技术领域
本发明属于水产经济动物基因工程育种技术领域，涉及一种提高鱼类omega-3多不饱和 脂肪酸的方法及应用，具体涉及促进多不饱和脂肪酸合成的两个去饱和酶fat2和fat1重组 基因，涉及这两个重组基因表达载体的制备方法，还涉及这两个重组基因共同配合使用的方 法，以及该方法在鱼类基因工程育种中的用途。
背景技术
Omega-3多不饱和脂肪酸，包括DHA和EPA是一类有利于人体健康的脂肪酸。越来越 多的流行病学和临床调查表明，EPA和DHA对很多疾病有预防和缓解的作用，这些疾病包 括动脉粥样硬化、心血管疾病、中风、神经疾病、肥胖、2型糖尿病、癌症和自身免疫疾病。 但是，包括人类在内的高等动物，缺少omega-3去饱和酶和delta-12去饱和酶，因此失去从 头合成这类脂肪酸的能力(Nakamura,2004)，必需从食物中获取这类脂肪酸。
深海鱼类是omega-3脂肪酸的主要来源。从头合成的长链omega-3多不饱和脂肪酸的主 要来源是海洋中的藻类，海洋鱼类通过摄食这些富含omega-3脂肪酸的海藻，使得omega- 3多不饱和脂肪酸在它们体内积累。目前，海洋渔业资源逐渐地枯竭(FAO,2012)。鱼粉价 格的上升，使得水产养殖中使用植物油脂和植物蛋白替代传统生产中使用的鱼油和鱼粉(Mi ller,2008)。这使得水产养殖鱼类中omega-3脂肪酸含量不断降低。这些矛盾和问题迫使人 们不断寻找和开发新的omega-3脂肪酸的食物来源。
转基因技术作为一种新的育种手段(Chen,1996)(Fu,2005)(Zhu,2000)，可以赋予转基因 动物本身不具备的能力。运用转基因技术促进鱼类多不饱和脂肪酸的合成已经在斑马鱼这种 模式动物中尝试。这些研究的主要策略是通过转基因过表达涉及长链多不饱和脂肪酸合成的 延长酶和去饱和酶(Alimuddin,2005;Alimuddin,2008;Alimuddin,2007;Kabeya,2014)，这些 延长酶和去饱和酶能够以18:2n-6和18:3n-3底物，进一步合成长链的ARA、EPA和DHA 多不饱和脂肪酸。
然而，包括斑马鱼在内的淡水鱼类自身拥有脂肪酸去饱和酶和延长酶(Monroig,2011)。 淡水鱼从食物摄取短链不饱和脂肪酸（如18:2n-6,或18:3n-3）后，它们可以通过去饱和酶和 延长酶生成长链多不饱和脂肪酸（20:4n-6,或20:5n-3）。并且omega-3长链多不饱和脂肪酸E PA和DHA的生成是底物浓度依赖(Senadheera,2011)(Thanuthong,2011)，即18:3n-3浓度依 赖的。在鱼类中过表达脂肪酸去饱和酶和延长酶基因，从而提高长链多不饱和脂肪酸的合成 通路活性，这种策略并不能从根本上解决鱼类缺少从头合成omega-3多不饱和脂肪酸能力的 问题，即不能从头生成18:3n-3的能力。
fat2基因是线虫中的一个delta-12去饱和酶基因，它可以将18:1转化成18:2n-6(Peyou- Ndi,2000)，是一个填补不饱和脂肪酸从头合成通路断裂的一个重要的去饱和酶基因。fat1 基因是在线虫中的一个omega-3去饱和酶，它可以将omega-6不饱和脂肪酸转变成omega- 3不饱和脂肪酸(Spychalla,1997;Kang,2001),如将18:2n-6转变成18:3n-3；20:4n-6转变成2 0:5n-3。因此，我们提出，同时将两个脂肪酸去饱和酶fat2和fat1基因引入鱼类中，可以使 鱼类获得从头合成omega3多不饱和脂肪酸的能力，即从18:1生成18:2n-6，18:2n-6生成1 8:3n-3；通过两个脂肪酸去饱和酶基因的同时配合作用，一方面fat2和fat1为omega-3长链 多不饱和脂肪酸的生成提供更多的18:3n-3底物，另一方面，fat1基因还可以将omega-6长 链多不饱和脂肪酸转变成omega-3长链多不饱和脂肪酸。因此，fat2和fat1重组基因的同时 使用，可以增加鱼类的omega-3脂肪酸含量。这种方法为omega-3多不饱和脂肪酸的获取提 供了新的食物来源。
发明内容
本发明的目的是提供了一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法，方法简单，易行， 可获得富含omega-3多不饱和脂肪酸的经济鱼类，适于大规模生产。
本发明的另一个目的是提供了一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法的应用，通 过将delta-12去饱和酶fat2基因和omega-3去饱和酶fat1基因通过转基因技术同时引入鱼类 中，这两个基因的配合使用，填补了鱼类omega-3多不饱和脂肪酸合成通路的两处断裂，使 鱼类获得从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力。其中，鱼类密码子优化的delta-12脂肪 酸去饱和酶（fat2）基因，delta-12去饱和酶可以将18:1转变成18:2n-6，从而填补了鱼类多 不饱和脂肪酸从头合成通路的第一个断裂。omega-3去饱和酶fat1基因可以将18:2n-6和20: 4n-6转化为18:3n-3和20:5n-3，填补了鱼类多不饱和脂肪酸从头合成通路的第二个断裂。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
设计和获得鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因，其步骤如下：
1）根据线虫的delta-12去饱和酶基因的氨基酸序列和斑马鱼的密码子偏好，设计鱼类密码 子优化的delta-12去饱和酶fat2基因序列，其序列为SEQIDNO.1所示，编码的蛋白质序 列为SEQIDNO.4所示。
2）人工合成鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因序列。
构建fat2和fat1转基因表达载体，其具体步骤如下：
A、构建含有绿色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-S V40poly(A)；
1）获得pTol2-SV40载体
设计含有多克隆位点的自退火引物：
MCS-F：CCGCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCT
