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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510072492.X (22)申请日 2015.02.11 201410764747.4 2014.12.11 CN C07K 14/575(2006.01) C07K 1/107(2006.01) A61K 38/22(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 3/04(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (71)申请人 浙江海昶生物医药技术有限公司 地址 311121 浙江省杭州市余杭区绿汀路 1 号 3 号楼 (72)发明人 陈小元 郎立新 。
2、牛刚 朱雷 赵孝斌 徐松琳 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 徐飞虎 徐关寿 (54) 发明名称 一种聚乙二醇修饰的 exendin 类似物及其制 备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及聚乙二醇衍生物定位修饰的 Exendin 类似物的制备方法及其应用。经聚乙二 醇在 Exendin 类似物的 C 末端特异性修饰后的产 物与未经修饰的 Exendin-4 具有相似的生物活 性， 同时拥有比未修饰的 Exendin-4 更长的体内 半衰期。本发明同时公开了所述的聚乙二醇修饰 的Exendin类似物在治疗II型糖尿病以及心肌梗 死方面的应用， 其具有制备。
3、简便， 疗效明显， 药效 长久、 稳定、 便于储存等优点。本发明在促进抗糖 尿病、 抗心肌梗死的高效治疗以及新药研发中具 有重要意义。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书10页 附图5页 CN 105985425 A 2016.10.05 CN 105985425 A 1/2 页 2 1.一种聚乙二醇修饰的 exendin-4 衍生物， 其结构式为 ： mPEG-L-S-CysEX4 (I) 其中， mPEG 为直链或具有支链结构的聚乙二醇， 其结构式表示为 RO(CH2CH2O) n-CH2CH2。
4、-， n 为 25-2500 的整数， R 是氢、 直链或支链的 C1-C20烷基、 环烷基、 烯基或芳基 ； L 表示连接基团， 选自如下的基团结构 ： -S-、 碘代乙酰基、 吡啶基二硫酚等 S 为硫原子 ； CysEX4 表示 exendin-4 类似物， 所述的 CysEX4 具有如下所示的序列 ： His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Glu-Glu-AIa -Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-。
5、Xaa -Xaa-Ser-Cys ； 其中 ： 第 2 位的 Xaa 是 Gly， Thr， Ala， Ser， Leu， Ile 或 Lys ； 第 10 位的 Xaa 是 Leu， Ala， Ser， Ile， Thr,Glu， 或 Lys ； 第 12 位的 Xaa 是 Lys， Leu， Thr， Ser， Gly， 或 Ile ； 第 13 位的 Xaa 是 Gln， Thr， Ala， Val， Leu， Ile 或 Lys ； 第 14 位的 Xaa 是 Met， Tyr， Thr， Ala， Ser， Ile 或 Lys ； 第 19 位的 Xaa 是 Val， Ala,Ser。
6、,Leu,Ile 或 Lys ； 第 20 位的 Xaa 是 Arg,Thr,Tyr,Ser,Leu,Ile 或 Lys ； 第 21 位的 Xaa 是 Leu,Thr,Ala,Asp,Glu,His 或 Lys ； 第 24 位的 Xaa 是 Glu,Leu,Thr,Ala,Ser,Lys 或 Ile ； 第 27 位的 Xaa 是 Lys,Ala,Ser,Leu,Thr,Ile 或 Arg ； 第 28 位的 Xaa 是 Asn,Thr,Ala,Ser,Leu,Ile 或 Lys ； 第 30 位的 Xaa 是 Gly,Thr,Ala,Ser,Leu,Ile 或 Arg ； 第 31 位的。
