技术领域
本发明涉及生产包含具有卷曲螺旋结构的丝蛋白如蜜蜂丝蛋白的丝纺丝液的 方法。所述丝纺丝液能够用于多种目的如个人护理用品、塑料、纺织物和生物医 学产品的生产。
背景技术
丝是由种类繁多的昆虫和蜘蛛物种生产的蛋白纤维。家蚕（Bombyxmori）的 丝作为缝合生物材料已被使用数百年。为了在转基因系统中克隆和表达蚕或蜘蛛 的丝的许多努力已经发现这是非常艰巨的任务（海格力斯任务，Herculeantask）。 这些丝基因的大尺寸和高度重复性序列使得它们顽抗在专门的丝腺以外表达，并 且导致低蛋白质产率。
尽管蚕茧和蛛网是最为人所熟知的丝，但是其他物种可以生产更适于转基因 生产的丝。意大利蜜蜂（Apismellifera）幼虫纺出丝茧，它们在其中孵化成蛹。蜜 蜂丝由四个小的（每一个~30kDa）和非重复性的纤维基因编码（Sutherland等人， 2006）。四个基因的同源组也已经在大黄蜂、斗牛犬蚁、黄猄蚁、川军蜂和亚细亚 蜜蜂中被发现（Sutherland等人，2007；Sezutsu等人，2007；Shi等人，2008； WO2007/038837）。
老式的X射线纤维衍射研究证明蜜蜂丝含有排列成卷曲螺旋构象的α-螺旋蛋 白，最可能为四聚卷曲螺旋结构（Atkins，1967），具有可能对应于四种不同的丝 蛋白的四条链。生物信息学技术预测所述蜜蜂丝蛋白序列的每一种均含有60-68% 的卷曲螺旋（Sutherland等人，2006）。
丝线能够从蜜蜂幼虫的所述丝腺中被拉伸出来。这些线与蚕丝纤维相比强度 较弱但是延展性和韧性较好（Hepburn等人，1979）。
Shi等人（2008）最近报道了亚细亚蜜蜂（Apiscerana）丝的重组生产。四种 亚细亚蜜蜂丝蛋白在大肠杆菌中被表达成可溶的形式，具有每升酵素10-60mg的 产率。使用多种实验技术来描述低浓度下（0.03至0.2重量%）所述蛋白质的结构 和相互作用的特征。这些确凿地证明既非单独的蛋白质亦非四种蛋白质的混合在 溶液中具有紧密的三级包装。所述蛋白质作为单体或疏松的关联二聚体存在并且 具有几乎不含α-螺旋结构的高度随机的螺旋构象。
需要有更深入的方法用于由能够用于制造种类繁多的产品的重组表达的卷曲 螺旋丝蛋白来生产丝纺丝液。
发明内容
本发明人惊奇地发现表面活性剂和离子液体能够用在生产包含卷曲螺旋丝蛋 白的丝纺丝液的方法中。
在第一方面中，本发明提供了用于生产丝纺丝液的方法，所述方法包含
i）裂解生产一种或多种丝蛋白的细胞，
ii）通过采用表面活性剂或离子液体接触它们使所述丝蛋白溶解，和
iii）浓缩所述丝蛋白来生产丝纺丝液，
其中所述一种或多种丝蛋白能够形成包含卷曲螺旋结构的三级结构。
在一个实施方案中，所述丝蛋白被浓缩，通过
a）通过加入沉淀所述表面活性剂的化合物来减少溶液中所述表面活性剂的 量，和
b）从在步骤a）中形成的所述沉淀中分离包含所述丝蛋白的溶液以生产所述 丝纺丝液。
能够用于沉淀表面活性剂的化合物是本领域已知的并且包括盐或碳水化合 物；或其两种或多种的组合。优选地，所述盐是钾盐或钠盐。在一个实施方案中， 所述碳水化合物是α-环糊精。
在另一个实施方案中，所述丝蛋白通过过滤被浓缩，更优选膜过滤，并且甚 至更优选正切流动过滤。
在一个实施方案中，所述方法进一步包含增加所述丝纺丝液中丝蛋白的浓度。 这通过本领域已知的任何方法能够被实现。例如，所述丝纺丝液对抗脱水溶液被 滤膜分析，如包含吸湿性聚合物的溶液。吸湿性聚合物的实例包括，但不限于， 聚乙二醇、淀粉酶和丝胶，或其两种或多种的组合。
在一个优选的实施方案中，所述丝纺丝液包含至少大约0.5%w/v的丝蛋白。 在另一个实施方案中，所述丝纺丝液包含大约0.5%至大约15%的丝蛋白。
所述细胞能够是任何细胞类型，典型地是包含编码所述丝蛋白的外源性多聚 核苷酸，并且能够生产所述丝蛋白的重组细胞。实例包括，但不限于，细菌细胞、 酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，或其两种或多种的组合。在一个优 选的实施方案中，所述细胞是细菌细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述细 菌细胞是大肠杆菌。
在一个优选的实施方案中，步骤i）进一步包含从已裂解的细胞中分离包涵体。
所述方法还可以包含在步骤i）之前培养所述细胞。
在一个优选的实施方案中，所述丝蛋白能够形成包含卷曲螺旋结构的三级结 构的部分包含七肽序列abcdefg的至少10个拷贝，并且其中处于位置a和d上的 至少25%的氨基酸是丙氨酸残基。更优选地，处于位置a、d和e上的至少25%的 氨基酸是丙氨酸残基。
在另一个优选的实施方案中，所述丝蛋白包含如下序列，更优选基本上由如 下序列组成，甚至更优选由如下序列组成，所述序列选自：
a）如SEQIDNO1至8、17至24、33至40、49至56、65至72、81至88、 97至98中任一个所提供的氨基酸系列，
b）与SEQIDNO1至8、17至24、33至40、49至56、65至72、81至88、 97至98中任一个或多个至少30%相同的氨基酸系列，和
c）a）或b）的生物学活性片段。
在以上方面，优选丝蛋白尽可能少地从细胞分泌。相应地，优选丝蛋白不包含 N末端信号系列。对于以上方面特别有用的丝蛋白的例子包括但不局限于，包含 如下序列、更优选基本上由如下序列组成、甚至更优选由如下序列组成的丝蛋白， 所述序列选自：
a）如SEQIDNO1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、 53、55、65、67、69、71、81、83、85、87或97中任何一个所提供的氨基酸序列，
b）与SEQIDNO1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、 53、55、65、67、69、71、81、83、85、87或97中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列，和
c）a）或b）的生物学活性片段。
在一个实施方案中，所述丝蛋白能够是许多相同的丝蛋白或是两种或多种不 同的丝蛋白的组合。在一个优选的实施方案中，如果使用不同的丝蛋白，那么就 是四种不同的丝蛋白。
在另一个实施方案中，所述丝蛋白包含第一丝蛋白，所述第一丝蛋白包含， 更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组成，
a）如SEQIDNO1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81或82中任何 一个所提供的氨基酸序列；
b）与SEQIDNO1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81或82中任何 一个或多个至少30%相同的氨基酸序列；和
c）a）或b）的生物学活性片段，
第二丝蛋白，所述第二丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组 成，
d）如SEQIDNO3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83或84中任何 一个所提供的氨基酸序列；
e）与SEQIDNO3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83或84中任何 一个或多个至少30%相同的氨基酸序列；和
f）c）或d）的生物学活性片段，
第三丝蛋白，所述第三丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组 成，
g）如SEQIDNO5、6、21、22、37、38、53、54、69、70、85或86中任何 一个所提供的氨基酸序列；
h）与SEQIDNO5、6、21、22、37、38、53、54、69、70、85或86中任何 一个或多个至少30%相同的氨基酸序列；和
i）g）或h）的生物学活性片段，和/或
第四丝蛋白，所述第四丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组 成，
j）如SEQIDNO7、8、23、24、39、40、55、56、71、72、87或88中任何 一个所提供的氨基酸序列；
k）与SEQIDNO7、8、23、24、39、40、55、56、71、72、87或88中任何 一个或多个至少30%相同的氨基酸序列；和
l）j）或k）的生物学活性片段。更优选地，关于以上方面，所述丝蛋白包含 第一丝蛋白、第二丝蛋白、第三丝蛋白和第四丝蛋白，或基本上由其组成，所述 第一丝蛋白包含，更优选地基本上由其组成，甚至更优选地由其组成，
a）如SEQIDNO1、17、33、49、65或81中任何一个所提供的氨基酸序列；
b）与SEQIDNO1、17、33、49、65或81中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
c）a）或b）的生物学活性片段，
第二丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组成，
d）如SEQIDNO3、19、35、51、67或83中任何一个所提供的氨基酸序列；
e）与SEQIDNO3、19、35、51、67或83中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
f）d）或e）的生物学活性片段，
第三丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组成，
g）如SEQIDNO5、21、37、53、69或85中任何一个所提供的氨基酸序列；
h）与SEQIDNO5、21、37、53、69或85中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
i）g）或h）的生物学活性片段，和/或
第四丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组成，
j）如SEQIDNO7、23、39、55、71或87中任何一个所提供的氨基酸序列；
k）与SEQIDNO7、23、39、55、71或87中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
l）j）或k）的生物学活性片段。
在一个实施方案中，所述第一丝蛋白、第二丝蛋白、第三丝蛋白和/或第四丝 蛋白由相同的细胞生产。
在一个可供选择的实施方案中，所述第一丝蛋白、第二丝蛋白、第三丝蛋白 和/或第四丝蛋白由不同的细胞生产。在该实施方案中，优选步骤ii）包含大约等 摩尔量的所述第一丝蛋白、所述第二丝蛋白、所述第三丝蛋白和所述第四丝蛋白。
在直至步骤iii）为止并且不包括步骤iii）的任何时候，根据本发明加工的所 述丝蛋白可以被独立地制备和组合。所述单独制备的丝蛋白能够是相同的或不同 的。例如，如文中所定义的第一丝蛋白在第一细胞中被表达并且如步骤i）和ii） 中所定义的被加工，如文中所定义的第二丝蛋白在第二细胞中被表达并且如步骤i） 和ii）中所定义的被加工，然后在进行步骤iii）之前将所述两种溶液组合。
所述表面活性剂和离子液体溶解已沉淀的蛋白质并且能够使所述丝蛋白保持 在溶液中同时允许后续步骤中卷曲螺旋结构的形成。
在一个优选的实施方案中，所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。用于本发 明的阴离子表面活性剂的实例包括，但不限于，十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂基 硫酸铵和其他烷基硫酸盐、1-辛基磺酸钠一水合物、月桂酰基肌氨酸钠、月桂基乙 醚硫酸钠（SLES）、牛去氧胆酸钠水合物和烷基苯磺酸盐；以及其两种或多种的组 合。在一个优选的实施方案中，所述阴离子表面活性剂是SDS。
在一个实施方案中，所述离子液体包含
i）选自氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐、乙酸盐、C1-C4-烷基硫酸盐、 甲基磺酸盐、甲苯磺酸盐、C1-C4-二烷基磷酸盐、硫酸氢盐和四氯铝酸盐的阴离子， 和
ii）选自1,3-C1-C4-二烷基咪唑鎓、3-氯吡啶鎓、4-二甲氨基吡啶鎓、2-乙基-4- 氨基吡啶鎓、2-甲基吡啶鎓、2-乙基吡啶鎓、2-乙基-6-甲基吡啶鎓、喹啉鎓、异喹 啉鎓、吡啶鎓、1-C1-C4-烷基咪唑鎓、1-甲基咪唑鎓、1,2-二甲基咪唑鎓、1-正丁基 咪唑鎓、1,4,5-三甲基咪唑鎓、1,4-二甲基咪唑鎓、咪唑鎓、2-甲基咪唑鎓、1-丁基 -2-甲基咪唑鎓、4甲基咪唑鎓、1-(2’-氨基乙基)咪唑鎓、1-乙烯基咪唑鎓、2-乙基 咪唑鎓和苯并三唑鎓的阳离子。
在另一个优选的实施方案中，所述方法生产每升培养细胞至少大约0.1g，更 优选至少大约1g，更优选至少大约1.5g，更优选至少大约2g，甚至更优选至少 大约2.5g的丝蛋白。
在另一个方面中，本发明提供了用于生产丝纺丝液的方法，所述方法包含
i）从细胞培养物中，或从无细胞的表达系统中获得上清液，生产一种或多种 丝蛋白，
ii）通过采用表面活性剂或离子液体接触它们使所述丝蛋白溶解，和
iii）浓缩所述丝蛋白来生产所述丝纺丝液，
其中所述一种或多种丝蛋白能够形成包含卷曲螺旋结构的三级结构。