MCS-R：CTATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAA。
通过PCR自退火获得一段两侧含XhoI和XbaI酶切位点，中间含有SalI、EcoRI、HindI II和BamHI4个酶切位点的片段。用XhoI和XbaI酶切4xKGFP质粒(Distel,2009)，保留 该质粒上的Tol2元件和SV40poly(A)终止序列，将该酶切片段与重叠延伸PCR所的片段连 接，获得pTol2-SV40载体；
2）获得pTol2-CMV-SV40载体
设计扩增CMV启动子，并且两侧附XhoI和SalI位点的引物：
CMV-F：CCGCTCGAGGCGTTATCCCCTGATTCTGT
CMV-R：ACGCGTCGACCGGATCTGACGGTTCACTAA
以质粒pEGFP-N1（Invitrogen）为模板，用引物CMV-F和CMV-R通过PCR扩增出C MV启动子，酶切后插入pTol2-SV40载体，获得pTol2-CMV-SV40载体；
3）获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体
设计引物重叠延伸PCR(Heckman,2007)引物：
SP1：GGAAGATCTGCGTTATCCCCTGATTCTGT
SP2：GTCTGGATCACTTGTACAGCTCGTCCATG
SP3：GCTGTACAAGTGATCCAGACATGATAAGATACA
SP4：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）和pCS2+（Invitrogen）为模板，以引物SP1、SP2、SP 3和SP4，通过重叠延伸PCR方法(Heckman,2007)通过两轮PCR获得CMV驱动EGFP表 达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框，将这个表达框用BglII和XhoI酶切位点插入p Tol2-CMV-SV40载体，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体； B、构建含有红色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry- SV40poly(A)；
设计扩增mCherry阅读框,并且两侧附NheI和XhoI酶切位点引物序列：
Cherry-F：CTAGCTAGCGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG
Cherry-R：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒TK5xC(Distel,2009)为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mC herry片段。将PCR片段用NheI和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EG FP-SV40poly(A)载体，将EGFP阅读框替换成为mCherry阅读框，获得pTol2-CMV-SV40 poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体；
C、构建fat2转基因表达载体pCMV:Cel.Fat2,CMV:mCherry；
设计扩增fat2阅读框，并两侧附HindIII和BamHI酶切位点的引物序列：
fat2Fr：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGACCATCGCTACCAAAGTG
fat2Re：CGCGGATCCTTACTGTGCCTTCTTTGCC
以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，通过H indIII和BamHI酶切位点将fat2克隆插入含有红色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly (A);CMV:mCherry-SV40poly(A)转基因表达载体；
最终获得pCMV:fat2,CMV:mCherry表达载体，其序列为SEDIDNO.2所示。
D、构建fat1转基因表达载体pCMV:fat1;CMV:EGFP,；
设计扩增fat1阅读框，并且两侧附EcoRIandXbaI酶切位点的引物：
fat1Fr：CCGGAATTCGCCGCCACCATGGTCGCTCATTCCAGCGAAG
fat1Re：GCAAAACCGGTGAAAACG
以质粒pCAGGS-fat1(Kang,2004)为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基 因扩增，通过EcoRIandXbaI酶切位点将fat1克隆插入含有绿色荧光报告元件的pTol2-C MV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)转基因表达载体，最终获得pCMV:fat1;CMV: EGFP表达载体，其序列为SEDIDNO.3所示。
一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其具体步骤如下：
A、建立fat2和fat1基因的转基因鱼家系，即Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)和Tg(CMV:fat1;C MV:EGFP)：
具体为：通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体pCMV:fat2,CMV:m Cherry和pCMV:fat1;CMV:EGFP分别导入鱼类受精卵中，筛选出F0代转基因鱼；
所述的表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；
所述的表达载体pCMV:fat1;CMV:EGFP的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示；
