技术领域
本发明属于抗生素提取技术领域，特别是涉及一种多拉菌素无菌溶液的制备方法。
背景技术
多拉菌素是由基因重组的阿维链霉菌新菌株通过添加环已氨羧酸为前体物质发酵而成的一种阿维菌素类抗生素，属于第三代阿维菌类药物。
现有技术中，多拉霉素的提取是采用有机醇浸提结合离子交换技术或有机醇浸提结合层析技术提取纯化多拉菌素发酵液，得到其成品，其存在的主要问题是：
1提取收率低。平均提取收率仅在70%左右。
2未对多拉菌素发酵液进行预处理，湿菌渣中水分含量超过了60%，直接使用有机溶剂进行浸提，导致溶液体积增大，增加了下游工序的处理难度。
3生产工艺较为复杂，生产周期长。
4生产成本较高，对比同类产品，市场竞争力较弱。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中的缺陷，提供一种有效提高提取收率，工艺简单，生产周期短，且降低后续工艺处理难度的多拉菌素无菌溶液的制备方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种多拉菌素无菌溶液的制备方法，其特征在于其工艺过程为：首先将以突变阿维链霉菌为菌种发酵生产的多拉菌素发酵液进行预处理，经闪蒸干燥后得到的干菌渣用有机溶剂A浸提，降温并加入纯化水析出，过滤后所得的多拉菌素粗品用有机溶剂B溶解，超滤，结晶，再次过滤后所得的得到固体多拉菌素用有机溶剂B溶解，微滤即可得到多拉菌素无菌溶液；
所述预处理过程为：首先，将多拉菌素发酵液用酸性溶液调pH2～3，搅拌10～20min后过滤，所得湿菌渣用水稀释，继续搅拌10～20min，再次过滤，所得湿菌渣用水稀释后用碱性溶液调pH9-10，再次搅拌20-40min，静置80-100min，板框过滤即可；
所述有机溶剂A为甲醇或乙醇或丁醇或异丁醇或丙酮；
所述有机溶剂B为药用甘油或PEG400。
所述酸性溶液为质量浓度为20-30%的盐酸或硫酸溶液，碱性溶液为质量浓度为30-40%的氨水或氢氧化钠溶液。
所述闪蒸干燥使用闪蒸干燥机干燥至菌渣水分含量低于5%，控制进风温度100～120℃，出风温度70～90℃，加料转速为50～400r/min。
所述干菌渣用有机溶剂A浸提两次，第一次浸提按照每1kg干菌渣加入4-5L有机溶剂A，第二次按照每1kg干菌渣加入2-2.5L有机溶剂A，每次浸提时间100-150min。
所述降温并加入纯化水析出过程为：将有机溶剂浸提液降温至0-5℃，加入其体积的4.5-5倍纯化水，静置150-190min，过滤，得到多拉菌素粗品。
所述多拉菌素粗品或固体多拉菌素溶解在有机溶剂B中，控制其质量浓度20-30%。
所述超滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa，超滤膜的材质为偏氟乙烯，孔径为100nm。
所述结晶过程为：在搅拌状态下，将超滤所得的多拉菌素超滤液降温至-10-0℃，降温速度控制在2-3℃/h，出现结晶现象时，加入晶种多拉菌素，用量为多拉菌素超滤液体积的0.1-0.3%，继续搅拌60-100min，然后养晶180-200min，过滤即可得到固体多拉菌素。
所述微滤采用膜过滤设备，该设备分别安装有规格为0.45um和0.22um的滤芯，过滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa,过滤结束，收集滤液，得到无菌多拉菌素溶液。
所述预处理过程为：第一次稀释所用纯化水用量为发酵液体积的20-30%，第二次稀释所用纯化水用量为发酵液体积的40-50%。
本发明的技术优势体现在：
1提取收率较高，达到了85%以上。
2本发明采用过滤技术代替离子交换和层析技术，降低生产工艺的难度，缩短了生产周期。
3本发明首先对发酵液进行了预处理，从而降低了后续工艺的处理难度（原因：多拉菌素发酵液经预处理后，可以去除大部分不溶性颗粒，不溶性颗粒占到杂质总量的80%以上）。
4多拉菌素临床应用的制剂主要是注射剂。按照国外兽药多拉菌素注射液质量标准，本发明提供了一种制备多拉菌素无菌溶液的方法，通过该方法得到的多拉菌素溶液进行配伍，其溶液质量符合质量标准。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例中的发酵液来源：
采用二级发酵模式生产多拉菌素，其生产菌种为突变阿维链霉菌，多拉菌素发酵培养基种子配方为玉米淀粉,黄豆饼粉,葡萄糖,棉籽饼粉，发酵培养基配方为玉米淀粉,黄豆饼粉,酵母粉,氯化钠,磷酸氢二钾,硫酸镁,碳酸钙,淀粉酶,前体环己甲酸。多拉菌素发酵温度为28℃,发酵周期为11天，发酵单位一般在1200mg/L。
超滤膜的材质为偏氟乙烯，孔径为100nm。