7、 Xaa 是 Pro,Val,Ser,Ala,Leu,Ile 或 Lys ； 第 32 位的 Xaa 是 Ser,Thr,Glu,Ser,Asp,Lys 或 Ile ； 第 33 位的 Xaa 是 Ser,Thr,Ala,Met,Leu,Ile 或 Lys ； 第 34 位的 Xaa 是 Gly,Thr,Met,Ser,Ile,Leu 或 Lys ； 第 35 位的 Xaa 是 Ala,Thr,Ala,Glu,Leu,Ile 或 Phe ； 第 36 位的 Xaa 是 Pro,Ala,Thr,Ser,Leu, 或 Ile ； 第 37 位的 Xaa 是 Pro,Thr,Ser,Ala,His,。
8、Lys 或 Ile ； 第 38 位的 Xaa 是 Pro,Thr,Val,Ser,Leu,Lys 或 Ile ； L-S-CysEX4 表示所述的 exendin-4 类似物通过第 40 位 Cys 巯基上的硫原子与 L 相连 接。 权 利 要 求 书 CN 105985425 A 2 2/2 页 3 2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的exendin-4衍生物， 其特征在于， 所述的聚乙 二醇可以是线性的、 分枝的、 分叉的或者由多个臂组成， 不同的聚乙二醇可以具有不同的聚 合链长度和聚合结构。 3.根据权利要求 1 所述的聚乙二醇修饰的 exendin-4 衍生物， 其特征在于， 所述。
9、的 CysEX4 具有如 Seq ID No.1-Seq ID No.12 所示的序列。 4.一种制备权利要求 1 所述的聚乙二醇修饰的 exendin-4 衍生物的方法， 包括如下步 骤 ： (1) 在反应溶剂中， 带有巯基反应基团的聚乙二醇分子与 CysEX4 多肽中的游离 Cys 反 应 ； (2) 任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的 CysEX4 多肽产物。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述方法步骤(1)中的聚乙二醇分子选自 甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺， 甲氧基聚乙二醇乙烯磺酸， 甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺， 甲氧 基聚乙二醇邻氮苯基二硫化物或甲氧基聚乙二醇吡啶基二。
10、硫酚等各种类型。 6.根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述方法步骤 (1) 中的聚乙二醇分子与 CysEX4 多肽偶联反应中， 进一步可使用还原剂， 还原剂选自 NaCNBH3或三乙胺。 7.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述方法步骤(2)中反应体系可以使用离 子交换层析、 疏水层析、 分子筛层析、 反向高效液相色谱或其组合进行分离和提纯。 8.一种药物组合物， 其包含治疗有效量的权利要求 1 所述的聚乙二醇修饰的 exendin-4 衍生物、 能够维持制剂在水溶液状态下 pH 值为 3.0-7.0 的缓冲液和其他药学上 可接受的稳定性辅料。 9.权利要求 1 所述的。
11、聚乙二醇修饰的 Exendin-4 衍生物在用于制备治疗 GLP-1/GLP-1 受体通路相关疾病的药物中的应用。 10.权利要求 1 所述的聚乙二醇修饰的 Exendin-4 衍生物在用于制备治疗心肌缺血性 损伤的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 105985425 A 3 1/10 页 4 一种聚乙二醇修饰的 exendin 类似物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 具体涉及一种聚乙二醇 (PEG) 修饰的 Exendin 类似物 及其制备方法及其在药物制备中的应用。 背景技术 0002 胰高血糖素肽-1(以下称为GLP-1)的功能主要是诱导体内各种生。
12、物学效应， 包括 刺激胰岛素的分泌， 抑制胰高血糖素的分泌， 促进饱腹感， 抑制胃肠的蠕动， 增加葡萄糖的 摄取并减轻体重。有报道称 GLP-1 能有效预防 II 型糖尿病的发展引起的胰腺细胞病变， 在 非胰岛素依赖型糖尿病 (NIDDM) 中， GLP-1 能够促进新生细胞的生长， 恢复胰岛素的分泌。 GLP-1 具有促进胰岛素的分泌却不降低血糖方面的显著地特性。此外， GLP-1 的注射不会引 起任何毒副作用。因此 GLP-1 在治疗 II 型糖尿病方面是非常有用的。 0003 然而， GLP-1 的广泛应用却存在一个瓶颈问题， 即 GLP-1 体内半衰期短。详细的 说， GLP-1 是一。