在该方面中，使用的是由所述细胞分泌的丝蛋白而不是用于生产所述丝纺丝 液的所述细胞中的丝蛋白。本领域技术人员将会理解，可以同时地或相继地进行 第一方面的步骤i）和以上方面的步骤i）。此外，在任何相应步骤中，源自所述细 胞和所述上清液的丝蛋白能够被组合并且在此基础上一起被加工。例如，能够单 独进行第一方面的步骤ii）和以上方面的步骤ii）并组合所述丝蛋白用于包括步骤 iii）和iv）的进一步加工。
在以上方面的一个特别优选的实施方案中，步骤i）进一步包含增加所述上清 液中丝蛋白的浓度。这通过本领域已知的任何方法能够被实现，例如通过采用沉 淀所述丝蛋白的试剂接触所述上清液，所述试剂如，但不限于，硫酸铵、三氯乙 酸、高氯酸和丙酮。
关于以上方面，优选所述丝蛋白尽可能多地由所述细胞分泌。因此，优选所 述丝蛋白包含N-末端信号序列。特别用于以上方面的丝蛋白的实例包括，但不限 于，包含以下序列的，更优选基本上由以下序列组成的，甚至更优选由以下序列 组成的丝蛋白，所述序列选自：
a）如SEQIDNO2、4、6、8、18、20、22、24、34、36、38、40、50、52、 54、56、66、68、70、72、82、84、86、88或98中任何一个所提供的氨基酸序列，
b）与SEQIDNO2、4、6、8、18、20、22、24、34、36、38、40、50、52、 54、56、66、68、70、72、82、84、86、88或98中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列，和
c）a）或b）的生物学活性片段。
在另一个实施方案中，所述丝蛋白包含第一丝蛋白，所述第一丝蛋白包含， 更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组成，
a）如SEQIDNO2、18、34、50、66或82中任何一个所提供的氨基酸序列；
b）与SEQIDNO2、18、34、50、66或82中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
c）a）或b）的生物学活性片段，
第二丝蛋白，所述第二丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组 成，
d）如SEQIDNO4、20、36、52、68或84中任何一个所提供的氨基酸序列；
e）与SEQIDNO4、20、36、52、68或84中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
f）c）或d）的生物学活性片段，
第三丝蛋白，所述第三丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组 成，
g）如SEQIDNO6、22、38、54、70或86中任何一个所提供的氨基酸序列；
h）与SEQIDNO6、22、38、54、70或86中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
i）g）或h）的生物学活性片段，和/或
第四丝蛋白，所述第四丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组 成，
j）如SEQIDNO8、24、40、56、72或88中任何一个所提供的氨基酸序列；
k）与SEQIDNO8、24、40、56、72或88中任何一个或多个至少30%相同 的氨基酸序列；和
l）j）或k）的生物学活性片段。
在另一个方面中，本发明提供了用于生产丝纤维的方法，所述方法包含挤压 和/或拉伸通过本发明的方法生产的丝纺丝液。
在一个实施方案中，所述挤压包含使所述丝纺丝液通过大约5μm至大约500 μm的毛细管。
在一个特别优选的实施方案中，所述方法包含
i）裂解生产一种或多种丝蛋白的细胞并且从所述细胞中分离包涵体，
ii）通过采用表面活性剂或离子液体接触它们使所述包涵体中的所述丝蛋白溶 解，
iii）浓缩所述丝蛋白来生产丝纺丝液，
iv）增加所述丝纺丝液中丝蛋白的浓度至大约2%至大约10%重量（%）的丝 蛋白，更优选大约3%至大约6%重量（%）的丝蛋白，和
vi）在脱水溶液中挤压所述丝纺丝液。
关于以上实施方案，所述脱水溶液优选包含醇类如甲醇或乙醇，或高浓度的 盐如MgCl2或NaCl。在这些条件下挤压的丝纤维作为湿法纺丝通常为本领域所知。
优选地，所述醇类是甲醇并且所述溶液中甲醇的浓度为大约40%至大约80% v/v，更优选大约50%至大约70%v/v。在该实施方案中，所述丝纺丝液可以包含 如文中所定义的单一类型的丝多肽，或者两种或多种不同的类型如四种不同的类 型。
在另一个方面中，本发明提供了用于生产丝薄膜的方法，其中所述方法包含 浇铸通过本发明的方法生产的丝纺丝液。
在另一个方面中，本发明提供了通过本发明的方法生产的丝纺丝液。
在另一个方面中，本发明提供了通过本发明的方法生产的丝纤维。
被提供的还有通过本发明的方法生产的丝薄膜。
在其他另一个方面中，本发明提供了包含本发明的丝纤维和/或丝薄膜的产品。
显而易见地，本发明的一个方面的优选特征和特性可应用于本发明的许多其 他方面。
贯穿本说明书的术语“包含（comprise）”，或变体如“包含（comprises）”或“包 含（comprising）”将被理解为意味着包含已陈述的元素、整体或步骤，或者元素、 整体或步骤的群组，但是不排除任何其他元素、整体或步骤，或者元素、整体或 步骤的群组。
以下通过非限制的例子和参考附加的附图的方式描述本发明。
附图说明
图1.溶解于SDS中的已纯化包涵体的SDS-PAGE。泳道对应于重组蛋白 AmelF1-4；标度为以kDa计的蛋白质重量。
图2.天然的蜜蜂丝（A）和重组的蜜蜂丝（B）的红外光谱中酰胺I和II区域 的傅里叶自去卷积。对应于结构的波段归属见表2。
图3.在空气中被拉伸（A）和在空气中被拉伸之后在甲醇中被第二次拉伸（B） 的重组蜜蜂丝纤维的正交偏振显微术。
图4.被挤压至甲醇浴中（A）和空气干燥之后在甲醇浴中被第二次拉伸至2 倍长度（B）或空气干燥之后在甲醇浴中被第二次拉伸至4倍长度（C）的重组蜜 蜂丝纤维的正交偏振显微术。
具体实施方案
序列表要素
SEQIDNO:1–在文中被称为Xenospira1的蜜蜂丝蛋白（在文中也被称为 AmelF1）（减去信号肽）。
SEQIDNO:2–在文中被称为Xenospira1的蜜蜂丝蛋白。
SEQIDNO:3–在文中被称为Xenospira2的蜜蜂丝蛋白（在文中也被称为 AmelF2）（减去信号肽）。
SEQIDNO:4–在文中被称为Xenospira2的蜜蜂丝蛋白。
SEQIDNO:5-在文中被称为Xenospira3的蜜蜂丝蛋白（在文中也被称为 AmelF3）（减去信号肽）。
SEQIDNO:6–在文中被称为Xenospira3的蜜蜂丝蛋白。
SEQIDNO:7–在文中被称为Xenospira4的蜜蜂丝蛋白（在文中也被称为 AmelF4）（减去信号肽）。
SEQIDNO:8–在文中被称为Xenospira4的蜜蜂丝蛋白。
SEQIDNO:9–编码蜜蜂丝蛋白Xenospira1的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:10-编码蜜蜂丝蛋白Xenospira1的核苷酸序列。
SEQIDNO:11–编码蜜蜂丝蛋白Xenospira2的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:12-编码蜜蜂丝蛋白Xenospira2的核苷酸序列。
SEQIDNO:13-编码蜜蜂丝蛋白Xenospira3的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:14-编码蜜蜂丝蛋白Xenospira3的核苷酸序列。
SEQIDNO:15-编码蜜蜂丝蛋白Xenospira4的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:16–编码蜜蜂丝蛋白Xenospira4的核苷酸序列。
SEQIDNO:17–在文中被称为BBF1的大黄蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:18–在文中被称为BBF1的大黄蜂丝蛋白。
SEQIDNO:19–在文中被称为BBF2的大黄蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:20–在文中被称为BBF2的大黄蜂丝蛋白。
SEQIDNO:21–在文中被称为BBF3的大黄蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:22–在文中被称为BBF3的大黄蜂丝蛋白。
SEQIDNO:23–在文中被称为BBF4的大黄蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:24–在文中被称为BBF4的大黄蜂丝蛋白。
SEQIDNO:25–编码大黄蜂丝蛋白BBF1的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:26–编码大黄蜂丝蛋白BBF1的核苷酸序列。
SEQIDNO:27–编码大黄蜂丝蛋白BBF2的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:28–编码大黄蜂丝蛋白BBF2的核苷酸序列。
SEQIDNO:29–编码大黄蜂丝蛋白BBF3的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:30–编码大黄蜂丝蛋白BBF3的核苷酸序列。
SEQIDNO:31–编码大黄蜂丝蛋白BBF4的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:32–编码大黄蜂丝蛋白BBF4的核苷酸序列。
SEQIDNO:33-在文中被称为BAF1的斗牛犬蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:34–在文中被称为BAF1的斗牛犬蚁丝蛋白。
SEQIDNO:35–在文中被称为BAF2的斗牛犬蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:36-在文中被称为BAF2的斗牛犬蚁丝蛋白。
SEQIDNO:37-在文中被称为BAF3的斗牛犬蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:38–在文中被称为BAF3的斗牛犬蚁丝蛋白。
SEQIDNO:39-在文中被称为BAF4的斗牛犬蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:40-在文中被称为BAF4的斗牛犬蚁丝蛋白。
SEQIDNO:41-编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF1的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:42-编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF1的核苷酸序列。
SEQIDNO:43-编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF2的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:44-编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF2的核苷酸序列。
SEQIDNO:45-编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF3的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:46–编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF3的核苷酸序列。
SEQIDNO:47–编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF4的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:48–编码斗牛犬蚁丝蛋白BAF4的核苷酸序列。
SEQIDNO:49–在文中被称为GAF1的黄猄蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:50–在文中被称为GAF1的黄猄蚁丝蛋白。
SEQIDNO:51–在文中被称为GAF2的黄猄蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:52–在文中被称为GAF2的黄猄蚁丝蛋白。
SEQIDNO:53–在文中被称为GAF3的黄猄蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:54–在文中被称为GAF3的黄猄蚁丝蛋白。
SEQIDNO:55–在文中被称为GAF4的黄猄蚁丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:56–在文中被称为GAF4的黄猄蚁丝蛋白。
SEQIDNO:57–编码黄猄蚁丝蛋白GAF1的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:58–编码黄猄蚁丝蛋白GAF1的核苷酸序列。