微滤中使用的滤芯由密理博中国有限公司提供膜过滤设备，该设备分别安装有规格为0.45um和0.22um的滤芯，过滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。
所述晶种为无菌原料药多拉菌素。
实施例1
多拉菌素发酵液10m3，效价为1324mg/L。
发酵液预处理：首先，用20%盐酸溶液将发酵液pH调至2，搅拌10min，过滤后得到湿菌渣。然后，在该湿菌渣中加入纯化水2m3，搅拌10min，再次过滤。最后，在再次过滤所得的湿菌渣中加入纯化水4m3，用30%的氨水溶液调节pH至9，搅拌20min，然后静置80min。静置结束后将发酵液进行板框过滤，得到多拉菌素湿菌渣。
闪蒸干燥：使用闪蒸干燥机，控制进风温度100～120℃，出风温度70～90℃，加料转速为50～400r/min。闪蒸干燥结束，得到多拉菌素干菌渣756kg，其中水分含量为4.1%。
有机溶剂A浸提：第一次浸提，加入甲醇3050L；第二次浸提，加入甲醇1550L，合并两次浸提液。
降温并加入纯化水析出：浸提液降温温度降至0℃，加入纯化水20700L，静置150-180min。静置结束后过滤，得到多拉菌素粗品12.5kg。
溶解：将多拉菌素粗品溶解在药用甘油中，浓度控制在20%。
超滤：超滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。超滤结束，收集滤液62L。
结晶：在搅拌状态下，将多拉菌素超滤液降温至-10℃，降温速度控制在2-3℃/h。出现结晶现象时，加入晶种62g。继续搅拌60min，然后养晶180min。养晶结束后过滤，得到固体多拉菌素11.4kg。
溶解：将固体多拉菌素溶解在药用甘油中，浓度控制在20%。
微滤：将多拉菌素溶液采用膜过滤设备过微滤，该设备分别安装有规格为0.45um和0.22um的滤芯。过滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。过滤结束，收集滤液，得到20%无菌多拉菌素溶液。
提取总收率：85.6%。
实施例2
多拉菌素发酵10m3，效价为1296mg/L。
发酵液预处理：首先，用23%硫酸溶液将发酵液pH调至2.3，搅拌13min，过滤后得到湿菌渣。其次，在该湿菌渣中加入纯化水2.3m3，搅拌13min，再次过滤；最后，在再次过滤所得湿菌渣中加入纯化水4.2m3，用33%的氢氧化钠溶液调节多拉菌素发酵液pH至9.3，搅拌25min，然后静置85min。静置结束后将发酵液进行板框过滤，得到多拉菌素湿菌渣。
闪蒸干燥：使用闪蒸干燥机，控制进风温度100～120℃，出风温度70～90℃，加料转速为50～400r/min。闪蒸干燥结束，得到多拉菌素干菌渣731kg，其中水分含量为4.0%。
有机溶剂浸提：第一次浸提，加入甲醇3080L；第二次浸提，加入甲醇1535L，合并两次浸提液。
降温并加入纯化水析出：将有机溶剂浸提液温度降至1℃，加入纯化水21300L，静置160min。静置结束后过滤，得到多拉菌素粗品12.2kg。
溶解：将多拉菌素粗品溶解在PEG400中，浓度控制在22%。
超滤：超滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。超滤结束，收集滤液55.3L。
结晶：在搅拌状态下，将多拉菌素超滤液降温至-8℃，降温速度控制在2-3℃/h。出现结晶现象时，加入晶种83g。继续搅拌70min，然后养晶185min。养晶结束后过滤，得到固体多拉菌素11.29kg。
溶解：将固体多拉菌素溶解在PEG400中，浓度控制在23%。
微滤：将多拉菌素溶液用膜过滤设备微滤，该设备分别安装有规格为0.45um和0.22um的滤芯。过滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。过滤结束，收集滤液，得到23%无菌多拉菌素溶液。
提取总收率：86.5%。
实施例3
多拉菌素发酵10m3，效价为1247mg/L。
发酵液预处理：首先，用25%盐酸溶液将发酵液pH调至2.5，搅拌15min，过滤后得到湿菌渣。其次，在该湿菌渣中加入纯化水2.5m3，搅拌15min，再次过滤；最后，在再次过滤所得湿菌渣中加入纯化水4.5m3，用35%的氨水溶液调节多拉菌素发酵液pH至9.5，搅拌30min，然后静置90min。静置结束后将发酵液进行板框过滤，得到多拉菌素湿菌渣。
闪蒸干燥：使用闪蒸干燥机，控制进风温度100～120℃，出风温度70～90℃，加料转速为50～400r/min。闪蒸干燥结束，得到多拉菌素干菌渣747kg，其中水分含量为3.9%。
