水稻抗病相关基因OSWRKY451和它在水稻抗病性改良中的应用.pdf

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因OsWRKY45-1的DNA片段的分离克隆和功能验证。所述的OsWRKY45-1基因的核苷酸序列和它编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。OsWRKY45-1基因表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的抗性明显增强，证明OsWRKY45-1基因在水稻抗白叶枯病和抗细菌性条斑病反应中是负调控因子，可以通过抑制OsWRKY45-1基因的表达改良水稻的抗病性。

1、  一个调控水稻对白叶枯病和细菌性条斑病产生抗性的OsWRKY45-1基因，它是序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。

2、  OsWRKY45-1基因编码区的核苷酸序列，它是编码序列表SEQ ID NO：1所示蛋白质的核苷酸序列。

3、  权利要求1所述的OsWRKY45-1基因和权利要求2所述的OsWRKY45-1基因编码区的核苷酸序列在增加水稻对白叶枯病和细菌性条斑病抗性中的应用。

水稻抗病相关基因OsWRKY45-1和它在水稻抗病性改良中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因OsWRKY45-1的分离克隆、功能验证和应用。OsWRKY45-1基因是水稻抗病反应中的负调控因子。抑制OsWRKY45-1基因功能后，水稻抗白叶枯病和抗细菌性条斑病(细条病)的能力显著提高。
背景技术
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。
根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996；Baker等，1997；Jia等，2000；Dangl和Jones，2001；Nimchuk等，2001)。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因大约只有30个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000；Schenk等，2000；Zhou等，2002)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。
水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害(过崇俭，1995)。另外，水稻细条病由细条病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)引起，也是水稻的重要病害。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。
分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过抑制作为抗病反应负调控因子的抗病相关基因的功能进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并通过抑制目标基因的功能鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。这个基因被命名为OsWRKY45-1。
本发明涉及分离一种包含OsWRKY45-1基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予水稻对由白叶枯病菌和细条病菌所引起的病害产生抗病反应。其中，所述片段如序列表SEQ IDNO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ IDNO：1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明它是一个含有WRKY结构域的转录因子。抑制序列表SEQ ID NO：1所示序列的表达可以增强水稻对白叶枯病和细条病的抗性。
可以采用已经克隆的OsWRKY45-1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY45-1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。可以采用遗传转化技术抑制OsWRKY45-1基因的功能，产生同时抗白叶枯病和抗细条病的转基因植株。采用这种技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。
在本发明的实施例部分，我们阐述了OsWRKY45-1基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1.OsWRKY45-1基因的序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。
图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsWRKY45-1以及验证OsWRKY45-1基因功能的流程图。
图2.PCR扩增产物和OsWRKY45-1基因的结构。“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码。数字示每一种结构的核苷酸数目。
图3.OsWRKY45-1基因和它的等位基因OsWRKY45-2编码的蛋白质的氨基酸序列对比。数字表示对应的最后一个氨基酸的位置。黑色方框表示两个蛋白质存在差异的氨基酸残基位点。
图4.用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术检测白叶枯病菌PXO61侵染后感病水稻品种牡丹江8和抗病水稻株系Rb49中OsWRKY45-1基因的表达模式。对照是接种PXO61前的样品，没经过任何处理；其它是接种PXO61后不同时间点的样品。每个样品中OsWRKY45-1基因的表达量是相对于接种前牡丹江8样品中OsWRKY45-1基因的表达量。
