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1、(10)授权公告号 CN 101696236 B (45)授权公告日 2012.02.15 CN 101696236 B *CN101696236B* (21)申请号 200910008880.6 (22)申请日 2009.02.11 C07K 7/16(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (73)专利权人 海南中和药业有限公司 地址 570216 海南省海口市南海大道 168 号 保税区内海南中和药业有限公司 专利权人 海南中和多肽药物研发有限公司 (72)发明人 崔学云 周宗贞 杨平 马中刚 蒋。
2、明更 (74)专利代理机构 北京华科联合专利事务所 11130 代理人 王为 WO 2006041945 A2,2006.04.20, CN 101314613 A,2008.12.03, (54) 发明名称 一种固相合成阿托西班方法 (57) 摘要 本发明涉及一种固相合成阿托西班方法， 包 括如下步骤 ： 1) 以 Rink Amide 树脂为载体， 脱 Fmoc- 保护后得到 H2N-Rink Amide 树脂 ； 2) 以 HOBT、 DIPCI 为缩合试剂， 将 Fmoc-Gly-OH 的羧基 与树脂氨基相连， 得到 Fmoc-Gly( 树脂 ) ； 3) 采用 Fmoc 策略依次固相。
3、合成序列剩余氨基酸 ； 4) 用碘 进行固相环化 ； 5) 然后用裂解试剂 ( 三氟乙酸 / 硫代苯甲醚 /1， 2- 乙二硫醇 / 水 ) 切割， 乙醚沉 淀， 得到阿托西班粗肽 ； 6) 粗品经 HPLC 制备分离 得阿托西班纯品。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 何睿 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 7 页 CN 101696236 B1/2 页 2 1. 一种阿托西班的固相合成方法， 其特征在于， 所述方法如下 ： (1) 制备 Fmoc-Gly- 树脂 将 100.00g Rink Amide 树脂加入到反应柱中，。
4、 加入 DCM 550ml/ 次洗涤 3 次、 再加入 DMF550ml/ 次洗涤 3 次， 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌 反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保 护效果 ； 称取 Fmoc-Gly-OH 23.79g 及 HOBT 10.80g， 加入 N、 N- 二甲基甲酰胺搅拌溶解， 完 全溶解后加入 12ml DIPCDI， 搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内， 搅拌反应 24 小时， 反应完 毕后， 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 3 次， 再用 DCM 5。
5、50ml/ 次洗涤 3 次， 最后用甲醇 550ml/ 次洗涤 3 次， 抽干， 倒出， 放入真空干燥箱干燥 12h， 取出称重， 为 103.19g， 测定替代 值为 0.77mmol/g ； (2) 制备 Fmoc-Orn(Boc)-Gly- 树脂 将 103.19g Fmoc-Gly- 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM 550ml/ 次洗涤 3 次、 再加入 DMF550ml/次洗涤3次， 向玻璃反应柱内加入配置好的30的哌啶/DMF溶液550ml， 搅拌反 应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护 效果 ； 称取 。
6、Fmoc-Orn(Boc)-OH 108.34g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加 入 lmmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱 内， 搅拌反应 90min， 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液 检测偶联效果 ； (3) 制备 Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽除 反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 。
7、5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果 ； 称取 Fmoc-Pro-OH及HOBT 32.21g， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min ； 抽去反 应液， 用 DMF550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果 ； (4) 制备 Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽除 反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗。
8、涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果 ； 称取 Fmoc-Cys(Trt)-OH 139.61g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI的DMF溶液37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min ； 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效 果 ； (5) 制备 Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅。
9、拌反应 30min， 抽除 反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果 ； 称取 Fmoc-Asn(Trt)-OH 142.23g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI的DMF溶液37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min ； 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效 果 ； (6) 制备 Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gl。
