人 徐平 平灵艳 杨大福 常蕾 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一。
2、种利用 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组的方 法及其专用培养基 (57) 摘要 本发明公开了一种利用 SILAC 标记大肠杆 菌蛋白质组的方法及其专用培养基。本发明提 供一种 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基， 包括无 机盐、 组氨酸盐酸盐、 异亮氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 丝氨酸、 重稳定性同位素标记 赖氨酸、 精氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸、 蛋氨酸、 腺嘌呤 硫酸盐、 尿嘧啶、 盐酸噻胺和葡萄糖 ； 所述无机盐 为 Na2HPO412H2O、 KH2PO4、 NaCl、 MgSO4、 NH4Cl 和 CaCl2。本发明的实验证明， 本发明开发的一种 SILAC 标记大。
3、肠杆菌专用培养基， 为标记大肠杆 菌蛋白质组、 定量内标的制备和高精度地定量蛋 白质组研究创造了条件。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一种 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基， 包括无机盐、 组氨酸盐酸盐、 异亮氨酸、 缬氨 酸、 亮氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 丝氨酸、 重稳定性同位素标记赖氨酸、 精氨酸、 苏氨酸、 酪氨 酸、 蛋氨酸、 腺嘌呤硫酸盐、 尿嘧啶、 盐酸噻胺和葡萄糖 ； 所述无机盐为 Na2HPO412。
4、H2O、 KH2PO4、 NaCl、 MgSO4、 NH4Cl 和 CaCl2。 2. 根据权利要求 1 所述的培养基， 其特征在于 ： 所述组氨酸盐酸盐为 L- 组氨酸盐酸盐 ； 所述异亮氨酸为 L- 异亮氨酸 ； 所述缬氨酸为 L- 缬氨酸 ； 所述亮氨酸为 L- 亮氨酸 ； 所述苯丙氨酸为 L- 苯丙氨酸 ； 所述色氨酸为 L- 色 氨酸 ； 所述丝氨酸为 L- 丝氨酸 ； 所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定性同位素标记 L-赖氨酸 ； 所述精氨酸为L-精氨酸 ； 所述苏氨酸为L-苏氨酸 ； 所述酪氨酸为L-酪氨酸 ； 所 述蛋氨酸为 L- 蛋氨酸。 3. 根据权利要求 2 所述的培养。
5、基， 其特征在于 ： 所述 Na2HPO4 12H2O、 所述KH2PO4、 所述NaCl、 所述MgSO4、 所述NH4Cl、 所述CaCl2、 所述盐 酸噻胺、 所述葡萄糖、 所述 L- 组氨酸盐酸盐、 所述 L- 异亮氨酸、 所述 L- 缬氨酸、 所述 L- 亮 氨酸、 所述 L- 苯丙氨酸、 所述 L- 色氨酸、 所述 L- 丝氨酸、 所述重稳定性同位素标记 L- 赖 氨酸、 所述 L- 精氨酸、 所述 L- 苏氨酸、 所述 L- 酪氨酸、 所述 L- 蛋氨酸、 所述腺嘌呤硫酸盐 和所述尿嘧啶的质量比为 17100 ： 3000 ： 580 ： 120 ： 1000 ： 11 ： 1 。
6、： 10000 ： 20 ： 30 ： 150 ： 30 ： 50 ： 20 ： 400 ： 30 ： 100 ： 200 ： 30 ： 20 ： 20 ： 20。 4.根据权利要求2或3所述的培养基， 其特征在于 ： 所述培养基还包括水 ； 所述培养基 由所述 Na2HPO412H2O、 所述 KH2PO4、 所述 NaCl、 所述 MgSO4、 所述 NH4Cl、 所述 CaCl2、 所述盐 酸噻胺、 所述葡萄糖、 所述 L- 组氨酸盐酸盐、 所述 L- 异亮氨酸、 所述 L- 缬氨酸、 所述 L- 亮 氨酸、 所述 L- 苯丙氨酸、 所述 L- 色氨酸、 所述 L- 丝氨酸、 所述重稳定。
7、性同位素标记 L- 赖氨 酸、 所述 L- 精氨酸、 所述 L- 苏氨酸、 所述 L- 酪氨酸、 所述 L- 蛋氨酸、 所述腺嘌呤硫酸盐、 所 述尿嘧啶和水组成。 5. 根据权利要求 2-4 中任一所述的培养基， 其特征在于 ： 所述 Na2HPO412H2O 在所述培养基中的终浓度为 17100mg/L ； 所述 KH2PO4在所述培养基中的终浓度为 3000mg/L ； 所述 NaCl 在所述培养基中的终浓度为 580mg/L ； 所述 MgSO4在所述培养基中的终浓度为 120mg/L ； 所述 NH4Cl 在所述培养基中的终浓度为 1000mg/L ； 所述 CaCl2在所述培养基中的。
