一种包含HBD3乳腺特异性表达载体的重组牛胎儿成纤维细胞.pdf

本发明涉及一种包含hBD3乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞，包括一种hBD3乳腺特异性表达载体，包含目的基因hBD3，分别在hBD3基因的5′端和3′端插入调控元件；所述的hBD3乳腺特异性表达载体为pEBB表达载体。一种包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞，其宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过转染外源性表达载体pEBB，将目的基因hBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。以包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转hBD3基因的奶牛。

1、  一种hBD3乳腺特异性表达载体，包含目的基因hBD3，其特征在于，分别在hBD3基因的5′端插入如SEQ.ID.NO.2所示的序列，3′端插入如SEQ.ID.NO.3所示的序列，作为调控元件。

2、  如权利要求1所述的hBD3乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述hBD3乳腺特异性表达载体还包含抗生素筛选基因和标记基因。

3、  如权利要求2所述的hBD3乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述的抗生素筛选基因为neor基因，所述的标记基因为EGFP基因。

4、  如权利要求1所述的hBD3乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述hBD3乳腺特异性表达载体为pEBB表达载体，通过多克隆位点XbaI和NheI将hBD3基因克隆到pEBB表达载体。

5、  一种包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过转染外源性表达载体pEBB，将目的基因hBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

6、  如权利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为1-3代的牛胎儿成纤维细胞。

7、  如权利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，牛胎儿成纤维细胞通过脂质体法转染外源性表达载体pEBB。

8、  如权利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，所述牛胎儿成纤维细胞为包含目的基因hBD3的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C200939。