B、将步骤A中获得的F0代转基因鱼饲养至性成熟与野生型鱼交配，筛选出F1代转基因鱼， 将F1代转基因鱼再与野生型鱼交配，筛选出F2代转基因鱼；
筛选方法：利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报 告基因，方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因鱼。通过转基因PCR法和反转 录PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得;
设计fat2转基因鱼的检测引物：
fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG
fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT
设计fat1转基因鱼的检测引物：
fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG
fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC
C、步骤B中获得转基因F2或F1代鱼为亲本，杂交筛选出同时表达fat2和fat1的双转基 因鱼即可。
一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3多不饱和脂肪酸斑马鱼 中的应用，其步骤如下
将fat2和fat1的双转基因鱼、fat2转基因鱼、fat1转基因鱼和野生型鱼饲养于同一个鱼 缸（鱼塘）中，投喂EPA和DHA低含量的饲料。比较fat2和fat1的双转基因鱼、fat2单转 基因鱼、fat1单转基因鱼和野生型鱼的肌肉组织中脂肪酸组分的差异。
所述的鱼为斑马鱼、黄颡鱼、鲤鱼或团头鲂。
与现有技术相比，本发明专利具有如下优点和效果：
在水产养殖中，投喂高含量鱼油饲料可以获得富含omega-3多不饱和脂肪酸的养殖鱼类。 鱼油来自于海洋捕捞的海水鱼类，随着海洋渔业资源的逐渐枯竭，这种办法显然是不可持续 型的，并且不利于海洋资源保护。
通过转基因过表达涉及长链多不饱和脂肪酸合成的延长酶和去饱和酶，提高鱼类从18: 2n-6和18:3n-3生成20:4n-6和20:5n-3的长链不饱和脂肪酸生成通路活性的这种策略，不能 从根本上解决鱼类缺乏从头生成omega-3多不饱和脂肪酸能力的问题。
本发明专利通过基因工程的方法，即在鱼类中同时引入delat-12去饱和酶fat2基因和o mega-3去饱和酶fat1基因，填补了鱼类omega-3多不饱和脂肪酸从头合成通路的断裂，赋 予鱼类从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力。这种基因工程育种方法赋予转基因动物新 的能力，并且是一种适应当下资源环境要求的能力的基因工程育种方法。这也体现出基因工 程方法在可持续发展，保护资源方面无法比拟的优势。
另外一方面，本发明专利从根本上解决了鱼类缺乏从头生成omega-3多不饱和脂肪酸能 力的问题。在斑马鱼中通过转基因过表达脂肪酸延长酶和去饱和酶，DHA含量增加10%到 26.8%。而本发明专利中，DHA可增加180%。由此可见，赋予鱼类从头合成omega-3多不 饱和脂肪酸的能力的优势。
附图说明
图1为本发明构建fat2和fat1基因表达载体示意图。
其中A为fat2基因表达载体示意图，B为fat1基因表达载体示意图；CMV真核表达启 动子，fat2为鱼类密码子优化的delta-12脂肪酸去饱和酶基因，mCherry为红色荧光蛋白基 因，SV40poly(A)为稳定mRNA的3’端序列，Tol2为Tol2转座子转座元件。
图2为野生型和转基因斑马鱼胚胎示意图。
其中A为36hpf野生型斑马鱼胚胎，B为红色荧光蛋白标记36hpf的fat2转基因斑马鱼 胚胎，C为绿色荧光蛋白标记36hpf的fat1转基因斑马鱼胚胎，D为红色和绿色荧光蛋白同 时标记的36hpf的fat2和fat1转基因斑马鱼胚胎。
图3为fat2和fat1基因在转基因斑马鱼肌肉组织中的表达。
其中A为fat2基因在Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)转基因斑马鱼肌肉组织中的表达，泳 道1-3：fat2转基因，泳道4：野生型，B为fat1基因在Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)转基因斑 马鱼肌肉组织中的表达，泳道1-3：fat1转基因，泳道4：野生型，C为fat2和fat1基因在T g(CMV:fat1;CMV:EGFP)/Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)双转基因斑马鱼肌肉组织中的表达， 泳道1-3：双转基因，泳道4：野生型。
图4为转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸组成。
注：*表示统计学上有显著差异（P<0.05）,***表示统计学上有非常显著性差异（P <0.005）。
图5为fat2和fat1双转基因填补了鱼类中多不饱和脂肪酸从头合成的断裂示意图。
在斑马鱼的体内，脂肪酸去饱和酶fadsd2基因和脂肪酸延长酶elovl2、elovl5基因经 过一系列的连续反应，将18:2n-6和18:3n-3转化成20:4n-6和20:5n-3。20:5n-3生成 22:6n-3可能存在Δ4去饱和酶通路或Δ6去饱和酶通路。fat2可以将18:1转化成18:2n-6，fat1 可以将18:2n-6和20:4n-6转化成18:3n-3和20:5n-3。缺少delta-12去饱和酶fat2和omega-3 去饱和酶fat1基因导致omega-3长链多不饱和脂肪酸合成通路断裂。
具体实施方式
本发明所述的试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述实验步骤，如未特别说明， 均为本领域的常规步骤。
实施例1：
设计和获得鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因
