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1、(10)授权公告号 CN 102839161 B (45)授权公告日 2013.07.03 CN 102839161 B *CN102839161B* (21)申请号 201210319225.4 (22)申请日 2012.09.03 C12N 9/16(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金 山学区 (72)发明人 邱君志 苏礼超 涂洁 宋飞飞 关雄 邱云锋 李小霞 郭庆丰 何肖云 吴国辉 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 CN 101100682。
2、 B,2011.04.27, 说明书全文 . CN 101525577 C,2011.07.20, 说明书全文 . CN 101403930 B,2011.05.25, 说明书全文 . CN 100381557 C,2008.04.16, 说明书全文 . CN 102168025 B,2012.08.08, 说明书全文 . CN 101845397 B,2012.06.27, 说明书全文 . liyang-ling 等 .CULTURE CONDITIONS FOR THE PRODUCTION OF TREHALOSE-HYDROLYSING ENZYMES FROM METARHIZIUM。
3、 ANISOPLIAE. mycosystema .2004, 第 23 卷 ( 第 3 期 ),403-411. 杨腊英 等 . 金龟子绿僵菌菌株培养基的 改良 .热带作物学报 .2008, 第 29 卷 ( 第 2 期 ),210-214. 肖代敏 等 . 戴氏绿僵菌活性多糖深层发酵 的培养基优化 .食品科学 .2010, 第 31 卷 ( 第 11 期 ),132-135. 宋漳 等 . 培养基组成对金龟子绿僵菌 M337 菌株稳定性的影响 .附件农林大学学报 （自然科 学版） .2008, 第 37 卷 ( 第 2 期 ),135-139. (54) 发明名称 一种绿僵菌发酵生产酯酶的。
4、培养基及方法 (57) 摘要 本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更 具体地， 本发明涉及一种绿僵菌发酵生产酯酶的 培养基及方法。所述培养基的原料含有酵母粉 1-3w%， D- 山 梨 醇 1-4w%， Ba2+0.01-0.04mol/L， VB40.005-0.02w%， 三醋酸甘油酯 2w%， 培养基初始 pH=6.6-7.5。该方法通过将发酵种子液按接种于 培养基， 250mL 的三角瓶装液量为 125mL， 接种量 10%， 于 27， 转速 160r/min 下培养。本发明的发 酵方法有发酵周期短 ； 条件温和， 易于控制 ； 提供 的用于绿僵菌发酵生产酯酶的培养基， 具有酯酶 产率。
5、高， 酯酶活力高等优点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张林 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102839161 B CN 102839161 B *CN102839161B* 1/1 页 2 1. 一种绿僵菌 MaYDTR 03 发酵生产酯酶的培养基， 其特征在于， 所述培养基的原料含 有酵母粉 1-2w%， D- 山梨醇 1-4 w %， Ba2+ 0.01-0.04 mol/L， VB40.005-0.02 w %， 三醋酸甘 油酯。