SEQIDNO:59–编码黄猄蚁丝蛋白GAF2的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:60–编码黄猄蚁丝蛋白GAF2的核苷酸序列。
SEQIDNO:61–编码黄猄蚁丝蛋白GAF3的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:62-编码黄猄蚁丝蛋白GAF3的核苷酸序列。
SEQIDNO:63–编码黄猄蚁丝蛋白GAF4的核苷酸序列（减去编码信号肽的 区域）。
SEQIDNO:64-编码黄猄蚁丝蛋白GAF4的核苷酸序列。
SEQIDNO:65-在文中被称为Vssilk3的川军蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:66–在文中被称为Vssilk3的川军蜂丝蛋白。
SEQIDNO:67-在文中被称为Vssilk4的川军蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:68-在文中被称为Vssilk4的川军蜂丝蛋白。
SEQIDNO:69-在文中被称为Vssilk2的川军蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:70-在文中被称为Vssilk2的川军蜂丝蛋白。
SEQIDNO:71-在文中被称为Vssilk1的川军蜂丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:72-在文中被称为Vssilk1的川军蜂丝蛋白。
SEQIDNO:73-编码川军蜂丝蛋白Vssilk3的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:74-编码川军蜂丝蛋白Vssilk3的核苷酸序列。
SEQIDNO:75–编码川军蜂丝蛋白Vssilk4的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:76–编码川军蜂丝蛋白Vssilk4的核苷酸序列。
SEQIDNO:77–编码川军蜂丝蛋白Vssilk2的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:78–编码川军蜂丝蛋白Vssilk2的核苷酸序列。
SEQIDNO:79–编码川军蜂丝蛋白Vssilk1的核苷酸序列（减去编码信号肽 的区域）。
SEQIDNO:80–编码川军蜂丝蛋白Vssilk1的核苷酸序列。
SEQIDNO:81–在文中被称为丝蛋白1的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS1）（减去信号肽）。
SEQIDNO:82–在文中被称为丝蛋白1的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS1）。
SEQIDNO:83–在文中被称为丝蛋白2的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS2）（减去信号肽）。
SEQIDNO:84–在文中被称为丝蛋白2的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS2）。
SEQIDNO:85–在文中被称为丝蛋白3的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS3）（减去信号肽）。
SEQIDNO:86–在文中被称为丝蛋白3的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS3）。
SEQIDNO:87-在文中被称为丝蛋白4的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS4）（减去信号肽）。
SEQIDNO:88–在文中被称为丝蛋白4的亚细亚蜜蜂丝蛋白（也被称为 ABS4）。
SEQIDNO:89-编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS1的核苷酸序列（减去编码信号 肽的区域）。
SEQIDNO:90-编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS1的核苷酸序列。
SEQIDNO:91-编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS2的核苷酸序列（减去编码信号 肽的区域）。
SEQIDNO:92-编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS2的核苷酸序列。
SEQIDNO:93-编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS3的核苷酸序列（减去编码信号 肽的区域）。
SEQIDNO:94-编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS3的核苷酸序列。
SEQIDNO:95-编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS4的核苷酸序列（减去编码信号 肽的区域）。
SEQIDNO:96–编码亚细亚蜜蜂丝蛋白ABS4的核苷酸序列。
SEQIDNO:97–在文中被称为MalF1的草蛉丝蛋白（减去信号肽）。
SEQIDNO:98–在文中被称为MalF1的草蛉丝蛋白。
SEQIDNO:99–编码草蛉丝蛋白MalF1的核苷酸序列（减去编码信号肽的区 域）。
SEQIDNO:100–编码草蛉丝蛋白MalF1的核苷酸序列。
SEQIDNO:101至108–寡聚核苷酸引物。
发明详述
通用技术和定义
除非另有特殊定义，本文中所使用的所有技术和科学术语均应被认为具有如 本领域技术人员通常所理解的相同的含义（例如，细胞培养、分子遗传学、制丝 加工、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学领域中）。
除非另外指出，本发明所使用的所述重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是标 准程序，为本领域技术人员所熟知。所述技术在通篇文献中被描述和解释如，J. Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984),J. Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbour LaboratoryPress(1989),T.A.Brown（编辑）,EssentialMolecularBiology:APractical Approach,第1和2卷,IRLPress(1991),D.M.Glover和B.D.Hames（编辑）,DNA Cloning:APracticalApproach,第1-4卷,IRLPress(1995和1996),和F.M.Ausubel 等人（编辑）,CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePub.Associatesand Wiley-Interscience(1988,包括迄今为止的所有更新),EdHarlow和DavidLane（编 辑）Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory，(1988),和J.E. Coligan等人（编辑）CurrentProtocolsinImmunology，JohnWiley&Sons(包括迄今 为止的所有更新)。
术语“和/或”，例如，“X和/或Y”将被理解为意味着或者“X和Y”或者“X或Y” 并且将用于提供对于二者兼有的含义或对于二者择一的含义的明确支持。
如文中所使用的，术语“丝蛋白”和“丝多肽”是指能够用于生产丝纤维的纤维蛋 白/多肽，和/或纤维蛋白复合物。
如文中所使用的，术语“一种或多种丝蛋白”是指可能使用两种或多种不同类型 的丝蛋白如本文中所定义的第一丝蛋白、第二丝蛋白等的方法。因此，在上下文， 一种丝蛋白意味着足以生产丝纺丝液的一群相同的丝蛋白分子。
如文中所使用的，术语“能够形成包含卷曲螺旋结构的三级结构”是指在适合的 条件下蛋白质用于形成所述结构的能力。例如，当被加工用于生产丝纤维时，所 述蛋白质形成所述结构。此外，该术语并不意味着所述整体蛋白质能够形成卷曲 螺旋结构，仅仅是其一部分。在一个实施方案中，大约45%至大约90%，更优选 大约55%至大约70%，甚至更优选大约60%至大约66%的所述丝蛋白能够形成包 含卷曲螺旋结构的三级结构。
如文中所使用的，术语“丝纺丝液”是指包含丝蛋白的水溶液。优选地，所述丝 纺丝液包含至少0.05%w/v，更优选至少0.1%w/v，甚至更优选至少0.5%w/v的 如文中所定义的丝蛋白。在一个实施方案中，通过本发明的方法生产的丝纺丝液 包含大约0.5%至大约15%（重量%）的丝蛋白。然而，如果没有进行增加所述丝 纺丝液中丝蛋白浓度的进一步的步骤，那么更典型的产率为大约0.5%至大约4% （重量%）的丝蛋白。使用本发明的方法生产的丝纺丝液经得起用于纤维形成和/ 或薄膜浇铸的挤压的检验。
如本文所使用的，“丝纤维”是指包含丝蛋白的细丝，所述细丝能够被编织成多 种物品如纺织品。
如文中所使用的，术语“减少表面活性剂溶液的量”，或其变体包括减少离子液 体的量，意味着表面活性剂或离子液体的总量被减少。在一个实施方案中，在所 述减少之后，在涉及所述溶液进一步浓缩的任何步骤之前，表面活性剂或离子液 体的浓度小于大约10mM，更优选小于5mM，甚至更优选小于1mM。
如文中所使用的，“脱水溶液”是任何溶液，优选地是水溶液，与待浓缩的所述 丝纺丝液相比，所述溶液具有更低的溶液中的水浓度。
如文中所使用的，当术语“溶解”是指所述丝蛋白与表面活性剂或离子液体接触 时，意味着所述表面活性剂或离子液体与所述丝蛋白结合并且通过防止它们的聚 集将它们保持在溶液中。这与在所述细胞中，特别是在包涵体中看到的丝蛋白形 成对比。
术语“信号肽”、“N-末端信号序列”及其变体是指在分泌的成熟蛋白质之前的氨 基末端蛋白质/多肽。所述信号肽被从所述成熟蛋白质切断并因此不存在于所述成 熟蛋白质中。信号肽具有引导和移位分泌的蛋白质穿过细胞膜的功能。所述信号 肽也是指信号序列，并且为本领域所熟知。
卷曲螺旋丝蛋白
术语“多肽”和“蛋白质”通常可交换使用并且是指可以通过非氨基酸基团的添 加被修饰的或不被修饰的单一多肽链。如文中所使用的，术语“蛋白质”和“多肽” 还包括文中所描述的丝蛋白的变体、突变、修饰物、类似物和/或衍生物。在一个 优选的实施方案中，在本发明中使用的丝蛋白仅由天然存在的氨基酸组成。
蛋白质的同一性%由具有空位创造罚分（gapcreationpenalty）=5和空位扩展 罚分（gapextensionpenalty）=0.3的GAP（Needleman和Wunsch，1970）分析（GCG 程序）来确定。查询序列以长度计至少为15个氨基酸，并且所述GAP分析在跨 越至少15个氨基酸的区域比对了所述两条序列。更优选地，所述查询序列以长度 计至少为50个氨基酸，并且所述GAP分析在跨越至少50个氨基酸的区域比对了 所述两条序列。更优选地，所述查询序列以长度计至少为100个氨基酸，并且所 述GAP分析在跨越至少100个氨基酸的区域比对了所述两条序列。甚至更优选地， 所述查询序列以长度计至少为250个氨基酸，并且所述GAP分析在跨越至少250 个氨基酸的区域比对了所述两条序列。甚至更优选地，所述GAP分析比对了所述 两条序列的整体长度。
如文中所使用的，“生物学活性”片段是保持全长蛋白质已定义的活性的本发明 的蛋白质的一部分，所述已定义的活性即用于生产丝的能力。只要其能保持已定 义的活性，生物学活性片段可以是任何长度。
术语“基本上由…组成”，或其变体，意味着被定义的氨基酸序列可以具有相对 于被定义的而言的一些，如一个、两个、三个或四个，额外的氨基酸。例如，当 不存在于被定义的序列中时，N-末端蛋氨酸可以被添加。术语“由…组成”，或其 变体，意味着当与被定义的序列相比时，被定义的序列不具有额外的或较少的氨 基酸，特别是在N-和C-末端。
关于被定义的蛋白质，可以理解的是高于如上所提供的那些的同一性%数字将 涵盖优选的实施方案。因此，在可应用的情况下，鉴于最小的同一性%数字，优选 所述蛋白质包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与相关的被提名的SEQIDNO至少 40%，更优选至少45%，更优选至少50%，更优选至少55%，更优选至少60%， 更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选 至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%， 更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选 至少98%，更优选至少99%，更优选至少99.1%，更优选至少99.2%，更优选至少 99.3%，更优选至少99.4%，更优选至少99.5%，更优选至少99.6%，更优选至少 99.7%，更优选至少99.8，甚至更优选至少99.9%相同。