1）根据线虫的delta-12去饱和酶fat2基因的氨基酸序列(GenBank:AF240777.1)和斑马鱼的 密码子使用偏好，设计鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因序列，其序列为SEQIDN O.1所示。
2）鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。
3）人工合成鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因序列（上海金斯瑞公司），fat2基因 序列插入到pUC57载体中。
实施例2：
fat2和fat1转基因表达载体的构建：
A、构建含有绿色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-S V40poly(A)
1）获得pTol2-SV40载体
设计含有多克隆位点的自退火引物：
MCS-F：CCGCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCT
MCS-R：CTATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAA
通过PCR自退火获得一段两侧含XhoI和XbaI酶切位点，中间含有SalI、EcoRI、Hind III和BamHI4个酶切位点的片段。PCR自退火的条件是：MCS-F和MCS-R按照1：1混 合，各自终浓度为50uM，以0.5℃/30秒的降温速度，从95℃下降至16℃。即95℃维持30 秒，94.5℃维持30秒，94℃维持30秒，温度依次下降至16℃。
用XhoI和XbaI酶切4xKGFP质粒，保留该质粒上的Tol2元件和SV40poly(A)终止序 列，将该酶切片段与自退火所的片段连接，获得pTol2-SV40载体，具体操作：
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶XhoI和XbaI(Takara)双酶切4xKGFP质粒中4-6 小时，参照Axygen公司的DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。在室温中，将回收的DNA载 体骨架和PCR自退火的多克隆位点片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，然后将连接产 物转化大肠杆菌TOP10菌株（购自Invitrogen公司）。转化的具体过程为：在冰上将连接产 物加入冰上融解的感受态细胞中，轻混匀；冰浴30分钟；42℃热激90秒，冰浴2分钟； 加入800ulLB培养基，37℃，120rpm培养45分钟；涂平板，37℃培养12-16h（常规方法， 分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。
用引物M13-F:GTAAAACGACGGCCAG，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC进行 PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒， 72℃延伸100秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。阳性克隆的扩增产物片段 大小为1600bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，获得pTol2-SV40载体。
2）获得pTol2-CMV-SV40载体
设计扩增CMV启动子，并且两侧附XhoI和SalI位点的引物：
CMV-F：CCGCTCGAGGCGTTATCCCCTGATTCTGT
CMV-R：ACGCGTCGACCGGATCTGACGGTTCACTAA
以质粒pEGFP-N1（Invitrogen）为模板，用引物CMV-F和CMV-R通过PCR扩增出C MV启动子。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，7 2℃延伸40秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为575bp， DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
将CMV启动子DNA片段在37℃水浴中用限制性内切酶XhoI和SalI(Takara)双酶切4 -6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶XhoI和SalI(Takara)双酶切pTol2-SV40载体4-6小 时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在室温中,将回收的pTol2-SV40载体骨架和CMV启动子DNA片段，用T4连接酶(NE B)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。
用引物CMV-N-F:CTCTGCTTATATAGACCTCCCA，和M13-R：CAGGAAACAGCTA TGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃ 复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的 扩增产物片段大小为928bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，获得pTol2-CMV-SV40载 体。
3）获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体。
设计引物重叠延伸PCR引物：
SP1：GGAAGATCTGCGTTATCCCCTGATTCTGT
SP2：GTCTGGATCACTTGTACAGCTCGTCCATG
SP3：GCTGTACAAGTGATCCAGACATGATAAGATACA