6、 2w%， 培养基初始 pH=6.6-7.5。 2. 一种绿僵菌 MaYDTR 03 发酵生产酯酶的培养基， 其特征在于， 所述培养基的原料按 重量分数计， 含有酵母粉 2%， D- 山梨醇 3%， BaCl22H2O 0.24%， VB40.01%， 三醋酸甘油酯 2%， 培养基初始 pH=6.9。 3. 一种绿僵菌 MaYDTR 03 发酵产酯酶的方法， 其特征在于， 所述方法包含以下步骤 ： （a） 将绿僵菌 MaYDTR 03 接种种子培养基， 制得发酵种子液 ； （b） 将步骤 （a） 中制得的发酵种子液接种于权利要求 1 或 2 所述的培养基， 250mL 的三 角瓶装液量为 12。
7、5mL， 接种量 10%， 于 27， 转速 160 r/min 下培养。 4. 如权利 3 所述绿僵菌 MaYDTR 03 发酵产酯酶的方法， 其特征在于， 所述种子培养基 的原料含有 ： 按培养基重量计， 牛肉膏2.0%， 蔗糖2.0%， 蛋白胨0.2%， 酵母粉0.2%， (NH4)2SO4 0.5%， K2HPO4 0.1% ， MgSO4.7H2O 0.05%， pH5.5。 权 利 要 求 书 CN 102839161 B 2 1/9 页 3 一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法 技术领域 0001 本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地， 本发明涉及一种绿僵菌发酵生 产酯酶的。
8、培养基及方法。 背景技术 0002 酯酶 （Esterase， EC3.1.1.1） 是一类能够催化酯键水解形成相应的酸和乙醇的酶 类， 广泛分布于动植物和微生物 (Bronscheuer， 2002)。微生物能够产生多种具有酯解活力 的酶类， 包括酯酶(Esterase)和脂肪酶(Lipase)。 酯酶能够水解或者合成酰基碳链长度小 于 10 的甘油酯类， 对于酰基碳链长度大于 10 的甘油酯类则没有催化活性。 0003 酯酶催化反应具较广的底物范围， 在催化底物反应时不需要辅助因子， 在一些变 形剂， 如有机溶剂中有很高的稳定性， 此外酯酶催化反应具有立体特异性和区域专一性的 特点。由于酯。
9、酶以上优点， 使得酯酶在很多领域有着广泛的应用。近年来， 全球市场工业用 酶市场不断扩大， 而酯酶是其中一种被广泛使用的生物催化剂， 在全球工业用酶市场占据 很高的很高比例。 随着日益高涨的能源成本、 石油煤炭等不可再生资源的衰竭、 环境污染以 及经济全球化， 大规模的可再生的， 环保的生物处理工艺来代替或者互补传统不可再生， 高 能耗， 高污染的工业生产工艺是刻不容缓。 0004 在食品加工方面， 利用酯酶分解底物后产物为呈香化合物， 将酯酶己应用于奶制 品的增香、 改善稻米和发酵类饮料的香味等方面， 如用酯酶处理过的奶制品比未处理的具 有更好的香味和可接受性 ； 在农业生产方面， 人工合成。
10、的有机磷化物广泛用于杀虫剂， 这 些物质的残留将危害环境并且最终危害人类健康， 来自于Brevundimonas diminuta和 Alteromonas sp. 酯酶被证明能有效降解这类物质， 广泛应用于清除有机磷杀虫剂的污染 ； 在医药合成方面， 酯酶主要用于拆分手性药物。 来自于Pseudomonas sp.的酯酶被应用于抗 炎药物布洛芬的生产， 来自于Bacillus cogulans的酯酶广泛应用于生物活性物质 DL- 甘 油醇缩丙酮的生产 ； 在轻化工业方面， 酯酶广泛应用于制浆造纸、 纺织品、 皮革处理等。 来自 于Ophiostoma piceae的酯酶能够有效的水解甘油三酯。
11、和幽醇酯， 酯酶能够显著降低制浆 造纸过程中的树脂， 因而能够显著提高机器的运行效率并改善纸张的品质， 因而广泛应用 于制浆造纸工业 ； 化工日用品方面， 碱性酯酶具有明显的助洗作用， 加入后使得洗涤剂朝低 磷或无磷的方向反应， 有利于降低水体中无机磷含量， 从而减少环境水体富营养化。 酯酶除 了在上述的食品加工、 农业生产、 医药合成以及轻化工业等行业广泛使用外， 酯酶还被认为 在环保型燃料、 生物柴油等生物能源的开发具有广泛的前景。 0005 微生物酯酶是一类重要的工业酶类， 国内外上从20世纪90年代到现在， 相继开发 出各种酯酶， 但是依旧无法满足现代工业需求。 我国真菌产酯酶的相关研。