图5.遗传转化载体pU1301的结构。
图6.T₀代遗传转化植株(D113UM)中的OsWRKY45-1基因表达量和对白叶枯病菌株PXO61的反应相关。对照为水稻品种牡丹江8(遗传转化的受体)。遗传转化植株中OsWRKY45-1基因的表达量是相对于对照牡丹江8中OsWRKY45-1基因的表达量。星号(*)表示与对照相比，遗传转化基因植株的病斑面积显著(P＜0.05)增大。
图7(包含图7A和图7B).超量表达OsWRKY45-1基因的两个T₁代家系D113UM10(见图7A)和D113UM11(见图7B)中的OsWRKY45-1基因的表达量与表型共分离。对照为水稻品种牡丹江8(遗传转化的受体)。遗传转化植株中OsWRKY45-1基因的表达量是相对于对照牡丹江8中OsWRKY45-1基因的表达量。星号(*)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P＜0.05)增大。
图8(包含图8A和图8B).OsWRKY45-基因T-DNA插入突变体2C-50229中T-DNA插入位点(见图8A)和突变体验证分析(见图8B)。数字表示T-DNA插入位点和PCR引物的相对位置。“ATG”是翻译起始密码。箭头w45F2、w45R1、RB1分别表示用来验证突变体是否正确的PCR引物；其中w45F2和w45R1引物是根据OsWRKY45-1基因启动子序列设计的，它们分别位于T-DNA插入位点两侧；RB1是根据T-DNA内部序列设计的引物。“717”和“301”分别表示引物w45F2和w45R1与T-DNA插入位点间的核苷酸数目，“100”表示引物w45R1和翻译起始位点ATG间的核苷酸数目。
图9.三个T₂代T-DNA插入突变体(2C-50229)家系中的OsWRKY45-1基因表达减少或消失与植株对白叶枯病菌株PXO86的抗性增强相关。对照为粳稻品种Dongjin(遗传转化的受体)。突变体植株中OsWRKY45-1基因的表达量是相对于对照Dongjin中OsWRKY45-1基因的表达量。星号(*)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P＜0.01)减小。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆OsWRKY45-1基因以及验证OsWRKY45-1基因功能的流程。根据以上的描述和下面的实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：OsWRKY45-1基因的序列和结构分析
1.OsWRKY45位点不同等位基因的确定
已有研究者报道OsWRKY45在苯并噻二唑(benzothiadiazole)(又称苯并[1，2，3]噻二唑-7-羧酸甲酯)诱导的水稻抗稻瘟病反应中扮演一个非常重要的角色(Shimono等，2007)。本发明的申请人根据来源于粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品种日本晴(一个公开报道应用的水稻品种)中的OsWRKY45基因(Shimono等，2007)序列设计了PCR引物w45F4(5′-ATGGTACCGCCTACGCATCATCTCCTTC-3′)(下划线代表KpnI限制性内切酶消化位点)和w45R4(5′-CAGGATCCTTATGGCACAACATTTAGCA-3′)，分别从粳稻品种牡丹江8(一个公开报道应用的水稻品种)和Dongjin(一个公开报道应用的水稻品种)以及籼稻(Oryza sativassp.indica)品种明恢63(一个公开报道应用的水稻品种)、珍汕97(一个公开报道应用的水稻品种)和93-11(一个公开报道应用的水稻品种)扩增了该基因。利用PCR引物w45F4、w45R4、w45F6(5′-ATCACAAAGCATAGCATCATCT-3′)、w45R6(5′-CTCAGCACCTCCTCCTGGTCGG-3′)和美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)分别从PCR扩增片段两端测序。序列比较发现牡丹江8和Dongjin中的OsWRKY45等位基因的序列与日本晴中的OsWRKY45基因序列完全一致；而明恢63、珍汕97和93-11中的OsWRKY45等位基因序列一致，但是与日本晴、牡丹江8和Dongjin中的OsWRKY45基因存在差异。为了区分这一对核苷酸序列不同的等位基因，我们将日本晴、牡丹江8和Dongjin中的OsWRKY45基因命名为OsWRKY45-1，明恢63、珍汕97和93-11中的等位基因命名为OsWRKY45-2(发明专利申请号：200810197309.9，公开号：CN101386856，水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用；发明人：王石平、陶增)。
2.OsWRKY45-1基因结构分析