9、  权利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。

一种包含hBD3乳腺特异性表达载体的重组牛胎儿成纤维细胞
技术领域
本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种包含hBD3乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞。
背景技术
乳房炎是奶牛中很常见的疾病，这种炎症是由多种病原微生物引起的，以大肠杆菌(E.coli)和葡萄球菌(S.aureus)为主(NOTEBAERT S，DEMON D，VANDEN BERGHE T et al.Inflammatory mediators in Escherichia coli-inducedmastitis in mice[J].Comparative Immunology，Microbiology and InfectiousDiseases，2008，31(6)：551-565；ZHEN YH，JIN LJ，LI XY et al.Efficacy ofspecific egg yolk immunoglobulin(IgY)to bovine mastitis caused byStaphylococcus aureus[J].Veterinary Microbiology，2009，133(4)：317-322.)。乳房炎对奶业造成了巨大的经济损失，目前，治疗乳房炎仍以抗生素的投放为主，但抗生素价格昂贵；而且长期使用抗生素会使细菌产生抗药性，所以寻求一种新的治疗乳房炎的方法迫在眉睫。
自身能够特异性的在乳房携带或者分泌抗乳房炎的因子，是解决奶牛乳房炎的理想方法，而这需要依赖于现代生物技术来构建转基因奶牛来实现。转基因动物的生产可以追溯到20世纪70年代中叶，用原核显微注射生产转基因动物持续了20多年(BOWEN RA，REED ML，SCHNIEKE A，et al.Transgenic cattle resulting from biopsied embryos：expression of c-ski in atransgenic calf[J].Biol Reprod，1994，50：664-8.)，但外源基因的随机整合和配子系传送外源基因的不确定性限制了这种技术的广泛应用。在小鼠上，胚胎干细胞可以代替原核注射(BRANDON EP，IDZERDA RL，MCKNIGHT GS.Targeting the mouse genome：a compendium of knockouts(Part II)[J].Curr Biol，1995，5：758-65.)，但胚胎干细胞系还没有在家畜上建立(SHIM H，GUTIERREZ-ADAN A，CHEN LR，et al.Isolation of pluripotent stem cells fromcultured porcine primordial germ cells[J].Biol Reprod，1997，57：1089)。
而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J，BHUIYAN M.M.U.，HYUN Y J，et al.An approach for producing transgeniccloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha1-antitrypsin gene[J].Theriogenology，2006，65(9)：1800-1812.)，其突出的优点是将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(WHEELER MB，WALTERS EM.Transgenic technology and applications inswine[J].Theriogenology，2001，56：1345-69.)。
人β-防御素3(hBD3)是人体产生的一种大小为4-5KD的抗菌肽，由45个氨基酸组成，它具有广谱、强效的抗多种微生物感染的作用，特别是对金黄色葡萄球菌等阳性菌有强烈杀伤作用(CHENA H，XUA ZN，LI P et al.Recent advances in the research and development of human defensins[J].Peptides，2006，27(4)：931-940.)。目前已有从扁桃体组织、人新鲜包皮组织、新鲜的人肝癌组织等组织中克隆到了hBD3的cDNA，并构建了各种hBD3表达载体，在大肠杆菌、人的某些细胞中得到表达(Li CL，Yuan H，Chen ZH et al.Expression of Recombinant Human β-Defensin 3 in E.coli and Its Antimicrobial Activity Analysis[J].Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2005，21(5)：705-708.；Tuo XY，Chai JK，Jiang W et al.Fusion expression of humanβ-defensin 3 and bactericidal/permeability increasing protein in P.pastoris[J].Journal of the Fourth Military Medical University，2007，28(7)：648-650.)。但是，以hBD3作为目标基因，以动物细胞为宿主细胞，特别是奶牛的体细胞为宿主细胞的表达载体，还未见报道；也没有以hBD3作为目标基因构建基因克隆胚的核供体细胞细胞系的报道。
发明内容
