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一种从蚕蛹油中提取高纯度的α‑亚麻酸乙酯的方法
    (一)技术领域

    本发明涉及一种从蚕蛹油中提取高纯度的α‑亚麻酸乙酯的方法。

    (二)背景技术：

    α‑亚麻酸，C18：3 n‑3，是人体必需脂肪酸，同时也是人体内DHA、EPA的合成前体，为药食两用的功能因子，应用于医药、食品、化妆品等领域。α‑亚麻酸广泛具有广泛的生理功能，包括：1.调节“三高”(高血脂、高血压、高血糖)；2.改善肝脏功能，恢复化学性肝脏损伤；3.预防心脑血管疾病，抗血小板凝集，预防心肌梗塞和脑梗塞，抑制脑出血；4.抵御艾滋病毒<HIV>的感染，抑制肿瘤作用；5.减轻病菌侵入能力，有效预防前列腺炎作用；6.改善各种炎症，防治哮喘、过敏、特异性湿疹等反应；7.补充大脑营养，改善智力，抗衰老、抗疲劳、保护视力；8.增加体内EPA和DHA的生成，预防老年痴呆症；9.美容、延缓青春，增加皮肤弹性，白发变黑发；10.稳定减肥功效。

    目前，α‑亚麻酸的油料来源主要为紫苏油，此外黑加仑籽油、胡麻籽油、亚麻籽油、接骨木油等草本、木本油料等小宗油料α‑亚麻酸含量也较高，但产量低、成本高。作为蚕丝大宗副产物，蚕蛹油中含有较丰富的功能性α‑亚麻酸(约占30％)，是极为经济的原料。

    目前，不饱和脂肪酸的分离方法很有限，主要有冷冻结晶法、尿素包埋法(CN1162009，)、分子蒸馏(99115426.4，CN101245359，CN101139289)及超临界CO₂萃取法(CN1429810，CN1366064)等。然而冷冻结晶法、尿素包埋法对于分离饱和程度不同的脂肪酸效果明显，但分离效率及选择性不高，CN1414080公开了膜分离技术提取α‑亚麻酸的工艺方法，其分离原理仍然基于饱和度不同的脂肪酸凝固点的差别，结合膜技术实现分离，因此选择性没有得到根本性改善。分子蒸馏及超临界CO₂萃取法对于分离碳数不同的脂肪酸有利，但操作成本较高、处理量相对较小，而且对于碳数相同而饱和度不同的多不饱和脂肪酸分离效果不佳。目前，络合色谱法(CN1317477，US5672726，)似乎是多不饱和脂肪酸高选择性分离相对有效的方法。侯相林等(CN1651396.A)采用亚铜离子作介质分离得到了纯度90％的亚麻酸乙酯。但其采用的油料为紫苏，其原料油中α‑亚麻酸初始含量高达62％，因此进一步纯化相对容易，而且基本可通过吸附色谱一步得到高纯度α‑亚麻酸。而对于蚕蛹油，α‑亚麻酸含不高(仅为20‑30％)，亚铜离子选择性低、易污染，吸附量小的问题就凸显出来，因此分离效率不高，选择性减弱，处理量明显降低，限制了工业化生产。

    银离子虽然价格相对较高，而且不稳定容易还原失活，但其对不饱和脂肪酸的选择性至今仍无可替代。通过选择适当的银盐和载体，可明显改善银离子的稳定性和选择性，提高重复使用次数降低成本。

    (三)发明内容

    本发明提供一种从蚕蛹油中提取高纯度的α‑亚麻酸乙酯的制备方法，本发明采用的技术方案是：

    一种从蚕蛹油中提取高纯度的α‑亚麻酸乙酯的方法，所述的方法包括以下步骤：

    (1)蚕蛹油和乙醇，在催化剂乙醇钠的存在下，在50～70℃温度下，28～100KHz的超声波条件下，反应1‑3小时后，水洗，静置分层，取有机相减压蒸馏除去溶剂，得到蚕蛹混合脂肪酸乙酯；所述蚕蛹油和乙醇的质量比为2.14∶1；所述乙醇钠的添加质量为蚕蛹油质量的1％；

    (2)乙醇中加入100～120目的硅胶，再加入银盐的乙醇溶液，搅拌均匀后，在氮气保护下蒸馏除去溶剂，然后在80℃温度下干燥8～12小时激活，制得银离子硅胶，银离子硅胶用湿法装柱得到银离子吸附柱；所述的银盐为四氟硼酸银、三氟甲烷磺酸银或硝酸银，所述硅胶和银盐的质量比为10～20∶1；