本发明申请人根据水稻全基因组序列数据库[TIGR(The Institute for Genomic Research，http://rice.tigr.org)]中提供的OsWRKY45-1基因的结构设计PCR引物w45F3(5′-ATGGATCCAGGAAGAGAGAGTGCGAGAG-3′)(下划线代表BamHI限制性内切酶消化位点)和w45R3(5′-GCAAGCTTGACGACACATCAACAAGGAA-3′)(下划线代表HindIII限制性内切酶消化位点)，采用反转录-PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)方法，从粳稻牡丹江8中扩增OsWRKY45-1的全长cDNA。具体操作方法是从牡丹江8叶组织中抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1-5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(Zhou等，2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录，获得总cDNA。以总cDNA为模板，用PCR引物w45F3和w45R3扩增获得OsWRKY45-1基因的cDNA。利用w45F3和w45R3引物和上述测序方法对OsWRKY45-1基因的cDNA进行测序。比较分析OsWRKY45-1基因的基因组序列和cDNA序列，确定来源于粳稻牡丹江8的OsWRKY45-1基因结构与水稻全基因组序列数据库中的OsWRKY45-1基因的结构一致。该基因由2147个核苷酸组成，包含三个外显子和两个内含子(图2)。第一个外显子由424个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1-424bp处)，其中包含由115个核苷酸组成的5’端非翻译区(untranslated region，UTR)(位于序列表SEQ ID NO：1的1-115bp处)和309个核苷酸组成的编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的116-424bp处)；第一个内含子由593个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的425-1017bp处)；第二个外显子由105个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1018-1122bp处)；第二个内含子由101个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1123-1223bp处)；第三个外显子由924个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1224-2147bp处)，其中包含由564个核苷酸组成的编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的1224-1787bp处)和由360个核苷酸组成的3’端UTR(位于序列表SEQ ID NO：1的1788-2147bp处)。
3.OsWRKY45-1基因编码产物分析
OsWRKY45-1基因的编码区由978个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的116-424、1018-1122和1224-1787bp处)，编码一个长度为326个氨基酸的蛋白质。该蛋白质属于典型的WRKY类转录因子，它具有一个保守的WRKY结构域，一个C2HC锌指结构(Eulgem等，2000)。按照Eulgem等(2000)的WRKY家族的分类，OsWRKY45-1蛋白属于第三个亚类。OsWRKY45-1基因编码的蛋白质与它的等位基因OsWRKY45-2基因(发明专利申请号：200810197309.9，公开号：CN101386856，水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用；发明人：王石平、陶增)编码的蛋白质相比，有六个氨基酸位点的替换和四个连续的甘氨酸的插入(图3)。
实施例2：病原侵染后OsWRKY45-1基因的表达谱分析
为了验证OsWRKY45-1基因是否参于水稻抗细菌性病害反应的调控，本发明申请人首先采用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)方法(Qiu等，2007)分析了OsWRKY45-1基因在不同水稻株系中接种白叶枯病菌株PXO61(Sun等，2004)后的表达模式。白叶枯病菌接种采用剪叶法对成株期的水稻进行接种(Sun等，2004)。白叶枯病菌株PXO61由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1～5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒Green PCR Master Mix(大连Tokara公司)、并根据试剂盒使用说明书，在ABI 7500 Real-Time PCR system(美国AppliedBiosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的OsWRKY45-1基因特异PCR引物是w45F(5′-TTCCTTGTTGATGTGTCGTCTCA-3′)和w45R(5′-CCCCCAGCTCATAATCAAGAAC-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。
实验材料Rb49是携带由基因自身启动子调控的抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26的转基因株系，该株系具有感病粳稻品种牡丹江8的遗传背景(Cao等，2007)。实验结果显示无论是感病品种牡丹江8还是抗病株系Rb49，接种白叶枯病菌株PXO61后都诱导OsWRKY45-1基因表达(图4)。这些结果提示OsWRKY45-1基因可能参与调控水稻抗白叶枯病反应。
实施例3：超量表达OsWRKY45-1基因验证其在水稻抗病反应中的功能
因为超量表达OsWRKY45-1的等位基因OsWRKY45-2增强水稻的抗病性(发明专利申请号：200810197309.9，公开号：CN101386856，水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用；发明人：王石平、陶增)，本发明申请人在感病水稻中超量表达OsWRKY45-1基因，并检测分析遗传转化植株的抗病性。具体操作分析如下：
1.分离OsWRKY45-1基因