本发明解决的问题在于提供hBD3乳腺特异性表达载体，以及基于该载体的，作为核供体细胞的包含hBD3乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，为克服奶牛乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种hBD3乳腺特异性表达载体，包含目的基因hBD3，分别在hBD3基因的5′端插入如SEQ.ID.NO.2所示的序列，3′端插入如SEQ.ID.NO.3所示的序列，作为调控元件。
所述的hBD3乳腺特异性表达载体，还包含抗生素筛选基因和标记基因，所述的抗生素筛选基因为neo基因，所述的标记基因为EGFP基因。
所述的hBD3乳腺特异性表达载体为pEBB表达载体，通过多克隆位点XbaI和NheI将hBD3基因克隆到pEBB载体。
一种包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞，其宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过转染外源性表达载体pEBB，将目的基因hBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。
所述的宿主细胞为1-3代的牛胎儿成纤维细胞。
所述的牛胎儿成纤维细胞通过脂质体法转染外源性表达载体pEBB。
所述牛胎儿成纤维细胞为包含目的基因hBD3的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 200939。
所述的包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明构建了一种hBD3乳腺特异性表达载体，通过在hBD3基因两端克隆牛β-酪蛋白基因的5′和3′调控区，牛β-酪蛋白基因的5′和3′调控区能够指导目的基因在牛的乳腺组织中特异的高效表达。
2、本发明将目的基因hBD3克隆到基础载体pBCP上，构建了hBD3乳腺特异性表达载体pEBB，将其转染到牛胎儿成纤维细胞，构建转基因的牛胎儿成纤维细胞系；荧光显微观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，并进行PCR鉴定证实目的基因hBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。
3、以包含目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转hBD3基因的奶牛。
4、将转基因克隆胚移入64头受体牛子宫，获得21头妊娠3个月的转基因克隆胚胎受体牛。
保藏说明
本发明所述的包含目的基因hBD3的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，进行了下述保藏：
保藏时间：2009年5月20日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC C 200939。
附图说明
图1是乳腺特异性表达载体pEBB的质粒图谱；
图2是BamHI和XbaI分别单酶切鉴定阳性重组质粒pBBD；
图3是SacI、SalI双酶切鉴定阳性重组质粒pEBB；
图4是荧光显微镜观察pEBB载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞的报告基因EGFP表达的结果图；
图5是对pEBB载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞基因组的hBD3基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；
图6是包含hBD3基因的重组胚的囊胚发育图；
图7是对包含hBD3基因的重组胚的基因组的hBD3基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图。
具体实施方式
本发明首先构建含有hBD3和绿色荧光蛋白(EGFP)基因的乳腺特异性表达载体pEBB，其次用脂质体法将外源性表达载体pEBB导入牛胎儿成纤维细胞，荧光显微观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因hBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；最后，将转染hBD3基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚，并进行PCR鉴定，将转基因克隆胚移入64头受体牛子宫，获得21头妊娠3个月的转基因克隆胚胎受体牛。
具体所涉及的试剂如下：G418、DMEM培养基和LipofectamineTM2000均购自美国GIBCO(Invitrogen)公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，胎牛血清为国产杭州四季青，细胞培养板和培养皿为丹麦Nunclon公司产品，质粒提取试剂盒和细胞基因组提取试剂盒均购自天根公司。Taq DNA聚合酶购自Takara公司。
下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明解释的而不是限定。
1、乳腺特异性表达载体pEBB的构建
a、目的基因hBD3的克隆
根据GeneID：55894所公布的hBD-3基因序列设计引物P1和P2，以人基因组为模板用引物P1、P2进行PCR扩增，引物序列如下：
前向引物P1：agcagctatg aggatccatt atctt    25
后向引物P2：ttttatttct ttcttcggca gcatt    25
50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，P1(10μmol/L)：1μL，P2(10μmol/L)：1μL，rTaq聚合酶(5U/μL)：0.25μL，模板1μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，加超纯水至50μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58.9℃退火30s，72℃延伸1min30s，31个PCR循环，72℃再延伸7min；