8、终浓度为 11mg/L ； 所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为 10000mg/L ； 所述盐酸噻胺在所述培养基中的终浓度为 1mg/L ； 所述 L- 组氨酸盐酸盐在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 所述 L- 异亮氨酸在所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 所述 L- 缬氨酸在所述培养基中的终浓度为 150mg/L ； 所述 L- 亮氨酸在所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 所述 L- 苯丙氨酸在所述培养基中的终浓度为 50mg/L ； 所述 L- 色氨酸在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 所述 L- 丝氨酸在所述培养基中的终浓度为 400mg/L ； 权 利 要。
9、 求 书 CN 102796682 A 2 2/2 页 3 所述重稳定性同位素标记 L- 赖氨酸在所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 所述 L- 精氨酸在所述培养基中的终浓度为 100mg/L ； 所述 L- 苏氨酸在所述培养基中的终浓度为 200mg/L ； 所述 L- 酪氨酸在所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 所述 L- 蛋氨酸在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 所述腺嘌呤硫酸盐在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 所述尿嘧啶在所述培养基中的终浓度为 20mg/L。 6. 根据权利要求 1-5 中任一所述的培养基， 其特征在于 ： 所述重稳定性同位素标记 L- 。
10、赖氨酸为 L-lysine-13C6或 L-lysine-13C615N2。 7. 一种制备权利要求 2-6 中任一所述的专用培养基的方法， 包括如下步骤 ： 按照所述 终浓度将所述 Na2HPO412H2O、 所述 KH2PO4、 所述 NaCl、 所述 MgSO4、 所述 NH4Cl、 所述 CaCl2、 所述 L- 组氨酸盐酸盐、 所述 L- 异亮氨酸、 所述 L- 缬氨酸、 所述 L- 亮氨酸、 所述 L- 苯丙氨 酸、 所述 L- 色氨酸、 所述 L- 丝氨酸、 所述重稳定性同位素标记 L- 赖氨酸、 所述 L- 精氨酸、 所述 L- 苏氨酸、 所述 L- 酪氨酸、 所述 L- 蛋氨。
11、酸、 所述腺嘌呤硫酸盐、 所述尿嘧啶、 所述盐酸 噻胺、 所述葡萄糖和水混合， 得到培养基。 8. 权利要求 1-6 所述的专用培养基在 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组中的应用。 9. 一种 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组的方法， 为将大肠杆菌在权利要求 1-6 所述的专 用培养基中培养， 实现 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组。 10. 根据权利要求 9 所述的方法， 其特征在于 ： 所述培养的方式为 37培养 7-12 代。 权 利 要 求 书 CN 102796682 A 3 1/7 页 4 一种利用 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培 养基 技术领域 0001 本发明。
12、涉及生物技术领域， 尤其涉及一种利用 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组的方 法及其专用培养基。 背景技术 0002 大肠杆菌是大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) 的简称， 因 1885 年被 Theodor Escherich 发现而得名。大肠杆菌属细菌界 (Bacteria)、 变形菌门 (Proteobacteria)、 - 变 形 菌 纲 (Gammaproteobacteria)、 肠 杆 菌 目 (Enterobacteriales)、 肠 杆 菌 科 (Enterobacteriaceae)、 埃 希 氏 菌 属 (Escherichia) 的 大 肠 埃 希 氏 。