申请人根据OsWRKY45-1基因在粳稻日本晴基因组中的位置(水稻全基因组序列数据库，http://rice.tigr.org)，以OsWRKY45-1基因两侧的基因组序列为模板，设计了两条PCR引物w45F4(5′ATGGTACCGCCTACGCATCATCTCCTTC-3′)(下划线代表KpnI限制性内切酶消化位点)和w45R4(5′-CAGGATCCTTATGGCACAACATTTAGCA-3′)(下划线代表BamHI限制性内切酶消化位点)，从日本晴中扩增包含OsWRKY45-1基因、长2293核苷酸的DNA片段(图2)。采用上述测序方法对PCR扩增产物进行测序，确认这个PCR扩增片段没有核苷酸错配。
2.超量表达遗传转化载体的构建
本发明所用载体是pU1301(图5)。pU1301是常用的水稻遗传转化载体(Cao等，2007；Qiu等，2007；Ding等，2008)。它是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。
将上述包含OsWRKY45-1基因、长2293核苷酸的DNA片段(图2)用限制性内切酶KpnI和BamHI消化，灭活酶后获得长2277核苷酸的DNA片段。同时，用限制性内切酶KpnI和BamHI消化携带玉米泛素启动子的遗传转化载体pU1301；酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsWRKY45-2基因的酶切片段和纯化好的载体pU1301做连接反应。通过测序验证阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为D113U。
3.遗传转化和T₀代遗传转化植株分析
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D113U导入水稻感病品种牡丹江8。获得的遗传转化植株被命名为D113UM(其中前面部分为遗传转化载体名称，M代表水稻品种牡丹江8)。本发明共获得独立转化植株10株。对全部转化植株在孕穗期接种白叶枯病菌株PXO61。接种14天后调查病斑长度和病叶长度，计算病斑面积(病斑长度/病叶长度×100％)。与遗传转化受体牡丹江8(对照)相比，6株阳性遗传转化植株的抗性没有显著变化(P＞0.05)，4株转化植株感病性显著增强(P＜0.05)(表1)。
表1.T₀代遗传转化植株(D113UM)对白叶枯病菌株PXO61的反应


⁽¹⁾每株遗传转化基因植株接种3-5片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。
本发明采用上述qRT-PCR分析方法检测遗传转化植株中OsWRKY45-1基因的表达量。结果显示所有阳性转化植株体内的OsWRKY45-1的表达量都大幅升高(图6)。
4.遗传转化植株的感病性增强和基因表达量共分离分析
为进一步验证遗传转化植株的感病性增强是否与OsWRKY45-1基因的表达量升高相关，本发明申请人对在T₀代感病性增强的2个遗传转化植株(D113UM10和D113UM11)的T₁代家系进行基因表达量和感病性共分离分析。在孕穗期接种白叶枯病菌PXO61，接种14天后调查，同时取样按照上述方法抽提RNA，采用上述qRT-PCR分析方法检测植株中OsWRKY45-1基因的表达量。结果显示遗传转化植株中的OsWRKY45-1基因表达量增加与植株感病性增强共分离(图7)；与对照牡丹江8相比所有感病性增强的植株中的OsWRKY45-1基因的表达量都升高。证明遗传转化植株的感病性增强是因为超量表达OsWRKY45-1基因所至。这些研究结果也说明OsWRKY45-1基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应中可能发挥负调控因子的作用。超量表达OsWRKY45-1基因，可增强水稻对白叶枯病的感病性或减弱水稻对白叶枯病的抗性。
实施例4：抑制OsWRKY45-1基因表达验证其在水稻抗病反应中的功能
为了进一步验证上述OsWRKY45-1基因的编码产物在水稻抗病反应中可能发挥负调控因子作用的推测，本发明申请人采用以下途径验证OsWRKY45-1基因的功能
1.T-DNA插入突变体的获得及验证
利用OsWRKY45-1基因的启动子和编码区序列检索水稻突变体数据库RiceGE(http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)，得知在韩国的水稻突变体库中存在一个T-DNA插入的突变体，其T-DNA插入位点位于OsWRKY45-1基因翻译起始位点ATG前401bp处(图8A)，可能会导致OsWRKY45-1基因的失活；该突变体植株编号为2C-50229，T-DNA载体为pGA2717，遗传转化受体为粳稻品种Dongjin(Jeong等，2006)。通过商业途径，申请人从韩国水稻突变体库中购得该突变体T₁代种子。种子经发芽后，获得8棵植株，被分别命名为2C-50229-1至2C-50229-8。
为了验证所获得突变体的正确性，申请人根据OsWRKY45-1基因的序列设计了一对位于T-DNA插入位点两侧的PCR引物(图8A)：w45F2(5′-ATGGATCCAAGCCCTTAGGAGGACATCA-3′)和w45R1(5′-ATACTGCAGGAGCTCAAAGCAGCAGGAGG-3′)。另外，根据T-DNA序列设计了PCR引物RB1(5′-ACCTGTAAGATTTAGCACCC-3′)(Jeong等，2002)。利用这3条PCR引物分析所获得突变体的T-DNA是否插入在OsWRKY45-1基因的启动子区。这一分析的基本原理是：在2C-50229的纯合突变体(一对同源染色体中都有T-DNA的插入)植株中，由于插入的T-DNA片段大约14kb(Wu等，2003)，利用引物w45F2和w45R1、采用常规PCR方法无法扩增如此大的DNA片段，而用引物RB1和w45R1可以扩增出一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段；在2C-50229的杂合突变体(一对同源染色体中只有一条染色体中有T-DNA插入)植株中，用引物w45F2和w45R1可以扩增一段大小已知的水稻基因组的DNA片段，用引物RB1和w45R1也可以扩增一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段；在2C-50229的阴性(家系中分离出的没有T-DNA插入的)植株中，用引物w45F2和w45R1可以扩增一段大小已知的水稻基因组DNA片段，但是用引物RB1和w45R1不能够扩增DNA片段。申请人对8株2C-50229家系的T₁植株进行了上述PCR分析。结果显示其中1株(2C-50229-5)是纯合突变体，3株(2C-50229-3、2C-50229-7和2C-50229-8)是杂合突变体，其余4株是阴性植株(图8B)。这些结果说明申请人获得的水稻材料2C-50229是OsWRKY45-1基因突变体。