PCR产物与pMD-18T Vector 4℃连接过夜，转化感受态细胞E.coliDH5α，通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经XbaI酶切鉴定阳性重组质粒pTAhBD3并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。hBD3基因测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，与公布的hBD-3基因序列(GeneID：55894)同源性为99％，因此所克隆的基因为人β-防御素3基因。
b、pEBB的载体结构
如图1所示，本发明具体以pBCP载体和pEGFP-C1载体构建包含目的基因hBD3的乳腺特异性表达载体pEBB。
pBCP载体是一种乳腺特异性表达载体，其中包括牛β-酪蛋白基因的5′和3′调控区(BBC5和BBC3)，以及它们之间的多克隆位点；牛β-酪蛋白是奶牛乳汁中主要的蛋白质，牛β-酪蛋白基因具有很强的表达活性，在泌乳激素的刺激下，牛β-酪蛋白基因的5′和3′调控区能够指导目的基因在牛乳腺组织中特异的高效表达。
pBCP载体的构建如下：将SEQ.ID.NO.2所示的BBC5片段TA克隆到pMD-18T载体(购自大连宝生物公司)上，获得的载体命名为pBBC5；将片段SEQ.ID.NO.3所示的BBC3片段TA克隆到pMD-18T载体(购自大连宝生物公司)上，获得的载体命名为pBBC3；Acc65和BamHI分别双酶切pBBC5和pBBC3，将酶切pBBC5的大片段和酶切pBBC3的小片段连接就得到了pBCP载体。
pEGFP-C1载体包含G418抗性筛选基因neor和带有CMV启动子的标记基因EGFP；标记基因EGFP可在哺乳动物细胞中高表达并产生荧光；pEGFP-C1载体商购就可以获得。
本发明通过多克隆位点XbaI和NheI将目的基因hBD3插入到pBCP上的多克隆位点，利用牛β-酪蛋白基因的调控序列来调控hBD3基因在牛乳腺上皮细胞中特异性的表达。在目的基因hBD3两端构建的调控元件，包括2.2kb的牛β-酪蛋白基因5′调控区(BBC5，包括1.7kb的包含有启动子的上游调控序列以及5′不翻译区中的第一外显子和部分第一内含子)，以及0.6kb的3′端调控区(BBC3，包含CSN2基因最后一个内含子的小部分、最后一个不翻译的外显子及150bp的侧翼区)，3′调控区还包含polyA加尾信号及控制转录终止的G/T簇，这些序列结构对mRNA的转录、在细胞质内的稳定性及介导其翻译调控起到重要的作用。牛β-酪蛋白基因的5′调控区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，3′调控区的核苷酸序如SEQ.ID.NO.3所示。
牛β-酪蛋白基因的5′调控区和3′调控区对目的基因的调节还表现为，在合理因素诱导下，如泌乳激素的刺激，两者可以协同发挥分子内的长程互作，使外源基因hBD3按牛β-酪蛋白内源转录方式进行转录(石统东，吴玉章，朱锡华.真核mRNA3′非翻译区在基因表达中的作用[J].生物化学与生物物理进展，1998，25(3)：195-197.)。牛β-酪蛋白基因的调控功能已在前期的研究中得到了证实，能够用来调控外源基因的表达。(刘金龙.人瘦蛋白乳腺表达载体的构建及细胞表达的初步研究[D].陕西：西北农林科技大学，2004.；何小宁.人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建及其在小鼠乳腺癌细胞中的表达[D].陕西：西北农林科技大学，2006.)
c、pEBB载体的构建
用NheI和BamHI双酶切载体pBCP，胶回收大片段，Klenow Fragment补平后待用。用XbaI单酶切pTAhBD3载体，胶回收小片段，Klenow Fragment补平。将回收的大、小片段用T4DNA连接酶4℃连接过夜，并转化感受态细胞E.coli DH5α，经BamHI和XbaI分别单酶切鉴定阳性重组质粒，如图2所示，其中，泳道1Marker；泳道2为XbaI单酶切鉴定，可以看到4480bp和2376bp的两条条带；泳道3为BamHI单酶切鉴定，可以看到一条约为6856的条带，说明hBD3通过XbaI酶切位点克隆到了载体pBCP上，将获得的重组质粒命名为pBBD。
以pBBD为模板用引物进行PCR扩增，其中，引物对为：
前向引物P3：aggagctcta atgagaaaag ggaaatgttg aatgg    35
后向引物P4：gtcgtcgact ttccacagct ctttttaaca tc       32
上下游引物划线部分分别为SacI和SalI酶切位点，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸4min，35个PCR循环；72℃再延伸10min。
将上述以pBBD为模板的PCR产物胶回收纯化后，以SacI、SalI双酶切后克隆入用同样酶双切的载体pEGFP-C1中，SacI、SalI双酶切鉴定阳性克隆载体，如图3所示，其中，泳道1为Marker；泳道2为SacI、SalI双酶切鉴定，可以看到4700bp和3800bp的两条条带；说明包含目的hBD3和调节元件的片段通过SacI、SalI双酶切位点克隆到了载体pEGFP-C1上，将获得的阳性重组质粒命名为pEBB。
由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，所以本研究使用了去内毒素的质粒提取试剂盒，以减少内毒素对试验结果的负面影响。用天根公司的去内毒素的质粒纯化试剂盒提取质粒后用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度，经测定，质粒的浓度为308.9ng/μl，OD260/280为2.01，说明质粒较纯，可用于转染。
2、pEBB表达载体转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞系