SP4：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）和pCS2+（Invitrogen）为模板，以引物SP1、SP2、SP 3和SP4，通过重叠延伸PCR方法，通过两轮PCR获得CMV驱动EGFP表达，并且末端 为SV40poly(A)信号的表达框，将这个表达框用BglII和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-S V40载体，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体，具体操作如 下：
以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）为模板，用引物SP1和SP2通过PCR扩增出CMV启动 子驱动EGFP表达的DNA序列。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒， 55℃复性90秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物 片段大小为1330bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
以质粒pCS2+（Invitrogen）为模板，用引物SP3和SP4通过PCR扩增出SV40poly(A) 信号。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延 伸20秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为196bp，DNA 清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
以50ng的CMV启动子驱动EGFP表达的DNA和50ng的SV40poly(A)信号DNA为P CR反应模板，用引物SP1和SP4通过PCR扩增出CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV 40poly(A)信号的表达框。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃ 复性30秒，72℃延伸120秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段 大小为1529bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶BglII和XhoI(Takara)双酶切CMV驱动EGFP表达， 并且末端为SV40poly(A)信号的表达框的PCR产物4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axy gen）酶切产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶BglII和XhoI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40载体 4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV4 0载体骨架和CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框的酶切DNA 片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。
用引物EGFP-F:GGATGTTGCCGTCCTCCTTG，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGA C进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复 性30秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增 产物片段大小为1300bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pTol2-CMV-SV40 poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体。
B、构建含有红色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry- SV40poly(A)
设计扩增mCherry阅读框,并且两侧附NheI和XhoI酶切位点引物序列：
Cherry-F：CTAGCTAGCGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG
Cherry-R：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒TK5xC(Distel,2009)为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mC herry片段。将PCR片段用NheI和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EG FP-SV40poly(A)载体，将EGFP阅读框替换成为mCherry阅读框，获得pTol2-CMV-SV40 poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体，具体操作如下：
以质粒TK5xC为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mCherry片段。P CR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸45秒， 30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为720bp，DNA清洁试剂盒 回收（Axygen）PCR产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶NheI和XhoI(Takara)双酶切mCherryDNA片段4- 6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶NheI和XhoI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40poly (A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体骨架和m CherryDNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10 菌株。