2.突变体植株对白叶枯病的抗性分析
将上述OsWRKY45-1基因的T-DNA插入纯合和杂合突变体植株2C-50229-5、2C-50229-7，2C-50229-8的后代(T₂家系植株)在孕穗期接种水稻白叶枯病菌株PXO86(Sun等，2004)。接种方法如前所述。白叶枯病菌株PXO86由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。接种21天后调查病斑长度和病叶长度，计算病斑面积(病斑长度/病叶长度×100％)，同时按前述方法取样抽提RNA，检测植株中OsWRKY45-1基因的表达量。结果表明，纯合突变体家系中OsWRKY45-1基因基本不表达，同时与对照(遗传转化受体水稻品种Dongjin)相比纯合突变体植株的病斑面积显著变小；而OsWRKY45-1基因在杂合突变体家系的不同植株中表达量不同；OsWRKY45-1基因在有些植株中基本不表达或其表达量比对照(遗传转化受体水稻品种Dongjin)明显降低，而在另外部分植株中表达量与对照相比没有明显差别(图9)。检测这些T₂代植株对白叶枯病菌接种后的反应，与对照相比，部分植株的病斑面积减小了大约22％至61％(表2)，而病斑面积减小的植株的OsWRKY45-1基因表达量都明显降低(图9)。即突变体植株抗病表型与目标基因的表达量降低共分离，进一步证明OsWRKY45-1基因的编码产物是水稻抗白叶枯病的负调控因子。抑制OsWRKY45-1基因的表达可增强水稻的抗病性。
表2.T₂代2C-50229家系对白叶枯病菌株PXO86的反应

⁽¹⁾每株遗传转化基因植株接种3-5片叶，21天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。
3.突变体植株对细条病的抗性分析
本发明申请人对纯合的T-DNA插入突变体的T₂家系(2C-5-0229-5)植株和具有同样遗传背景的对照水稻品种Dongjin在4-5叶期接种细条病菌JSB2-24、HNB8-47、RH3(Chen等，2006)。申请人采用针刺法接种细条病菌(Chen等，2006)。结果显示与对照Dongjin相比，具有同样遗传背景的2C-5-0229-5植株对细条病菌JSB2-24、HNB8-47、RH3的抗性显著增强(P＜0.01)，其病斑长度减短了大约50％至65％(表3)。
表3.T₂代2C-50229家系对细条病菌的反应


⁽¹⁾每个数据是3棵植株的共计8个病斑长度的平均值。接种15天后调查病斑和病叶长度。
这些结果说明OsWRKY45-1基因的编码蛋白既是水稻抗白叶枯病反应的负调控因子，也是抗细条病反应的负调控因子。抑制OsWRKY45-1基因表达可培育具有广谱抗性的水稻。
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<212>DNA
<213>Oryza sativa
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2147)
<220>
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<222>(116)..(424)
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<222>(425)..(1017)
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<221>CDS
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<220>
<221>Intron
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<220>
<221>CDS
<222>(1224)..(1787)
<220>
<221>3’UTR
<222>(1788)..(2147)
<400>1
gggtgctttg agctccatca ccagctgagc tgcgaggaag agagagtgcg agagtgcgcg     60
gcagcggcag tgtagtgtca gtcactgggt gtgcgcttgc ttgcttggat tgagg atg     118
                                                             Met
                                                             1
acg tca tcg atg tcg ccg gcg ccg gcg ccg gcg tac gcg cag gtg atg      166
Thr Ser Ser Met Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Gln Val Met
            5                   10                  15
gag gac atg gag aag ggg aag gag ctg gcg gcg cag ctg cag ggg ctc      214