    (3)步骤(1)制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯加入步骤(2)制得的银离子吸附柱，依次用正己烷、含丙酮1％体积百分比的正己烷为洗脱液洗脱，最后用洗脱剂A为洗脱液洗脱并收集馏分，所述的洗脱剂A为丙酮、乙腈、乙醚、正己烯、2，4‑己二烯或十四烯，得到高纯度的α‑亚麻酸乙酯溶液；所述洗脱液的流速为2mL/min；所述每种洗脱液的用量为柱床层体积的5‑10倍；

    (4)步骤(3)制得的α‑亚麻酸乙酯溶液减压蒸馏除去溶剂，得到高纯度的α‑亚麻酸乙酯。

    所述的方法步骤(3)中，在步骤(1)制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯加入步骤(2)制得的银离子吸附柱之前，优选先将步骤(2)制得的银离子吸附柱用正己烯、2，4‑己二烯或十四烯平衡30min，得到预饱和银离子吸附柱；再将步骤(1)制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯加入预饱和银离子吸附柱。

    所述正己烯、2，4‑己二烯或十四烯又可称为竞争性吸附剂，其原理在于，正己烯、2，4‑己二烯或十四烯与银离子具有弱的结合能力，在上样前加入银离子吸附柱中，使银离子吸附饱和。当蚕蛹混合脂肪酸乙酯过柱时，与银离子络合能力不强的饱和脂肪酸乙酯、含有一个双键或两个双键的不饱和脂肪酸乙酯可以自由通过，而含有三个双键的多不饱和的亚麻酸乙酯与银离子的络合能力大于正己烯、2，4‑己二烯或十四烯，因此取代竞争性吸附剂而被银离子吸附，从而实现亚麻酸乙酯与其他脂肪酸乙酯的分离。最后用大量的洗脱剂将亚麻酸乙酯洗脱。

    更优选的，步骤(2)制得的银离子吸附柱先用正己烯平衡30min，得到预饱和银离子吸附柱；再将步骤(1)制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯加入预饱和银离子吸附柱。

    所述的洗脱剂A优选为正己烯。

    最优选的，步骤(2)制得的银离子吸附柱先用正己烯平衡30min，得到预饱和银离子吸附柱；再将步骤(1)制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯加入预饱和银离子吸附柱；洗脱剂A选用正己烯。

    本发明所述的步骤(1)中，反应温度为50～70℃，优选为60～70℃；超声波频率为28～100KHz，优选为45～100KHz。

    本发明所述的步骤(2)中，银盐优选为四氟硼酸银。

    所述的步骤(2)中，乙醇溶液为70wt％的乙醇水溶液，所述70wt％的乙醇水溶液的质量与银盐质量比为30～50∶1。

    较为具体的，推荐本发明所述的从蚕蛹油中提取高纯度的α‑亚麻酸乙酯的方法按照以下步骤进行：

    (1)蚕蛹油和乙醇，在催化剂乙醇钠的存在下，在50～70℃温度下，28～100KHz的超声波条件下，反应3小时后，水洗，静置分层，取有机相减压蒸馏除去溶剂，得到蚕蛹混合脂肪酸乙酯；所述蚕蛹油和乙醇的质量比为2.14∶1；所述乙醇钠的添加质量为蚕蛹油质量的1％；

    (2)乙醇中加入100～120目的硅胶，再加入四氟硼酸银的70wt％乙醇水溶液，搅拌均匀后，在氮气保护下蒸馏除去溶剂，然后在80℃温度下干燥8～12小时激活，制得银离子硅胶，银离子硅胶用湿法装柱得到银离子吸附柱；所述硅胶和四氟硼酸银的质量比为10～20∶1；所述70wt％的乙醇水溶液质量与四氟硼酸银质量比为30～50∶1；

    (3)步骤(2)制得的银离子吸附柱用正己烯平衡30min，得到预饱和银离子吸附柱；步骤(1)制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯加入预饱和银离子吸附柱，依次用正己烷、含丙酮1V％的正己烷为洗脱液洗脱，最后用正己烯为洗脱液洗脱并收集馏分，得到高纯度的α‑亚麻酸乙酯溶液；所述洗脱液的流速为2mL/min；所述每种洗脱液的用量为柱床层体积的5‑10倍；

    (4)步骤(3)制得的α‑亚麻酸乙酯溶液减压蒸馏除去溶剂，得到高纯度的α‑亚麻酸乙酯。

    本发明首先采用醇解得到蚕蛹混合脂肪酸乙酯。然后由于蚕蛹油脂肪酸组成中α‑亚麻酸含量一般在20‑30％之间，为提高分离的选择性一步得到高纯度的α‑亚麻酸乙酯，研究筛选了高选择性的金属离子络合剂，并结合采用预饱和银离子柱来选择性阻碍棕榈油酸、油酸、亚油酸等低饱和度脂肪酸吸附，进一步提α‑高亚麻酸乙酯的络合选择性。

