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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610058264.1 (22)申请日 2016.01.27 A61K 48/00(2006.01) A61P 15/00(2006.01) (71)申请人 广州市科虎生物技术研究开发中心 地址 510000 广东省广州市增城中新镇安良 村下岳社西丫岭 (72)发明人 张永亮 习欠云 史合群 (74)专利代理机构 北京市盈科律师事务所 11344 代理人 马丽丽 (54) 发明名称 GRF 表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的 药物中的用途 (57) 摘要 本发明涉及 GRF 表达质粒在制备降低仔猪出 生弱仔率的药物中的用途。本发明通。
2、过向孕猪肌 肉注射 GRF 表达质粒， 进行基因转移， 使 GRF 表达 质粒在母猪肌肉组织中高效表达， 进而促进胎儿 的发育， 降低了出生仔猪的弱仔率， 最终达到提高 养猪业经济效益的目的， 具有巨大的实际应用价 值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105617404 A 2016.06.01 CN 105617404 A 1.GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途。 2.根据权利要求1所述的用途， 其特征在于： 所述GRF表达质粒为pVAX1-GRF质粒。 3.根据权利要求1所述。
3、的用途， 其特征在于： 所述降低仔猪出生弱仔率的药物为注射 剂。 4.根据权利要求3所述的用途， 其特征在于： 所述降低仔猪出生弱仔率的药物为肌肉注 射剂。 5.根据权利要求1所述的用途， 其特征在于： 所述降低仔猪出生弱仔率的药物为孕猪注 射药物。 6.根据权利要求5所述的用途， 其特征在于： 所述孕猪为怀孕60-80天的母猪。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105617404 A 2 GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及畜牧养殖领域， 尤其涉及GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的 药物中的用途。 背景技术 0002 猪肉是我国。
4、肉类消费的主要来源， 占肉类消费的65。 2014年， 我国猪肉产量达 5671万吨， 占居世界第一位。 因此， 生猪生产直接关系到国计民生， 有 “猪粮安天下” 之说。 0003 现代养猪业生产中， 我国的生猪养殖生产水平较低， 特别是母猪的生产水平更为 突出， 导致生产养殖成本和资源消耗增加， 直接影响生猪养殖的经济效益和健康发展， 因此 开展提高母猪生产力的工作具有十分重要的意义。 我国每头母猪每年提供的上市猪的数量 仅为17-18头左右， 远远低于国外的26-28头的水平， 成为制约我国生猪养殖生产水平的主 要因素。 0004 当前， 困扰着母猪生产水平发展的问题主要是弱仔问题。 有资。
5、料表明， 我国猪弱仔 的发生率在15-20。 造成弱仔的因素很多， 包括疾病、 营养、 胎盘效率、 管理和环境气候因 素等。 实际生产中， 人们较多关心的是疾病因素， 而对妊娠期子宫胎盘的发育及激素水平的 研究方面， 即宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)缺乏足够的认识和 重视。 胎盘能分泌多种激素， 如包括绒毛膜促性腺激素、 绒毛膜生长激素(胎盘催乳激素)、 绒毛膜促甲状腺激素、 雌激素和孕激素等， 对于胎儿生长发育有重要的作用。 通常胎儿初生 重的2/3部分在母猪妊娠后期的1/3的时段内发育形成， 特别是妊娠1314周至分娩前是胎 儿生长。
