用于检测大肠癌的新的基因组合及其基因芯片 【技术领域】
本发明涉及生物基因领域，尤其是用于大肠癌检测的基因及其基因芯片。
背景技术
大肠癌是常见恶性肿瘤之一，在我国恶性肿瘤发病率中居第5位，且呈现出“发病率上升，发病年龄提前，误诊率高”三个新特点。近年来大肠癌的发病率逐年升高，已从20世纪70年代的第六位上升到90年代的第三位，而且发病年龄有年轻化的趋势。目前用于诊断大肠癌的方法有多种：CEA(癌胚抗原)作为大肠肿瘤复发的临床监测价值远大于早期诊断的价值，因其在其他肿瘤中也有较高的表达，缺乏特异性；大便潜血试验(RPHA-FOBT)仍为检测早期大肠癌的重要手段，但由于早期大肠癌无出血者占有较大的比例，仍有漏诊率；国外推出的大肠癌检测试剂盒，主要采用免疫组化技术，针对手术后病理标本进行检测，其灵敏度都在30％左右。到目前为止，尚没有一种有关大肠肿瘤的特异性免疫标志物可供临床上用于大肠肿瘤的早期筛检，误诊率高达70％以上。
基因芯片(Gene Chip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵，借助核苷酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。
基因芯片起源于20世纪80年代，近年来得到了迅猛的发展，但主要是应用于医药和研究领域，应用于大肠癌的早期检测在我国尚属首次，这将会极大促进大肠癌早期诊断的发展。
【发明内容】
本发明的目的为提供一种特异性好、灵敏度高、准确率高的用于检测大肠癌的新基因组合。
本发明的目的之二为提供应用该新的基因组合的用于检测大肠癌的基因芯片。
实现上述目的的技术方案为：
用于检测大肠癌疾病的新的基因组合，该基因组合包括30个基因片段(如表1所示)，其中第30种基因片段为质控基因。这30个基因片断是针对大肠癌的30个指标而设计的，利用30个基因片段共同来检测大肠癌基因表达谱的改变，进而对大肠癌进行侦检和预后监控。这30种基因片段如下表所示：
表1 30种基因片段
本发明用于检测大肠癌的新的基因组合可应用于生物芯片技术(包括基因芯片技术、蛋白芯片技术、组织芯片技术、细胞芯片技术等)、聚合酶链反应(PCR)、核酸分子杂交技术以及其他病原体基因诊断技术。
本发明的有益效果为：
1、特异性好：现有的大肠癌的诊断仅是检测一个或几个指标缺乏特异性，所以容易引起误诊，尤其是早期大肠癌的误诊率更是高达70％以上。本发明用于检测大肠癌的新的基因组合可同时检测大肠癌病原体的30个指标，特异性高达95％。
2、灵敏度和准确率高：敏感性达95％，临床符合率(准确率)达95％。
3、可对大肠癌进行快速侦检和预后监控。
4、可用于各种类型的大肠癌的诊断和预后监控，尤其可用于早期大肠癌的诊断。
一种应用用于检测大肠癌的新的基因组合的基因芯片，其特征为：芯片包括(1)用于检测大肠癌的新的基因组中前29种基因片断作为检测寡核苷酸探针和第30种质控制基因作为质量控制寡核苷酸探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。
可用于该基因芯片中的探针标记技术有：核素标记、生物素标记、地高辛标记、荧光素标记、胶体铁标记、胶体金标记、联合标记及其他可用的标记技术。
该基因芯片可用于各种类型大肠癌的检测，尤其可用于早期大肠癌地检测。该基因芯片可对大肠癌进行快速侦检并分期分型。另外，本基因芯片的检测样本可以为大肠癌新鲜组织，也可以为大肠癌患者的粪便。
为保证芯片的质量，应注意以下事项：
1、样品核酸的提取：提取的核酸必须具有较高的纯度(OD260/OD280比值应大于1.50)和一定的量(10ng-100ng)，以保证标记的质量和特异性扩增，如果纯度不够，可能导致后面的杂交出现非特异点。
2、样品核酸的标记：掺入的标记物必须达到一定的浓度(每个反应掺入的标记物为0.1-1ug)，以保证杂交点的灵敏度，若浓度不够，杂交结果常会出现假阴性。
3、同源核酸杂交：应掌握杂交温度控制在42℃左右，温度过低，会出现非特异杂交点，使特异性降低，温度过高，则往往出现假阴性。
大肠癌早期诊断基因芯片和常规检测疾病的方法向比较具有以下优点：