12、究起步较晚， 在期 刊杂志上鲜有报道， 覃拥灵等人利用诱变裂褶菌 ZM37.8， 获得稳定的正突变高产菌株 E1， 其产酯酶量为 87.56U/mL （覃拥灵等， 2007） 。真菌发酵有别于细菌发酵， 真菌在发酵过程中 可以随时取样接种于 LB 培养基， 检测是否染杂菌 ； 也可通过添加抗生素减少染菌， 且真菌 发酵条件温和， 易于控制等鲜明特点。 因此真菌发酵法生产的独特优势， 有利于真菌酯酶更 说 明 书 CN 102839161 B 3 2/9 页 4 广泛地工业化应用。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法。 0007 本发明首先提供了一种绿僵。
13、菌发酵生产酯酶的培养基， 所述培养基的原料含有酵 母粉 1-3w%， D- 山梨醇 1-4 w %， Ba2+ 0.01-0.04 mol/L， VB40.005-0.02 w %， 三醋酸甘油酯 2w%， 培养基初始 pH=6.6-7.5。 0008 更优选地， 所述培养基的原料按重量分数计， 含有酵母粉 2%， D- 山梨醇 3%， BaCl22H2O 0.24%， VB40.01%， 三醋酸甘油酯 2%， 培养基初始 pH=6.9。 0009 其次， 本发明还提供了一种绿僵菌发酵产酯酶的方法， 所述方法包含以下步骤 ： 0010 （a） 将绿僵菌接种种子培养基， 制得发酵种子液 ； 00。
14、11 （b） 将步骤 （a） 中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基， 250mL 的三角瓶装液量为 125mL， 接种量 10%， 于 27， 转速 160 r/min 下培养。 0012 所述种子培养基的原料含有 ： 按培养基重量计， 牛肉膏 2.0%， 蔗糖 2.0%， 蛋白胨 0.2%， 酵母粉 0.2%， (NH4)2SO4 0.5%， K2HPO4 0.1% ， MgSO4.7H2O 0.05%， pH5.5。 0013 本发明采用的绿僵菌为绿僵菌 M a Y D T R 03（以下简称绿僵菌 Ma-3） （何学友 等， 应用绿僵菌和白僵菌林间防治木麻黄毒蛾的初步研究。
15、， 福建林业科技， 2011 年 6 月） 。 0014 采用本发明优化后的培养基， 菌龄4d， 发酵周期54h， 发酵产生结果绿僵菌Ma-3产 酯酶为 45U/mL 以上。 0015 本发明的发酵方法有发酵周期短 ； 条件温和， 易于控制 ； 提供的用于绿僵菌发酵 生产酯酶的培养基， 具有酯酶产率高， 酯酶活力高等优点。 附图说明 0016 图 1 为对硝基苯酚标准曲线。 具体实施方式 0017 本发明用下列实施例来进一步说明本发明， 但本发明的保护范围并不限于下列实 施例。 0018 实施例 1 0019 单因素实验确定培养基最优成分 0020 （1） 种子培养基配制 ： 牛肉膏 20.0。
16、g， 蔗糖 20.0g， 蛋白胨 2.0g， (NH4)2SO4 5.0g， 酵母粉 2.0g， K2HPO4 1.0g ， MgSO47H2O 0.5g， 蒸馏水定容到 1000mL， 调 pH 至 5.5， 分装于 250mL 的三角瓶， 每个三角瓶含 150mL。0.1MPa， 灭菌 20min。使用前可加入抗生素对培养基 预处理。 0021 （2） 发酵种子的制作 ： 将绿僵菌 Ma-3 接种于马铃薯琼脂培养基上， 于 27下培养 5d， 待其产孢子， 即活化 ； 将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基， 27， 转速 160 r/min 下培养 24h， 即为发酵液。 002。