通过将适当的核苷酸变化引入到编码所述丝蛋白的核酸中，或通过所需的蛋 白质的体外合成能够制备文中所描述的天然存在的丝蛋白的氨基酸序列突变。所 述突变包括，例如，所述氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代。缺失、插入和 取代的组合能够用于达成最终构建体，只要最终蛋白质产品拥有所需的特性。
使用本领域已知的任何技术都能够制备突变的（改变的）蛋白质。例如，本 发明的多聚核苷酸能够被体外诱变。所述体外诱变技术包括将所述多聚核苷酸亚 克隆至适合的载体中，将所述载体转化成“增变株”如大肠杆菌XL-1red（Stratagene） 并且将所述已转化的细菌繁殖至适合的世代数。在另一个实施例中，本发明的所 述多聚核苷酸被施加如Harayama所广泛描述的DNA改组技术（1998）。这些DNA 改组技术可以包括可能除了与本发明的那些相关的基因以外的本发明的基因，如 来自不同于文中特征化的特异性物种的膜翅目或脉翅目物种的丝基因。使用文中 所描述的用于确定它们是否能够用作丝蛋白的技术能够轻易地筛选源自突变的/改 变的DNA的产品。
在设计氨基酸序列突变时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的 特性。用于突变的所述位点能够被单独地或连续地修饰，例如，通过（1）取决于 所获得的结果，首先用保守氨基酸选择、然后用更激进的选择取代，（2）删除靶 标残基，或（3）向已定位位点的毗邻插入其他残基。
氨基酸序列的缺失或插入通常在大约1至15个残基的范围内变化，更优选大 约1至10个残基并且典型地大约1至5个相邻的残基。
取代突变至少有一个氨基酸残基从所述蛋白质分子中被除去并且在它的位置 插入不同的残基。对于取代诱变而言最感兴趣的位点包括被鉴定为对于功能很重 要的位点。其他感兴趣的位点是那些从不同菌株或物种中获得的相同的特定残基 的位点。这些位置对于生物活性可能是重要的。这些位点，尤其是属于至少三个 其他同一性保守位点的序列的那些，优选以相对保守的方式被取代。所述保守取 代如名为“示范性取代”的表1所示。
表1.示范性取代
通过由共有序列(abcdefg)n代表的七肽重复来描述丝蛋白卷曲螺旋结构的特 征。在一个优选的实施方案中，所述蛋白质具有卷曲螺旋结构的部分包含所述七 肽序列abcdefg的至少10个拷贝，并且处于位置a和d上的至少25%的氨基酸是 丙氨酸残基。
在一个优选的实施方案中，所述具有卷曲螺旋结构的蛋白质包含至少12个连 续的所述七肽拷贝，更优选至少15个连续的所述七肽拷贝，甚至更优选至少18 个连续的所述七肽拷贝。在另一个实施方案中，所述具有卷曲螺旋结构的蛋白质 能够具有多达至少28个所述七肽拷贝。典型地，所述七肽拷贝将被重复地衔接着。 然而，它们未必一定是完全的重复衔接，例如，如WO2007/038837的图5和6所 示，在两个七肽之间可以发现一些氨基酸，或者可以发现一些被截断的七肽（参 看，例如，WO2007/038837的图5中的Xenospira1）。
关于能够用于具有卷曲螺旋结构的所述丝蛋白的氨基酸取代的指导在WO 2007/038837的图5和6以及表6至10中提供。当基于文中所提供的实验数据而 预测的有用氨基酸取代与WO2007/038837的表1中提供的示范性取代发生冲突 时，优选使用所述基于实验数据的取代。
所述丝蛋白的卷曲螺旋结构具有高含量的丙氨酸残基，特别是处于所述七肽 的氨基酸位置a、d和e。然而，位置b、c、f和g也具有高频率的丙氨酸残基。在 一个优选的实施方案中，处于所述七肽的位置a、d和/或e的至少15%的氨基酸是 丙氨酸残基，更优选至少25%，更优选至少30%，更优选至少40%，甚至更优选 至少50%。在另一个优选的实施方案中，处于所述七肽的位置a和d两处的至少 25%的氨基酸是丙氨酸残基，更优选至少30%，更优选至少40%，甚至更优选至 少50%。此外，优选处于所述七肽的位置b、c、f和g的至少15%的氨基酸是丙氨 酸残基，更优选至少20%，甚至更优选至少25%。
典型地，所述七肽将不包含任何脯氨酸或组氨酸残基。此外，所述七肽将很 少包含（1个或2个），若有的话，苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甘氨 酸或色氨酸残基。除了丙氨酸以外，所述七肽中的常见（例如大于5%，更优选大 于10%）氨基酸包括亮氨酸（特别是处于位置b和d），丝氨酸（特别是处于位置 b、e和f)、谷氨酸（特别是处于位置c、e和f)、赖氨酸（特别是处于位置b、c、 d、f和g）以及处于位置g的精氨酸。
在一个优选的实施方案中，通过使用模式识别程序MARCOIL来确定所述七 肽（DelorenziandSpeed,2002）。
对于本发明的所述方法有用的蛋白质（和多聚核苷酸）能够从种类繁多的膜 翅目和脉翅目物种中被纯化（分离）。膜翅目的实例包括，但不限于，细腰亚目中 的任何物种（蜜蜂、蚂蚁和黄蜂），其包括下列昆虫科；青蜂科（青蜂）、蚁科（蚂 蚁）、蚁蜂科（绒蚁）、蛛蜂科（蛛蜂）、土蜂科、胡蜂科（胡蜂、蜾蠃蜂、川军蜂）、 榕小蜂科（榕小蜂）、小蜂科（小蜂）、蚁小蜂科（蚁小蜂）、旋小蜂科（旋小蜂）、 金小蜂科（金小蜂）、旗腹姬蜂科（旗腹姬蜂）、茧蜂科、姬蜂科（姬蜂）、切叶蜂 科、蜜蜂科、分舌蜂科、集蜂科和准蜂科（集油蜂）。脉翅目的实例包括来自下列 昆虫科的物种：螳蛉科、草蛉科（草蛉）、蚁蛉科（蚁蛉）和蝶角蛉科（蝶角蛉）。 使用文中所描述的用于来自大黄蜂（Bombusterrestris）、斗牛犬蚁（Myrmecia forficata）、黄猄蚁（Oecophyllasmaragdina）和草蛉（Malladasignata）的丝的相 同过程来描述所述另外的蛋白质（和多聚核苷酸）的特征。
在合成中或合成之后被有区别地修饰的蛋白质也包括在本发明的范围内，例 如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保 护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接至抗体分子或其他分子配体等。这些 修饰可用于增加所述蛋白质的稳定性和/或生物活性。
多聚核苷酸
术语“多聚核苷酸”与术语“核酸”在文中可交换使用。
在多聚核苷酸背景下的术语“外源性”是指当存在于细胞中，或无细胞表达系统 中时，相对于它的天然态发生量的改变的多聚核苷酸。在一个实施方案中，所述 细胞是天然地不包含所述多聚核苷酸的细胞。然而，所述细胞可以是包含非内源 性多聚核苷酸的细胞，所述非内源性多聚核苷酸导致其编码蛋白质的生产量的改 变，优选增加。本发明的外源性多聚核苷酸包括未从其所存在的转基因（重组） 细胞，或无细胞表达系统的其他成分中分离出的多聚核苷酸，以及在所述细胞或 无细胞系统中生产随后从至少一些其他成分中纯化出的多聚核苷酸。
多聚核苷酸的同一性%由具有空位创造罚分=5和空位扩展罚分=0.3的 GAP（Needleman和Wunsch，1970）分析（GCG程序）来确定。除非另有陈述， 查询序列以长度计至少为45个核苷酸，并且所述GAP分析在跨越至少45个核苷 酸的区域比对了所述两条序列。优选地，查询序列以长度计至少为150个核苷酸， 并且所述GAP分析在跨越至少150个核苷酸的区域比对了所述两条序列。更优选 地，查询序列以长度计至少为300个核苷酸，并且所述GAP分析在跨越至少300 个核苷酸的区域比对了所述两条序列。甚至更优选地，所述GAP分析比对了所述 两条序列的整体长度。
关于被定义的多聚核苷酸，可以理解的是高于如上所提供的那些的同一性%数 字将涵盖优选的实施方案。因此，在可应用的情况下，鉴于最小的同一性%数字， 优选本发明的多聚核苷酸包含序列，所述序列与相关的被提名的SEQIDNO至少 40%，更优选至少45%，更优选至少50%，更优选至少55%，更优选至少60%， 更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选 至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%， 更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选 至少98%，更优选至少99%，更优选至少99.1%，更优选至少99.2%，更优选至少 99.3%，更优选至少99.4%，更优选至少99.5%，更优选至少99.6%，更优选至少 99.7%，更优选至少99.8%，甚至更优选至少99.9%相同。
在一个实施方案中，编码用于本发明的丝蛋白的多聚核苷酸包含序列，更优 选基本上由序列组成，甚至更优选由序列组成，所述序列选自：
a）如SEQIDNO9至16、25至32、41至48、57至64、73至80、89至96、 99或100中任何一个所提供的核苷酸序列，
b）与SEQIDNO9至16、25至32、41至48、57至64、73至80、89至96、 99或100中任何一个或更多至少30%相同的核苷酸序列，和
c）a）或b）的编码部分的生物学活性片段。
当优选所述丝蛋白尽可能少的从所述细胞分泌时，所述被编码的丝蛋白不包 含N-末端信号序列。编码所述丝蛋白的多聚核苷酸的实例包括那些序列，其包含 以下序列，更优选基本上由以下序列组成的，甚至更优选由以下序列组成，所述 序列选自：
a）如SEQIDNO9、11、13、15、25、27、29、31、41、43、45、47、57、 59、61、63、73、75、77、79、89、91、93、95或97中任何一个所提供的核苷酸 序列，
b）与SEQIDNO9、11、13、15、25、27、29、31、41、43、45、47、57、 59、61、63、73、75、77、79、89、91、93、95或97中任何一个或更多至少30% 相同的核苷酸序列，和
c）a）或b）的生物学活性片段。
本发明的其他实施方案依赖于具有N-末端信号序列的丝蛋白的表达，和/或如 文中所定义的第一丝蛋白、第二丝蛋白、第三丝蛋白和/或第四丝蛋白的共同生产 （co-production）（在相同的或不同的细胞中）。基于序列表中所提供的序列信息， 本领域技术人员能够轻易地鉴定用于针对本发明的每一个实施方案的表达的代表 性多聚核苷酸。
当与天然存在的分子相比时，用于本发明的所述方法的多聚核苷酸可以拥有 一种或多种突变，所述突变是核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变能够是天然 存在的（也就是说，从天然来源中分离）或合成的（例如，通过在所述核酸上进 行定点诱变）。
在严格的条件下，用于本发明的多聚核苷酸还能够与如文中所提供的编码丝 蛋白的核苷酸序列杂交，所述核苷酸序列如SEQIDNO9至16、25至32、41至 48、57至64、73至80、89至96、99和100中的一种或多种。如文中所使用的， 术语“严格的杂交条件”等是指本领域熟悉的参数，包括随着寡聚核苷酸的长度而变 化的杂交温度。在编辑的所述方法的参考文献中（Sambrook等人（如前所述）和 Ausubel等人（如前所述）），可以发现核酸杂交参数。例如，如文中所使用的，严 格的杂交条件能够是指在杂交缓冲液（3.5xSSC、0.02%菲可、0.02%聚乙烯吡 咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白（BSA）、2.5mMNaH2PO4（pH7）、0.5%SDS、2mM EDTA）中于65℃的杂交，随后是于50℃的0.2xSSC、0.01%BSA中一次或多次 的洗涤。
核酸构建体
用于本发明的所述方法的细胞将典型地包含编码所述丝蛋白的核酸构建体。 所述构建体可以被整合到所述细胞的基因组中，或者是染色体外如重组载体。所 述载体含有异源性多聚核苷酸序列，其是天然条件下未发现与编码所述丝蛋白的 所述多聚核苷酸分子毗邻的多聚核苷酸序列，并且优选其源自与衍生出所述多聚 核苷酸分子的物种不同的物种。所述载体能够是RNA或DNA，可以为原核的或 真核的，并且典型地是转座子（如US5,792,294中所描述）、病毒或质粒。
重组载体的一种类型包含可操纵地连接至表达载体的编码所述丝蛋白的多聚 核苷酸分子。词组可操纵地连接是指多聚核苷酸分子向表达载体中的插入，所述 插入以所述分子在被转化到宿主细胞中时能够被表达的方式进行。如文中所使用 的，表达载体是能够转化宿主细胞并且影响特异性多聚核苷酸分子表达的DNA或 RNA载体。优选地，所述表达载体还能够在所述宿主细胞中复制。表达载体能够 是原核的或真核的，并且典型地是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明 的重组细胞中发挥功能（即，指导基因表达）的任何载体，所述载体包括在细菌、 真菌、体内寄生虫、节肢动物、昆虫、动物和植物细胞中的载体。本发明特别优 选的表达载体能够在植物细胞中指导基因表达。本发明的载体还能够用于在无细 胞表达系统中生产所述蛋白质，所述系统为本领域所熟知。