Glu Asp Met Glu Lys Gly Lys Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gln Gly Leu
        20                  25                  30
ctc cgc gac tcg ccg gag gcc ggc cgc ttc gtc gac cag att ctc cac      262
Leu Arg Asp Ser Pro Glu Ala Gly Arg Phe Val Asp Gln Ile Leu His
    35                  40                  45
acc ttc tcc cgg gcg atg cgg gcg ctc gac aag gcg gcg gtc tcc gcc      310
Thr Phe Ser Arg Ala Met Arg Ala Leu Asp Lys Ala Ala Val Ser Ala
50                  55                  60                  65
gcc gga gga gaa ggg tcg gag gtg cag agc gag gtc acc tgc ggg ggc      358
Ala Gly Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Val Thr Cys Gly Gly
                70                  75                  80
ggg gcc agc gcc ggc ggg aag agg aaa gcc ccc gcc gcc gac cgg aag      406
Gly Ala Ser Ala Gly Gly Lys Arg Lys Ala Pro Ala Ala Asp Arg Lys
            85                  90                  95
gcc aac tgc cgc agg agg tgagaacgaa ggccagagca tagctcatca             454
Ala Asn Cys Arg Arg Arg
        100
caaagcatag catcatctgt gtgtaattag ctgcgttctt tcagggaaga taggggggat    514
tgtccctcgt tttccgcgcg cacgcttttc aaactactat acggtgcgtt tttcgtataa    574
attttctata ggaaagttgc tttaaaaaat catattaatc catttttgaa gtttcaaaat    634
cataaaatca tgcgctaatg gttcacctcg ttttgcgtat attcccaatc ttctctattt    694
ccttctcctc aaacacagcc tgggagtgtt tgagaagggg attgaggaga ttgggaagat    754
acgtaaaacg aggtgagcca ttagctcatg attaattgag tattaactat tttaaatttt    814
aaaaatagat taatatgatt ttttaaagca actttcctat agaaattttt tgcaaaaaac   874
gtaccgttta atagtttgaa aagcgtgcgc gcggaaaacg agagccaatc tcccctatca   934
cccctaaacg aacgatacct tccctatcac ccctaaacga acgatacctt aatgtactaa   994
gatttgtgtg tacgtattgc agg acg cag caa tcg tcc ggg aat tcg gtg gtc  1047
                          Thr Gln Gln Ser Ser Gly Asn Ser Val Val
                              105                 110
gtc aag aac ctc gac gac ggc cag gca tgg cgc aag tac ggg cag aag    1095
Val Lys Asn Leu Asp Asp Gly Gln Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys
    115                 120                 125
gag atc caa aac tcc aag cac cca aag tgagtagact tgtcccgaca          1142
Glu Ile Gln Asn Ser Lys His Pro Lys
130                 135
aaaaacaatg tgttcgagac tgtacagttg gatgcgttgc gcgctgacga ggagttgttt  1202
ggggtatgct acgtgtacag g gcc tac ttc cgg tgc acg cac aag tac gac    1253
                        Ala Tyr Phe Arg Cys Thr His Lys Tyr Asp
                            140                 145
cag ctg tgc acg gcg cag cgg cag gtg cag cgc tgc gac gac gac ccg    1301
Gln Leu Cys Thr Ala Gln Arg Gln Val Gln Arg Cys Asp Asp Asp Pro