10、y- 树脂 ： 权 利 要 求 书 CN 101696236 B2/2 页 3 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽除 反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果 ； 称取 Fmoc-Thr(tBu)-OH 139.61g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI的DMF溶液37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min ； 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取。
11、样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效 果 ； (7) 制备 Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽除 反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果 ； 称取 Fmoc-Ile-OH84.24g及HOBT 32.21g， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反。
12、应 90min ； 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果 ； (8) 制备 Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树 脂 ： 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽除 反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果 ； 称取 Fmoc-D-Tyr(Et)-OH 103.02g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加。
13、入 1mmol/ mlDIPCDI的DMF溶液37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min ； 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效 果 ； (9) 制备 Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gl y- 树脂 ： 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽除 反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果 ；。
14、 称取 Mpr(Trt)-OH83.06g及HOBT 32.21g， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀 ； 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min ； 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果 ； (10) 环化 称取31.73g碘加入1250ml DMF中搅拌溶解， 完全溶解后加入到反应柱内， 氮气吹搅反 应 30min ； 反应完毕后， 抽去反应液， 用 DMF 1250ml/ 次洗涤 3 次， 再用 DCM 1250ml/ 次洗涤 3 次。
15、， 最后用甲醇 1250ml/ 次洗涤 3 次， 抽干， 倒出， 放入真空干燥箱干燥 12h ； (11) 裂解 将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中， 加入配制好的裂解试剂 2200ml， 搅拌反 应 120min， 其中所述裂解试剂为三氟乙酸硫代苯甲醚 1， 2- 乙二硫醇水 90 5 3 2 ； 过滤， 树脂用三氟乙酸洗涤 3 次 ； 合并滤液， 缓慢沉降到 22000ml 的无水乙醚中 ； 静置2h后开始离心， 离心完毕后用无水乙醚2500ml/次离心洗涤6次， 将得 到的粗肽放入真空干燥箱内抽干， 即得氧化型阿托西班粗品。 权 利 要 求 书 CN 101696236 B1/7 页 4 一。
16、种固相合成阿托西班方法 技术领域 ： 0001 本发明涉及一种合成活性多肽原料药的方法， 尤其是涉及一种固相合成阿托西班 的方法。 背景技术 ： 0002 阿托西班 (atosiban)， 其化学名称为 ： 1-(3- 硫醇丙醇酸 )-2-(O- 乙基 -D 酪氨 酸 )-4-L- 苏氨酸 -8-L- 鸟氨酸 - 催产素。 0003 其结构式为 ： 0004 0005 阿托西班是一种催产素类似物， 为人工合成的环状多肽， 是子宫内及蜕膜、 胎膜 上受体的催产素竞争性拮抗剂， 在临床上使用其醋酸盐治疗早产。醋酸阿托西班注射液 (AtosibanAcetate Injection) 由辉凌公司 (。
17、Ferring AB) 研制， 2000 年 3 月 23 日首次在 奥地利上市， 商品名为 ： 0006 相关文献报道阿托西班的合成方法是通过Boc保护的甘氨酸(Gly)和氯甲基树脂 制备得到氨基酸树脂， 然后通过循环缩合偶联其余的保护氨基酸得到肽树脂， 肽树脂经氨 解后得到全保护肽， 通过钠氢解脱去侧链保护基团， 进行碘环化得到目的肽。 该合成方法存 在这样几个问题 ： 一、 氨解低温操作要求且时间长， 产品纯度不高， 设备要求复杂 ； 二、 脱侧 链保护基团用到金属钠， 在安全性方面存在隐患， 对生产操作有较大的限制 ； 三、 步骤较为 繁琐， 影响生产进度， 增加了产品质量的风险。本发。
18、明结合肽的结构性质， 选择了能直接用 TFA裂解得到酰胺键的Rink Amide树脂作为起始树脂， 选用了Fmoc固相合成方法解决了上 述问题。 发明内容 ： 0007 本发明的目的在于提供一种固相合成阿托西班的方法， 以克服现有技术上存在的 缺陷。 0008 本发明的方法包括 ： 0009 以 Rink Amide 树脂为起始原料， 以 Fmoc 保护的氨基酸为单体， 以 DIPCI 和 HOBt 为缩合剂， 依次逐个接上氨基酸， 用碘进行固相环化， 加入裂解试剂， 用乙醚沉淀， 获得氧化 型粗品 ； 采用反相高效液相色谱法进行分离纯化后， 再经冷冻干燥获得游离肽或相应的盐。 0010 本发。
19、明的制备方法， 步骤如下 ： 说 明 书 CN 101696236 B2/7 页 5 0011 1)以Fmoc-Rink Amide树脂为起始原料， 去除Fmoc后与Fmoc-Gly-OH的侧链羧基 相连， 得到 Fmoc-Gly 树脂 ； 0012 2) 按照阿托西班氨基酸的结构顺序依次连接其余氨基酸 ； 0013 3) 用碘进行固相环化 ； 0014 4) 用裂解试剂进行切割得阿托西班粗肽， 用乙醚沉淀粗肽 ； 0015 5) 用反相高效液相法纯化分离。 0016 上述过程以 HOBT、 DIPCI 为缩合试剂， 以三氟乙酸 / 硫代苯甲醚 /1， 2- 乙二硫醇 / 水为裂解试剂， 树脂。
