本发明属基因工程领域，是一种控制植物病毒病的基因工程方法。已有的技术： 1.D.C.Baulcombe el al，Nature 321：446-449（1986）所述，在宿主细胞中表达产生致病病毒的卫星RNA来抑制该病毒在植物中的增殖和扩散。此法能延缓病毒病的发生，但仅适合于极少数带有能抑制该病毒增殖的卫星RNA的病毒引起的植物病害的控制，而且还可能造成难以预测的环境污染结果。一种卫星RNA在某一种宿主有抑制致病病毒的危害程度，而在另一植物就可能增强该病毒对那种宿主的危害程度。且RNA容易变异，原来能控制该病毒对某宿主危害有益的卫星RNA有可能在变异后加重该病毒对原宿主植物的危害程度。
2.A.P.Powell et al，Science 232：738-743（1986）所述，在宿主植物中表达病毒外壳蛋白基因来抑制该病毒在宿主中的增殖。这方法能延缓该病毒病的发生，但只能控制一年生植物中由非种传性病毒引起地病毒病的发生和发展。为达到和增强控制病毒病效果，宿主植物需累积大量该病毒的外壳蛋白，这对植物不利，如用于直接食用的植物，人们心理上也难接受。
3.R.N Beachy et al，In：D.Evered d S.Harnett（eds）Plant resistance to viruses，151-158，John Wileyd Sons，（1987）所述，在宿主植物中表达病毒基因组的一段反意RNA片段，以此控制该病毒在宿主中的增殖。但这种方法对病毒病控制效果很差。
本发明的目的在于克服已有技术不足之处。通过病毒诱导方法，使原来已导入植物未表达成蛋白的毒蛋白基因表达成毒蛋白，引起病毒感染细胞“自杀”，可以达到控制病毒在植株中增殖和扩散的目的。
本发明的内容：本发明利用抑制宿主植物蛋白质合成的毒蛋白基因读码框取代病毒亚基因组cDNA的一种基因读码框，在此读码框原5′端保留可被该病毒复制酶识别的碱基序列，或换上可被其它病毒复制酶识别的碱基序列，或串联接上几种病毒各自复制酶识别的碱基序列，或接上几种病毒的复制酶共同识别的同源碱基序列，插在可在植物中表达的启动子和3′末端间，导入植物，表达成负链毒蛋白RNA。在相关病毒感染的细胞中，负链RNA转变成正链毒蛋白RNA，翻译产生控制相应的病毒在宿主植物中的增殖和扩散的毒蛋白，如在毒蛋白基因读码框5′端接的是正链RNA病毒包括不带亚基因组正链RNA病毒5′端非转译区cDNA片段，按此方法组成嵌合基因，导入植物，这种植物也能抗不带亚基因组的正链RNA病毒引起的病毒病。
本发明的根本特征是向植物导入平时不能表达成蛋白质但在被病毒感染细胞中才能表达成毒蛋白的嵌合基因。一些DNA病毒中只有被该病毒另一些基因产物诱导才能表达的基因的读码框和植物中只在某病毒入侵后才在感染细胞中诱导表达的基因的读码框用毒蛋白读码框取代，组成嵌合基因，导入植物，由于这些嵌合基因只在这些病毒感染的宿主细胞中转录和转译产生毒蛋白，这样的植物也能获得对这些病毒引起的病毒病的抗性。
本发明的具体技术路线是：
1.把一种带亚基因组病毒cDNA的外壳蛋白基因读码框换上一种能强烈抑制宿主植物蛋白质合成的毒蛋白基因读码框。
2.保留这段cDNA原外壳蛋白基因读码框5′端可被该病毒复制酶识别从负链基因组RNA产生正链外壳蛋白RNA的片段和病毒3′端确保原病毒正链RNA稳定性的片段，以能在植物中转录成负链RNA的形式，插入植物启动子和3′末端间，组成嵌合基因。
3.将嵌合基因插入带植物筛选标记基因如嵌合的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTⅡ）基因的质粒载体T-DNA区内，通过接合转移，把此质粒导入无T-DNA区而带Vir区的Ti质粒的农杆菌中。
4.通过植物叶碟片或原生质体和农杆菌共培养的办法，把带此嵌合基因和筛选标记基因的T-DNA区导入植物染色质基因组，产生抗某抗菌素的带此毒蛋白基因的工程植株。
5.从工程植株中筛选出最抗该病毒病的植株，通过有性繁殖、继代培育，得到遗传上稳定的抗该病毒的种子后代。从完全抗病毒的工程植株还可得到用于生产的无性繁殖材料。