有机溶剂浸提：第一次浸提，加入甲醇3365L；第二次浸提，加入甲醇1718L，合并两次浸提液。
降温并加入纯化水析出：将有机溶剂浸提液降温降至3℃，加入纯化水23890L，静置170min。静置结束后过滤，得到多拉菌素粗品12kg。
溶解：将多拉菌素粗品溶解在药用甘油中，浓度控制在25%。
超滤：超滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。超滤结束，收集滤液48L。
结晶：搅拌过程中，将多拉菌素超滤液降温至-5℃，降温速度控制在2-3℃/h。出现结晶现象时，加入晶种96g。继续搅拌80min，然后养晶190min。养晶结束后过滤，得到固体多拉菌素10.86kg。
溶解：多拉菌素固体溶解在药用甘油中，浓度控制在25%。
微滤：将多拉菌素溶液膜过滤设备，该设备分别安装有规格为0.45um和0.22um的滤芯。过滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。过滤结束，收集滤液，得到25%无菌多拉菌素溶液。
提取总收率：87.1%。
实施例4
多拉菌素发酵10m3，效价为1301mg/L。
发酵液预处理：首先，用28%盐酸溶液将发酵液pH调至2.7，搅拌18min，过滤后得到湿菌渣。其次，在该湿菌渣中加入纯化水2.7m3，搅拌18min，再次过滤；最后，在再次过滤所得湿菌渣中加入纯化水4.7m3，用38%的氢氧化钠溶液调节多拉菌素发酵液pH至9.7，搅拌35min，然后静置95min。静置结束后将发酵液进行板框过滤，得到多拉菌素湿菌渣。
闪蒸干燥：使用闪蒸干燥机，控制进风温度100～120℃，出风温度70～90℃，加料转速为50～400r/min。闪蒸干燥结束，得到多拉菌素干菌渣750kg，其中水分含量为3.9%。
有机溶剂浸提：第一次浸提，加入甲醇3525L；第二次浸提，加入甲醇1800L，合并两次浸提液。
降温并加入纯化水析出：将有机溶剂浸提液温度降至4℃，加入纯化水23890L，静置170min。静置结束后过滤，得到多拉菌素粗品12.21kg。
溶解：多拉菌素粗品溶解在PEG400中，浓度控制在28%。
超滤：超滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。超滤结束，收集滤液43.6L。
结晶：在搅拌状态下，将多拉菌素超滤液降温至-3℃，降温速度控制在2-3℃/h。出现结晶现象时，加入晶种110g。继续搅拌90min，然后养晶195min。养晶结束后过滤，得到固体多拉菌素11.28kg。
溶解：多拉菌素固体溶解在PEG400中，浓度控制在28%。
微滤：将多拉菌素溶液膜过滤设备，该设备分别安装有规格为0.45um和0.22um的滤芯。过滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。过滤结束，收集滤液，得到28%无菌多拉菌素溶液。
提取总收率：86.7%。
实施例5
多拉菌素发酵10m3，效价为1290mg/L。
发酵液预处理：首先，用30%硫酸溶液将发酵液pH调至3，搅拌20min，过滤后得到湿菌渣。其次，湿菌渣中加入纯化水3m3，搅拌18min，再次过滤；最后，湿菌渣中加入纯化水5m3，用40%的氨水溶液调节多拉菌素发酵液pH至10，搅拌40min，然后静置100min。静置结束后将发酵液进行板框过滤，得到多拉菌素湿菌渣。
闪蒸干燥：使用闪蒸干燥机，控制进风温度100～120℃，出风温度70～90℃，加料转速为50～400r/min。闪蒸干燥结束，得到多拉菌素干菌渣753kg，其中水分含量为4.0%。
有机溶剂浸提：第一次浸提，加入甲醇3765L；第二次浸提，加入甲醇1882L，合并两次浸提液。
降温并加入纯化水析出：将有机溶剂浸提液温度降至5℃，加入纯化水28237L，静置180min。静置结束后过滤，得到多拉菌素粗品12.12kg。
溶解：多拉菌素粗品溶解在药用甘油中，浓度控制在30%。
超滤：超滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。超滤结束，收集滤液40.4L。
结晶：在搅拌状态下，将多拉菌素超滤液降温至0℃，降温速度控制在2-3℃/h。出现结晶现象时，加入晶种120g。继续搅拌100min，然后养晶200min。养晶结束后过滤，得到固体多拉菌素11.13kg。
溶解：多拉菌素固体溶解在药用甘油中，浓度控制在30%。
微滤：将多拉菌素溶液膜过滤设备，该设备分别安装有规格为0.45um和0.22um的滤芯。过滤过程中，压力控制在0.2-0.3MPa。过滤结束，收集滤液，得到30%无菌多拉菌素溶液。
提取总收率：86.2%。