20、的取代值为 0.6 0.8mmol/g。 0017 裂 解 试 剂 优 选 是 按 ： 三 氟 乙 酸 硫 代 苯 甲 醚 1， 2- 乙 二 硫 醇 水 90 5 3 2的体积比配制而成。 0018 用反相高效液相法纯化分离阿托西班时， 其色谱条件优选为 ： 0019 色谱柱 ： 15cm 0020 色谱柱填充剂 ： 十八烷基硅烷键合硅胶 (C18) 10m 0021 上样量 ： 50g 目的肽 / 次 0022 检测波长 ： 230nm 0023 流速 ： 400ml/min 0024 流动相 ： A ： 0.3醋酸水溶液 ； B ： 乙腈 0025 色谱条件 ： 梯度程序见下表。 002。
21、6 0027 本发明优选的制备方法， 其步骤如下 ： 0028 (1) 制备 Fmoc-Gly- 树脂 ： 0029 将 Rink Amide 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM 洗涤 3 次、 再加入 DMF 洗涤 3 次， 向 玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 洗涤。称取 Fmoc-Gly-OH 及 HOBT， 加入 N、 N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 搅拌溶解， 完全溶解后加 入 DIPCDI， 搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内， 搅拌反应 24 小时。抽去反应液， 用 DMF/DCM/ 甲醇洗涤， 抽干。 0030。
22、 (2) 制备 Fmoc-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 0031 将 Fmoc-Gly- 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM、 DMF 洗涤。向玻璃反应柱内加 入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 洗涤。称取 Fmoc-Orn(Boc)-OH 及 HOBT， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液， 搅拌均匀。 将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应90min。 抽去反应液， 用 DMF 洗涤。 0032 (3) 制备 Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂。
23、 ： 说 明 书 CN 101696236 B3/7 页 6 0033 将 Fmoc-Orn(Boc)-Gly- 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM、 DMF 洗涤。向玻璃反应柱 内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 洗涤。称取 Fmoc-Pro-OH及HOBT， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液， 搅 拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反应液， 用 DMF 洗涤。 0034 (4) 制备 Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly。
24、- 树脂 ： 0035 将 Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM、 DMF 洗涤。向玻璃反 应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 洗涤。 称取 Fmoc-Cys(Trt)-OH 及 HOBT， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反 应液， 用 DMF 洗涤。 0036 (5) 制备 Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-。
25、Gly- 树脂 ： 0037 将 Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM、 DMF 洗 涤。向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反应 30min， 抽除反应液， 加 入 DMF 洗涤。称取 Fmoc-Asn(Trt)-OH 及 HOBT， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI 的 DMF 溶液， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反应液， 用 DMF 洗涤。 0038 (6) 制备 Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cy。
26、s(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 0039 将 Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM、 DMF 洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反应 30min， 抽 除反应液， 加入 DMF 洗涤。称取 Fmoc-Thr(tBu)-OH 及 HOBT， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后 加入 1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反应液， 用 DMF 洗涤。 0040 (7)。
27、 制备 Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 0041 将 Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂加入到反应柱 中， 加入 DCM、 DMF 洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 洗涤。称取 Fmoc-Ile-OH 及 HOBT， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶 解后加入 1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应 柱内。