17、2 （3） 酶液的制备 ： 取步骤 （2） 下的发酵液在 4下， 5000 r/min 离心， 15min， 得上 清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长 405nm 处测定吸光值。换算成酶活单位 U/ 说 明 书 CN 102839161 B 4 3/9 页 5 mL。 0023 （4） 酯酶酶活测定 ： 根据 Westlake K 等人的酯酶酶活测定方法， 进行改进， 取 1 mL 1mmol/L的对硝基苯酯酸酯(p-NPC2)溶液、 2 mL 50mM Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液加人试管 中， 放人恒温水浴器中， 40保温 15 min， 再加 1 mL 酶液振荡反应 4.。
18、5 min， 立即加入 2 mL 95%乙醇终止反应， 在波长405nm处测定吸光值。 另以在沸水浴中失活的酶液代替原酶液为 空白。酶活力单位的定义为在本实验测定条件下， 以每分钟催化产生 1mol 的对硝基苯酚 所需的酶量为 1 个酶活力单位 (U)。酶活力 （U/g 或 U/mL） =AKVn/(tm)（A 为样品 的吸光度 ； K 为吸光常数 ； V 为反应试剂的总体积 ； n 为酶液的稀释倍数 ； t 为反应时间 ； m 为 酶液质量或体积， g 或 mL） 。 0024 （5） 标准曲线的制作 ： 精确配制对硝基苯酚 2mmol/L 标准溶液 ； 首先在试管中加 入不同体积 50mm。
19、ol/L Tris-Hcl pH7.2， 在 40保温 15 min， 在加入不同体积的对硝基苯 酚标准液。反应 4.5min 后立即加入 2mL95% 乙醇。反应体系为 6mL（对硝基苯酚和缓冲液 4mL， 终止液为 2mL） 。每个浓度做 3 平行实验， 为空白对照。在波长 405 nm 处测定吸光值。 以吸光值为纵坐标， 标准溶液溶度为横坐标， 经统计处理得到的线性回归方程， y=0.0025x， R2=0.9976， 结果见图 1。 0025 （6） 不同碳源、 氮源、 金属离子、 维生素对产酯酶的影响 0026 （a） 碳源对酶产量的影响， 在含有三醋酸甘油酯 2% (w/v）（经细。
20、菌过滤器除菌后加 入， 下同） 、 蛋白胨 1%、 KH2PO4 0.1%、 MgSO4.7H2O 0.05%、 NaCl 0.1%、 FeSO4.7H2O 0.001%、 pH7.0 的培养基中分别添加2%葡萄糖、 蔗糖、 麦芽糖、 果糖、 L(+)-阿拉伯糖、 海藻糖、 D-山梨醇、 可 溶性淀粉， 0.1MPa， 灭菌 20min （下同） ， 接入相同的绿僵菌菌液， 在 27、 160r/min 的摇床中 培养 60h 检测酶活性， 结果见表 1。 0027 （b） 金属离子对产酶的影响， 在含有三醋酸甘油酯 2% (w/v） 、 蔗糖 2%、 蛋白胨 1%、 pH7.0 的培养基分别。
21、添加 0.02mol/L（以 6（a）中含有的金属离子按其浓度换算得来） FeCl36H2O、 NaCl、 MgCl26H2O、 CaCl2、 MnCl24H2O、 KCl、 BaCl22H2O、 ZnCl2、 CuCl22H2O、 FeCl24H2O， 灭菌， 接入相同的绿僵菌菌液， 在 27、 160r/min 的摇床中培养 60h 检测酶活 性， 结果见表 2。 0028 （c） 氮源对酶产量的影响， 在含有三醋酸甘油酯 2% (w/v） 、 蔗糖 2%、 KH2PO4 0.1%、 MgSO4.7H2O 0.05%、 NaCl 0.1%、 FeSO4.7H2O 0.001%、 pH7.0。