13、种内源性二肽基肽酶 -IV(DPP-IV) 的底物， DPP-IV 通过移除 GLP-1N- 末端 组氨酸 - 丙氨酸的二肽部分 ( 氨基酸 7 和 8) 使 GLP-1 失活， 使得 GLP-1 生物周期短。目 前有许多方法可以减少 GLP-1 的降解或者延长 GLP-1 在血浆中的寿命， 同时保持其生物活 性， 这些方法包括使用 DPP-IV 抑制剂 (， 使用 GLP-1 受体和 GLP-1 衍生物反应的配体， 如 Exendin。Exendin 是 John Eng( 美国专利号 ： 5.424.286) 从南美产毒蜥的唾液分泌物中 分离和鉴定出的天然产物， 它属于多肽类分子， 能够降。
14、低血液葡萄糖含量。Exendin-4 与 GLP-1(7-36)-NH2具有高度同源性， 其序列如下 ： 0004 H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-G lu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 0005 在体内试验中， 发现 Exendin-4 的半衰期大大高于 GLP-1， 为 2 到 4 小时， 每天腹 部注射 2 到 3 次， Exendin。
15、-4 在血液中即可达到足够的含量。此外， 由于 Exendin-4 能够调 节胃肠蠕动， 减少摄取食物并且抑制血液中胰高血糖素 ( 美国专利号 ： 6858576,6956026， 6872700)。 Exendin-4于2005年4月获美国FDA批准， 用于改善使用二曱双胍和磺酰脲类药 物作用不理想的 II 型糖尿病患者的血糖控制。临床结果显示， Exendin-4 用于糖尿病治疗 效果明显， 且副反应较小， 但是每天两次的皮下给药给病人带来很多不便。由于 Exendin-4 在 II 型糖尿病治疗机理方面具有明显优势， 开发其长效类似物是很多国外制药公司研发 热点之一。 0006 聚乙二醇。
16、 (PEG)， 基本结构为 HO-(-CH2CH2O-)n-H， 具有很强的亲水性， 通过 PEG 修 饰的多肽或蛋白类药物具有溶解性好， 免疫原性低， 血液中保留时间长的有点。另外 PEG 与药用的多肽分子适当结合， 可以增加其分子量， 保护其免受肾小球滤过， 避免被蛋白酶 水解。当 PEG 分子量为 1000 或更高时， PEG 呈现低非常低的毒性。当其分子量在 1000 到 6000 之间时， PEG 能够分布全身并通过肾脏代谢。当 PEG 分子量在 1000 到 100000 范围内 时， PEG 可以正确的偶联到多肽上。当 PEG 具有约 40000 分子量时， 它可以在血液， 肝脏。
17、中 说 明 书 CN 105985425 A 4 2/10 页 5 分布并在肝脏中进行代谢。虽然 PEG 具有这些优点， 但是 PEG 的共价修饰可能会影像蛋白 质构想从而改变蛋白的生物功能。例如， 如果 PEG 与氨基酸残基的随机结合， 那么可能会导 致多种 PEG- 蛋白复合物， 则需要复杂工序分离纯化混合物中所需要的化合物 ； 另外， PEG 通 过共价键与蛋白质上的赖氨酸残基偶联， 如果此赖氨酸的残基负责蛋白质的活性， 那么 PEG 偶联的蛋白质就不能表现出原有的生物功能， 甚至活性降低乃至丧失。 0007 目前已经有多种尝试将 PEG 修饰 Exendin-4 多肽， 从而开发出长效。
18、稳定的糖尿病 治疗药物。目前常用的 Exendin-4 多肽的 PEG 修饰多为利用 Exendin-4 序列中的赖氨酸 实现修饰。例如美国专利 NO.6924264 中阐述， 使用分子量从 5000 到 12000 道尔顿的 PEG 的分子通过与赖氨酸的 - 氨基通过共价键结合而形成的 Exendin-4 类似物与未经修饰 的 Exendin-4 相比， 具有更长的半衰期， 同时保留了原有的生物活性。但是， 由于序列中的 赖氨酸在 Exendi-4 与其受体结合时， 需要发挥一定作用， 通过此类方法定点或随机的修饰 Exendin-4 分子在与其受体结合时， 由于 PEG 的存在导致 Exe。
19、ndin-4 与受体结合力减弱， 进 而明显的降低 Exendin-4 的生物活性。另外， 采用随机标记法， 所得到的产物复合物在分离 纯化上则受到很大挑战， 增加了生产制备成本。以上两点严重限制了 Exendin-4 在临床上 的进一步应用。 发明内容 0008 本发明所要解决的一个技术问题是克服目前对Exendin-4进行修饰例如PEG化修 饰时专一性差的缺点， 提供一种对 Exendin-4 多肽及其衍生物进行定点聚乙二醇 (PEG) 化 修饰后的产物， 并仍然能保持 Exendin-4 生物学活性同时延长其半衰期。 0009 为此， 本申请发明人通过深入的研究， 明确 Exendin-。