6、发育最快的阶段， 同时也是胎儿体能储备的关键时期。 若母猪在妊娠期胎盘功能不 足， 则胎儿在母猪体内发育不良， 出生体重小， 生长缓慢， 死亡率高， 造成弱仔等无效仔猪比 例偏大。 因此， 胎盘的功能直接关系到的胎猪在子宫里的正常发育和生长。 0005 哺乳动物的生长发育由一系列复杂的神经内分泌免疫调节系统调控， 它起源于下 丘脑。 而下丘脑分泌两种对于脑垂体细胞很重要的肽类： 促生长激素释放激素GRF和生长抑 素SST。 GRF作用于脑垂体促进生长激素GH的分泌， 从而增加肝脏和其他组织中胰岛素样生 长因子类IGF-1的生成， 而GH在肝脏以IGF-1的形式促进机体新陈代谢。 动物在生长过程。
7、中， 动物神经内分泌生长轴各因子(激素、 受体、 结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着 关键的作用。 整个过程的调控复杂， 存在着基因的转录、 表达、 产物的修饰以及各水平的反 馈调节机制。 0006 1962年Frantz等发现猪的下丘脑含有刺激生长激素分泌的物质存在， 1964年Due 等用纯化或部分纯化的下丘脑浸出液加入鼠垂体培养液中， 能提高生长激素的分泌量。 1971年Schally等从猪下丘脑浸出液和垂体门静脉血中分离出一种10肽， 可刺激GH的分泌。 1982年， Guillemin、 River先后分别报道了胰岛细胞肿瘤及类癌患者有典型肢端肥大症， 且 临床表现中GH明显升。
8、高而无垂体病变， 并由肿瘤组织中成功地提取和纯化了具有刺激GH分 泌活性的肽及其降解产物， 确定了其一级结构， 其中分子量最大， 具有代表性的为44肽， 称 为人胰生长激素释放因子(Human pancreatic growth hormone releasing factor, 说 明 书 1/5 页 3 CN 105617404 A 3 hpGRF)。 另外还发现了其降解产物， 包括hpGRF1-43、 hpGRF1-40、 hpGRF1-39、 hpGRF1-37、 hpGRF1-32、 hpGRF1-29等。 以后的研究证明， hpGRF和下丘脑合成的GRF结构完全一致， 其成 熟形式。
9、为GRF144NH2。 随着分离纯化GRF方法的不断改进， 相继从不同动物的下丘脑中 分离到各种GRF， 包括猪、 牛、 山羊和绵羊、 鼠的GRF。 随着科学技术的发展， 已能应用多肽合 成和基因工程技术生产GRF， 使对GRF的研究进入了新的阶段。 发明内容 0007 有鉴于此， 有必要针对仔猪出生时弱仔率较高、 母猪生产水平较低的问题， 本发明 提供GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途。 0008 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 0009 GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途。 0010 优选地， 所述GRF表达质粒为pVAX1-GRF质粒。 。
10、0011 优选地， 所述降低仔猪出生弱仔率的药物为注射剂。 0012 优选地， 所述降低仔猪出生弱仔率的药物为肌肉注射剂。 0013 优选地， 所述降低仔猪出生弱仔率的药物为孕猪注射药物。 0014 优选地， 所述孕猪为怀孕60-80天的母猪。 0015 优选地， 所述pVAX1-GRF质粒的注射剂量为18mg/头。 0016 优选地， 所述pVAX1-GRF质粒的注射剂量为4mg/头。 0017 一种降低仔猪出生弱仔率的方法， 将GRF表达质粒注射入孕猪肌肉组织中， 经基因 转移后， 测定母猪产仔弱仔率的变化。 0018 优选地， 所述基因转移利用体外基因转移仪进行， 基因转移的电压为204。
11、0V， 脉 冲频率为49Hz， 脉冲脉宽为10100ms。 使用电转移技术增强了质粒的转移， 从而可以使 注射部位的肌肉成为一个生物反应器， 用来持久产生和分泌蛋白质到血液循环系统中。 相 比于用腺病毒介导的基因转移， 在一次注射后电转移可以使蛋白质的表达水平量增加至少 23个以上数量级， 并有可能达到生理所需的水平。 0019 优选地， 所述降低仔猪出生弱仔率的方法包括以下步骤： 0020 S1.对怀孕6080天的母猪后肢肌肉注射pVAX1-GRF质粒， 注射剂量为18mg/头； 0021 S2.经体外基因转移仪处理， 基因转移的电压为2040V， 脉冲频率49Hz， 脉冲脉 宽10100m。