    本发明的原料蚕蛹油可通过常规的溶剂萃取后脱胶、脱酸得到，此方法是本领域技术人员所熟知的。本发明所说的蚕蛹油可通过这种熟知的方法制得，也可直接从市售获得。

    本发明通过金属离子络合吸附剂从混合脂肪酸中一步实现高纯度α‑亚麻酸乙酯的分离。首先对蚕蛹油超声波辅助乙醇醇解制得蚕蛹混合脂肪酸乙酯，然后将产物通过竞争性吸附物预饱和的金属离子的络合吸附柱，饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸自由通过，而多不饱和脂肪酸与银离子形成π复合物。双键越多复合物越稳定。然后改变洗脱溶剂进行洗脱，得到的α‑亚麻酸乙酯纯度为95‑99％。由于竞争性吸附物的存在，阻碍了单不饱和脂肪酸的吸附络合，因此大大提高了分离的选择性，同时明显减少银离子的流失，改善银离子吸附剂的稳定性，因此可多次使用，降低生产成本。

    (四)具体实施方式

    实施例1‑4蚕蛹油的溶剂萃取及预处理

    将蚕蛹置于85‑90℃真空干燥3h，机械粉碎至60‑80目，然后准确称取100g干蚕蛹粉，按照蚕蛹质量和溶剂体积的料液比为1∶10g/ml，加入溶剂，超声波萃取(45KHz)30min，真空浓缩，称重计算蚕蛹油含量(干重)，反应条件和收率见表1。

    表1.不同溶剂超声辅助萃取蚕蛹油

    

    超声辅助萃取在常温下进行，条件温和，产品质量好。萃取效率高，可显著减少萃取时间。不同溶剂效果差别较大，氯仿/甲醇萃取率最高，但色素被共萃取因此蛹油色泽较深，后序工艺不便，另外氯仿的毒性也是食品加工需避免的。正己烷萃取物颜色浅黄，但萃取率明显偏低，可能部分极性脂质和色素没被萃取。正己烷/异丙醇(2∶1)应是较好的选择，不论萃取率还是产品质量都可接受。

    实例5‑16超声波辅助蚕蛹油乙酯化的研究

    按照实施例3的方法制备得到蚕蛹油，然后和乙醇，催化剂乙醇钠，按照表2的反应条件进行反应，反应结束后，水洗，静置分层，取有机相减压蒸馏除去溶剂，得到蚕蛹混合脂肪酸乙酯；乙醇钠的添加质量为2.15g。反应结果如表2。

    表2不同超声条件下蚕蛹油乙酯化研究

    

    注：乙醇/蚕蛹油的摩尔比约为10∶1，乙醇钠为催化剂，添加量为油质量的1％.

    数据显示，超声波明显优于传统的机械搅拌，相同时间内的转化率明显高于机械搅拌。在实现期望的产率条件下，超声波会大大缩短反应时间。此外，不同频率的超声波的“空穴”效应不会有本质差别，但高频率(45kHz)的转化率略高于低频(28kHz)，尤其低温下效果更明显。

    实例17‑20不同银盐吸附剂络合分离α‑亚麻酸的研究

    称取前述实施例制得的40g蚕蛹混合脂肪酸乙酯溶于正庚烷中，得到1000mL 4％(m/v)的乙酯庚烷溶液。取适量硝酸银、四氟硼酸银、三氟甲烷磺酸银，溶于适量30％乙醇溶液中得到银离子浓度为5mg/mL的银离子溶液。分别取2mL乙酯庚烷溶液和银离子溶液于10mL棕色具塞试管中，25℃剧烈振荡3h。平衡后测两相的体积，取上层庚烷相GC分析亚麻酸乙酯的含量及纯度。根据吸附前后溶剂中α‑亚麻酸含量及各相体积计算α‑亚麻酸的回收率，列于表3中。

    表3不同种类的银盐对a‑亚麻酸的络合效果

    

    数据显示，添加等量银离子条件下，四氟硼酸银不论a‑亚麻酸选择性还是回收率均最高，这可能与其较低的晶格能有关。其次是三氟甲烷磺酸银，硝酸银效果最差。

    实例21‑25四氟硼酸银柱色谱分离α‑亚麻酸的研究

    银离子硅胶制备如下：50g硅胶(100‑120目，表面积127.85m²g^‑1)分散在乙醇中(20mL，10min)，加入150mL四氟硼酸银乙醇溶液(5g四氟硼酸银溶于150mL70wt％乙醇水溶液中)连续搅拌10min，在氮气保护下水浴蒸干乙醇得到自由流动的吸附银离子的硅胶，然后80℃干燥过夜，激活得到银离子硅胶。冷却盛于棕色瓶中干燥保藏。湿法装柱(玻璃色谱柱19mm×30cm，填充高度5cm)得到银离子吸附柱。