20、4 与其细胞中受体的结合作 用， 对 exindin-4 多肽 1-39 位的氨基酸位点进行了结构化改造， 包括但不限于常规的氨基 酸的替代， 氨基酸位点直接的置换及化学的修饰等， 并在其氨基酸序列的末端增加一个半 胱氨酸， 经改造后的多肽命名为 CysEX4， 所获得的 Exendin 类似物基本保留 Exendin-4 的 天然生物活性。并依此为理论根据设计了新的 PEG 修饰方法， 由于在 Exendin 类似物的 C 末端定点引入半胱氨酸从而可进行定点 PEG 修饰， 此 Exendin 类似物 -PEG 复合物不会影响 Exendin 类似物与其受体的结合能力， 继而在保留 Exen。
21、din-4 的天然生物活性的同时延长 了 Exendin-4 或其类似物在体内的存留时间。 0010 此 Exendin 类似物 -PEG 具有良好的药代动力学和药理效应， 和天然 Exendin-4 相 比， 这种复合物在治疗糖尿病中减少了注射剂量和注射次数。 0011 一方面， 本发明提供了聚乙二醇修饰的 exendin-4 衍生物， 其结构式为 ： 0012 mPEG-L-S-CysEX4 (I) 0013 其中， mPEG 为直链或具有支链结构的聚乙二醇， 其结构式表示为 RO(CH2CH2O) n-CH2CH2-， n 为 25-2500 的整数， R 是氢、 直链或支链的 C1-C。
22、20烷基、 环烷基、 烯基或芳基 ； 0014 L 表示连接基团， 选自如下的基团结构 ： 说 明 书 CN 105985425 A 5 3/10 页 6 0015 -S-、 碘代乙酰基、 吡啶基二硫酚等 0016 S 为硫原子 ； 0017 CysEX4 表示 exendin-4 类似物， 所述的 CysEX4 具有如下所示的序列 ： 0018 His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Glu-Glu -Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-。
23、Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-X aa-Xaa-Xaa-Ser-Cys ； 0019 其中 ： 0020 第 2 位的 Xaa 是 Gly， Thr， Ala， Ser， Leu， Ile 或 Lys ； 0021 第 10 位的 Xaa 是 Leu， Ala， Ser， Ile， Thr,Glu， 或 Lys ； 0022 第 12 位的 Xaa 是 Lys， Leu， Thr， Ser， Gly， 或 Ile ； 0023 第 13 位的 Xaa 是 Gln， Thr， Ala， Val， Leu， Ile 或 Lys ； 0024 第 14 位的 Xaa 是 Met， Tyr， Thr。
24、， Ala， Ser， Ile 或 Lys ； 0025 第 19 位的 Xaa 是 Val， Ala,Ser,Leu,Ile 或 Lys ； 0026 第 20 位的 Xaa 是 Arg,Thr,Tyr,Ser,Leu,Ile 或 Lys ； 0027 第 21 位的 Xaa 是 Leu,Thr,Ala,Asp,Glu,His 或 Lys ； 0028 第 24 位的 Xaa 是 Glu,Leu,Thr,Ala,Ser,Lys 或 Ile ； 0029 第 27 位的 Xaa 是 Lys,Ala,Ser,Leu,Thr,Ile 或 Arg ； 0030 第 28 位的 Xaa 是 Asn,T。
25、hr,Ala,Ser,Leu,Ile 或 Lys ； 0031 第 30 位的 Xaa 是 Gly,Thr,Ala,Ser,Leu,Ile 或 Arg ； 0032 第 31 位的 Xaa 是 Pro,Val,Ser,Ala,Leu,Ile 或 Lys ； 0033 第 32 位的 Xaa 是 Ser,Thr,Glu,Ser,Asp,Lys 或 Ile ； 0034 第 33 位的 Xaa 是 Ser,Thr,Ala,Met,Leu,Ile 或 Lys ； 0035 第 34 位的 Xaa 是 Gly,Thr,Met,Ser,Ile,Leu 或 Lys ； 0036 第 35 位的 Xaa 是。