利用引物mCherryN-F:CACGGAGCCCTCCATGTGC，和M13-R：CAGGAAACAGCT ATGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃ 复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的 扩增产物片段大小为970bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pTol2-CMV-SV 40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体。
C、构建fat2转基因表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry,其序列为SEDIDNO.2所示；
设计扩增fat2阅读框，并两侧附HindIII和BamHI酶切位点的引物序列：
fat2Fr：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGACCATCGCTACCAAAGTG
fat2Re：CGCGGATCCTTACTGTGCCTTCTTTGCC
以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，通过H indIII和BamHI酶切位点将fat2克隆插入含有红色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly (A);CMV:mCherry-SV40poly(A)转基因表达载体，具体操作如下：
以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，PCR 扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸80秒，3 0个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1131bp，DNA清洁试剂盒 回收（Axygen）PCR产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶HindIII和BamHI(Takara)双酶切fat2DNA片段 4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶HindIII和BamHI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV 40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶 切产物。
在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)载体骨架和f at2DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌 株。
用引物M13-F：GTAAAACGACGGCCAG和fat2R:CCCTGGGTCACAGAGGAAGA进 行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30 秒，72℃延伸120秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增产物 片段大小为1955bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pCMV:fat2,CMV:mCher ry转基因表达载体，其序列为SEQIDNO.2所示，载体示意图见图1中A。
D、构建fat1转基因表达载体pCMV:Cel.Fat1,CMV:EGFP,其序列为SEDIDNO.3所示；
设计扩增fat1阅读框，并且两侧附EcoRIandXbaI酶切位点的引物：
fat1Fr：CCGGAATTCGCCGCCACCATGGTCGCTCATTCCAGCGAAG
fat1Re：GCAAAACCGGTGAAAACG
从质粒pCAGGS-fat1(Kang,2004)为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基 因扩增，通过EcoRIandXbaI酶切位点将fat1克隆插入含有绿色荧光报告元件的pTol2-C MV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)转基因表达载体,具体操作如下：
从质粒pCAGGS-fat1为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基因扩增，PCR 扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸80秒，3 0个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1206bp，DNA清洁试剂盒 回收（Axygen）PCR产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶EcoRIandXbaI(Takara)双酶切fat1DNA片段4 -6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶EcoRIandXbaI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV4 0poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切 产物。