6.在此毒蛋白基因读码框前，该病毒复制酶识别片段的cDNA两侧各有一特定的限制性内切酶切口，可用该病毒其它为复制酶识别的片段的cDNA，其它病毒复制酶特异识别片段的cDNA，甚至不带亚基因组正链RNA病毒RNA的5′端非转译区片段的cDNA取代;也可用串联起来的几种病毒的复制酶各自识别片段的cDNA或共同识别的同源碱基片段的cDNA取代;组成导入植物能抗一种或多种病毒病的嵌合基因。
7.除了用这里使用的二元型Ti载体与农杆菌共培养法把嵌合毒蛋白基因导入植物的方法之外，还可用一元型Ti载体经农杆菌共培养或DNA直接转移法，把嵌合的毒蛋白基因导入植物，得到工程植株。
8.用于抑制植物蛋白质合成的毒蛋白基因有白喉毒素片段A基因、绿脓假单胞杆菌外毒素A基因等细菌的修饰延长因子2的酶蛋白基因;资源植物商陆抗病毒蛋白等和食用植物小麦、玉米、苦瓜等的核糖体失活蛋白基因。用于转负链毒蛋白RNA为正链毒蛋白RNA的片段有各种带亚基因组正链RNA病毒（如烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯病毒X、马铃薯病毒Y、苜蓿花叶病毒、雀麦花叶病毒、大麦条斑花叶病毒等）复制酶从各自病毒的负链RNA转录为正链亚基因组RNA所需碱基片段的cDNA和各正链RNA病毒包括无亚基因组正链RNA病毒5′端非转译区片段的cDNA。
本发明的作用机制是：
1.在病毒未感染的工程植株中都有一定数量的毒蛋白负链RNA，这些RNA不能变成正链RNA和产生相应的毒蛋白。当植物被病毒感染后，病毒利用宿主蛋白质合成系统来合成复制酶;这些复制酶识别和转录负链毒蛋白RNA，产生mRNA;这些mRNA又利用植物蛋白质合成系统翻译生成相应的毒蛋白;这些毒蛋白又反馈地抑制被感染宿主细胞的蛋白质合成。这里的毒蛋白具酶的性质，有很强的抑制蛋白质合成的能力。这样，不论宿主细胞原来蛋白质合成的活力如何，利用这种反馈机制，在病毒感染的宿主细胞中，蛋白质合成都会迅速地被严重抑制。
2.带亚基因组的正链RNA病毒从感染细胞转移到相邻细胞或较远的组织，需要合成一定数量的病毒的和转移相关的蛋白。这些蛋白往往是从亚基因组RNA翻译而来。病毒进入宿主细胞生成复制酶后，先要转录生成负链的基因组RNA，再由它们转变为各正链亚基因组RNA。在工程植株中预存有一定数量带有能被病毒复制酶识别和转录所需片段的毒蛋白负链RNA的条件下，病毒感染宿主细胞后将优先地生成毒蛋白mRNA，翻译成毒蛋白。在还未能积累病毒转移所需各转移蛋白之前，该蛋白迅速反馈地抑制感染细胞中蛋白质的合成。这样，病毒既不能增殖也不能扩散到邻近细胞中去。如工程植物中预存一定数量带有病毒复制酶能识别的该病毒负链基因组RNA的3′端（即原来正链基因组RNA的5′端）的毒蛋白负链RNA，在该病毒入侵后，病毒感染细胞中也会以类似机制优先生成毒白和把病毒限制于原初感染的细胞中。
3.在病毒感染的宿主细胞生成少数毒蛋白从而使细胞蛋白质合成基本被抑制和病毒复制被抑制后，该细胞还有RNA和蛋白质降解活性。如它的RNA酶能把病毒RNA完全降解，则毒蛋白和病毒蛋白也将随之被清除，该细胞有可能恢复到未被病毒感染前的状态。
本发明的优点和效果：
由于本法通过病毒自身诱导，反馈地抑制它自己繁殖和扩散所依赖的宿主蛋白质合成而达到控制病毒病的作用，所以，与过去的方法相比，1.本法可完全控制病毒病的发展。例如，可以用本法得到的一种工程植株能抵制烟草花叶病毒在工程植株中的扩散，2.本法适于控制一年生和多年生、有性繁殖和无性繁殖等多种植物抗病毒。3.农业上最主要的病毒病害大部份由带亚基因组的正链RNA病毒引起，本发明适于控制这些病毒引起的植物病害，也适于控制不带亚基因组的正链RNA病毒引起的病毒病害，经延伸使用本法，还可控制绝大多数病毒引起的致植物病毒病害的目的。4.使用本发明得到的工程植株，平时不含毒蛋白，病毒感染后只在被感染细胞中暂时累积几个毒蛋白分子，它们也不会侵入人畜细胞。这样的工程植株对植物本身、对人、畜和对环境都不会带来不良影响。