26、 Ala,Thr,Ala,Glu,Leu,Ile 或 Phe ； 0037 第 36 位的 Xaa 是 Pro,Ala,Thr,Ser,Leu, 或 Ile ； 0038 第 37 位的 Xaa 是 Pro,Thr,Ser,Ala,His,Lys 或 Ile ； 0039 第 38 位的 Xaa 是 Pro,Thr,Val,Ser,Leu,Lys 或 Ile ； 0040 L-S-CysEX4 表示所述的 exendin-4 类似物通过第 40 位 Cys 巯基上的硫原子与 L 相连接。 0041 优选的， CysEX4 多肽选自如下序列的多肽 ： 0042 Seq ID No.1: 0043。
27、 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-P ro-Pro-Pro-Ser-Cys ； 0044 Seq ID No.2: 说 明 书 CN 105985425 A 6 4/10 页 7 0045 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Arg。
28、-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-P ro-Thr-Pro-Ser-Cys ； 0046 Seq ID No.3: 0047 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Ile-Arg-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-L eu-Pro-Lys-Ser-Cys ； 0048 Seq ID No.4: 0049 His-Se。
29、r-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ile-Gln-Ala-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Tyr-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Thr-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-P ro-His-Pro-Ser-Cys ； 0050 Seq ID No.5: 0051 His-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Lys-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Thr-Asn-Gly-Ar。
30、g-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-P ro-Pro-Val-Ser-Cys ； 0052 Seq ID No.6: 0053 His-Lys-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Ala-Ser-Lys-Gln-Tyr-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Ile-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-P ro-Pro-Pro-Ser-Cys ； 0054 Seq ID No.7: 0055 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Glu-Ser-L。
31、ys-Thr-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Ser-Gly-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-Phe-P ro-Pro-Pro-Ser-Cys ； 0056 Seq ID No.8: 0057 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-L eu-Thr-Pro-Ser-。
32、Cys ； 0058 Seq ID No.9: 0059 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Lys-Thr-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ser-Ile-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-P ro-Pro-Pro-Ser-Cys ； 0060 Seq ID No.10: 0061 His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Arg-Le。