d、牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO₂培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO₂培养箱中培养。1-3代的牛胎儿成纤维细胞，培养至细胞达到90％汇合用于转染。
本发明以G418作为筛选药物，由于表达载体pEBB的骨架上有G418抗性基因neor，外源基因pEBB得到表达的牛胎儿成纤维细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。
G418最小致死浓度的测定：在牛胎儿成纤维细胞培养液(DMEM细胞培养液)中分别加入浓度梯度的G418筛选1周，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≥600μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600μg/ml。
e、pEBB表达载体转染牛胎儿成纤维细胞
转基因的方法有很多种，包括电穿孔法、显微注射法、基因枪法、病毒载体法、受体介导法等。本发明具体采用脂质体转染法，用表达载体pEBB转染牛胎儿成纤维细胞，脂质体转染试剂lipofectamineTM2000与DNA通过离子间相互作用，形成单层阳离子脂质包裹DNA的类脂-DNA复合物颗粒，通过细胞膜将外源DNA送到细胞内。用脂质体进行基因转移与其它方法相比，操作简便、重复性好、不受DNA大小限制、无组织特异性和免疫原性。具体为：
接种前一天，将第1代牛胎儿成纤维细胞以1×10⁵接种于12孔板中，培养过夜使细胞达到70-80％汇合。对于每孔细胞，分别将3μg的pEBB表达载体和9μl的脂质体加入到含有100μl无血清DMEM培养液的两个200μl离心管中，5min内将两个离心管中的液体混合，室温孵育20min后，缓慢将其加入到不含血清的DMEM细胞培养液中；5-6h后，转换为含血清的正常DMEM细胞培养液继续培养，24h后加入G418至终浓度600μg/ml。
f、pEBB载体阳性表达的细胞筛选
pEBB转染牛胎儿成纤维细胞24h后，在荧光显微镜下观察报告基因EGFP的表达情况，并在含血清的DMEM细胞培养液中添加600μg/ml的最小致死浓度的G418筛选；以未转染pEBB的牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418(600μg/ml)。
pEBB转染细胞24h后，在荧光显微镜下可以看到绿色荧光，如图4所示，转基因的牛胎儿成纤维细胞发出绿色荧光，说明pEBB已经进入细胞并且阳性表达；pEBB转染细胞7d后，对照组的细胞全部死亡，将包含pEBB转染阳性的细胞组的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，可见到阳性细胞形成岛屿状细胞群，在荧光显微镜下仍然可以看到绿色荧光；然后消化细胞用不加G418的正常培养液扩大培养。
本发明筛选的阳性细胞都是稳定转染pEBB的细胞，目的基因pEBB整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外；在稳定转染的过程中，质粒pEBB上携带的基因会整合到宿主细胞的基因组上，整合的位置是随机的；通过G418筛选7天再半剂量持续筛选来达到稳定转染的目的，表现为报告基因在被转染的阳性细胞内持续表达，因此筛选的阳性细胞持续发出绿色荧光并呈现G418抗性。
以上构建的通过整合pEBB载体到细胞基因组，得到包含目的基因hBD3的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 200939。
g、pEBB载体阳性表达细胞的PCR鉴定
取扩大培养后的pEBB阳性表达的牛胎儿成纤维细胞，提取细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR鉴定hBD3基因是否整合到细胞基因组中，阴性对照为未转染的正常牛胎儿成纤维细胞，PCR鉴定所用引物对为P1和P2；
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58.9℃退火30s，72℃延伸1min30s，31个PCR循环，72℃再延伸7min；回收PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，其中，泳道1为DNAMarkerIV，泳道2为pEBB转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道3为未转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道2与3相比，明显可以看到一条1200bp左右的条带，而目的基因hBD3为1156bp，而作为阴性对照的泳道3并没有看到，说明目的基因hBD3整合到了宿主细胞牛胎儿成纤维细胞的基因组。
hBD3基因整合到了宿主细胞牛胎儿成纤维细胞的基因组，与之相连的牛β-酪蛋白基因的5′和3′调控区与目的基因hBD3也会一起整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。
3、以上述基因组整合了目的基因hBD3的牛胎儿成纤维细胞(CCTCC C200939)作为核供体细胞，构建转基因克隆胚
h、卵母细胞的成熟培养
卵巢采自西安市牛屠宰场，无菌采取荷斯坦奶牛卵巢，2-3小时内运回实验室，抽取3～8mm直径的卵泡，收集卵母细胞卵丘复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。卵母细胞的成熟培养液为：TCM199(Gibaco)加10％胎牛血清，10ng/ml的表皮生长因子，培养条件为：38.5℃，5％CO₂、95％空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2％透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体排放作为卵母细胞成熟的判定标准，挑选成熟卵母细胞用于核移植试验。