1、准确，基因芯片设有阳性和阴性对照，可避免环境和人为因素造成的错误的诊断。
2、快速，常规检测需要一周的时间，而芯片只需8个小时左右。
3、灵敏，芯片的灵敏性(0.1pg)可比PCR技术高1000倍。
4、信息量大：PCR一次只检一种指标，而芯片一次可检测20～30种指标。
【附图说明】
图1为芯片样式设计图
图2为芯片检测结果
图3为基因芯片重复性检测结果
【具体实施方式】
实施例1 应用用于检测大肠癌的新的基因组合的基因芯片的制备
1、材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂
主要试剂RNA提取试剂(Trizol Reagent)、饱和酚、DEPC、DNA marker、Oligod(T)18购自上海生工。逆转录酶M-MLV(RNase H-)、Taq酶、Agarose Gel，M-MLV Rtase cDNA synthesisKit(code D6130)、RNA酶抑制剂、琼脂糖(Agarose)均购自大连宝生物公司。DNA纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司；DIG DNA标记试剂盒、地高辛杂交检测试剂盒购自购自深圳依诺金生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程公司合成；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2临床资料
(1)大肠癌新鲜组织样本：组织标本取自来自甘肃省肿瘤医院和甘肃省人民医院在2005年10月-2006年4月期间手术切除的新鲜大肠癌标本，前均未做化疗或放疗，术后经病理证实，同时距肿瘤边缘5-10cm以上切取正常组织(术后病理证实无癌细胞侵润)作为对照。标本离体后5min内即投入液氮罐内冻存。肿瘤病理类型均为腺癌。
(2)大肠癌患者粪便样本：检测样本为甘肃省肿瘤医院和甘肃省人民医院病2006年10月-2007年10月期间大肠癌及正常人粪便样本的150例粪便检测样本(其中大肠癌样本50例)分别用潜血和芯片方法进行对比检测，保存于-80℃。
1.1.3仪器和设备
仪器和设备：PCR仪购自杭州郎基；点样器；杂交仪；扫描仪均为自行设计，委托生产厂家制造。
2.引物设计
通过gene bank分别查找到大肠癌肿瘤标志物各数条序列，然后使用DNAStar分析设计出这些引物。引物见表1。
1.3基因芯片的制作
1.3.1大肠癌核酸的提取(大肠癌新鲜组织样本)
(1)从液氮中取出冻存的新鲜组织200mg，在液氮预冷的研钵中研碎组织，采用Trizol法提取组织总RNA，测定总RNA纯度并用Oligo dT纤维素层析法纯化mRNA。
(2)使用TaKaRa的M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit反转录合成cDNA的第一链，用于制备探针模板。
1.3.2核酸探针的扩增
(1)以1.3.1所获得的核酸为模板，使用表1所设计的引物，分别扩增出片断，以作为探针。(2)PCR反应体系50.0μL，包括10×Buffer 5.0μL，25mmol dNTPmixture0.5，TaqDNA酶1.0μL，目的引物上下游各1.0μL，cDNA模板1.0μL，三蒸水38.5μL，反应条件：94℃预变性5min；94℃预变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃10min后终止反应。(3)利用小片段DNA纯化试剂盒对获得的30种基因片段PCR产物进行纯化。
1.3.3点膜
通过微量点样器将所获得的探针点在预处理的尼龙膜上。
根据图1所示芯片样式设计图，用手动点样仪进行芯片点样。操作程序：(1)GAPDH，ACTIN，CYCLIND1等30种基因的点样液在100℃变性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。(2)尼龙膜(购自Amersco公司，带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10min，悬空晾干。(3)每点1μl把上述探针片段点在尼龙膜上(每张尼龙膜面积大约20cm2)(4)湿膜在紫外灯下照5min，取出让膜自然干燥。