    取1.0mL前述制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯，溶于5mL正己烷中，加入银离子吸附柱，先用50mL正己烷洗脱除去未被吸附的脂肪酸和饱和脂肪酸，然后用正己烷/丙酮(99∶1，v/v)洗脱单不饱和脂肪酸，最后用50mL洗脱剂X(如表4所示)洗脱亚麻酸和微量亚油酸，流速2mL/min。每50mL收集一个馏分，GC分析a‑亚麻酸乙酯的含量，计算回收率，结果列于表4中。

    表4银离子柱色谱中不同洗脱剂的吸脱效果

    

    棕榈酸、硬脂酸等饱和脂肪酸乙酯主要存在于正己烷组分中，而油酸甲脂和部分棕榈油酸甲脂主要存在于正己烷/丙酮(99∶1，v/v)组分中。而亚麻酸的剥离溶剂中，乙腈洗脱能力最强，这应与乙腈极性强以及其与银离子的强结合能力有关。丙酮的洗脱能力也较强，但其对银离子有一定溶解能力，使用不经济。非极性的庚烷、乙醚洗脱能力较差。此外己烯表现出较好的吸脱能力，其极性不强而且能够与银离子以弱的π键络合，这为后续进一步提高吸附选择性提供了便利。

    实例26‑28竞争性吸附物预处理四氟硼酸银柱色谱对α‑亚麻酸分离选择性的影响

    己烯较强的洗脱能力启示，如果在上样前先用己烯处理吸附剂，己烯可与银离子以弱的π键络合。由于银离子已被饱和，当带有一个双键和两个双键的不饱和脂肪酸过柱时，其被银离子吸附的几率变小，而多不饱和的亚麻酸带三个双键，其与银离子络合能力远大于己烯，因此亚麻酸可取代己烯被吸附，最后用过量体积己烯洗脱将可能大大提高α‑亚麻酸的分离选择性。

    如实施例21‑25中的方法，制得银离子吸附柱，然后加入50mL洗脱剂Y(如表5所示)平衡30min，得到预饱和银离子吸附柱，然后取1.0mL实施例13制得的蚕蛹混合脂肪酸乙酯，溶于5mL正己烷中，加入预饱和银离子吸附柱，先用50mL正己烷洗脱除去未被吸附的脂肪酸和饱和脂肪酸，然后用正己烷/丙酮(99∶1，v/v)洗脱单不饱和脂肪酸，最后用50mL洗脱剂Y(如表5所示)洗脱亚麻酸和微量亚油酸，流速2mL/min。每50mL收集一个馏分，GC分析a‑亚麻酸乙酯的含量，计算回收率，结果如表5所示：

    表5.不同竞争性吸附物对银离子柱色谱分离a‑亚麻酸乙酯效果的影响

    

    结果表明，采用正己烯、十四烯预饱和银离子吸附柱可明显改善a‑亚麻酸含量分离选择性，产物中a‑亚麻酸含量含量增加了10～20％。但2，4‑己二烯效果并不理想，可能是其与银离子的结合过强有关，而且其分离量与亚麻酸接近，因此亚麻酸取代十四烯与银离子结合难度较大，使得亚麻酸与其他饱和度较低的脂肪酸共流出，因此分离选择性降低。此外虽然正己烯、十四烯的阻碍效果均不错，但十四烯沸点(251℃)远高于正己烯(52℃)，考虑到后续工艺中亚麻酸分离回收的便利，正己烯是更适合的阻滞剂和洗脱溶剂。

    实施例29

    四氟硼酸银离子吸附柱按实施例21‑25介绍的方法制备。然后用50mL正己烯平衡30min。然后取1.0mL蚕蛹混合脂肪酸乙酯(实施例13所得)，溶于5mL正己烷中，加入预饱和银离子吸附柱。洗脱顺序依次为50mL正己烷、50mL正己烷/丙酮(99∶1，v/v)，最后用50mL正己烯洗脱。流速2mL/min。每50mL收集一个馏分，GC分析a‑亚麻酸乙酯含量，计算回收率，结果发现正己烯馏分中亚麻酸乙酯纯度为96.8％，亚麻酸回收率85.8％。

    实施例30

    蚕蛹脂肪酸乙酯制备、装柱、上样方法及条件同实施例29。洗脱顺序依次为50mL正己烷、50mL正己烷/丙酮(99∶1，v/v)，最后用50mL丙酮洗脱。流速2mL/min。每50mL收集一个馏分，GC分析a‑亚麻酸乙酯含量，计算回收率，结果发现丙酮馏分中亚麻酸乙酯纯度为90.6％，亚麻酸回收率87.2％。