33、u-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ala-Asn-Gly-Gly-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-P ro-Pro-Ile-Ser-Cys ； 0062 Seq ID No.11: 0063 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Ser-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Lys-Tyr-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Thr-Ile-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-P ro-Pro-Pro-Ser-Cys ； 说 明 书 CN 105985425 A 7 5/10 页 8。
34、 0064 Seq ID No.12: 0065 His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Glu-Ser-Leu-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu -Ala-Ala-Lys-His-Phe-Ile-Thr-Trp-Leu-Ser-Ala-Gly-Leu-Ile-Ser-Ser-Gly-Ala-P ro-Pro-Pro-Ser-Cys ； 0066 CysEX4 可以通过化学合成获得。CysEX4 多肽的化学合同可通过本领域公知的标 准多肽固相合成技术合成， 可以采用叔丁氧羰基 (Boc) 和芴甲氧羰基 (Fmoc) 两种 N 端保护 策略。例如采用 Fmo。
35、c 策略时， 可按照树脂固相合成的方法依次连接相应氨基酸， 期间依次 脱去 Fmoc- 保护基团， 然后切肽， 获得粗品， 粗品经 C18 柱分离纯化， 即可制得 CysEX4 多肽。 0067 CysEX4 多肽也可通过基因工程重组表达的方式获得。根据设计好的 CysEX4 多 肽序列， 可以确定该多肽序列的基因序列， 然后用本领域公知的方法将含编码 CysEX4 多 肽序列的核酸克隆到各种表达载体中去， 在原核或真核细胞中重组表达， 经纯化后即可得 到 CysEX4 多肽， 所用标准的分子克隆过程见 J. 萨姆布鲁克等 (J. 萨姆布鲁克等，分子克 隆实验指南 第二版， 科学出版社， 19。
36、95) 的叙述。重组表达时， 原核表达载体可包括例如 质粒如 pRSET、 pET 和 pBAD 等， 其中可采用的启动子有例如 lac、 trc、 trp、 recA 或 araBAD 等。用于在酵母中表达的真核表达载体如 pAO， pPIC， pYES， pMET 等， 其中可使用诸如 AOX1， GAP， GAL1， AUG1 等的启动子。用于在哺乳动物细胞中表达的载体如 pSVL， pCMV， pRc/RSV， pcDNA3， pBPV 等， 其中可使用诸如 CMV， SV40， EF-1， UbC， RSV， ADV， BPV 和 肌动蛋白等的 启动子。在一个优选的实施方案中， 所述。
37、 Exendin 类似物在大肠杆菌、 酵母或哺乳动物细胞 体系中进行表达， 并且使用经过密码子优化的编码序列。 0068 CysEX4 多肽由于氨基酸序列中只存在一个游离的 Cys， 因此， 带有巯基反应基团 的聚乙二醇反应试剂可以和 CysEX4 多肽中的巯基基团特异性的结合 , 获得聚乙二醇定点 单修饰的产物。所述的聚乙二醇反应试剂包括甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺， 甲氧基聚乙二 醇乙烯磺酸， 甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺， 甲氧基聚乙二醇邻氮苯基二硫化物、 甲氧基聚乙 二醇吡啶基二硫酚等各种类型， 但其类型并不限于此。优选的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇 马来酰亚胺。 0069 所述的聚乙二醇分子量范。