12、s； 0022 S3.于妊娠母猪产仔后检测仔猪的出生重。 0023 更优选地， 所述基因转移的电压为32V， 脉冲频率为8Hz， 脉冲脉宽为100ms。 0024 肌肉组织可以表达外源的基因， 但表达效率很低， 难于达到明显的作用。 所以， 为 了使肌肉组织高效表达外源基因， 采用提高肌肉组织表达效率的措施十分重要。 SP启动子 是根据骨骼肌 -actin启动子能在肌肉组织中特异性启动外源基因表达的这一特性， 将骨 骼肌 -actin启动子加以改造， 将E-box、 MEF-2、 TEF-1和SRE序列随意组合所构建的合成启 动子重组库中筛选出的一种人工合成启动子， 其在肌肉组织中的转录能力远。
13、远超过天然肌 肉特异启动子和病毒启动子。 电穿孔介导转移外源基因的方法是依据细胞生物学和免疫学 等理论， 采用微电子及计算机技术， 通过设计特定的控制电路产生合适的脉冲电流， 瞬间改 变靶细胞的通透性， 促进DNA、 RNA等核酸及蛋白、 化学小分子物质快速进入细胞， 提高转染 说 明 书 2/5 页 4 CN 105617404 A 4 率、 增强药物作用、 增加表达量的效果。 使用电穿孔技术增强了质粒的转移， 从而可以使注 射部位的肌肉成为一个生物反应器， 用来持久产生和分泌蛋白质到血液循环系统中。 在一 次注射后电穿孔转移， 相比于用腺病毒介导的基因转移， 这种方法可以使蛋白质的表达水 。
14、平量增加至少2-3个以上数量级， 并有可能达到生理所需的水平。 本发明通过启动子的优化 及电转移的方法， 可以使外源基因在肌肉组织中的表达效率大大提高。 0025 与现有技术相比， 本发明的有益效果： 0026 本发明利用肌肉特异性表达pVAX1-GRF质粒的特性， 并通过注射特定剂量的质粒 和特定条件下的体外基因转移， 使pVAX1-GRF质粒在母猪肌肉组织中高效表达， 进而促进胎 儿的发育， 降低了出生仔猪的弱仔率， 最终达到提高养猪业经济效益的目的， 具有巨大的实 际应用价值。 附图说明 0027 图1为pVAX1-GRF质粒图谱。 具体实施方式 0028 为了更好的说明本发明， 下面结。
15、合附图和具体实施方式做进一步说明。 本发明中 所用试剂或仪器均可由市场购得， 使用的检测方法等都是本领域所熟知的， 在此不再赘述。 0029 本发明中使用的GRF表达质粒为pVAX1-GRF质粒， 其图谱如图1所示， 通过以下方法 制备： 0030 (1)称取的工程菌(大肠杆菌DH5 ， pVAX1-GRF质粒转化菌)菌体10g， 重悬于50mL溶 液N(50mmol/L Tris， 10mmol/L EDTA， RNaseA 40 g/mL， pH8.1)中。 然后添加50mL溶液O (0.12mol/L NaOH， 1十二烷基磺酸钠(SDS)， 于室温下对菌体裂解510min。 使用20m。
16、L 3mol/L的醋酸钾溶液， 于4中和裂解液20min。 然后将裂解液以5572r/min(8000g)离心 15min， 取上清液； 将上清液经过0.145/0.122 m囊式过滤器过滤。 0031 (2)将装填好的210mL离子交换色谱柱(215cm116cm)接入Biologic色谱系统。 部 分澄清液体加入1/20体积含20的Triton溶液(750mmol/L NaCl， 50mmol/L Tris， 20 Triton X-100或Triton X-114， pH7.10)， 稍作搅拌混合后， 于4静止1h， 然后进行色谱纯 化得到实验组样品。 0032 实验组样品色谱纯化方法：。
17、 用0 .13mol/L NaOH清洗色谱柱， 用3倍柱体积含 500mmol/L NaCl、 50mmol/L Tris、 15(体积分数)异丙醇和0.115(体积分数)非离子表 面活性剂的缓冲液(pH7.10)平衡色谱柱， 将处理好的样品置于冰水浴中(04)用蠕动泵 进行上样， 保持温度为1013。 然后用含625mmol/L NaCl、 50mmol/L Tris和15异丙醇 的缓冲液(pH7.10)淋洗色谱柱至基线平稳。 接着用含1.125mol/L NaCl、 50mmol/LTris和 15(体积分数)异丙醇的缓冲液(pH8.15)进行洗脱， 线性流速为120cm/h， 按照254。