13、菌 (Escherichia coli)， 是革兰氏阴性短杆菌， 大小 0.51 3 微米， 周身鞭毛， 能运动， 无芽孢。 0003 大肠杆菌在自然界广泛分布， 也是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种 细菌， 主要寄生在大肠内， 大多数不致病， 与人终身相伴。其代谢活动能抑制肠道内分解蛋 白质的微生物生长， 减少蛋白质分解产物对人体的危害， 还能合成维生素 B 和 K， 并产生有 杀菌作用的大肠杆菌素， 惠及其寄生的宿主。 0004 由于菌体繁殖迅速， 易培养， 价廉， 易变异且易被检出等诸多优点， 大肠杆菌已经 成为现代生物学中研究最多的一种模式生物。由于其结构简单， 大肠杆菌被广泛。
14、用于生物 化学、 遗传学、 分子生物学和代谢途径的研究， 以揭示生命的奥秘。大肠杆菌对于分子遗传 学的建立和发展以及生物工程的兴起均发挥了重要作用。 Cohen和Boyer于1973年在大肠 杆菌中创造了重组 DNA 技术， 开创了基因工程研究的先河， 使得该菌成为代谢途径和生物 机制研究最透彻的微生物之一。 0005 由于遗传背景清楚、 载体和受体系统完备、 技术操作简单、 生长迅速、 培养简单、 重 组子稳定和大规模发酵便宜等优点， 使得大肠杆菌成为基因工程研究中最主要的原核受体 菌， 广泛应用于外源 DNA 的克隆和扩增、 原核基因高效表达和基因文库构建等基础研究。用 大肠杆菌生产的人生。
15、长激素、 生长激素释放抑制因子、 胰岛素等均已经取得了成功， 并成功 地实现了产业化， 创造了巨大的产业价值。 0006 尽管大肠杆菌具有诸多优点， 但也给人类带来了诸多麻烦， 如果控制不当， 还可能 引起突发事件。 作为条件致病菌， 在肠道中的大肠杆菌一旦离开肠道进入胆囊、 尿道、 膀胱、 阑尾等， 可引起炎症反应。 当细菌由于如溃疡等因素导致的穿孔而进入腹腔时， 通常会导致 致命性的腹膜炎症感染。大肠杆菌的某些菌株本身还具有毒性 （其中一些类似导致痢疾的 毒素） ， 可以导致食物中毒， 使得细胞脱水引起腹泻等， 并可引发群体的急性感染， 如1996年 5-8月份日本的O157 ： H7大肠。
16、杆菌引起的疫情， 波及9000多人。 不仅如此， 由于许多大肠杆 菌可在菌体死亡溶解后产生内毒素， 对机体产生强烈的毒性， 可引起宿主发热、 毒血症、 败 血症、 心包炎、 肝周炎、 气囊炎、 输卵管炎、 肾炎等严重疾患， 甚至休克死亡， 使得大肠杆菌所 致疾病的治疗更为复杂。而抗药性基因的衍变以及在菌株间的广泛传播， 使得耐药菌泛滥 成灾， 难治愈， 死亡率高并且极易复发， 这已经成为人类临床治疗的重大难题和养禽业的重 说 明 书 CN 102796682 A 4 2/7 页 5 大威胁， 困扰和阻滞了养殖业的发展。因此， 耐药基因及其质粒在大肠杆菌菌株间的转殖、 衍变和耐药菌的产生、 发展。
17、的系统生物学探索也同样具有重要的生物医学研究价值。 0007 蛋白质是基因功能的直接执行者， 且相互关联， 共同执行细胞复杂的生命活动过 程。蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质， 并研究其功能的新兴学科。大肠杆菌的 蛋白质组学研究， 特别是定量蛋白质组学研究可以发现、 鉴别基因差异和生物学处理的效 应， 揭示其分子调控网络及其分子机制。 但由于技术的限制， 早期大肠杆菌组学水平的蛋白 质鉴定主要依靠双向凝胶电泳， 难于分清所有的蛋白质及其量的变化。近来， 基于液相色 谱 - 质谱联用技术为简单蛋白质组的高覆盖奠定了技术基础。由于质谱本身并不是好的定 量工具， 定量蛋白质组学研究需要定量标准。
18、。目前基于细胞培养过程中的重稳定性同位素 标记氨基酸的整体蛋白质组标记技术 （stable isotope labeling by amino acid in cell culture， SILAC） 已经成为定量蛋白质组学研究的金标准。 0008 Krijgsveld 等在进行 15N 标记的线虫定量蛋白质组学研究时利用15N 标记的铵盐 作为唯一氮源培养大肠杆菌， 这种培养基不但价格昂贵， 难以达到高水平标记， 并且对数据 处理要求较高。丁琛等利用哺乳动物细胞的 SILAC 培养基培养大肠杆菌， 用于制备目标导 向蛋白质组学研究用的重稳定性同位素标记肽段。 但这种标记方法使用哺乳动物细胞的。