特别地，所述核酸构建体含有调控序列如转录控制序列、翻译控制序列、复 制源（originsofreplication）以及与所述重组细胞相配的和控制所述多聚核苷酸分 子表达的其他调控序列。转录控制序列是控制转录的启动、延伸和终止的序列。 特别重要的转录控制序列是那些控制转录启动的，如启动子、增强子、操作子和 抑制子序列。适合的转录控制序列包括能够在本发明的至少一种所述重组细胞中 发挥功能的任何转录控制序列。多种所述转录控制序列是本领域技术人员已知的。 优选的转录控制序列包括那些在细菌、酵母、节肢动物、植物或哺乳动物细胞中 发挥功能的，如，但不限于，tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体 λ、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫因、α-交配 因子、毕赤酵母醇氧化酶、甲病毒属亚基因组启动子（如辛德毕斯病毒亚基因组 启动子）、抗生素耐受性基因、杆状病毒、玉米夜蛾（HeliothisZea）昆虫病毒、牛 痘病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其他痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒（如即刻早 期启动子）、猿猴病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒长末端重复、劳斯 肉瘤病毒、热休克、磷酸盐和硝酸盐转录控制序列以及能够控制原核或真核细胞 中基因表达的其他序列。
如上所概述的，本发明的一个方面依赖于从所述细胞中分泌出的所述丝蛋白， 典型地归因于N-末端信号序列的存在。适合的信号序列的实例包括，但不限于， 组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、干扰素、白介素、生长激素、病毒包膜糖蛋白信 号段、尼克烟草（Nicotiananectarin）信号肽（US5,939,288）、烟草伸展蛋白信号、 大豆油质蛋白油体结合蛋白信号、拟南芥（Arabidopsisthaliana）液泡基本的几丁 质酶信号肽，以及文中所定义的所述丝多肽的天然信号序列。
细胞
本发明的大多数方法依赖于生产如文中所定义的一种或多种丝蛋白的细胞的 使用。通过能够将多聚核苷酸分子插入所述细胞的任何方法能够实现多聚核苷酸 分子向细胞的转化。转化技术包括，但不限于，转染、电穿孔、显微注射、脂质 转染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持为单细胞或者可以生长为组织、 器官或多细胞生物。已转化的多聚核苷酸分子能够保持在染色体外或者能够整合 到已转化的（即，重组的）细胞的染色体中的一个或多个位点中，所述整合以保 留它们的待表达的能力的方式进行。
用于转化的适合的宿主细胞包括能够被编码如文中所定义的丝多肽的多聚核 苷酸转化的任何细胞。宿主细胞可能是内在地（即，天然地）能够生产所述丝多 肽的或者可能是在被如文中所定义的至少一种多聚核苷酸分子转化之后能够生产 所述丝多肽的。宿主细胞能够是能够生产如文中所定义的至少一种丝蛋白的任何 细胞，并且包括细菌、真菌（包括酵母）、寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞。 宿主细胞的实例包括沙门氏菌属（Salmonella）、埃希氏菌属(Escherichia)、杆菌 (Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、酵母菌属(Saccharomyces)、粘虫属(Spodoptera)、 分支杆菌属(Mycobacteria)、尺蠖属(Trichoplusia)、BHK（幼仓鼠肾）细胞、MDCK 细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS（例如，COS-7）细胞和Vero细胞。宿主细 胞的其他实例是大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12衍生物；伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）；鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium），包括减毒株；秋粘虫（Spodoptera frugiperda）；拟尺蠖（Trichoplusiani）；和非致癌的小鼠成肌G8细胞（例如，ATCC CRL1246）。额外的适当的哺乳动物细胞宿主包括其他肾细胞系、其他成纤维细胞 系（例如，人、鼠或鸡胚胎成纤维细胞系）、骨髓瘤细胞系、中国仓鼠卵巢细胞、 小鼠NIH/3T3细胞、LMTK细胞和/或HeLa细胞。特别优选的宿主细胞是细菌细 胞。
本领域技术人员能够轻易地确定适合的培养条件如针对特殊细胞类型的介 质、温度和时间。例如，在一个实施方案中，所述细胞是于大约30℃至大约37℃ 培养了大约24小时至大约48小时周期的大肠杆菌。
重组DNA技术能够用于通过操纵，例如，宿主细胞中所述多聚核苷酸分子的 拷贝数、那些多聚核苷酸分子被转录的效率、所得转录产物被翻译的效率和翻译 后修饰的效率来改善已转化的多聚核苷酸分子的表达。用于增加多聚核苷酸分子 表达的重组技术包括，但不限于，将多聚核苷酸分子可操纵地连接至高拷贝数质 粒上、将所述多聚核苷酸分子整合到一种或多种宿主细胞染色体中、将载体稳定 性序列添加到质粒上、转录控制信号（例如，启动子、操作子、增强子）的取代 或修饰、翻译控制信号（例如，核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列）的取代或 修饰、修饰多聚核苷酸分子以适应宿主细胞密码子的使用和删除去稳定化转录产 物的序列。
丝纺丝液的生产
本发明涉及生产丝纺丝液的方法，所述丝纺丝液随后能够用于种类繁多的应 用。
本发明的一个方面的一个步骤涉及裂解细胞来释放生产于和包含于所述细胞 中的丝蛋白。通过本领域已知的任何手段能够进行该步骤。例如，典型地离心所 述细胞悬浮液将所述细胞制成丸状并且重新悬浮所述细胞制成更加浓缩的溶液以 用于裂解。细胞能够，例如，通过弗氏压碎器（FrenchPress）的通路被裂解、使 用Polytron（BrinkmanInstruments）被均质化或者在冰上被超声处理。裂解细胞（如 细菌细胞）的替代方法为本领域技术人员所熟知（参看，例如，Sambrook等人， 如前所述）。多种试剂盒可用于细胞裂解并且为本领域所熟知，例如Bugbuster试 剂盒（Novagen）和ProteaPrep试剂盒（ProteaBiosciences,Inc.）。
本发明人已经鉴定了如文中所定义的在细菌中表达的丝蛋白形成不溶性聚集 体（“包涵体”）。在一个优选的实施方案中，所述方法包括这些包涵体的分离。几 个方案可适用于蛋白质包涵体的纯化。例如，包涵体的纯化典型地包括采用如上 所讨论的方法通过破坏细菌细胞的包涵体的提取、分离和/或纯化。在一个实施方 案中，所述细胞被裂解，所述细胞膜被溶解，并且包含所述包涵体的不溶性部分 被分离用于进一步加工。
本发明的一个方面依赖于增加来自所述上清液的丝蛋白的浓度。此外，这能 够通过本领域已知的任何方法来实现。在一个实施方案中，这通过采用沉淀所述 丝蛋白的试剂接触所述上清液来实现，所述试剂如，但不限于，硫酸铵、三氯乙 酸、高氯酸和丙酮，或者商用沉淀剂混合物如PlusOne（AmershamBiosciences） 或Perfect-Focus（GenoTechnologyInc.）。
但是，优选在丝蛋白产率不足够高的情况下，用于生产丝纺丝液的本发明的 可选步骤包含增加所述丝纺丝液中丝蛋白的浓度。此外，这能够通过用于增加水 溶液中蛋白质浓度的本领域已知的任何方法来实现。在一个特别有用的实施方案 中，通过对抗脱水溶液如包含吸湿性聚合物的溶液的滤膜分析来浓缩所述丝纺丝 液。适合的吸湿性聚合物的实例包括，但不限于，聚乙二醇（PEG）、淀粉酶和丝 胶，或其两种或多种的组合。有一系列分子大小的PEG分子可被利用，通过选用 于滤膜分析的膜和所需的浓缩速率确定所述PEG的选择。优选地，所述PEG具有 大约8,000至大约10,000g/mol的分子量和大约25%至大约50%的浓度。
表面活性剂
在一个实施方案中，如文中所定义的生产丝纺丝液的步骤包括表面活性剂的 使用。本发明人惊奇地发现表面活性剂（如SDS）能够使如文中所定义的丝蛋白 保持在溶液中同时允许在所述表面活性剂的浓度被降低时形成卷曲螺旋结构。
在一个实施方案中，所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。用于本发明的阴 离子表面活性剂的实例包括，但不限于，十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂基硫酸铵 和其他烷基硫酸盐、1-辛基磺酸钠一水合物、月桂酰基肌氨酸钠、月桂基乙醚硫酸 钠（SLES）、牛去氧胆酸钠水合物和烷基苯磺酸盐；或其两种或多种的组合。在一 个优选的实施方案中，所述阴离子表面活性剂是SDS。
能够使用增加所述丝蛋白溶解度的任何浓度的所述表面活性剂。例如，使用 至少大约0.1%v/v的所述表面活性剂。在一个实施方案中，使用大约0.1%至大约 10%v/v，更优选地，大约0.5%至大约2%v/v或大约0.5%至大约5%v/v的所述表 面活性剂。
用于生产丝纺丝液的本发明的所述方法的进一步的步骤包含通过添加沉淀所 述表面活性剂的化合物来降低表面活性剂的量用于辅助所述丝蛋白的正确折叠。 可以使用与所述表面活性剂结合并且降低所述表面活性剂溶解度的任何化合物。 实例包括，但不限于，盐或碳水化合物如α-环糊精；或其两种或多种的组合。优 选地，所述盐是钾盐或钠盐。优选地，所述钾盐是氯化钾并且所述钠盐是乙酸钠。 能够使用导致溶液中表面活性剂的量降低的任何浓度的所述化合物。例如，添加 所述化合物至最终浓度为大约1mM至大约1M，更优选大约40mM至大约100 mM或大约40mM至400mM。
用于生产丝纺丝液的本发明的所述方法的进一步的步骤包含从随着所述化合 物的添加而形成的所述沉淀中分离所述溶液。这能够通过本领域已知的任何方法 来实现。所述方法如使用离心（例如在16000g离心5分钟），并且除去包含（其 为）所述丝纺丝液的所述上清液（溶液）。优选地，在该步骤之后，所述丝蛋白构 成至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少 95%，更优选至少97%，更优选至少99%，甚至更优选100%的溶液中的蛋白质。
离子液体
通常，离子液体能够被定义为化合物，所述化合物完全由离子组成并且在低 于大约100℃，优选低于大约85℃的温度下是液体。如在本发明中所使用的，离 子液体通常包含一种或多种阴离子和一种或多种阳离子。在优选的实施方案中， 所述离子液体包含有机阳离子，所述有机阳离子通过衍生一种或多种化合物以包 括取代基来创造，所述取代基如烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、 多种芳香基团，如（取代的或无取代的）苯基、（取代的或无取代的）苄基、（取 代的或无取代的）苯氧基和（取代的或无取代的）苄氧基以及在其环的部分具有 一个、两个或三个杂原子多种杂环芳香基团，所述杂环是取代的或无取代的。所 述衍生的化合物包括，但不限于，咪唑、吡唑、噻唑、异噻唑、氮代噻唑、氧代 噻唑、噁嗪、噁唑啉、环氧氮硼烷、dithiozole（未找到中译文）、三唑、delenozole （未找到中译文）、环氧磷烷、吡咯、环硼烷、呋喃、噻吩、环磷烷、五唑、吲哚、 吲哚林、噁唑、异噁唑、异四唑、四唑、苯并呋喃、二苯并呋喃、苯并噻吩、二 苯并噻吩、噻二唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、哌嗪、哌啶、吗啉酮、吡喃、annoline （未找到中译文）、酞嗪、喹唑啉、胍鎓、喹喔啉、基于胆碱的类似物，及其组合。 所述基本的阳离子结构能够是单一或多重取代的或无取代的。
所述离子液体的阴离子部分能够包含无机部分、有机部分，或其组合。在优 选的实施方案中，所述阴离子部分包含一种或多种部分，所述部分选自卤素、磷 酸盐、烷基磷酸盐、烯基磷酸盐、双(三氟甲基磺酰基)亚胺（NTf2）、BF4-、PF6-、 AsF6-、NO3-、N(CN)2-、N(SO3CF3)2-、氨基酸、取代的或无取代的碳硼烷、高氯酸 盐、拟卤素如硫氰酸盐和氰酸盐、基于金属氯化物的路易斯酸（例如，氯化锌和 氯化铝）或C1-6羧酸盐。拟卤化物是一价的并且具有那些类似于卤化物的性质。 根据本发明的有用的拟卤化物实例包括氰化物、硫氰酸盐、氰酸盐、雷酸盐和叠 氮化物。含有1-6个碳原子的示范性羧酸盐是甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、 己酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐等等。
根据本发明能够制备和使用多种离子液体。特别地，能够使用如上所提到的 所述阳离子和阴离子的任何组合。仅需要将一种或多种阳离子（如以上所描述的 那些）与一种或多种阴离子（如以上所描述的那些）组合来形成在如文中所描述 的条件下为液体的材料。例如，阳离子性咪唑鎓部分能够与阴离子性卤素部分组 合来形成在所需的条件下为液体的材料（例如，1-丁基-3-甲基-咪唑鎓氯化物）并 且其基本上完全由离子部分形成。因此，本发明涵盖了多种多样的离子液体的使 用是显而易见的。根据本发明所使用的离子液体的具体的、非限制性的实例包括 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓氯化物（“BmimCl”）；1-烯丙基-3-甲基-咪唑鎓氯化物 （“AmimCl”）；1-乙基-3-甲基-咪唑鎓氯化物；1-氢-3-甲基-咪唑鎓氯化物；1-苄基 -3-甲基-咪唑鎓氯化物（“BenzylmimCl”）；1-异丙基-3-甲基-咪唑鎓氯化物；1-间甲 氧基苄基-3-甲基-咪唑鎓氯化物（“MethoxyBenzylmimCl”）；1-间甲基苄基-3-甲基- 咪唑鎓氯化物(“MethylBenzylmimCl”);1-苄基-3-甲基-咪唑鎓氯化物和1-甲基-3-苄 基-咪唑鎓二氰胺(″BenzylmimDca")。