1.4样品的处理
1.4.1核酸的提取(大肠癌患者粪便样本)
(1)大肠癌新鲜组织样本方法同1.3.1，使用引物5’-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTACGC GGG-3’和5’-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT(30)n-1n-3’反转录合成cDNA的第一链。
(2)采用Trizol法提取大肠癌患者粪便样本总RNA，使用引物5’-AAG CAG TGG TAA CAACGC AGA GTA CGC GGG-3’和5’-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT(30)n-1n-3’反转录合成cDNA的第一链。
1.4.2核酸的扩增
(1)以1.4.1所获得的核酸为模板，使用设计的通用引物5’-AAG CAG TGG TAA CAA CGCAGA GT-3扩增出基因片段，以作为检测样品。
(2)PCR反应体系25.0μL，包括10×Buffer 2.5μL，10mmol dNTPmixture 0.5ul，地高辛-11-dUTP 0.5ul，TaqDNA酶0.5μL，通用引物上下游各0.5μL，cDNA模板5.0μL，三蒸水12.5μL，反应条件：94℃预变性5min；94℃预变性30s，65℃退火30s，68℃延伸500s，30个循环；72℃10min后终止反应。
1.5杂交
加500ul预杂交液于基因芯片上，42℃处理40min。取20ul 1.4.2的产物于1.5ml的离心管内，100℃变性10min.-20℃冷却5min，加杂交液450ul，混匀，于基因芯片上，42℃杂交1h。分别用2×SSC，0.1×SDS和0.1×SSC，0.1×SDS各洗三次，加400ul3％BSA，42℃封闭30min，450ul缓冲液中加1.6ulAV-AP，42℃酶联20min，先用洗涤液洗膜三次，后加入显色液(450ul底物液+1.6ulBCIP+1.6ulNBT)，常温或42℃显色3~5min。用蒸馏水或自来水冲洗，终止显色。
1.6杂交结果的分析
将杂交完毕晾干的DNA阵列用自制的芯片扫描仪进行扫描分析，根据大量样品的分析，设置读数0.05以下为阴性，0.1以上为阳性，两者之间为可疑。打印诊断报告。
样品同时进行PCR或RT-PCR和其他检测方法进行比较。
阳性和阴性对照：分为人的GAPDH，ACTIN，CYCLIND1基因片段，加入反应系统，以监视标记和杂交、显色系统是否有效。
2结果
2.1准确率检测的结果
我们针对性的对分别GAPDH，ACTIN，CYCLIND1等30种基因进行了检测，杂交结果：30张芯片分别出现GAPDH，ACTIN，CYCLIND1等30种基因特异性杂交点，检测结果皆为阳性，没有非特异性杂交点的出现。同时阳性对照明显，读数大于0.3，阴性对照则小于0.05。(如图2)
2.2重复性检测结果
同时各取1个样本进行3次重复性检测。结果如图3。
2.3检出率的检测结果
利用我们研制的大肠癌基因诊断芯片对50例患者的粪便脱落细胞进行检测，发现48例检测为阳性，1例为弱阳性，1例为阴性；其特异性达95％、敏感性达95％、临床符合率(准确率)达95％，基本上达到设计要求。
2.4消化道肿瘤样本的检测
11例消化道肿瘤患者粪便检测结果(见表2)。
表2 11例消化道肿瘤患者粪便检测结果
肿瘤种类 统计数量(例) 隐血实验阳性 芯片检测阳性 咽喉相关肿瘤 3 0 0 食管癌 5 0 1 贲门癌 1 0 0 胃间质癌肝转 1 0 0 原发性肝癌 1 0 0
2.5高危人群检出率的检测结果
表3 50例正常人群粪便检测结果
种类 统计数量(例) 隐血实验阳性 芯片检测阳性 正常人群1(低危人群) 20 0 0 正常人群2(高危人群) 28 2 1
●正常人群48例，其中隐血阳性正常人群2例(见表3)