19、培 养基， 完全改变了普通的大肠杆菌培养基组成和特性， 无法研究大肠杆菌的正常发酵条件， 且价格昂贵。 Carroll等利用M9盐基础培养基制备目标导向蛋白质组学研究用的重稳定性 同位素标记肽段， 尽管也获得了单个目的蛋白的较高的标记效率， 但生长缓慢， 也没有对标 记过程进行有效监测， 难于应用于定量蛋白质组学研究。 由于缺乏有效的标记方法， 至今还 没有大肠杆菌高效 SILAC 培养基的问世和大规模定量蛋白质组学研究论文的发表， 阻碍了 大肠杆菌定量蛋白质组学研究的进展及其在发酵产业、 基础医学研究中作用的发挥。 发明内容 0009 本发明的一个目的是提供一种 SILAC 标记大肠杆菌专用。
20、培养基。 0010 本发明提供的专用培养基， 包括无机盐、 组氨酸盐酸盐、 异亮氨酸、 缬氨酸、 亮氨 酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 丝氨酸、 重稳定性同位素标记赖氨酸、 精氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸、 蛋氨 酸、 腺嘌呤硫酸盐、 尿嘧啶、 盐酸噻胺和葡萄糖 ； 0011 所述无机盐为 Na2HPO412H2O、 KH2PO4、 NaCl、 MgSO4、 NH4Cl 和 CaCl2。 0012 上述培养基中， 所述组氨酸盐酸盐为L-组氨酸盐酸盐 ； 所述异亮氨酸为L-异亮氨 酸 ； 所述缬氨酸为 L- 缬氨酸 ； 所述亮氨酸为 L- 亮氨酸 ； 所述苯丙氨酸为 L- 苯丙氨酸 ； 所述 色氨酸为 。
21、L- 色氨酸 ； 所述丝氨酸为 L- 丝氨酸 ； 所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定 性同位素标记 L- 赖氨酸 ； 所述精氨酸为 L- 精氨酸 ； 所述苏氨酸为 L- 苏氨酸 ； 所述酪氨酸 为 L- 酪氨酸 ； 所述蛋氨酸为 L- 蛋氨酸。 0013 上述培养基中， 所述 Na2HPO412H2O、 所述 KH2PO4、 所述 NaCl、 所述 MgSO4、 所述 NH4Cl、 所述 CaCl2、 所述盐酸噻胺、 所述葡萄糖、 所述 L- 组氨酸盐酸盐、 所述 L- 异亮氨酸、 所 述 L- 缬氨酸、 所述 L- 亮氨酸、 所述 L- 苯丙氨酸、 所述 L- 色氨酸、 所述 L- 丝氨酸。
22、、 所述重 稳定性同位素标记 L- 赖氨酸、 所述 L- 精氨酸、 所述 L- 苏氨酸、 所述 L- 酪氨酸、 所述 L- 蛋 氨酸、 所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为 17100 ： 3000 ： 580 ： 120 ： 1000 ： 11 ： 1 ： 10000 ： 20 ： 30 ： 150 ： 30 ： 50 ： 20 ： 400 ： 30 ： 100 ： 200 ： 30 ： 20 ： 20 ： 20。 说 明 书 CN 102796682 A 5 3/7 页 6 0014 上述培养基还包括水 ； 所述培养基由所述 Na2HPO412H2O、 所述 KH2PO4、 所述 NaC。
23、l、 所述MgSO4、 所述NH4Cl、 所述CaCl2、 所述盐酸噻胺、 所述葡萄糖、 所述L-组氨酸盐酸盐、 所述 L- 异亮氨酸、 所述 L- 缬氨酸、 所述 L- 亮氨酸、 所述 L- 苯丙氨酸、 所述 L- 色氨酸、 所述 L- 丝 氨酸、 所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、 所述L-精氨酸、 所述L-苏氨酸、 所述L-酪氨酸、 所述 L- 蛋氨酸、 所述腺嘌呤硫酸盐、 所述尿嘧啶和水组成。 0015 上述培养基中， 所述 Na2HPO412H2O 在所述培养基中的终浓度为 17100mg/L ； 0016 所述 KH2PO4在所述培养基中的终浓度为 3000mg/L ； 0017 。
24、所述 NaCl 在所述培养基中的终浓度为 580mg/L ； 0018 所述 MgSO4在所述培养基中的终浓度为 120mg/L ； 0019 所述 NH4Cl 在所述培养基中的终浓度为 1000mg/L ； 0020 所述 CaCl2在所述培养基中的终浓度为 11mg/L ； 0021 所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为 10000mg/L ； 0022 所述盐酸噻胺在所述培养基中的终浓度为 1mg/L ； 0023 所述 L- 组氨酸盐酸盐在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 0024 所述 L- 异亮氨酸在所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 0025 所述 L- 缬氨酸在所述。