    150                 155                 160
gcg agc tac agg gtc acc tac atc ggc gag cac acc tgc cgg gac ccg    1349
Ala Ser Tyr Arg Val Thr Tyr Ile Gly Glu His Thr Cys Arg Asp Pro
165                 170                 175                 180
gcc acc gcc ccc atc atc gcg gcg cac gtc atc cac cag gtc gcc gcc    1397
Ala Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala His Val Ile His Gln Val Ala Ala
                185                 190                 195
ggc gac aac gac gac ggc tgc ggc ggc ctc caa gcg ggg tcc cgc ctc    1445
Gly Asp Asn Asp Asp Gly Cys Gly Gly Leu Gln Ala Gly Ser Arg Leu
            200                 205                 210
atc agc ttc gtc gcc gcg ccg gcg gcg cca gta gac gct gcc gcg gcg    1493
Ile Ser Phe Val Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val Asp Ala Ala Ala Ala
        215                 220                 225
ccg acg acc agc acg atc acc acg gtc acc gcg ccg ggc ccg ctg ctg    1541
Pro Thr Thr Ser Thr Ile Thr Thr Val Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu
    230                 235                 240
cag ccg ctc aag gtg gag ggc ggc gtc ggc tcg tcc gac cag gag gag    1589
Gln Pro Leu Lys Val Glu Gly Gly Val Gly Ser Ser Asp Gln Glu Glu
245                 250                 255                 260
gtg ctg agc agc ctc acg ccc ggc agc tcc gcg gcg cgc ggc ggc ggc      1637
Val Leu Ser Ser Leu Thr Pro Gly Ser Ser Ala Ala Arg Gly Gly Gly
                265                 270                 275
ggc ggc ggc gga gtc gcg ggt ccc ttc ggg ccg gac cag ggc gat gtc      1685
Gly Gly Gly Gly Val Ala Gly Pro Phe Gly Pro Asp Gln Gly Asp Val
            280                 285                 290
acg tcc tcc ctg cac tgg agc tac gac gcc gtc gcc ggc atg gag ttc      1733
Thr Ser Ser Leu His Trp Ser Tyr Asp Ala Val Ala Gly Met Glu Phe
        295                 300                 305
ttc aag aac gac gag gtt gtc ttc gat ctg gac gac att atg ggt ttg      1781
Phe Lys Asn Asp Glu Val Val Phe Asp Leu Asp Asp Ile Met Gly Leu
    310                 315                 320
agc ttt tgatcaccga agaatcatgg atggacacgg gccgggtaaa acgatcgaaa       1837
Ser Phe
325
gaagatggat tccacgcgtg tgtacagaaa taattagcgg cagcgcggat cttaatttgg    1897
aacttgcaaa gatactccta attagcctgg ctagattagt ttgtaaattc cttgttgatg    1957
tgtcgtctca gctttaagct gcagacatgc tagcaagtaa caacacgatt agtacgtagt    2017
aatgtggttc ttgattatga gctgggggtc ttaacctttt ttgtgtgaca agcaagagaa    2077
gaggatttgg gtacaatgta atcctgttct tccgctttcg aaaaaaaaaa acatatagct    2137
tcacgtgcct                                                           2147