38、围为 1-100kDa， 优选范围为 2-60KDa， 更优选的范围为 20-40KDa。聚乙二醇可以是线性的、 分枝的、 分叉的或者由多个臂组成， 不同的聚乙二醇可 以具有不同的聚合链长度和聚合结构。合适的分支 PEG 可按照美国专利 No.5,932,462 中 所述进行制备， 该专利的全部公开内容通过参考并入本文。所述分叉 PEG 是指在靠近聚合 物链一端的地方具有分支的 PEG， 分叉 PEG 的主链可以是直链或支链的。 0070 本发明中的聚乙二醇是所属领域中已知的， 其可通过多种途径得到， 包括例如通 过商业途径获得， 如 Nektar Inc.,CarboMer Inc.， Th。
39、e Dow Chemical Company 等等， 或者 根据本领域中已知的方法自行制备。 0071 本发明还提供了一种制备聚乙二醇修饰 CysEX4 多肽的方法， 其包括如下步骤 ： 0072 (1) 在反应溶剂中， 带有巯基反应基团的聚乙二醇分子与 CysEX4 多肽中的游离 Cys 反应 ； 0073 (2) 任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的 CysEX4 多肽产物。 0074 在一个实施方案中， 在步骤 (1) 的 PEG 与 CysEX4 多肽偶联反应中， 进一步可使用 还原剂， 还原剂包括 NaCNBH3 或三乙胺， 但并不限于此。 说 明 书 CN 105985425 。
40、A 8 6/10 页 9 0075 反应过程中， 所用反应溶剂没有特别的限制， 通常是本领域中经常使用的缓冲液， 所选择的缓冲液要与聚乙二醇的反应条件相匹配。优选的缓冲液可选择乙酸盐缓冲液， 柠 檬酸盐缓冲液， 硼酸盐缓冲液， 磷酸盐缓冲液或有机溶剂 ( 优选 DMSO) 等， 优选磷酸盐缓冲 液。 0076 所述的聚乙二醇反应试剂包括甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺， 甲氧基聚乙二醇乙烯 磺酸， 甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺， 甲氧基聚乙二醇邻氮苯基二硫化物、 甲氧基聚乙二醇吡 啶基二硫酚等各种类型， 但其类型并不限于此。优选的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇马来酰 亚胺。 0077 所述的聚乙二醇分子分子量范。
41、围为 1-100kDa， 优选范围为 2-60KDa， 更优选的范 围为20-40KDa。 聚乙二醇为直链状或者分支状， 优选的PEG结构中含有两个或更多的支链， 最好的 PEG 具有三个支链。 0078 反应过程中， CysEX4 多肽和聚乙二醇及其衍生物反应的摩尔比范围为 1:1-4， 优 选为 1:1-2。摩尔比的选择取决于各种因素， 包括 PEG 及其衍生物的分子结构、 分子量、 PH、 反应温度和反应时间等。例如， 每摩尔的 CysEX4 多肽需要使用 1 到 2 摩尔的甲氧基聚乙二 醇马来酰亚胺。 0079 在本发明中， 未反应的物质可以通过典型的透析方法来去除， 例如在适当的缓冲。
42、 液中透析， 如可以使用乙酸盐缓冲液， 柠檬酸盐缓冲液， 硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。 0080 在本发明中， 反应体系可以使用离子交换层析、 疏水层析、 分子筛层析、 反向高效 液相色谱或其组合进行分离和提纯。 0081 PEG 修饰 Exendin-4 衍生物作为药物活性成分， 可以制备成各种口服或注射剂量 类型。制备为注射剂型是， 所述的药物组合物包含治疗有效量的聚乙二醇修饰的 CysEX4 多 肽或其衍生物、 能够维持制剂在水溶液状态下pH值为3.0-7.0的缓冲液和其他药学上可接 受的稳定性辅料。缓冲液可任选自磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 磷酸缓冲液、 醋酸缓冲液、 巴比妥钠缓冲液。
43、或柠檬酸缓冲液， 浓度为 5-100mmol/L， 优选 10-30mmol/L， 最优选 20mmol/ L ； 缓冲液的 pH 范围在 3.0-7.0， 优选 4.0-6.0。稳定性的辅料可选用甲硫氨酸、 葡萄糖、 蔗 糖、 甘露醇或甘氨酸的一种或几种， 辅料浓度 ( 重量 / 溶液体积， w/v) 为 1 -6， 优选为 2 -4。根据需要， 还可将上述的药物制剂制备为冻干粉针， 冻干前的液体制剂基本上为 等张和或等渗的， 因此冻干后加入适量的注射用水能够还原形成等张或等渗溶液。 0082 口服的试剂包括片剂， 丸剂， 粉剂， 颗粒剂和胶囊剂。这些固体形式通常配制至少 需要一种辅料成分，。