本发明还涵盖了多种离子液体混合物的使用。事实上，离子液体混合物能够 用于提供具有定制的性质（如粘度）的离子液体。例如，BenzylmimCl是相对粘滞 的离子液体；然而，通过与AminCl混合能够显著降低它的粘度。因此，通过改变 粘性较大成分和粘性较小成分之间的比例能够调节所述离子液体混合物的粘度。
根据本发明所使用的离子液体能够根据文献被合成。优选地，在使用之前， 所述离子液体在真空干燥箱中被烘干（例如，于100℃）一段时间，如大约48小 时。在一个实施方案中，所述离子液体由材料形成，所述材料在环境条件下为固 体的（例如，结晶的）但是在增加的温度下为液体的（如大于大约30℃、大于大 约50℃、大于大约75℃或大于大约100℃）。通常，所述结晶的材料能够被置于适 当的容器中并且被加热至溶解（参看，例如，IonicLiquidsinSynthesis,Wasserscheid, P.和Weldon,T.(编辑),WileyPub.）。当然，所述离子液体还能够包含在环境条件下 （例如，在20-25℃左右的温度下）为液体的材料。
过滤和/或色谱法
溶解的丝蛋白可以被浓缩并从杂质中分离出来，所述杂质如所述表面活性剂、 离子液体和基于电荷、亲水性、亲和力、溶解度或稳定性，或者尺寸的其他细胞 成分。分离技术的非限制性实例包括硫酸铵沉淀、色谱法和膜过滤（包括切向流 膜过滤）。在利用用于分离的色谱法的实施方案中，示范性的方法包括离子交换（阳 离子的或阴离子的）、亲和色谱法、亲水性相互作用、疏水性相互作用、尺寸排除 和凝胶渗透（参看US6,248,570）。
在一些实施方案中，通过膜过滤能够进行所述分离，所述膜过滤包括，但不 限于，如单通道、无出路的直流过滤（DFF）以及横向流或正切流动过滤（TFF） 的方法。根据本发明，过滤依据使用具有已定义孔径范围的半渗透膜，根据尺寸 分离分子的原则。过滤方法和可以在分离中使用的膜类型的组合是本领域技术人 员已知的。
根据本发明，膜过滤是受到聚合的或无机的膜影响的细胞成分的分离。在本 领域中，根据其从载体液体中除去的物质尺寸定义的膜有四种常见的可接受的类 别。连续的透膜过滤的方法从最小的孔到最大的孔依次为逆向渗透（RO）、纳米过 滤（NF）、超滤（UF）和微米过滤（MF）。
采用上述膜的过滤通过使用具有特定孔径的膜根据分子的分子量来分离分 子。例如，采用具有小于0.001微米的孔径的RO膜的分离旨在分离具有小于200 道尔顿的分子量的分子。采用具有从0.001至0.008微米以内的孔径的NF膜的过 滤旨在分离具有从200道尔顿至15千道尔顿（kDa）以内的的分子量的分子。采 用具有从0.005至0.1微米以内的孔径的UF膜的过滤旨在分离具有从5kDa至300 kDa以内的的分子量的分子。采用具有从0.05至3.0微米以内的孔径的微米过滤膜 的过滤旨在分离具有从100kDa至3000kDa及更大的分子量的分子。
根据本发明，膜过滤能够将溶解的丝蛋白从其他成分中分离出来，所述膜过 滤基于利用膜的尺寸排除，所述膜具有由所述膜的孔径所确定的特定的截留分子 量（MQWCO）。MWCO，也称作名义分子量限制（NMWL）或名义截留分子量 （NMWCO），是千道尔顿规格的用于膜过滤的名称。所述MWCO被定义为所述 分子90%被所述膜保留的分子量。因为，例如，相同分子量的分子能够具有显著 不同的形状，所以尽管所述MWCO不是精确的度量标准，但仍旧是有用的度量标 准并且通常为膜生产商所使用。在本发明中不但可以使用疏水性膜而且可以使用 亲水性膜。所述膜可以作为平板状薄片使用或者在螺旋状缠绕结构中使用。还可 以使用中空纤维。关于UF膜的组成，可以使用许多潜在的膜材料包括，但不限于， 再生纤维素、聚醚砜（其可以或可以不被修饰来改变它固有的疏水性）、聚偏二氟 乙烯，以及陶瓷和金属氧化物的聚集体。许多聚醚砜UF膜能够经受0.5-1.3的pH 范围和高达85℃的温度范围。用于MF膜的材料包括用于UF膜的每一种，以及 聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和PTFE（TEFLONTM）。
在一些实施方案中，所述溶解的丝蛋白能够被过滤用于从较小的细胞成分中 分离大细胞碎片来避免所述细胞碎片干扰涉及使用膜或色谱法的分离和纯化步骤 的进行。在这些实施方案中，所述渗过物包含所述丝蛋白并且被回收。
在一些实施方案中，膜能够用于具有适合的MWCO的分离步骤。例如，在本 发明的所述方法中使用的典型的丝蛋白具有大约30kDa的分子量（MW）。在这些 实施方案中，所述渗余物包含所述丝蛋白并且能够被回收。
在一个优选的实施方案中，正切流动过滤对于所述丝蛋白既发挥渗滤作用又 发挥浓缩作用。在TFF中，典型地，所述溶液平行于所述过滤膜流动。跨膜压力 差导致流动的和可滤过的溶质（它的分子量小于所述膜的分子量或者类似于此， 如球蛋白）流经所述滤器。在HPTFF（高效正切流动过滤）中，所述膜是带电荷 的，因此既使用尺寸又使用电荷来分离污染物（参看US20030229212）。根据本 发明，渗滤能够是不连续的或连续的渗滤。在不连续的渗滤中，所述溶液被浓缩， 并且失去的体积由新缓冲液代替。在连续的渗滤中，所述溶液的体积通过在旧缓 冲液被除去时新缓冲液的流入被保持。在一些实施方案中，通过使用超滤膜的正 切流动过滤能够进行所述丝蛋白的分离和纯化。
用途
使用本发明的所述方法生产的丝纺丝液能够用于一系列广泛和多样的医学、 军事、工业和商业应用。例如，所述丝纺丝液用于生产丝纤维，所述丝纤维进而 能够用于医用装置（如缝合线、皮肤移植片、细胞生长基质、替换韧带和外科用 网状织物）以及广泛的工业和商业产品（如，例如，电缆、绳索、网、钓鱼线、 服装织物、防弹背心内衬、容器织物、背包、背囊、书包或钱包皮带、粘附性装 订材料、非粘附性装订材料、束缚材料、帐篷织物、防水油布、水池覆盖物、车 辆覆盖物、围栏材料、密封剂、建筑材料、防风雨材料、弹性分隔材料、运动设 备）的制造；并且，事实上，几乎用于纤维或织物的任何用途，所述纤维或织物 的高抗张强度和弹性是所需的特性。所述丝纺丝液还应用于个人护理用品组合物 （如化妆品、皮肤护理品、毛发护理品和染发剂）的生产；和微粒涂覆（如色素）。
所述丝可以以它们的天然形式来使用或者可以将它们修饰来形成衍生物，所 述衍生物提供更有益的效果。例如，通过结合至聚合物以降低如US5,981,718和 US5,856,451中所描述的变应原性可以将所述丝修饰。适合的修饰聚合物包括，但 不限于，聚亚烷基氧化物、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚（乙烯吡咯烷酮）和右旋糖 酐。在另一个实施方案中，通过其他蛋白质修饰剂的选择性消化和拼接可以将所 述丝修饰。例如，通过在大约60℃的高温下采用酸的处理可以将所述丝蛋白裂解 成较小的肽单元。有用的酸包括，但不限于，稀盐酸、硫酸或磷酸。可选地，通 过采用碱（如氢氧化钠）的处理或使用可以被使用的适合的蛋白酶的酶消化可以 完成所述丝蛋白的消化。
可以将所述蛋白质进一步修饰来提供性能特性，所述性能特性有益于个人护 理用品的特异性应用。用于个人护理用品的蛋白质的修饰为本领域所熟知。例如， 通常所使用的方法如US6,303,752、US6,284,246和US6,358,501中所描述。修饰 的实例包括，但不限于，用于促进水-油乳液增强的乙氧基化作用、用于提供亲脂 兼容性的硅氧基化作用和有助于与肥皂和去污剂组合物的兼容性的酯化作用。此 外，采用官能团可以将所述丝蛋白衍生化，所述官能团包括，但不限于，胺、环 氧乙烷、氰酸酯、羧酸酯、硅酮共聚醇、硅氧烷酯、脂肪族季胺、乌拉坦、聚丙 烯酰胺、二羧酸酯和卤代酯。通过与二亚胺的反应和通过金属盐的形成也可以将 所述丝蛋白衍生化。
符合上述定义的“多肽”（和“蛋白质”），所述衍生的和/或修饰的分子在文中 也广泛地被认为是“多肽”和“蛋白质”。
所述丝纺丝液能够连同其他纤维类型一起纺织和/或用其他纤维类型捆绑或编 织。实例包括，但不限于，聚合物纤维（例如，聚丙烯、尼龙、聚酯）、其他植物 和动物来源的纤维和丝（例如，棉花、羊毛、家蚕（Bombyxmori）或蜘蛛丝）和 玻璃纤维。一个优选的实施方案是用10%聚丙烯纤维编织的丝纤维。本发明涵盖 了所述纤维组合的生产能够轻易地实践用于增强任何所需的特性，例如，外观、 柔软度、重量、耐用度、防水性质、改善的制造成本，所述特性通常可以在用于 医学、工业或商业应用的纤维的制造和生产中寻求。
个人护理用品
化妆品和皮肤护理组合物可以是包含在化妆品上可接受的介质中的有效量的 丝的无水组合物。这些组合物的用途包括，但不限于，皮肤护理、皮肤清洁、化 妆品和抗皱产品。用于化妆品和皮肤护理组合物的有效量的丝在文中被定义为相 对于所述组合物总重量的比例以重量计介于大约10-4至大约30%，但是优选以重 量计介于大约10-3至15%。这个比例可以随着化妆品或皮肤护理组合物的类型而 变化。对于化妆品上可接受的介质而言，适合的组合物如US6,280,747中所描述。 例如，所述化妆品上可接受的介质可以含有脂肪物质，所述脂肪物质相对于所述 组合物总重量的比例以重量计介于大约10至大约90%，其中所述脂肪相含有至少 一种液体的、固体的或半固体的脂肪物质。所述脂肪物质包括，但不限于，油、 蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质。可选地，所述组合物可以采用稳定的分散系的 形式如油包水或水包油乳剂。此外，所述组合物可以含有一种或多种常规的化妆 品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括，但不限于，抗氧化剂、防腐剂、填充物、表 面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、芳香剂、增稠剂、润湿剂和阴离子型、非离 子型或两性聚合物，以及染料或色素。
采用包含通过本发明的方法生产的丝的被乳化的材料可生产的被乳化的化妆 品和准药物，例如，清洁化妆品（美容皂、洁面乳、香波、洗发水等等）、毛发护 理用品（染发剂、毛发化妆品等等）、基础化妆品（普通霜、乳液、剃须膏、调节 剂、古龙水、剃须水、化妆油、面膜等等）、上妆化妆品（粉底、眉笔、眼霜、眼 影、睫毛膏等等）、芳香化妆品（香水等等）、美黑和防晒化妆品（美黑和防晒霜、 美黑和防晒水、美黑和防晒油等等）、指甲化妆品（指甲霜等等）、眼线化妆品（眼 线笔等等）、唇部化妆品（唇膏、唇霜等等）、口腔护理用品（牙膏等等）、沐浴化 妆品（沐浴用品等等）等等。
所述化妆品组合物还可以是指甲护理用品的形式，如指甲油。指甲油在文中 被定义为用于指甲处理和着色的组合物，所述组合物包含在化妆品上可接受的介 质中的有效量的丝。用于指甲油组合物的有效量的丝在文中被定义为相对于所述 指甲油总重量的比例以重量计介于大约10-4至大约30%。用于指甲油的化妆品上 可接受的介质成分如US6,280,747中所描述。所述指甲油典型地含有溶剂和成膜 物质，如纤维素衍生物、聚乙烯基衍生物、丙烯酸聚合物或共聚物、乙烯基共聚 物和聚酯聚合物。所述组合物还可以含有有机的或无机的色素。
毛发护理组合物在文中被定义为用于毛发处理的组合物，包括但不限于香波、 调节剂、洗液（lotion）、气雾剂、凝胶和摩丝，所述组合物包含在化妆品上可接受 的介质中的有效量的丝。用于毛发护理组合物的有效量的丝在文中被定义为相对 于所述组合物总重量的比例以重量计介于大约10-2至大约90%。用于毛发护理组 合物的化妆品上可接受的介质成分如US2004/0170590、US6,280,747、US 6,139,851和US6,013,250中所描述。例如，这些毛发护理组合物能够是水性的、 醇性的或水-醇溶液，所述醇优选为乙醇或异丙醇，对于水-醇溶液而言，相对于总 重量的比例以重量计介于大约1至大约75%。此外，所述毛发护理组合物可以含 有如上所给定的一种或多种常规的化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂。
毛发着色组合物在文中被定义为用于毛发着色、染色或漂洗的组合物，包含 在化妆品上可接受的介质中的有效量的丝。用于毛发着色组合物的有效量的丝在 文中被定义为相对于所述组合物总重量的比例以重量计介于大约10-4至大约60%。 用于毛发着色组合物的化妆品上可接受的介质成分如US2004/0170590、US 6,398,821和US6,129,770中所描述。例如，毛发着色组合物通常含有无机的基于 过氧化的染色氧化剂和可氧化的着色剂的混合物。最常见的所述基于过氧化的染 色氧化剂是过氧化氢。通过主要中间体（例如对苯二胺、对氨基苯酚、对二氨基 吡啶、羟基吲哚、氨基吲哚、氨基胸腺嘧啶或氰基苯酚）与次要中间体（例如苯 酚、间苯二酚、间氨基苯酚、间苯二胺、萘酚、吡唑酮、羟基吲哚、儿茶酚或吡 唑）的氧化偶联形成所述氧化的毛发着色剂。此外，毛发着色组合物可以含有氧 化剂、掩蔽剂、稳定剂、增稠剂、缓冲载体、表面活性剂、溶剂、抗氧化剂、聚 合物、非氧化的染料和调节剂。