18、nm紫外 吸收曲线分峰收集。 将洗脱液收集入离心管中， 加入等体积的异丙醇沉淀质粒。 0033 对照组样品不进行非离子表面活性剂处理， 而且用于平衡色谱柱的缓冲液中不添 加非离子表面活性剂， 其他色谱纯化条件同实验组相同。 0034 将异丙醇沉淀获得的质粒用75-80乙醇浸泡60min灭菌， 无菌生理盐水洗涤4次， 再用无菌生理盐水悬浮质粒， 调节至适当浓度。 说 明 书 3/5 页 5 CN 105617404 A 5 0035 实施例1 0036 将30头怀孕60天的母猪(大白猪)随机分成2组， 第一组注射生理盐水1mL， 第二组 注射浓度为2mg/mL的质粒1mL， 注射部位为后肢肌肉。。
19、 后经体外基因转移仪处理， 转移电压 为32V， 脉冲频率7Hz， 脉冲脉宽100ms； 于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重， 按800克为标准 计算弱仔数及弱仔率， 结果第二组出生体重比第一组提高86克/头仔猪(P0.05)， 弱仔率降 低6.9(P0.05)。 0037 实施例2 0038 将30头怀孕60天的母猪(大白猪)随机分成2组， 第一组注射生理盐水1mL， 第二组 注射浓度为2mg/mL的质粒1mL， 注射部位为后肢肌肉。 后经体外基因转移仪处理， 转移电压 为30V， 脉冲频率5Hz， 脉冲脉宽50ms； 于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重， 按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率， 结。
20、果第二组出生体重比第一组提高82克/头仔猪(P0.05)， 弱仔率降低 5.9(P0.05)。 0039 实施例3 0040 将20头怀孕75天的母猪(长白猪)随机分成2组， 第一组注射生理盐水1mL， 第二组 注射浓度为3mg/mL的质粒1mL， 注射部位为后肢肌肉。 后经体外基因转移仪处理， 转移电压 为36V， 脉冲频率5Hz， 脉冲脉宽40ms； 于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重， 按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率， 结果第二组出生体重比第一组提高98克/头仔猪(P0.05)， 弱仔率降低 7.8(P0.05)。 0041 实施例4 0042 将30头怀孕80天的母猪(大白猪)随机分。
21、成2组， 第一组注射生理盐水1mL， 第二组 注射浓度为3mg/mL的质粒1mL， 注射部位为后肢肌肉。 后经体外基因转移仪处理， 转移电压 为30V， 脉冲频率5Hz， 脉冲脉宽90ms； 于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重， 按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率， 结果第二组出生体重比第一组提高92克/头仔猪(P0.05)， 弱仔率降低 6.6(P0.05)。 0043 实施例5 0044 将30头怀孕60天的母猪(大白猪)随机分成2组， 第一组注射生理盐水1mL， 第二组 注射浓度为4mg/mL的质粒1mL， 注射部位为后肢肌肉。 后经体外基因转移仪处理， 转移电压 为30V， 脉冲频率6H。
22、z， 脉冲脉宽80ms； 于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重， 按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率， 结果第二组出生体重比第一组提高99克/头仔猪(P0.05)， 弱仔率降低 7.2(P0.05)。 0045 由实施例1-5可知， 将pVAX1-GRF质粒注射入孕猪肌肉中， 经基因转移后， 可以明显 提高出生仔猪的体重， 降低出生仔猪的弱仔率， 详细结果如表1所示。 0046 表1、 各实施例中出生仔猪体重及弱仔率统计表 说 明 书 4/5 页 6 CN 105617404 A 6 0047 0048 注： 在计算弱仔率时， 仔猪的总数和计算平均体重时仔猪的总数相同。 0049 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105617404 A 7 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 105617404 A 8 。