44、 如， 如淀粉， 碳酸钙， 蔗糖， 乳糖， 或明胶。除了辅料成分之外， 还有润滑 剂， 例如使用硬脂酸镁或滑石。液体形式的口服剂， 包括悬浮液， 体内使用的液体， 乳剂， 和 糖浆剂。这些剂型可包括湿润剂， 甜味剂， 风味剂和 / 或防腐剂， 亦或简单的稀释剂， 如液体 或液体石蜡。注射的制剂包括无菌水溶液， 非水溶剂， 悬浮剂， 乳剂， 冻干剂， 和栓剂。非水 溶剂或悬浮液， 包括丙二醇， 聚乙二醇， 植物油， 例如橄榄油， 以及可注射的酯， 如油酸乙酯。 0083 以 exendin-4 序列为基础所衍生的作为 GLP-1 受体结合的 CysEX4 多肽衍生物均 可以通过本发明中所述方法定。
45、点修饰 PEG 分子。经过 PEG 分子修饰的 CysEX4 多肽衍生物 在保持原有 Exendin-4 生物活性的基础上， 具备了更长的体内半衰期。此外， 限制修饰位置 和 PEG 及其衍生物的数量可以减少各种因素引起的副作用。 0084 本发明的另一方面还提供了所述的聚乙二醇修饰的 Exendin-4 衍生物用于治疗 说 明 书 CN 105985425 A 9 7/10 页 10 GLP-1/GLP-1 受体通路相关疾病的应用。这些聚乙二醇修饰的 Exendin-4 或 Exendin-4 衍 生物的应用包括 ： 利用聚乙二醇修饰的CysEX4多肽其衍生物对GLP-1/GLP-1受体通路。
46、相关 疾病的影像学诊断以及疗效监测 ； 利用聚乙二醇修饰的 CysEX4 多肽或其衍生物对 GLP-1/ GLP-1 受体通路相关疾病的治疗。 0085 聚乙二醇修饰的 CysEX4 多肽及其衍生物， 通过引起胰岛素的过量分泌在疾病的 预防和治疗中起作用， 例如糖尿病和肥胖， 并导致降低血浆葡萄糖含量， 抑制胃肠蠕动， 促 进饱腹感， 或抑制食物的摄取， 如过敏性结肠综合征。 0086 发明人还意外发现， 聚乙二醇修饰的 CysEX4 多肽或其衍生物， 能够通过 GLP-1 受 体而激活 cAMP 和磷脂酸肌醇 -3 激酶， 从而治疗心肌缺血性损伤。另外， GLP-1 能够活化抗 氧化酶而减轻。
47、心肌缺血所引起的纤维化， 并促进左心室的功能恢复。 0087 发明人意外发现， 接受聚乙二醇修饰的 CysEX4 多肽或其衍生物注射治疗的动物 组在心肌梗死后血管新生情况得到显著改善， 心肌缺血组仅发生较弱的间质纤维化， 心肌 细胞未见明显肥大 ； 而未经修饰的 Exendin-4 和生理盐水注射组未能表现出明显的血管新 生能力提高或明显的对间质纤维化情况的改善， 心肌细胞肥大现象较为明显。这显示聚乙 二醇修饰的 CysEX4 多肽或其衍生物可应用治疗治疗心肌缺血性损伤， 这一发现在现有技 术文献中从未报道。 0088 因而， 本发明的另一个实施方案中， 还涉及聚乙二醇修饰的 CysEX4 多。
48、肽或其衍生 物在制备治疗心肌缺血性损伤的药物中的应用。 0089 本发明所述的 PEG 修饰 Exendin-4 衍生物剂量取决于各种因素， 包括体重， 年龄， 性别， 身体状况， 饮食， 给药时间， 给药途径， 代谢率和疾病的严重程度。一般来说， 一到两 个星期时间内通过不同的给药途径观察药物被完全吸收的有效剂量， 在每日有效剂量范围 内， 本发明的复合物可能一次给药， 或每日多次给药。 附图说明 0090 图 1 ： 高效液相色谱法分析修饰后的 Exendin-4 衍生物纯度。 0091 图 2 ： 体外细胞水平上比较不同修饰方法的 Exendin-4 衍生物与受体的结合。与 未经修饰的E。
49、xendin-4相比， 经过修饰的Exendin-4衍生物与受体的结合力未受较大影响。 0092 图 3 ： 不同 Exendin-4 衍生物的药代动力学分析。与未经修饰的 Exendin-4 相比 较， 经过修饰的Exendin-4衍生物在血液内半衰期得到明显延长。 未经过修饰的Exendin-4 半衰期为 6.8 小时， 经过 PEG 修饰的 Exendin-4 衍生物半衰期为 41.2 小时。 0093 图 4 ： 不同 Exendin-4 衍生物的药效动力学分析。与未经过修饰的 Eendin-4 相比 较， 经过 PEG 修饰的 Exendin-4 衍生物注射小鼠体内血糖浓度明显下降并恢复缓慢。 0094 图 5 ： 心肌梗死小鼠模型经过 Exendin-4 治疗后的生存曲线。与未经过修饰的 Exendin-4 相比， 经过 PEG 修饰的 Exendin-4 衍生物明显延长了心肌梗死小鼠的存活时间。 0095 图 6 ： 免疫荧光染色分析心肌梗死病变部位的血管分布。与未经治疗和经过未修 饰 Exendin-4 治疗的组织相比， 经过 PEG 修饰的 Exendin-4 衍生物治疗组的心肌梗死病变 部分新生血管更加丰富， 表现了较好的。