i转基因克隆胚的构建
本方面采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体核转移到去除细胞核的成熟卵母中，其中，整合有外源基因的供体细胞是关键，本发明将供体细胞控制到10代以内，这主要考虑减少体外培养导致的突变在培养过程中的积累。
核移植具体为：显微操作液为含10％FBS，5μg/ml细胞松弛素B的PBS，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10μg/mlHoechst 33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；
采用电融合法进行体细胞核移植，过程如下：在显微镜下挑选直径为15μm左右的供体细胞注射到透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧密接触，注射后的细胞-卵胞质重组体以微电极挤压融合法进行融合；
融合前先将细胞-卵胞质重组体放入融合液(含0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA)中预平衡4～6min；用与显微操作仪连接的微电极的尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予2次电脉冲进行电融合(28V、10μs)。融合后的细胞-卵胞质重组体放入含10％FBS(fetal bovingserum，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)的M199(购自GIBCO公司)中，38.5℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，0.5～1h后观察融合情况。
j、转基因克隆胚的激活及体外培养
融合的重组胚(细胞-卵胞质重组体)在含10％FBS的M199中平衡2h后，用含5μmol/L离子霉素(Ionomycin，购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液(购自SIGMA公司)处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养5h，洗3次后转移到mSOF aa微滴中培养，培养密度为5μL每个重组胚，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，每48h半量换液1次，第7～9天检查囊胚发育情况，如图6所示，克隆胚正常发育至囊胚，图中黑色部分为内细胞团，外围为滋养层细胞。
k、转基因克隆胚PCR鉴定目的基因hBD3
重组胚胎基因组DNA的提取：将重组胚胎样品放入100μl灭菌的离心管中，加入20μl灭菌双蒸水，煮沸5m in后稍离心，置于-20℃保存或直接用于PCR。
以提取的重组克隆胚的基因组为模板，PCR鉴定目的基因hBD3，PCR反应：反应体系和过程同步骤g的hBD3PCR扩增相同，以未转基因的克隆胚为阴性对照。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，以DNA MarkerIV为分子质量标准，获得了大小为1156bp的扩增带，与预期大小相符，如图7所示，其中，泳道1为DNA MarkerIV，泳道2为重组克隆胚，泳道3为未转基因的克隆胚，泳道2与3相比，明显可以看到一条1200bp左右的条带，而目的基因hBD3为1156bp，而作为阴性对照的泳道3并没有看到，说明目的基因hBD3整合到胚胎基因组中。
l、转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定
第7天的囊胚用非手术法移入自然发情后第七天的荷斯坦受体牛子宫内，每个受体牛移植2枚囊胚。受体牛移植后观察其返情情况，对未返情的在移植后30d用B超做怀孕检查。以后每隔一月检查一次，以观察妊娠维持情况。
本发明共移植转hBD3基因克隆胚胎到64头同期发情的受体奶牛体内，一个月后有57头建立妊娠，3个月后有21头维持妊娠并将继续被监测。
核苷酸序列表
<110>西北农林科技大学
<120>一种包含hBD3乳腺特异性表达载体的重组牛胎儿成纤维细胞
<160>3
<210>1
<211>1156
<212>DNA
<213>人β-防御素3(hBD3)
<400>1
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gaagaaagaa ataaaa                                                    1156
<210>2
<211>2050
<212>DNA
<213>牛β-酪蛋白基因的5′调控区
<400>2
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tagagctagc                                                           2050
<210>3
<211>641
<212>DNA
<213>牛β-酪蛋白基因的3′调控区
<400>3
tctaggatcc tctagagatt aatgattcca agtaagccga tgtttggtcc tagaggaatt     60
tttataacct ttaagagaag gcatagcatg gtgtttttgt aataagattt cttttatgaa    120
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gaacatatca aaatatgtat aaaaataatt tctggaattg tgattattat ttctttaaga    480
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