22、的培养基中分别添加1%的酵母粉、 蛋白胨、 甘氨酸、（NH4） 2HPO4、 (NH4)2SO4、 NaNO3、 NH4NO3、 KNO3、 胰蛋白胨、 叶酸、 酸水解蛋白胨， 灭菌， 接入相同的绿僵菌菌液， 在 27、 160r/min 的摇床中培养 60h 检测酶活性， 结果见表 3。 0029 （d） 维生素对酶产量的影响， 在含有三醋酸甘油酯 2% (w/v） 、 蛋白胨 1%， 蔗糖 2%、 KH2PO4 0.1%、 MgSO4.7H2O 0.05%、 NaCl 0.1%、 FeSO4.7H2O 0.001%、 pH7.0 的培养基中分别添加 0.01% 硫胺素 VB1、 核黄素 V。
23、B2、 氨基嘌呤 VB4、 吡哆醇类 VB6、 烟酸、 叶酸、 抗坏血酸 VC、 生育酚 脂 VE 、 VA、 VD， 灭菌， 接入相同的绿僵菌菌液， 在 27、 160r/min 的摇床中培养 60h 检测酶活 性， 结果见表 4。 0030 表 1 不同碳源对酶产量的影响 0031 说 明 书 CN 102839161 B 5 4/9 页 6 0032 表 2 不同金属离子对酶产量的影响 0033 0034 表 3 不同氮源对酶产量的影响 0035 说 明 书 CN 102839161 B 6 5/9 页 7 0036 表 4 不同维生素对酶产量的影响 0037 0038 从表中可以得出最。
24、佳的培养基成分为 D- 山梨醇， 酵母粉， Ba2+， VB4， 接下来的正交 实验将以此作为发酵培养基成分。 0039 实施例 2 0040 正交实验确定最优发酵条件 0041 （1） 正交实验确定最佳培养基 0042 从单因素实验确定的培养基的基础上， 改变各成分的溶度， 和 pH 值， 配置不同的 培养基， 方法同实施例 1 中步骤 （1） 、（2） 。见表 5， 将相同量的接种量 （10%）菌种接种于 250mL， 装有 50mL 培养液， 在 27， 转速 160 r/min 下培养培养 48h。然后按实施例 1 步骤 （3） 、（4） 测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的。
25、实验组号， 进行验证实验。为 说 明 书 CN 102839161 B 7 6/9 页 8 了避免累赘实施例中的培养基配法、 粗酶液的制作、 酶活测定方法均与实施例 1 的方法相 同。 0043 表 5 绿僵菌 Ma-3 酯酶五因子四水平 （45） 正交实验设计 0044 0045 表 6 绿僵菌 Ma-3 酯酶五因子四水平 （45） 正交实验设计实验结果 0046 0047 注 :K1 为各因素水平 1 的所有酶活力之和， K2 为各因素水平 2 的所有酶活力之 和， K3 为各因素水平 3 的所有酶活力之和， K4 为各因素水平 4 的所有酶活力之和， R 为极 差， 酶活力的数字代表 3。
26、 次重复的平均值 (mean) 标准差 (S.D)。 0048 表 7 培养基优化验证试验 说 明 书 CN 102839161 B 8 7/9 页 9 0049 0050 正交结果分析表明 ： 最佳因素组合是 A3B3C2D2E2， 即 D- 山梨醇 2%， 酵母粉 1%， Ba2+ 0.02mol/L， VB40.01%， pH6.9， 且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包 括 D- 山梨醇 2%、 酵母粉 1%、 Ba2+0.01mol/L、 VB40.1%、 pH6.9， 即 A3B3C2D2E2。表 6 变化因子 的极差值 R 分别为碳源 (94.33)、 氮源 (10。
27、2.86)、 金属离子 (117.25)、 维生素 (81.01) 和 pH(66.62)， 表明碳源、 氮源、 金属离子、 维生素和 pH 的变化与绿僵菌 Ma-3 产酯酶培养基相 关， 尤其是金属离子的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言， pH 的改变对产酶的影响较 小。 0051 (2) 正交实验确定最优培养条件 0052 在从正交实验确定的最优培养基的基础上， 通过设定不同接种量， 装液量， 菌龄， 培养时间， 在 27， 转速 160 r/min 下培养， 各组号的培养时间以表 9 为准。然后按实施例 1 步骤 （3） 、（4） 测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号。