本发明的实施例：
本发明以烟草抗烟草花叶病毒（TMV）引起的花叶病为例。使用的毒蛋白是白喉毒素片段A，它不能进入人畜细胞，只要几个分子就足以迅速地严重抑制一个细胞的蛋白质合成。这里使用的可被TMV复制酶识别的片段是外壳蛋白基因读码框前的片段。在进行重组时，为确保嵌合基因有高转录能力和得到正链RNA后有高转译能力，选用了花椰菜花叶病毒强启动子（CaMV355启动子）和它的3′末端，保留了原TMV外壳蛋白mRNA5′端完整的非转译区碱基。为了保持负链RNA和由它转录产生的正链RNA有相当好的稳定性，我们用原外壳蛋白读码框前0.6Kb长的碱基片段放在3′端，而5′端保留了原TMV3′端生成正链RNA高级结构所要的碱基序列。这里嵌合基因是通过二元型Ti载体经农杆菌导入植株的。整个操作流程如下面所示：
1.嵌合基因重组流程：
（1）带TMV3′末端包括外壳蛋白基因cDNA的pOM5Ⅱ2经HindⅢ酶切，用Klenow酶填平，ApaⅠ部份酶切，取所需HindⅢ-ApaⅠ-ApaⅠ片段，导入载体pRT100花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和它的3′末端间的ApaⅠ、SmaⅠ切口中，得pKC503。
（2）pKC503用SacⅠ及ClaⅠ酶切，去除原外壳蛋白基因片段，与合成的SacⅠ-NcoⅠ-SalⅠ-DraⅠ多聚接头及pKC503上原来的DraⅠ-ClaⅠ的61个碱基对的片段相连，得pKC505。
（3）pTH-1的带白喉毒素（DT）片段A基因的NcoⅠ到EcoRI片段，先导入pRAJ275的NcoⅠ、EcoRI切口中，使NcoⅠ前接上SacⅠ切口，得pRAJ275DT。将pRAJ275DT用SalⅠ和HpaⅠ酶切并把带DT片段A基因的SalⅠ-HpaⅠ片段导入pKC505的SalⅠ和SacⅠ切口间，SacⅠ已预先用T4DNA聚合酶填平，得pKC525。
这里和后面的重组操作均按T.Maniatis等人所著“Molecular Cloning A Laboratory Manual”（Cold Spring Harbor Laboratory 1982）一书所叙方法进行。
2.嵌合基因导入农杆菌和导入烟草产生抗烟草花叶病毒工程植株的方法：
（1）将pKC525中的嵌合基因，用HindⅢ切出，导入Bin19载体的HindⅢ切口，得pKC545。这样，嵌合的毒蛋白基因就被置于能使植物抗卡那霉素的嵌合的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTⅡ）基因边上;二者均在Bin19载体的T-DNA区内。
（2）pKC545通过pRK2013的协助，经常规接合转移操作，导入带LBA4404的农杆菌中，用混有卡那霉素、链霉素和利福霉素的LB培养基筛选，抑制对卡那霉素敏感的仅带LBA4404的农杆菌和对链霉素、利福霉素敏感的带pKC545或pPK2013的大肠杆菌，就筛出所需的带LBA4404和pKC545的农杆菌pAKC545。LBA4404为含Vir区而不含T-DNA区的Ti质粒，农杆菌与受伤的植物组织、细胞接触时，它的Vir基因表达产物将使pKC545的T-DNA区进入植物细胞。
（3）农杆菌pAKC545接种于LB液体培养基中，在28℃下培养12小时，以LB液体培养基稀释一至三倍，与不抗卡那霉素的无菌烟草叶新切的碟片接触5至10分钟，经无菌滤纸吸去菌液后，叶碟片转到MS0固体培养基，在每天连续照光12小时的25℃培养箱中放置三天，转于带6-卞基嘌呤（1μg/ml）、头孢肟钠（300μg/ml）和卡那霉素（100μg/ml）的MS固体培养基上，再在相同培养条件下放置约20天，得很多转化烟草的幼芽;切取这些幼芽，转到带上述抗菌素但无6-苄基嘌呤的MS固体培养基上生根，约20天后得抗卡那霉素的转化烟草苗，把这些烟草苗从培养基中移栽到温室，待成活后，用TMV感染，即可筛出完全抗TMV的工程烟株。