所述丝还能够用于涂覆色素和化妆品微粒以便改善用于化妆品和涂覆组合物 的所述微粒的分散性。化妆品微粒在文中被定义为微粒化的材料如在化妆品组合 物中使用的色素或惰性微粒。适合的色素和化妆品微粒，包括，但不限于，无机 颜色色素、有机色素和惰性微粒。所述无机颜色色素包括，但不限于，二氧化钛、 氧化锌以及铁、镁、钴和铝的氧化物。有机色素包括，但不限于，D&CRedNo.36、 D&COrangeNo.17、D&CRedNo.7、11、31和34钙色淀、D&CRedNo.12钡 色淀、D&CRedNo.13锶色淀、FD&CYellowNo.5铝色淀和碳黑微粒。惰性微 粒包括，但不限于，碳酸钙、硅酸铝、硅酸钙、硅酸镁、云母、滑石、硫酸钡、 硫酸钙、粉末状NylonTM、全氟代烷烃和其他惰性塑料。
所述丝还可以在牙线中使用（参看，例如，US2005/0161058）。所述牙线可以 是单丝纱线或多丝纱线，并且纤维可以或可以不是扭曲的。所述牙线可以被包装 成单件或者是具有用于将其切成任何所需长度的切口的卷状物。所述牙线可以被 提供为不同于细丝的一系列形状，如但不限于，条和片等等。所述牙线可以采用 不同材料进行涂覆，如但不限于，用于牙线的蜡、聚四氟乙烯单丝纱线。
所述丝还可以在肥皂中使用（参看，例如，US2005/0130857）。
色素和化妆品微粒的涂覆
用于色素和化妆品微粒涂覆的丝的有效量在文中被定义为相对于微粒干重的 比例以重量计介于大约104至大约50%之间，但优选介于大约0.25至大约15%之 间。所使用的所述丝的最适宜量取决于被涂覆的色素或化妆品微粒的类型。例如， 与无机颜色色素一起使用的丝的量优选以重量计介于大约0.01%至20%之间。在有 机色素的情况下，优选的丝的量以重量计介于大约1%至大约15%之间，而对于惰 性微粒而言，优选的丝的量以重量计介于大约0.25%至大约3%之间。用于制备被 涂覆的色素和微粒的方法如US5,643,672中所描述。这些方法包括：在振摇或混 合的同时，将所述丝的水溶液添加到所述微粒中，形成所述丝和所述微粒的浆体 并干燥，将所述丝的溶液喷洒在所述微粒上干燥或者将所述丝和所述微粒的浆体 冻干。这些被涂覆的色素和化妆品微粒可以用于化妆品配方、油漆、墨水等等。
生物医学
所述丝可以被用作绷带上的涂料来促进伤口愈合。对于这个应用而言，所述 绷带材料采用有效量的所述丝进行涂覆。出于伤口愈合绷带的目的，有效量的丝 在文中被定义为相对于所述绷带材料重量的比例以重量计介于大约10-4至大约 30%之间。待涂覆的所述材料可以是任何柔软的，生物学上惰性的，有孔的布料或 纤维。实例包括，但不限于，棉花、丝、人造丝、醋酸纤维、丙烯酸纤维、聚乙 烯纤维、聚酯纤维及其组合。通过本领域已知的一些方法可以完成所述布料或纤 维的涂覆。例如，可以将待涂覆的所述材料浸入到含有所述丝的水溶液中。可选 地，可以使用喷枪将含有所述丝的所述溶液喷洒到待涂覆的所述材料的表面上。 此外，使用辊涂印刷工艺可以将含有所述丝的所述溶液涂覆到表面上。所述伤口 绷带可以包括其他添加剂，包括但不限于，消毒剂如碘、碘化钾、聚维酮碘、利 凡诺、过氧化氢、苯扎氯铵和氯己定；治疗促进剂如尿囊素、盐酸地布卡因和苹 果酸氯苯胺；血管收缩剂如盐酸萘唑啉；收敛剂如氧化锌；和结痂剂如硼酸。
所述丝纺丝液还可以采用作为伤口敷料材料的薄膜的形式被使用。采用无定 形薄膜的形式作为伤口敷料材料的丝的用途如US6,175,053中所描述。所述无定 形薄膜包含稠密且无孔的结晶度低于10%的含有有效量的丝的薄膜。对于用于伤 口护理的薄膜而言，丝的有效量在文中被定义为以重量计介于大约1至99%之间。 所述膜还可以含有其它成分包括但不限于其他蛋白质如丝胶和如上所述的消毒 剂、治疗促进剂、血管收缩剂、收敛剂以及结痂剂。其他蛋白质如丝胶可以以重 量计可占所述组合物的1至99%。所列举的其他成分的量优选总计低于所述组合 物的大约30%（以重量计），更优选介于所述组合物的大约0.5至20%（以重量计）。 通过在水溶液中溶解上述材料，过滤或离心除去不溶物以及将所述溶液浇铸在光 滑的固体表面（如丙烯酸板）上，然后干燥可以制备所述伤口敷料薄膜。
所述丝纺丝液还可以用于生产缝合线（参看，例如，US2005/0055051）。所述 缝合线能够以由超高分子量纤维和丝纤维构成的编织套为特征。聚乙烯提供强度。 聚酯纤维可以与高分子量聚乙烯一起编织来提供改善的束缚性质。所述丝可以采 用对比色被提供来提供用于改善的缝合线识别和鉴定的踪迹。与其他纤维相比， 丝具有更好的组织顺从性，允许待切割的末端接近于结点而不用担心缝合线的末 端与周围组织之间的有害相互作用。使用用于涂覆所述缝合线的多种材料也能够 增强所述高强度缝合线的操作特性。所述缝合线有利地具有EthibondNo.5缝合线 般的强度，但是具有No.2缝合线般的直径、感觉和打结能力。因此，对于大多数 整形外科程序（如肩袖修复、跟腱修复、髌腱修复、ACL/PCL再造、髋部和肩部 再造程序，以及在缝合锚中使用的或与缝合锚一起使用的缝合线的替换）而言， 所述缝合线是理想的。例如，所述缝合线能够是无涂覆的，或者是采用蜡（蜂蜡、 石蜡、聚乙烯蜡或其他）、硅酮（DowCorning硅酮流体202A或其他）、硅酮橡胶、 PBA（聚丁酸）、乙基纤维素（Filodel）或其他涂料涂覆的，来改善织带的润滑性、 结点的安全性或耐磨性。
所述丝纺丝液还可以用于生产支架（参看，例如，US2004/0199241）。例如， 所提供的支架移植体包括腔内支架和移植体，其中所述支架移植体包括丝。所述 丝诱导接受所述支架移植体的宿主的应答，其中所述应答能够导致所述丝支架移 植体和与所述丝支架移植体的丝毗邻的所述宿主的组织之间的增强的粘附力。通 过多种手段的任何一种可以将所述丝附属于所述移植体，例如，通过将所述丝交 织到所述移植体中或者通过将所述丝粘附到所述移植体上（例如，借助粘附剂或 借助缝合线）。所述丝可以采用线、织带、片、粉末等形式。关于所述丝在所述支 架移植体上的位置，可以仅仅将所述丝附属于所述支架的外表面，和/或可以将所 述丝附属于所述支架移植体的末端区域，以便辅助在宿主中那些末端区域固定于 邻近组织。种类繁多的支架移植体可以在本发明的范围内使用，取决于所需的处 理的位点和本质。例如，支架移植体可以是分为两部分的或管状的移植体，圆柱 形的或锥形的，自身可膨胀的或气球-可膨胀的，一体式的或模块化的等。
除了丝以外，所述支架移植体可以含有在一些或所有的所述丝上面的涂覆， 其中所述涂覆随着所述支架移植体插入宿主而降解，所述涂覆从而延迟了所述丝 与所述宿主之间的接触。适合的涂覆包括，但不限于，明胶、可降解的聚酯（例 如，PLGA、PLA、MePEG-PLGA、PLGA-PEG-PLGA及其共聚物和混杂物）、纤 维素和纤维素衍生物（例如，羟丙基纤维素）、多糖（例如，透明质酸、右旋糖酐、 右旋糖酐硫酸酯、壳聚糖）、脂类、脂肪酸、糖酯、核酸酯、聚酸酐、聚原酸酯和 聚乙烯醇（PVA）。所述含丝支架移植体可以含有生物学活性试剂（药物），其中所 述试剂从所述支架移植体中被释放出来，然后在所述支架移植体被插入其中的宿 主中诱导了增强的细胞应答（例如，细胞的或细胞外的基质沉积）和/或纤维化应 答。
所述丝纺丝液还可以用于生产用于在体外生产韧带和肌腱的基质（参看，例 如，US2005/0089552）。基于丝-纤维的基质能够被播种在多能干细胞上，如骨髓 基质细胞（BMSC）。所述通过生物工程制成的韧带或肌腱有利地以细胞定向和/或 在所施加的机械力方向的基质卷曲模式作为特性，并且如果施加所述力的话，其 还以沿着所述机械力或刺激来产生的机械负载的轴向产生包括I型胶原、III型胶 原和纤维连接蛋白的韧带和肌腱特异性标记作为特性。在一个优选的实施方案中， 所述韧带或肌腱以纤维束的存在作为特性，所述纤维束被排列成螺旋状结构。能 够被生产的韧带或肌腱的一些实例包括前交叉韧带、后交叉韧带、肩袖肌腱、肘 部和膝部的中间侧副韧带、手部的屈肌韧带、踝部的侧韧带以及颌骨或颞下颌关 节的肌腱和韧带。通过本发明的方法可以生产的其他组织包括软骨（既有关节的 又有半月板的）、骨、肌肉、皮肤和血管。
所述丝纺丝液还可以用于生产水凝胶（参看，例如，US2005/0266992）。合成 丝胶水凝胶能够以开孔结构作为特性，所述开孔结构允许它们作为组织工程学支 架、细胞培养底物、伤口和烧伤敷料、软组织替代物、骨填充物，以及用于药学 或生物学活性化合物的载体来使用。
所述丝纺丝液还可以用于生产皮肤病学组合物（参看，例如，US 2005/0019297）。此外，所述纺丝液还可以用于生产缓释组合物（参看，例如，US 2004/0005363）。
纺织品
所述丝纺丝液还可以用于生产用于随后用于纺织品的纤维表面的涂覆。这为 所述纤维上提供了单层的蛋白质薄膜，导致了光滑的抛光。US6,416,558和US 5,232,611描述了对于纤维的抛光涂覆的添加。在这些公开中描述的方法提供了抛 光所述纤维以提供好感觉和光滑表面的多种用途的实例。对于这个应用而言，采 用有效量的所述丝涂覆所述纤维。对于用于纺织品的纤维涂料的目的，丝的有效 量在文中被定义为相对于所述纤维材料重量的比例以重量计介于大约1至大约 99%之间。所述纤维材料包括，但不限于，棉花、聚酯（如人造丝和LycraTM）、尼 龙、羊毛的纺织纤维和包括天然丝的其他天然纤维。适合于将所述丝应用于所述 纤维上的组合物可以包括共溶剂（如乙醇、异丙醇、六氟烷醇（hexafluoranol）、 异硫氰酸基铀酸酯（isothiocyanouranate））和能够与水混合以形成溶液或微乳的其 他极性溶剂。可以将所述含丝溶液喷洒到所述纤维上或者将所述纤维浸入到所述 溶液中。然而不必要的是，优选闪式干燥所述被涂覆的材料。一个可选择的方案 是将所述丝组合物应用到编织纤维上。本发明的一个理想的实施方案是使用丝来 涂覆如用于丝袜的可伸缩织物。
复合材料
丝纤维能够被添加到聚氨酯、其他树脂或热塑性填充物中来制备控制盘和其 他建筑材料或作为代替木头和刨花板的模塑家具和台式（benchtop）。所述组合物 还能够用于建筑物和自动的建筑特别是屋顶和门板。所述丝纤维再次强化了使所 述材料更加坚固并且允许重量更轻的建筑具有等于或大于其他刨花板和复合材料 的强度的所述树脂。丝纤维可以被分离并且被添加到合成的复合成形树脂中或者 与源自植物的蛋白质、淀粉和油组合使用来生产基于生物学的复合材料。用于生 产所述材料的工艺如JP2004284246、US2005175825、US4,515,737、JP47020312 和WO2005/017004中所描述。
纸张添加剂
所述丝的纤维性质对于造纸而言能够增加强度和质量质地。通过将丝线在棉 浆中呈斑点状分散制备超光滑的手工纸张，而制造的丝纸张被用做礼品包装纸、 笔记本封面、手提袋。用于从丝纺丝液中生产纸张产品的工艺一般如JP2000139755 中所描述。
高级材料
从本发明的丝纺丝液中生产的丝具有相当的韧性并且当其被弄湿时在保持这 些性质的方面可以从其他丝中脱颖而出（Hepburn等人，1979）。
服装纺织工业中的实质性增长领域是技术的和智能的纺织品。对于健康的、 高性能的、有利环境的和个性化的纺织品产品的需求有所增长。当被弄湿时不改 变性质并且特别地保持它们的强度和延展性的纤维，如本发明的那些，对于用于 运动和休闲穿着以及工作穿着的功能服装和防护服装而言是有用的。
在武器和监控技术中的发展促进了在个人防护设备以及与战场相关的系统和 结构中的创新。除了常规的要求如对于延长的暴露的材料耐用度、过度磨损和对 抗外界环境的防护以外，从本发明的丝纺丝液中生产的丝纺织品能够被加工来抵 抗弹道投射(ballisticprojectiles)、火灾和化学品。用于生产所述材料的工艺如WO 2005/045122和US2005268443中所描述。
实施例
实施例1-蜜蜂丝蛋白的重组生产和纯化
为了创造重组表达构建体，使用下列寡核苷酸引物组，通过来自如Sutherland 等人（2006）所述的cDNA克隆的PCR对不含信号肽的四种蜜蜂丝基因序列（基 因库登记号：FJ235088、FJ235089、FJ235090、FJ235091）进行扩增。
AmelF1：GGAATTC（SEQIDNO：101）和CGGCTTATTA（SEQIDNO：102）；
AmelF2：GGAATTCGC（SEQIDNO：103）和CGGCTTATTA（SEQIDNO：104）；
AmelF3：GGAATTC（SEQIDNO：105）和CGGCTTATTA（SEQIDNO：106）；
AmelF4：GGAATTC（SEQIDNO：107）和CGGCTTATTA（SEQIDNO：108）（克隆限制酶位点采用下划线和粗体表示并且与所述cDNA序列匹配的序列采用斜体表示）。
将PCR扩增子克隆至pET14b表达载体（Novagen）的限制酶位点（AmelF1 和AmelF2：BspH1和BamHI；AmelF3：Nco1和BglII；AmelF4：Nco1和BamHI） 并且在表达之前通过DNA测序验证所述序列。
将所述构建体转化成Rosetta2（DE3）感受态细胞（Novagen）并且将所述丝 蛋白在摇瓶内的50ml过夜表达瞬时TB介质（overnightexpressinstantTBmedium， Novagen）中初始表达。所述四种蜜蜂丝蛋白（AmelF1-4）于20℃以可溶性形式 以及于30℃和37℃以不溶性形式在大肠杆菌细胞中合成。如根据在SDS-PAGE（图 1）之后可比较的蛋白质条带强度来判断，当对从所述包涵体中回收的蛋白质在温 度≥30℃进行延长期（24-36h）的表达时，获得最高的蛋白质产率。使用通过质谱 确定的蛋白质鉴别，定量的凝胶条带强度分析表明从所述包涵体中回收的蛋白质 实质上是纯净的（＞95%）丝蛋白。随后的分析发现从包涵体中溶解的蛋白质自身 组装成天然样的结构。因此，所有随后的表达在如此的条件下进行以致从所述包 涵体中回收重组蛋白质。
