新型中性植酸酶 【技术领域】
本发明涉及一种新型中性植酸酶，特别涉及来编码该中性植酸酶的基因序列。
背景技术
植酸酶是一种可以将植酸水解为肌醇和磷酸的酶类。饲料中添加植酸酶后可将植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸盐，供动物吸收利用，从而提高磷的利用率和骨骼矿化程度，可节约磷资源、降低饲料成本。但天然来源的植酸酶含量太低而难以大量提取生产。
因此，找到一种新型的植酸酶，并通过基因工程手段克隆该植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达植酸酶基因，可以使植酸酶的制备产业化。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种新的植酸酶基因，将该基因克隆并表达后，可以得到一种新型的中性植酸酶，该酶可以产业化生产，并具有较高的比活力。
本发明提供了一种新的中性植酸酶基因：本发明筛选出含有胞外分泌植酸酶的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，并从该柠檬酸杆菌基因组中PCR得到一个中性植酸酶基因phyA；将该基因克隆到表达载体pPIC9K，转化到酵母菌GS115中。用甲醇诱导植酸酶的表达，通过镍柱亲和纯化带有His Tag的植酸酶。通过SDS-PAGE验证植酸酶纯化情况。
对上述植酸酶进行了性质的测定通过不同温度和不同pH值的处理，得到该酶的最适温度和最适pH值等性质。
经测定，本发明得到的新的植酸酶比活力约为1000U/mg。
本发明提供的新的中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：1所编码的植酸酶蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其衍生序列。
所述氨基酸序列的衍生序列包括以下情况：
(f)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有植酸酶功能的多肽；
(g)将SEQ ID NO：1所示的核酸分子的简明序列所编码的多肽；
(h)在严谨条件下与SEQ ID NO：1所示核酸分子的互补链杂交的核酸所编码的具有植酸酶活性的多肽；
(i)由SEQ ID NO：1所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽；或
(j)与SEQ ID NO：2所示的多肽序列具有至少70％同源性的具有植酸酶活性的多肽，优选75％，80％，85％，90％或95％，特别是99％的同源性。
通过基因工程手段，如人工合成或其它方式克隆该植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达，可以产业化生产具有较高酶活性的中性植酸酶。
【附图说明】
图1：中性植酸酶PHYA的最适pH结果。
图2：pPIC9K-phyA的质粒图谱
序列信息：
编码柠檬酸杆菌的中性植酸酶成熟蛋白质的DNA序列SEQ ID NO：1；
柠檬酸杆菌的中性植酸酶成熟蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO：2
【具体实施方式】
以下实施例中所用的材料和试剂来源如下：
1.菌株与载体 大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司，载体由本研究构建并保存。巴斯德毕氏酵母GS115和表达载体pPIC9K购自invitrogen公司。
2.酶与试剂盒 限制性内切酶，连接酶，Taq酶为NEB公司产品。基因组提取试剂盒为天根生化公司产品。
3.生化试剂DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成为ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸酶钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。NTA树脂为Qiagen公司产品。
4.培养基 大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。巴斯德毕氏酵母养基为YPD(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)。
实施例1产植酸酶的柠檬酸杆菌的筛选
从新疆高温照射环境中取得土壤进行微生物富集培养。培养基使用LB培养基，成分为：酵母粉0.5％、蛋白胨0.3％、0.5％氯化钠、pH为7。培养条件：称取适量土壤放入LB培养基，37℃，200r/min，培养3-6天。每日吸取少量培养液进行梯度稀释(10-2-10-10)，涂布于含有植酸钠的固体培养基中，37℃培养2-3天。固体培养基成分：植酸钠1％，NaNO30.3％，MgSO4·7H2O 0.5％，KCl 0.5％，K2HPO40.1％，FeSO4·7H2O 0.001％，琼脂1％，pH6.0。若培养基中生长的菌落周围出现了明显的菌圈，则可初步判断该菌能产生出植酸酶，选出培养基中产生最大菌圈的菌落。
实施例2柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)基因组的提取与鉴定
将选取的培养基中地菌，挑取单菌落放入LB液体培养基中培养，取菌液用于该菌的基因组DNA的提取。使用Tiangen公司的TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒，按公司提供的试剂盒操作说明书提取该菌的基因组DNA。为了鉴定菌属，以基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增该菌株的16s rDNA序列。
设计细菌16SrDNA的引物：F 27：5′-agagtttgatcatggctcag-3′
R 1492：5′-tacggttaccttgttacgactt-3′
PCR产物长度约1.4kb，测序后与GenBank数据库中DNA序列进行比对，发现该序列与柠檬酸杆菌的16s rDNA基因序列相似性达98％，因此，将该菌株在分类学上鉴定为柠檬酸杆菌。
实施例3柠檬酸杆菌基因组中植酸酶基因的克隆
从Genbank中的找到其他柠檬酸杆菌中关于植酸酶基因序列，设计简并引物，如下：
phyA F(EcoR I)：5′-GAATTCATGAGTACATTCATCATTC-3′
phyA R(Not I)：5′-GCGGCCGCTTATTCCGTAACTGCACAC-3′
下划线部分为EcoRI(上游引物F)和NotI(下游引物R)识别位点。
PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，观察长度约为1.3Kb。运用T4DNA连接酶连接到T-载体上(pMDl8-T simple vector，Takara公司)。经过测序，得到序列推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例4柠檬酸杆菌中植酸酶基因的酵母转化及筛选表达
连接T-载体的植酸酶DNA片段经过限制性核酸内切酶NotI和EcoRI消化，通过浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳纯化后，将线性化的植酸酶基因切割下来，使用DNA回收试剂盒(Tiangen)回收线性化的植酸酶DNA；将载体质粒pPIC9K用限制性核酸内切酶NotI和EcoRI消化，运用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳纯化后，将线性化的载体片段切割下来，使用DNA回收试剂盒(Tiangen)回收线性化的载体质粒片段pPIC9K。用T4DNA连接酶把两段纯化的DNA片段连接起来，转化大肠杆菌JMl09。之后提取质粒，使用限制性核酸内切酶DraI将质粒线性化。后悬浮于100μl电转感受态毕赤酵母GS115细胞中，将混悬液转移到0.1cm的电穿孔杯(BioRad)中，使用Gene Pulser Xcell(BioRad)装置，1800V、25μF和200Ω进行电激。电激后立即加入lml的lmol/L的山梨醇，随后涂布与含组氨酸缺陷的MM培养基平板上，30℃培养2天。PCR筛选含有phyA基因的转化子。
将活化的pPIC9K-phyA菌液lml加入到100ml LB培养基中，37℃使菌液浓度达OD600＝0.6-0.8时进行甲醇诱导。30℃摇床(200rpm)用10ml/L的甲醇诱导，每12小时向培养基中添加一次甲醇，共诱导2天。由于植酸酶在酵母菌中的异源表达能有效地分泌到胞外，因此诱导后的菌液，经离心得到上清即是植酸酶的粗酶液。
实施例5来自柠檬酸杆菌中重组植酸酶的纯化
将用pPIC9K转化的GSll5的培养物进行离心去除细菌细胞，用Tris碱将粗酶液的上清pH调节到7.9。将上清通过pH 7.9平衡的Ni-NTA层析柱子，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。通过SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况。将纯化得到的植酸酶蛋白收集，低温存放。
实施例6柠檬酸杆菌中异源表达的植酸酶酶活测定
有目的植酸酶的收集管用与测定植酸酶酶活，酶活测定方法如下：将上清用缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM CaCl2，10％甘油，pH710)做适当稀释后，取015ml酶液，加入2ml 2mM的植酸钠(100mM Tris-HCl，pH710，012mM CaCl2)，37℃保温30min，加入215ml 20％TCA(w/v)终止酶活反应，5000r/min离心5min，然后加入5ml硫酸亚铁-钼酸铵显色液[(115％钼酸铵∶515％硫酸)∶(217％硫酸亚铁)＝4∶1，v/v]，5000r/min离心5min，700mM测定无机磷酸含量。对照为先在015ml的酶稀释液中加入215ml 20％TCA使酶失活，再加入同体积的底物保温。酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放1nmol无机磷所需的酶量为一个酶活性单位。
实施例7来自柠檬酸杆菌中重组植酸酶的最适pH
在实施例5中所述的缓冲液和条件下，研究柠檬酸杆菌中植酸酶(按照实施例6纯化)的活性对pH的依赖性。所述酶在较广范围内都有活性，而在中性条件下6.5-7.5之间活性最大。
实施例8来自柠檬酸杆菌中重组植酸酶PHYA的比活
使用按照实施例6的纯化制备物来评估PHYA植酸酶的比活。根据实施例5在pH7.0测定的植酸酶活性，通过用BCA蛋白质测试试剂盒测量总蛋白质浓度并通过用SDS-PAGE估计的植酸酶含量对其进行校正计算该酶浓度。按照这些测量来自柠檬酸杆菌的重组植酸酶的比活力约为1000U/mg。
【序列表】
<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>新型中性植酸酶
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1299
<212>DNA
<213>柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)
<400>1
atgagtacat tcatcattcg tttattattt ttttctctct tatgcggttc tttctcaata 60
catgctgaag agcagaacgg tatgaaactt gagcgggttg tgatagtgag ccgccatgga 120
gtaagagcac ctacgaagtt cactccaata atgaaagatg tcacacccga tcaatggcca 180
caatgggatg tgccgttagg atggctaacg cctcgtgggg gagaacttgt ttctgaatta 240
ggtcagtatc aacgtttatg gttcacgagc aaaggtctgt tgaataatca aacgtgccca 300
tctccagggc aggttgctgt tattgcagac acggatcaac gcacccgtaa aacgggtgag 360
gcgtttctgg ctgggttagc accaaaatgt caaattcaag tgcattatca gaaggatgaa 420
gaaaaaactg atcctctttt taatccagta aaaatgggga catgttcgtt taacacattg 480
aaggttaaaa acgctattct ggaacgggcc ggaggaaata ttgaactgta tacccaacgc 540
tatcaatctt catttcggac cctggaaaat gttttaaatt tctcacaatc ggagacatgt 600
aagactacag aaaagtctac gaaatgcaca ttaccagagg ctttaccgtc tgaacttaag 660
gtaactcctg acaatgtatc attacctggt gcctggagcc tttcttccac gctgactgag 720
atatttctgt tgcaagaggc ccagggaatg ccacaggtag cctgggggcg tattacgggg 780