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Met Thr Ser Ser Met Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Gln Val
1               5                   10                  15
Met Glu Asp Met Glu Lys Gly Lys Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gln Gly
            20                  25                  30
Leu Leu Arg Asp Ser Pro Glu Ala Gly Arg Phe Val Asp Gln Ile Leu
        35                  40                  45
His Thr Phe Ser Arg Ala Met Arg Ala Leu Asp Lys Ala Ala Val Ser
    50                  55                  60
Ala Ala Gly Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Val Thr Cys Gly
65                  70                  75                  80
Gly Gly Ala Ser Ala Gly Gly Lys Arg Lys Ala Pro Ala Ala Asp Arg
                85                  90                  95
Lys Ala Asn Cys Arg Arg Arg
            100
<210>3
<211>35
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>3
Thr Gln Gln Ser Ser Gly Asn Ser Val Val Val Lys Asn Leu Asp Asp
1               5                   10                  15
Gly Gln Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Glu Ile Gln Asn Ser Lys
            20                  25                  30
His Pro Lys
        35
<210>4
<211>188
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>4
Ala Tyr Phe Arg Cys Thr His Lys Tyr Asp Gln Leu Cys Thr Ala Gln
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Gln Arg Cys Asp Asp Asp Pro Ala Ser Tyr Arg Val Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile Gly Glu His Thr Cys Arg Asp Pro Ala Thr Ala Pro Ile Ile
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Ala Ala His Val Ile His Gln Val Ala Ala Gly Asp Asn Asp Asp Gly
    50                  55                  60
Cys Gly Gly Leu Gln Ala Gly Ser Arg Leu Ile Ser Phe Val Ala Ala
65                  70                  75                  80
Pro Ala Ala Pro Val Asp Ala Ala Ala Ala Pro Thr Thr Ser Thr Ile
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Thr Thr Val Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Gln Pro Leu Lys Val Glu
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Gly Gly Val Gly Ser Ser Asp Gln Glu Glu Val Leu Ser Ser Leu Thr
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Pro Gly Ser Ser Ala Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala
    130                 135                 140
Gly Pro Phe Gly Pro Asp Gln Gly Asp Val Thr Ser Ser Leu His Trp
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Ser Tyr Asp Ala Val Ala Gly Met Glu Phe Phe Lys Asn Asp Glu Val
                165                 170                 175
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