为了增加蛋白质产率，发展和优化了用于AmelF3的大规模的补料分批发酵工 艺（batchfedfermentationprocess）。使用最小培养基（起始体积1.6升）在2升 BiostatB培养瓶（SartoriusStedim，Melsungen，Germany）中进行发酵。使用葡萄 糖作为初始的碳来源，在采用IPTG的丝蛋白表达诱导之后切换到甘油补料。初始 的介质含有（每升）：KH2PO4，13.3g；(NH4)2HPO4，4g和柠檬酸1.7g。使用2M NaOH将所述介质的pH调节至最终值7.0。将下列成分分别灭菌，然后添加（每 升最终介质）：40ml的50%(w/v)葡萄糖；5ml的1MMgSO4；130μl的0.1M盐 酸硫胺素；1ml的100mg/ml氨苄西林和5ml的维生素/微量金属溶液，所述溶液 含有（每升溶液）：生物素，0.2g；CuSO4·5H2O，2.0g；NaI，0.08g；MnSO4·H2O， 3.0g；Na2MoO4·2H2O，0.2g；硼酸，0.02g；CoCl2·6H2O，0.5g；ZnCl2，7.0g； FeSO4·7H2O，22.0g；CaSO4·2H2O，0.5g和H2SO4，1ml。
用于所述四种株的发酵接种（inocula）在与用于发酵液的相同介质中于37℃ 被培养20h。一旦将所述接种转移到发酵瓶，就通过10%(w/v)NH4OH或10%(w/v) H3PO4的添加将所述介质的pH调节和控制至7.0。将温度控制在37℃，并且通过 操纵搅拌速度高达1100rpm并且当必需时采用纯氧使空气供给丰富将溶解氧（DO） 的浓度维持在40%的空气饱和度以上。
当培养物已经增长至在600nm下的光密度（OD600nm）值大约为20（在接种 之后~10h）时，将IPTG添加至最终浓度为1mM。所述发酵液以批次模式被操作 直至所有的葡萄糖被消费，如通过DO中的骤升所表明的（在接种之后~12h）。在 甘油补料分批阶段，将400ml的62%(v/v)甘油溶液以50ml/h的速率投入到所述 发酵液中。培养物增长24h，之后通过离心收集细胞并于-80℃保存。在这些条件 下，所述发酵液的OD600nm值为34并且溶解后被纯化的重组AmelF3的产率大约 为每升发酵液2.5克。使用相同的发酵条件来表达其他的蜜蜂丝蛋白。表达丝蛋白 AmelF1、2和4的株增长至OD600nm值分别为30、67和57。溶解后被纯化的重组 蛋白质AmelF1、2和4的产率大约分别为每升发酵液0.2、1.5和1.9克。
来自优化的补料分批发酵系统的被纯化的蛋白质的2.5g/L的产率是目前对于 任何重组丝蛋白而言最高的已报道的表达水平。对于这种高产率有贡献的因素包 括所述蜜蜂丝蛋白基因的尺寸和本质以及所述丝蛋白的结构性质。相对于编码被 广泛研究的蜘蛛的蛛丝和家蚕的蚕丝的基因的大尺寸（>10kbp）和高度重复性本 质，所述蜜蜂丝基因是小的（大约1kbp）以及在它们的DNA序列中的远远较少的 重复（Sutherland等人，2006）。所述较小的尺寸和降低的重复水平意味着所述蜜 蜂基因不具有遗传不稳定性的倾向，所述遗传不稳定性包括早发性翻译终止和截 断，其由高度重复性核苷酸序列的转基因表达所致。
根据用于可溶的或包涵体制备的生产商方案，在采用BugBusterMasterMix （Novagen）反复处理之后，包涵体中的所述丝蛋白从大肠杆菌细胞中被纯化。通 过采用4-12%梯度的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（Invitrogen）分析蛋 白质溶液。通过如前所述的衔接的质谱验证重组丝蛋白的鉴别（Sutherland等人， 2006）。
包涵体中的丝蛋白被溶解在3%十二烷基硫酸钠（SDS）中，于60℃的2h孵 育。使用QuantiProBCA分析试剂盒（Sigma）测量溶液中的蛋白质浓度。当必需 时，所述四种重组蜜蜂丝蛋白的每一种的溶液以等摩尔的比例被混合。通过对抗 导致KDS沉淀的5g/LKCl溶液的滤膜分析从蛋白质溶液中除去过量的SDS。通过 在16000g下离心5分钟除去所述沉淀。
实施例2-傅里叶变换红外光谱法（FTIR）
使用傅里叶变换红外光谱法来比较天然的和重组的蜜蜂丝的蛋白质结构。天 然的蜜蜂丝片从市售的蜂房中获得，在氯仿中被充分地洗涤来除去蜡并且在水中 被充分地洗涤来除去水溶性污染物。所述四种重组蜜蜂丝蛋白的每一种的溶液以 等摩尔的比例被混合、浇铸并干燥成薄膜。使用适宜搭配i系列成像红外显微配件 的Perkin-ElmerSystem2000傅里叶变换光谱仪以传输模式获得来自这些样品的红 外光谱。使用Spectrum软件（5.3.1版本）收集光谱并且显示为在4cm-1的分辨率 下收集的256次扫描的平均值。使用Grams/AI软件v5.05进行收集后的数据处理 和分析。每一种丝光谱的酰胺I区域的去卷积如图2所示。对于结果和组分二级结 构归属的总结如表2所示。
表2.FTIR曲线拟合总结
所述FTIR结果表明所述天然的蜜蜂丝含有大约65%的卷曲螺旋结构，其与先 前的基于序列的预测（Sutherland等人，2006）一致。所述重组丝的光谱与所述天 然丝的光谱极其类似，并且估计所述重组丝含有59%的卷曲螺旋结构。
实施例3-干法纺丝
将所述包涵体溶解在3%SDS中来提供可溶性蜜蜂丝蛋白溶液中通常介于 0.5-2重量%至高达3重量%之间的蛋白质。通过KCl沉淀从丝蛋白溶液中除去过 量的SDS。所述钾盐沉淀除去了高达95%，如70-80%，的SDS（通过称量所述沉 淀物）但是＜10%的蛋白质（通过测量溶液中的蛋白质浓度）。通过对抗20重量% 聚乙二醇（PEG，MW8000，Sigma）或Slide-A-Lyzer浓缩溶液（Pierce）的延长 的滤膜分析来浓缩所述丝溶液，直至获得蜂蜜样粘度（10-15重量%左右的蛋白质）。 将已浓缩的丝纺丝液的液滴悬吊在空气中的一副镊子的尖头之间并且将镊子打开 来形成优良的线（图3A）。这些单轴拉伸线在空气中是稳定的但是可溶解在水中。 然后将纤维浸没在90%甲醇10%水浴中，将其第二次拉伸至大约2倍长度，并将 其空气干燥图3B）。所述双轴拉伸线在水中是不可溶的。通过配有起偏振镜头组的 光学显微镜，并且通过ZeissEVOLS15环境扫描电子显微镜检测单轴拉伸和双轴 拉伸纤维。
通过ESEM（未显示）成像的重组丝线的横截面是圆形的并且沿着它们的长度 的直径是相当统一的。单轴拉伸纤维具有粘附于它们表面的小物体，所述小物体 可能是盐的晶体，然而双轴拉伸纤维具有光滑的表面。偏振光显微镜显示单轴拉 伸纤维不是双折射的，但是双轴拉伸纤维是强烈地双折射的（图3）。
通过AustralianSynchrotron的SAXS/WAXS光束线的广角X射线散射来分析单轴拉伸和双轴拉伸纤维以及重组丝薄膜。的波长和0.558m的相机长度提供了大约0.07至的q-范围，使用山嵛酸银标准品校准所述q-范围。通过来自SDS晶体的强信号来控制用于所述薄膜和用于单轴拉伸纤维的所述WAXS模式，但是这在所述双轴拉伸纤维中是不可检测的。本发明人由此计算出双轴拉伸线在每单位长度内含有＜0.1%的所述单轴拉伸线中发现的SDS晶体。或者由于强烈的SDS衍射限制了所述技术的灵敏度，或者由于在非常良好的双轴拉伸纤维的情况下的低信噪比，来自重组丝的蛋白质散射模式不能够被分析。
在InstronTensileTestermodel4501上以2.5mm/分钟的速率测量重组蜜蜂丝线 的强度和延展性。在空气中于21℃和65%相对湿度下进行测试。在测试之前，将 每一种纤维穿过塑料框中的3mm狭槽并且用环氧胶固定。在光学显微镜下测量每 一种纤维的标距长度（L0）和直径。表3比较了重组丝纤维的机械性质和从蜜蜂 丝腺中拉伸的天然纤维的性质。
表3.与天然纤维相比的重组蜜蜂丝纤维的张力性质
实施例4-湿法纺丝
通常如实施例1所描述的制备丝蛋白。通常，在SDS溶解之后的蛋白质浓度 为3%左右的丝蛋白。如果蛋白质溶液具有较低的浓度，则通过对抗20重量%聚乙 二醇（PEG，MW8000，Sigma）或Slide-A-Lyzer浓缩溶液（Pierce）的延长的滤 膜分析来浓缩它们，直至溶液为3-6%的丝蛋白。
将或者AmelF1-4的等摩尔混合物或者单独的AmelF3的已浓缩的蛋白质溶液 通过10cm的100μm毛细管以10m/分钟的速率挤压至甲醇溶液中（50-90%甲醇）， 其导致形成良好的和连续的线。在空气中干燥所述线并通过配有起偏振镜头组的 光学显微镜检测。所述线表现出显著的双折射，表明所述线中的蛋白质呈定向排 列（图4A）。将空气干燥的纤维浸没在90%甲醇10%水浴中并且将其第二次拉伸 至大约2倍长度（图4B）或4倍长度（图4C），并且将其空气干燥。在InstronTensile Testermodel4501上以2.5mm/分钟的速率测量重组蜜蜂丝线的强度和延展性。在 空气中于21℃和65%相对湿度下进行测试。在测试之前，将每一种纤维穿过塑料 框中的3mm狭槽并且用环氧胶固定。在光学显微镜下测量每一种纤维的标距长度 （L0）和直径。
表4和表5描述了未被拉伸的重组丝纤维的机械性质。拉伸过程导致线更加 坚固并且不溶于水，以及具有高度双折射性。
表4.在伴有或不伴有拉伸过程将已浓缩的丝蛋白纺丝液挤压至甲醇之后重组 蜜蜂丝纤维的张力性质
表5.蜜蜂丝纤维的机械性质
1按照(d0/d1)2计算，其中d0和d1是初始的纤维和被拉伸的纤维的直径。
实施例5-圆二色谱（CD）
将所述AmelF3蜜蜂丝蛋白表达至大肠杆菌的包涵体中。使用同等干重的去污 剂十二烷基硫酸钠（SDS）打开AmelF3包涵体来产生2-4%单体蛋白质溶液。采 用动态光散射（DLS）测量出在100mMNaCl中稀释10倍的所述蛋白质-去污剂溶 液中微粒的流体动力学直径为9.2+/-0.1nm（含有98.2%颗粒体积的峰）。在相同 的实验条件下，不含蛋白质的3%SDS溶液中SDS胶束的直径为5.5+/-0.2nm处 的单峰。在SDS-蛋白质溶液中检测不到SDS胶束，证实了大多数所述SDS被结 合到所述蛋白质上。
通过使用KCl除去SDS来重新折叠蛋白质。与SDS相比十二烷基硫酸钾具有 显著较低的溶解度并且从溶液中沉淀出来，其中所述十二烷基硫酸钾能够通过离 心被除去。将所述蛋白质溶液进行对抗水的滤膜分析来降低盐水平，然后通过对 抗PEG8000的滤膜分析进行浓缩，导致3-4%的蛋白质和0.2-0.4%的SDS浓度。 当AmelF3溶液在100mMNaCl（相当于生理学盐水平）中被稀释10倍时，所述 颗粒直径增至20.3+/-0.7nm（含有86.8%颗粒体积的峰），与对于AmelF3卷曲螺 旋所计算的近似颗粒直径一致。
使用配有温度控制器的AVIVModel410分光光度计（AVIVBiomedical,Inc., Lakewood,NJ）采集盛放在0.01mm光程长度的夹心石英池（NovaBiotech,ElCajon, CA）中的蜜蜂AmelF3溶液（0.12%）的CD光谱。于25℃下采用1nm的波段宽 度从260nm至180nm对所有样品进行扫描，并且将四次重复性试验的结果平均 化。AmelF3溶液的CD光谱在220和209nm显示出强烈的光谱极小值，并且1.02 的220nm/209nm比例，其支持了卷曲螺旋结构的存在。一或大于一的220nm/209 nm比例是卷曲螺旋的指标，反之小于0.86的比例则是分离螺旋的指标。DLS测量 表明，在将SDS添加回所述AmelF3溶液中之后，所述流体动力学微粒直径被减 小至在所述原始单体溶液中所观察到的尺寸，证实了对于将所述蛋白质折叠成天 然样丝蛋白构象而言，大多数SDS的去除是先决条件。相比于所述AmelF3蛋白 质，来自亚细亚蜜蜂的同源蛋白的组氨酸标记化重组版本在可比较的浓度下保持 了单体的和随机性占主导的卷曲（Shi等人，2008）。该结果表明，当在低水平的 SDS存在的条件下被制备时，单独的AmelF3发生折叠来采取天然样丝分子结构。
本领域技术人员显而易见的是，在不背离上面广义描述的本发明的精神和范 围的条件下，可以如具体实施方案所示对本发明进行各种改变和/或修饰。因此， 本发明的实施方案被认为是对各方面的说明、而非限制。
本申请要求了2009年8月26日提交的US61/237,156和2010年3月19日提 交的US61/315,812的优先权，将二者的整体内容并入文中以供参考。
将在文中所讨论的和/或所参考的所有出版物以其全文形式并入本文中。
对已经包括在本说明书中的文献、技术、材料、装置、制品等进行的任何讨 论仅仅是为本发明提供内容。不能认为是承认任何或所有这些材料构成了部分现 有技术基础或者是在本申请的每一项权利要求的优先权日之前已经存在的与本发 明相关的领域中的公知常识。
参考文献
Atkins(1967)J.Mol.Biol.24:139-41.
DelorenziandSpeed(2002)Bioinformatics18:617-625.
Harayama(1998)TrendsBiotech.16:76-82.
Hepburn等人(1979)InsectBiochem.9:69-77.
NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453.
Sezutzu等人(2007)Biosci.Biotechnol.Biochem.71:2725-34.
Shi等人(2008)Biomaterials29:2820-8.
Sutherland等人(2006)GenomeRes16:1414-21.
Sutherland等人(2007)MolBiolEvol24:2424-32.