本发明是属于生物技术领域控制牛胚胎性别的一种途径和方法。 性别控制问题,特别是对家畜的性别控制问题,长期以来一直是生物科学家致力于研究的重大的理论课题之一,许多科学家曾根据X型和Y型两种不同类型的精子的物理和化学特性间的差异,先后采用电泳法、沉降法、逆流离心法、超声波处理法以及H-Y抗原等方法,试图把含有X染色体和Y染色体两种不同类型的精子分离,再分别进行人工授精,以实现人工控制性别的目的。遗撼的是,这些有益的尝试至今尚未取得令人满意的结果。
本发明是采用一种特殊的手段先取得胚胎细胞,然后利用染色体技术直接制备胚胎细胞的染色体,通过对染色体的显微观察和分析,对胚胎的性别作出判定,实现人工控制性别,达到提高母犊出生率,增加畜群中母畜比例地目的。
这里应用的对牛胚胎性别的早期判定方法,是采用染色体技术,通过对Y染色体的探测来实现的。这种判定性别的方法,为解决家畜性别控制这一生物领域的重大课题开辟了新途径,创造了一种行之有效的新方法。是生物技术领域的新突破。这项发明不仅具有重大的理论意义,而且在畜牧业生产实践中也具有重大的应用价值。
如把该项技术应用于畜牧业生产,可以提高畜群中母畜的比例,特别是应用于奶牛业生产,能大大提高母犊的出生率,可望获得显著的经济效益。对胚胎性别判定越早经济效益越明显。本项研究证明,牛胚胎性别的判定早在母牛妊娠后20天左右即可进行,但对牛胚胎性别判定的最适宜时间是母牛妊娠后30-40天。
这项发明所采用的技术路线是,吸取胚胎绒毛膜组织细胞,应用细胞研究技术进行组织培养,然后通过对染色体制片作显微观察和分析,作出性别判定。
具体的技术路线如下:
1、吸取胚胎绒毛膜组织细胞的方法
(1)用穿刺针头,如图1中的标号1(外径2mm,长度165mm,不锈钢制品),在后海穴位注射2%普鲁卡因10ml,目的在于松驰子宫口。
(2)应用直肠把握法,将子宫颈开张器,如图1中标号2(外径3mm,顶球外径4.5mm,长度400mm,不锈钢制品),先通过子宫颈,然后将子宫颈通过管,如图1中标号3(外径6mm,内径5mm,长度360mm,金属制品)套在子宫颈开张器(图1中标号2)上使其通过子宫颈,待子宫颈通过管(图1中的标号3)通过子宫颈后把子宫颈开张器(图1标号2)拉出。
(3)将吸取胚胎组织软管,如图1中的标号4(外径3-4mm,内径2-3mm,长度700mm,软塑料透明管)沿着子宫颈通过管(图1中的标号3)的内壁进入子宫,使吸取胚胎组织软管(图1中的标号4)造成一定负压,然后轻轻拉出吸取胚胎组织软管(图1中的标号4),这样一次可吸得胚胎绒毛膜组织5-10mg。
2、利用胚胎绒毛膜组织细胞制备染色体的方法
(1)培养基的制备:按常规法制备RPMI1640培养液,调至PH7.2,抽滤灭菌,分装培养瓶,每瓶3ml,置于冰箱中保存备用。
(2)培养:将吸得的胚胎绒毛膜组织细胞立即放入备用的培养瓶中,加秋水仙素,使其最终浓度为0.03-0.05ug/ml,置38℃恒温培养箱培养2-3小时。
(3)低渗处理:将培养物连同培养液倒入离心管,置1000转/分,离心8-10分钟;吸弃上清液,加浓度为0.8-1.2%柠檬酸纳8ml,置入预温37℃恒温水浴中低渗30分钟。
(4)预固定:把固定液,甲醇:冰醋酸(3∶1)1ml加入低渗液中,轻轻打匀,固定20分钟。
(5)固定:
(6)再固定:离心弃去上清液,再加固定液8ml,轻轻打匀,固定20分钟。
(7)用60%冰醋酸处理:离心弃去上清液,加入1-1.5ml 60%冰醋酸,轻轻摇动2分钟,使绒毛膜细胞从上皮组织上脱落下来,制成细胞悬液。
(8)离心:以1000转/分,离心8-10分钟,弃去上清液。
(9)制片:留沉淀物,加适量的固定液(0.5-1ml)制成细胞悬液,滴片、干燥。
(10)染色:用4∶1(PH7.4)Giemsa染色20-30分钟、冲洗、干燥、镜检。
(11)胚胎性别判定:牛(Bos taurus)的体细胞染色体为30对,2n=60,常染色体为29对,均为端着丝点,性染色体公母不同,母牛为XX(即X型),公牛为XY(即Y型),X染色体和Y染色体虽都是近中着丝点,但X染色体比Y染色体要长的多,胚胎是否属于Y型[如图2牛胚胎绒毛细胞染色体制片显微照片(Y型)]在高倍显微镜下很容易确定。如作显微镜摄影放大分析更清楚。