28、， 进行验证实 验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、 粗酶液的制作、 酶活测定方法均与实施例 1 的方 法相同。 0053 表 8 绿僵菌 Ma-3 酯酶四因子三水平 （34） 正交实验 0054 0055 表 9 绿僵菌 Ma-3 酯酶四因子三水平 （34） 正交实验设计实验结果 0056 说 明 书 CN 102839161 B 9 8/9 页 10 0057 注 : K1 为各因素水平 1 的所有酶活力之和， K2 为各因素水平 2 的所有酶活力之 和， K3 为各因素水平 3 的所有酶活力之和， R 为极差， 酶活力的数字代表 3 次重复的平均值 (mean) 标准差 (S.D)。 。
29、0058 表 10 培养条件优化验证试验 0059 0060 总结了 4 个因子 ( 接种量、 装液量、 菌龄和培养时间 ) 对绿僵菌 Ma-3 产酯酶产生 的影响。表 9 中的 R 值表明培养时间 (54.36) 是一个比其他培养条件更重要的因子， 其次 是装液量 (39.97)， 然后是菌龄 (35.71)， 对绿僵菌 Ma-3 产酯酶影响最小的因子是接种量 (19.19)。最优相应的实验条件应为 A2B3C2D2( 接种量 10%， 装液量 125mL/250mL， 菌龄 4d， 培 养时间 54h） 。在培养该菌产的时候， 要注意培养时间， 以提高产酶效率。 0061 实施例 3 00。
30、62 真菌产酯酶发酵方法 0063 （1） 发酵种子的制备 0064 （A） 菌种和培养基 0065 菌种 ： 绿僵菌 Ma-3 0066 斜面培养基 ： PDA 培养基 0067 液体种子培养基 ： 牛肉膏 20.0g， 蔗糖 20.0g， 蛋白胨 2.0g， (NH4)2SO4 5.0g， K2HPO4 1.0g ， MgSO47H2O 0. 5g， 蒸馏水定容至 1000mL， 调 pH 值为 5.5， 0.1MPa， 灭菌 20min， ( 该 培养基 pH 值较低是为了抑制杂菌生长 )。 说 明 书 CN 102839161 B 10 9/9 页 11 0068 （B） 种子液制备 。
31、0069 将斜面上的纯种绿僵菌 Ma-3 转接到多个 250mL 三角瓶中， 其中装有 100mL 培养 基， 然后在 27 ( 温度较发酵培养同样是为了抑制染菌 )， 在往复式震荡摇床转速 160 r/ min 下培养培养 4d， 带菌丝生长健壮， 菌液呈粘稠状时， 说明种子已经生长好了。 0070 此外接种前可在种子液中加入抗生素， 杀灭或者抑制杂菌的生长， 从而获得不带 杂菌的纯种菌种。 0071 （2） 发酵培养 0072 发酵培养基 ： 按照培养基优化正交实验， 即 D- 山梨醇 2%， 酵母粉 1%， BaCl22H2O 0.24%， VB40.01%， pH6.9， ， 三醋酸甘油酯 2% (w/v） ， 配制。 0073 将上一步骤中制备的绿僵菌 Ma-3 发酵种子液， 按培养条件正交实验得出的最佳 条件， 接种量 10% 接种于 250mL 三角瓶中， 瓶中装有 125mL 发酵培养液， 0074 摇床温度 ： 27 1， 0075 发酵周期 ： 54h， 0076 发酵产生结果绿僵菌 Ma-3 产酯酶为 45U/mL 以上， 该实施例表明本发明的摇瓶实 验工艺良好。 说 明 书 CN 102839161 B 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102839161 B 12 。