25、培养基中的终浓度为 150mg/L ； 0026 所述 L- 亮氨酸在所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 0027 所述 L- 苯丙氨酸在所述培养基中的终浓度为 50mg/L ； 0028 所述 L- 色氨酸在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 0029 所述 L- 丝氨酸在所述培养基中的终浓度为 400mg/L ； 0030 所述重稳定性同位素标记 L- 赖氨酸在所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 0031 所述 L- 精氨酸在所述培养基中的终浓度为 100mg/L ； 0032 所述 L- 苏氨酸在所述培养基中的终浓度为 200mg/L ； 0033 所述 L- 酪氨酸在。
26、所述培养基中的终浓度为 30mg/L ； 0034 所述 L- 蛋氨酸在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 0035 所述腺嘌呤硫酸盐在所述培养基中的终浓度为 20mg/L ； 0036 所述尿嘧啶在所述培养基中的终浓度为 20mg/L。 0037 上 述 培 养 基 中， 所 述 重 稳 定 性 同 位 素 标 记 L- 赖 氨 酸 为 L-lysine-13C6或 L-lysine-13C615N2。 0038 本发明的另一个目的是提供一种制备上述的专用培养基的方法， 包括如下步骤 ： 按照所述终浓度将所述Na2HPO4 12H2O、 所述KH2PO4、 所述NaCl、 所述MgSO。
27、4、 所述NH4Cl、 所述 CaCl2、 所述L-组氨酸盐酸盐、 所述L-异亮氨酸、 所述L-缬氨酸、 所述L-亮氨酸、 所述L-苯 丙氨酸、 所述 L- 色氨酸、 所述 L- 丝氨酸、 所述重稳定性同位素标记 L- 赖氨酸、 所述 L- 精氨 酸、 所述 L- 苏氨酸、 所述 L- 酪氨酸、 所述 L- 蛋氨酸、 所述腺嘌呤硫酸盐、 所述尿嘧啶、 所述 盐酸噻胺、 所述葡萄糖和水混合， 得到培养基。 0039 上述的培养基在 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组中的应用也是本发明保护的范围。 0040 本发明的第三个目的是提供一种 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组的方法。 0041 本发明提供。
28、的方法， 为将大肠杆菌在上述的培养基中培养， 实现 SILAC 标记大肠 杆菌蛋白质组。 说 明 书 CN 102796682 A 6 4/7 页 7 0042 上述方法中， 所述培养的方式为 37培养 7-12 代。 0043 本发明的实验证明， 本发明开发的一种 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基， 可以专 门用于 SILAC 标记大肠杆菌蛋白质组， 不仅省却了营养缺陷型构筑的繁琐步骤和遗传条件 限制， 而且可以实现快速、 高效地标记， 为定量内标的制备和高效精确地定量蛋白质组研究 创造了条件。 附图说明 0044 图 1 为 SILAC 标记的大肠杆菌蛋白的色谱 - 质谱联用结果图 00。
29、45 图 2 为 SILAC 标记的大肠杆菌蛋白的标记效率测试结果图 具体实施方式 0046 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0047 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0048 本发明可以通过以下实例更容易地理解， 但本发明并不仅限于这些实例。 0049 实施例 1、 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基 0050 表 1 为 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基组分 说 明 书 CN 102796682 A 7 5/7 页 8 0051 0052 备注 ： 无机试剂为普通分析纯国产试剂， 轻标氨基酸均购自美国 Amresco 。