在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体骨架和fat 1DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。
利用引物M13-F：GTAAAACGACGGCCAG和fat1-R：TCTCCGATAATCAGAATCTC AATG进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃ 复性30秒，72℃延伸140秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的 扩增产物片段大小为2086bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pCMV:fat1,CM V:EGFP转基因表达载体，其序列为SEQIDNO.3所示，载体示意图见图1中B。
实施例3：
一种提高斑马鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其步骤是：
A、建立fat2和fat1基因的转基因斑马鱼家系，即Tg(CMV:fat2,CMV:mCherry)和Tg(CMV:f at1,CMV:EGFP)：
1）通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体分别导入斑马鱼受精卵中。
将25ng/ul的转基因载体DNA和25ng/ul的Tol2转座酶RNA的混合液注射入1细胞期 的受精的斑马鱼胚胎中，注射24小时后，将表达红色或绿色荧光蛋白的胚胎挑选出来饲养 至性成熟。
2）筛选转基因成功的斑马鱼。
利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报告基因， 方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因斑马鱼。即将转基因F0代与野生型鱼交 配，获得它们的子代胚胎，将表达红色或绿色荧光蛋白的子代胚胎饲养成熟，获得转基因F 1代转基因鱼(Xiong,2013)。结果见图2中B、C。以相同方法获得F2代转基因鱼。
3）通过反转录PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得：
设计fat2转基因鱼的检测引物：
fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG
fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT
设计fat1转基因鱼的检测引物：
fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG
fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC
用Trizol(Invitrogen)提取转基因阳性胚胎的总RNA。37℃水浴条件下用DNaseI(Prome ga)酶切总RNA,去除总RNA中的基因组DNA的污染。以Oligod(T)为反转录引物，用反转 录酶ReverTraAce（TOYOBO）获得cDNA。反应条件为42℃孵育60分钟。PCR检测c DNA中fat2和fat1基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃ 复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段 大小分别为102bp和423bp。结果见图3。
B、以fat2和fat1转基因F2代斑马鱼为亲本，杂交获得同时表达fat2和fat1的双转基因斑 马鱼。通过红色和绿色荧光蛋白以及反转录PCR确定fat2和fat1双转基因斑马鱼的获得。 结果见图2中D和图3中C。
实施例4：一种提高斑马鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3多不饱和 脂肪酸斑马鱼中的应用，其步骤如下：
A、将实施例3中制备的fat2和fat1的双转基因斑马鱼、fat2转基因斑马鱼、fat1转基因斑 马鱼和野生型斑马鱼饲养于同一个鱼缸（鱼塘）中，投喂EPA(0.2%)和DHA(0%)低含量的 饲料。
B、检测转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸含量。
在4℃条件下，用含有0.005%丁基羟基甲苯（Sigma）抗氧化剂的氯仿/甲醇（2：1）溶 液抽提斑马鱼肌肉的总脂肪酸，氮气吹走有机溶剂。甲酯化总脂肪酸，即在100℃水浴条件 下，用含有5%硫酸的甲醇溶液处理总脂肪酸1h。
用气象色谱(TRACEGC,ThermoScientific)定量分析甲酯化的总脂肪酸组分。气象色 谱以FID为检测器，氮气为载气，条件是40℃/分钟的升温速度从50℃升温至170℃，然后 以18℃/分钟的升温速度升温至210℃，210℃维持28分钟。
fat2单转基因斑马鱼肌肉组织中，18:1与野生型相比减少10.3%(25.3%vs.28.2%;P <0.05)，18:2n-6含量与野生型相比增加30.8%(11.9%vs.9.1%;P<0.05)。这表明在斑 马鱼中，Fat2去饱和酶能有效地将18:1转化成为18:2n-6。结果见图4
fat1单转基因斑马鱼肌肉组织中，18:3n-3含量与野生型相比增加52.5%(9.0%vs.5.9%; P<0.005)，20:5n-3含量与野生型相比增加81.3%(2.9%vs.1.6%;P<0.005)，22:6n-3 含量与野生型相比增加135.2%(12.7%vs.5.4%;P<0.005)。同时，18:2n-6含量与野生型相 比减少14.3%(7.8%vs.9.1%;P<0.005)。这表明在斑马鱼中，Fat1去饱和酶能有效地将n -6PUFA转化成为n-3PUFA。结果见图4。