gaaaaagaat ggagagattt gttaagtctg cataacgctc agtttgatct tttgcaaaga 840
actccagaag ttgcccgtag tagagccaca ccattactcg atatgataga cactgcatta 900
ttgacaaatg gtacaacaga aaacaggtat ggcataaaat tacccgtatc tctgttgttt 960
attgctggtc atgataccaa tcttgcaaat ttaagcgggg ctttagatct taactggtcg 1020
ctacccggtc aacccgataa tacccctcct ggtggggagc ttgtattcga aaagtggaaa 1080
agaaccagtg ataatacgga ttgggttcag gtttcatttg tttatcagac gctgagagat 1140
atgagggata tacaaccgtt gtcgttagaa aaacctgccg gcaaagttga tttaaaatta 1200
attgcatgtg aagagaaaaa tagtcaggga atgtgttcgt taaaaagttt ttccaggctc 1260
attaaggaaa ttcgcgtgcc agagtgtgca gttacggaa 1299
<210>2
<211>433
<212>prt
<213>柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)
<400>2
MET Ser Thr Phe Ile Ile Arg Leu Leu Phe Phe Ser Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ser Phe Ser Ile His Ala Glu Glu Gln Asn Gly MET Lys Leu Glu Arg
20 25 30
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr
35 40 45
Pro Ile MET Lys Asp Val Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val
50 55 60
Pro Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Gln Arg Leu Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn
85 90 95
Gln Thr Cys Pro Ser Pro Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp
100 105 110
Gln Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro
115 120 125
Lys Cys Gln Ile Gln Val His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Thr Asp
130 135 140
Pro Leu Phe Asn Pro Val Lys MET Gly Thr Cys Ser Phe Asn Thr Leu
145 150 155 160
Lys Val Lys Asn Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu
165 170 175
Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu
180 185 190
Asn Phe Ser Gln Ser Glu Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys
195 200 205
Cys Thr Leu Pro Glu Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp
210 215 220
Asn Val Ser Leu Pro Gly Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu
225 230 235 240
Ile Phe Leu Leu Gln Glu Ala Gln Gly MET Pro Gln Val Ala Trp Gly
245 250 255
Arg Ile Thr Gly Glu Lys Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn
260 265 270
Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg
275 280 285
Ala Thr Pro Leu Leu Asp MET Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly
290 295 300
Thr Thr Glu Asn Arg Tyr Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe
305 310 315 320
Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp
325 330 335
Leu Asn Trp Ser Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly
340 345 350
Glu Leu Val Phe Glu Lys Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp
355 360 365
Val Gln Val Ser Phe Val Tyr Gln Thr Leu Arg Asp MET Arg Asp Ile
370 375 380
Gln Pro Leu Ser Leu Glu Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu
385 390 395 400
Ile Ala Cys Glu Glu Lys Asn Ser Gln Gly MET Cys Ser Leu Lys Ser
405 410 415
Phe Ser Arg Leu Ile Lys Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr
420 425 430
Glu