28、， 搅拌反应 90min。抽去反应液， 用 DMF 洗涤。 0042 (8) 制备 Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gl y- 树脂 ： 0043 将 Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂加入到反 应柱中， 加入 DCM、 DMF 洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液， 搅拌反 应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 洗涤。称取 Fmoc-D-Tyr(Et)-OH 及 HOBT， 加入 DMF 搅拌溶 解。
29、， 完全溶解后加入 1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加 入到反应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反应液， 用 DMF 洗涤。 0044 (9) 制备 Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc )-Gly- 树脂 ： 0045 将 Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树 说 明 书 CN 101696236 B4/7 页 7 脂加入到反应柱中， 加入DCM、 DMF洗涤。。
30、 向玻璃反应柱内加入配置好的30的哌啶/DMF溶 液， 搅拌反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 洗涤。称取 Mpr(Trt)-OH 及 HOBT， 加入 DMF 搅拌 溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液 加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反应液， 用 DMF 洗涤。 0046 (10) 环化 0047 称取碘 (I2) 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入到反应柱内， 氮气吹搅反应 30min。反应完毕后， 抽去反应液， 用 DMF、 DCM、 甲醇洗涤， 抽干。 0048 (11) 裂解 00。
31、49 将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中， 加入配制好的裂解试剂 ( 三氟乙酸硫代苯 甲醚 1， 2- 乙二硫醇水 )， 搅拌反应 120min。过滤， 树脂用三氟乙酸 (TFA) 洗涤。合并 滤液， 缓慢沉降到 10 倍体积的无水乙醚中。静置 2h 后开始离心， 离心完毕后用无水乙醚离 心洗涤， 即得氧化型阿托西班粗品。 0050 (12) 纯化 0051 将得到的粗肽减压干燥后加水溶解， 溶液用0.45m的微孔滤膜过滤。 滤液经C18 柱分离纯化， 以 0.3醋酸水溶液和乙腈为流动相， 检测波长为 230nm， 流速 ： 300 800ml/ min， 收集需要的流出液后， 去盐， 冷冻干燥，。
32、 的目标产物， 收率约为 65。 0052 本发明的的阿托西班制备工艺中， 采用 DMF、 HOBT、 和 DIPCI 进行缩合反应， 具有 操作简单， 工艺稳定， 副反应少， 消旋率低的特点。裂解过程中采用 TFA， 而不是 Boc 策略的 HF， 大大降低了对人员的毒害及环境污染， 并且未采用通常的离子交换柱换盐， 而是将样品 的纯化与换盐同时进行， 减少了溶剂的浪费及目标产物的损失。生产成本低， 产率高， 在工 业生产中具有重要意义。 具体实施方式 ： 0053 以下通过实施例进一步说明本发明， 但不作为对本发明的限制。 0054 实施例 1 制备 Fmoc-Gly- 树脂 0055 将。
33、 100.00g Rink Amide 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM 550ml/ 次洗涤 3 次、 再加 入 DMF550ml/ 次洗涤 3 次， 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅 拌反应 30min， 抽除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去 保护效果。称取 Fmoc-Gly-OH 23.79g 及 HOBT 10.80g， 加入 N、 N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 搅拌 溶解， 完全溶解后加入 12ml DIPCDI， 搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内， 搅拌反应 24 小时。 反应完毕后， 抽去。
34、反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 3 次， 再用 DCM 550ml/ 次洗涤 3 次， 最后用 甲醇 550ml/ 次洗涤 3 次， 抽干， 倒出， 放入真空干燥箱干燥 12h。取出称重， 为 103.19g， 测 定替代值为 0.77mmol/g。 0056 实施例 2 制备 Fmoc-Orn(Boc)-Gly- 树脂 0057 将 103.19g Fmoc-Gly- 树脂加入到反应柱中， 加入 DCM 550ml/ 次洗涤 3 次、 再加 入 DMF550ml/ 次洗涤 3 次。向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅 拌反应 30min， 抽除。
35、反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去 保护效果。 称取Fmoc-Orn(Boc)-OH 108.34g及HOBT 32.21g， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解 后加入 1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反 说 明 书 CN 101696236 B5/7 页 8 应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙 醇溶液检测偶联效果。 0058 实施例 3 制备 Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 00。
36、59 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽 除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取 Fmoc-Pro-OH及HOBT 32.21g， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。抽去反 应液， 用 DMF550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。 0060 实施例 4 制备 Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc。