fat2和fat1的双转基因斑马鱼肌肉组织中，18:1含量与野生型相比减少了37.6%(17.6% vs.28.2%;P<0.005)，18:2-6含量与野生型相比没有明显改变(9.7%vs.9.1%;P>0.0 5),但是与fat2单转基因斑马相比，减少了18.5%(9.7%vs.11.9%;P<0.005)，表明部分1 8:2-6被Fat1转化成18:3n-3。18:3n-3含量与野生型相比增加45.8%(8.6%vs.5.9%;P< 0.05)，20:5n-3含量与野生型相比增加68.8%(2.7%vs.1.6%;P<0.005)，22:6n-3含量与 野生型相比增加175.9%(14.9%vs.5.4%;P<0.005)。22:6n-3含量与fat1单独转基因相比 增加了17.3%。这表明，fat2和fat1共同配合使用，能有效提高鱼类体内的omega-3多不饱 和脂肪酸含量。结果见图4。
实施例5：
一种提高鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其步骤是：
A、建立fat2和fat1基因的转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼家系，即Tg(CMV:fat2;CMV:mChe rry)和Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)。
具体为：通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体（pCMV:fat2,CMV: mCherry和pCMV:fat1;CMV:EGFP表达载体）分别导入鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼受精卵中，将 表达红色或绿色荧光蛋白的胚胎挑选出来饲养至性成熟。将这些鱼饲养至性成熟，与野生型 鱼交配，获得它们的子代胚胎(Xiong,2013);
B、利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报告基因， 方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼。即将转基因F0 代与野生型鱼交配，获得它们的子代胚胎，将表达红色或绿色荧光蛋白的子代胚胎饲养成熟， 获得转基因F1代转基因鱼，以相同方法获得F2代转基因鱼。通过转基因PCR法和反转录 PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得;
设计fat2转基因鱼的检测引物：
fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG
fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT
设计fat1转基因鱼的检测引物：
fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG
fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC
用Trizol(Invitrogen)提取转基因阳性鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼胚胎的总RNA。37℃水浴条件下 用DNaseI(Promega)酶切总RNA,去除总RNA中的基因组DNA的污染。以Oligod(T)为反 转录引物，用反转录酶ReverTraAce（TOYOBO）获得cDNA。反应条件为42℃孵育60分 钟。PCR检测cDNA中fat2和fat1基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃ 变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃ 保存。扩增产物片段大小分别为102bp和423bp。
C、以fat2和fat1转基因F2代鱼为亲本，杂交获得同时表达fat2和fat1的双转基因鲤鱼、 团头鲂或黄颡鱼，通过红色和绿色荧光蛋白以及反转录PCR确定fat2和fat1双转基因的获 得。
实施例6：
一种提高鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3 多不饱和脂肪酸鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼中的应用，其步骤如下：
A、将实施例5中制备的双转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼与其对应的野生鱼饲养于同一个鱼 塘中，投喂EPA(0.2%)和DHA(0%)低含量的饲料。
B、检测转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸含量。
在4℃条件下，用含有0.005%丁基羟基甲苯（Sigma）抗氧化剂的氯仿/甲醇（2：1）溶液抽 提鲤鱼肌肉的总脂肪酸，氮气吹走有机溶剂。甲酯化总脂肪酸，即在100℃水浴条件下，用 含有5%硫酸的甲醇溶液处理总脂肪酸1h。
用气象色谱(TRACEGC,ThermoScientific)定量分析甲酯化的总脂肪酸组分。气象色谱以F ID为检测器，氮气为载气，条件是40℃/分钟的升温速度从50℃升温至170℃，然后以18℃ /分钟的升温速度升温至210℃，210℃维持28分钟。
fat2和fat1双转基因鲤鱼肌肉组织中，18:3n-3含量与野生型相比增加6.3倍，20:5n-3 含量与野生型相比增加3.8倍，22:6n-3含量与野生型相比增加57%。
fat2和fat1双转基因团头鲂和黄颡鱼和肌肉组织中，与野生型相比omega-3多不饱和脂 肪酸（22:6n-3）的含量均显著增加。
SEQUENCELISTING
<110>中国科学院水生生物研究所
<120>一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用
<130>一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用
<160>4
<170>PatentInversion3.1
<210>1
<211>1131
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
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