30、公司， L-lysine-13C6购自美国 CIL 公司， 货号 ： CNLM-291-0.25。 0053 按照上述组分及其终浓度， 用超纯水配置， 得到 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基。 无机盐及葡萄糖采用高压灭菌的方式， 氨基酸及维生素采用过滤除菌的方式。 0054 实施例 2、 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基的应用 说 明 书 CN 102796682 A 8 6/7 页 9 0055 一、 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基标记大肠杆菌 0056 1、 SILAC 标记 0057 实验室常用的基因工程改造的大肠杆菌， 如E.coli BL21(DE3)等均可用本发明的 培养条。
31、件进行培养。 0058 挑取新鲜的大肠杆菌 E.coli BL21(DE3) 菌落， 接种到普通的含有 50g/ml 氨卞 青霉素的 LB 液体培养基， 220 转 / 分钟转速下 37培养 10 小时， 10000g 离心 3 分钟收集 菌体， 用无菌水清洗 2 遍， 再按照 OD600初始值为 0.00037（1.5/212=0.00037） 的密度接种于 由实施例 1 制备的 SILAC 标记大肠杆菌专用培养基中， 37培养 12 代至 OD 值约为 1.5 时， 17000g 离心 5 分钟， 收集菌体， 得到 SILAC 标记 E.coli BL21(DE3) 菌体。 0059 2、。
32、 检测 0060 1） 总蛋白的提取 0061 以10mM pH 8.0的Tris缓冲液、 0.1M的NaH2PO4、 8M尿素、 0.02%SDS和10mM -巯 基乙醇作为蛋白提取液， 用玻璃珠 （Biospec Products Inc.,Bartlesville） 震荡破壁法裂 解 SILAC 标记 E.coli BL21(DE3) 菌体。菌体 - 玻璃珠混合液在旋涡混合仪上最高速震荡 1 分钟， 在冰上冷却 1 分钟， 共 14 次得到裂解产物， 再将裂解产物在 17000g 的条件下离心 5 分钟， 收集上清得到总蛋白。用常用的 Bradford 法定量后用于蛋白酶消化。 0062。
33、 2） 消化 0063 取 5g 总蛋白经终浓度 5mM 的 DTT 处理 30 分钟后， 用终浓度 20mM 的碘乙酰胺避 光25下处理30分钟， 再加入尿素至终浓度为8M变性30分钟， 用50MmNH4HCO3稀释尿素至 4M 浓度， 用 10ng/l 的赖氨酸蛋白酶 C（Lys-C ： 日本 Wako 公司 , 货号 ： 125-05061） 37 消化 14 小时， 得到肽段。 0064 3） 色谱 - 质谱联用分析 0065 将上述所得的肽段以 C18 柱脱盐 (3M,St.Paul,MN)， 以 10l 的 5% 乙腈和 1% 甲酸的色谱 - 质谱联用上样缓冲液进行溶解， 取 2l。
34、 进行色谱 - 质谱联用分析， 具体 参 照 文 献 Xu,P.;Duong,D.;Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50中记载的 方法。 0066 随机选取半胱氨酸合成酶 A 肽段 IQGIGAGFIPANLDLK 结果如图 1 （标记曲线的图说 明的总体肽段的标记水平） 所示， 利用本发明开发的 SILAC 培养基对大肠杆菌进行 12 代培 养， 大肠杆菌的蛋白可以达到完全标记， 所有肽段。
35、从开始时的全部为轻标赖氨酸的形式变 为只有重稳定性同位素标记赖氨酸的形式。表明本申请开发的 SILAC 培养基培养 12 代后 可以实现大肠杆菌蛋白质组的完全标记。 0067 二、 SILAC 标记大肠杆菌的标记效率测定 0068 按照上述第一部分中 1 的方法标记 E.coli BL21(DE3)， 并分别在 1 代、 2 代、 3 代、 7 代和 12 代取样， 按照上述第一部分中 2 的方法进行提取总细胞蛋白、 测定标记效率 （为重 标氨基酸替换轻标氨基酸的比例） 。对每个样品的定量结果进行轻重标定量值的对数的分 布分析。实验重复三次， 结果取平均值。 0069 结果表明如图2和表1所示， 1代时标记效率为48.27%， 2代时为73.88%， 3代时为 84.98%， 7 代时为 98.46%， 12 代时为 99.49%。表明本申请开发的 SILAC 培养基培养 7 代后 说 明 书 CN 102796682 A 9 7/7 页 10 已经接近完全标记， 12 代后可以实现大肠杆菌蛋白质组的完全标记。 0070 表 1 为大肠杆菌标记效率 0071 0072 # 标记效率 = 标记后的重标信号 / 总信号。 说 明 书 CN 102796682 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796682 A 11 。