37、)-Gly- 树脂 ： 0061 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽 除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取 Fmoc-Cys(Trt)-OH 139.61g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反 应 90min。抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联 效果。 006。
38、2 实施例 5 制备 Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 0063 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽 除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取 Fmoc-Asn(Trt)-OH 142.23g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反 应 90min。抽去反应液， 用 。
39、DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联 效果。 0064 实施例 6 制备 Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树脂 ： 0065 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽 除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取 Fmoc-Thr(tBu)-OH 139.61g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI 的 DMF 溶。
40、液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反 应 90min。抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联 效果。 0066 实施例 7 制备 Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly- 树 脂 ： 0067 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽 除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取 Fmoc-Ile-OH84.24g及HOBT 32。
41、.21g， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。 0068 实施例 8 制备 Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Bo c)-Gly- 树脂 ： 0069 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽 说 明 书 CN 101696236 B。
42、6/7 页 9 除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取 Fmoc-D-Tyr(Et)-OH 103.02g 及 HOBT 32.21g， 加入 DMF 搅拌溶解， 完全溶解后加入 1mmol/ mlDIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反 应 90min。抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联 效果。 0070 实施例 9 制备 Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(T。
43、rt)-Pro-Or n(Boc)-Gly- 树脂 ： 0071 向玻璃反应柱内加入配置好的 30的哌啶 /DMF 溶液 550ml， 搅拌反应 30min， 抽 除反应液， 加入 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 用 5的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取 Mpr(Trt)-OH83.06g及HOBT 32.21g， 加入DMF搅拌溶解， 完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI 的 DMF 溶液 37ml， 搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内， 搅拌反应 90min。 抽去反应液， 用 DMF 550ml/ 次洗涤 6 次， 取样用 5的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。 。
44、0072 实施例 10 环化 0073 称取31.73g碘(I2)加入1250ml DMF中搅拌溶解， 完全溶解后加入到反应柱内， 氮 气吹搅反应 30min。反应完毕后， 抽去反应液， 反应完毕后， 抽去反应液， 用 DMF 1250ml/ 次 洗涤 3 次， 再用 DCM 1250ml/ 次洗涤 3 次， 最后用甲醇 1250ml/ 次洗涤 3 次， 抽干， 倒出， 放 入真空干燥箱干燥 12h。 0074 实施例 11 裂解 0075 将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中， 加入配制好的裂解试剂 ( 三氟乙酸硫代苯 甲醚 1， 2- 乙二硫醇水 90 5 3 2 )2200ml， 搅拌反应 1。
45、20min。过滤， 树 脂用三氟乙酸 (TFA) 洗涤 3 次。合并滤液， 缓慢沉降到 22000ml 的无水乙醚中。静置 2h 后 开始离心， 离心完毕后用无水乙醚2500ml/次离心洗涤6次， 将得到的粗肽放入真空干燥箱 内抽干， 即得氧化型阿托西班粗品。 0076 实施例 12 纯化 0077 色谱柱 ： 15cm 0078 色谱柱填充剂 ： 十八烷基硅烷键合硅胶 (C18)10m 0079 上样量 ： 50g 目的肽 / 次 0080 检测波长 ： 230nm 0081 流速 ： 400ml/min 0082 流动相 ： A ： 0.3醋酸水溶液 ； B ： 乙腈 0083 色谱条件 ： 梯度程序见下表。 说 明 书 CN 101696236 B7/7 页 10 0084 0085 将得到的粗肽减压干燥后加水35000ml溶解， 溶液用0.45m的微孔滤膜过滤。 滤 液按照纯化条件上样， 收集流动相从 0.3醋酸水溶液乙腈 (64 36) 至 0.3醋酸水溶 液乙腈(5842)梯度内的目的峰溶液， 并将收集的溶液浓缩， 去盐， 冷冻干燥， 的目标产 物， 收率为 66.5。 说 明 书 。