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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510323323.9 (22)申请日 2015.06.12 A61K 49/00(2006.01) (71)申请人 沈阳药科大学 地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路 103 号 (72)发明人 王淑君 何蕊 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 靳玲 (54) 发明名称 淋巴示踪用异硫蓝注射液及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种高效淋巴亲和性的异硫蓝 注射液及其制备方法。通过采用不同渗透压调节 剂的种类及用量， 从而达到高效淋巴引流与摄取 的作用。其中， 所述的渗透压调节剂为。
2、氯化钠、 葡 萄糖中的一种或其组合物。优点是 ： 克服水溶性 染料在临床肿瘤前哨淋巴定位术皮下注射后在组 织间隙弥散、 淋巴摄取率低、 染色效果差的缺陷， 可准确定位淋巴结， 无需其它辅助设备， 无放射 性、 简便、 直观， 即可达到淋巴示踪的目的， 是一种 极具开发前景及临床应用价值的技术方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 106267240 A 2017.01.04 CN 106267240 A 1/1 页 2 1.一种淋巴示踪用异硫蓝注射液， 其特征在于， 每 1000ml 异硫蓝注射液。
3、， 其处方组成 为 ： 异硫蓝 5-20g pH 调节剂 0.2%1.0% 渗透压调节剂 0.25%15.0% 注射用水 加至 1000ml。 2.根据权利要求 1 所述的淋巴示踪用异硫蓝注射液， 其特征在于 ： 所述 pH 调节剂为磷 酸氢二钠、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾中的一种或几种， 其中优选磷酸氢二钠、 磷 酸二氢钾中的一种或几种， 磷酸氢二钠用量为 0.2% 1.0%（g/mL） ， 优选为 0.5% 0.8% （g/mL） ； 磷酸二氢钾用量为 0.2% 0.6%（g/mL） ， 优选为 0.2% 0.4%（g/mL） ， 混合比例为 磷酸氢二钠 ： 磷酸二氢钾 =1。
4、:1 5:1， 优选 1:1 3:1， 最佳 2.44:1。 3.根据权利要求 1 或 2 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述渗透压调节剂为氯化钠、 葡萄糖、 PEG、 甘露醇中的一种或几种， 其中优选氯化钠、 葡萄糖中的一种或几种， 其用量为 氯化钠 0.25% 4.0%（g/mL） ， 优选为 1.2% 2.8%（g/mL） ， 最佳为 2.0%（g/mL） ； 葡萄糖 1% 15%（g/mL） ， 优选为 5% 12%（g/mL） ， 最佳为 10%（g/mL） 。 4.根据权利要求 1 所述的淋巴示踪用异硫蓝注射液的制备方法， 其特征在于， 包括以 下制备步骤 ： 1） 浓配 ： 。
5、称取处方量的 pH 调节剂和渗透压调节剂， 加入处方量 80% 的注射用水， 搅拌 约 15-20min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 15-20min 使溶解， 投入 0.1% 0.5% 针用 活性炭， 于 40 60（优选 50） 搅拌吸附 10 30min( 优选 20min) ； 2） 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液 ； 补加注射用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10-15min， 经 0.22m 微孔 滤膜过滤， 检验可见异物 ； 3） 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封， 121灭菌 15min， 检漏， 灯检。 。
6、5.淋巴示踪用异硫蓝注射液在制备用于描绘定位淋巴管及淋巴结的示踪术制剂中的 应用。 6.根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 所述描绘定位淋巴管及淋巴结的示踪术 选自恶性肿瘤、 淋巴水肿、 乳糜性积液。 7.根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述恶性肿瘤， 选自黑色素瘤、 乳腺癌、 胃 癌、 卵巢癌、 肠癌、 睾丸癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 甲状腺癌、 肺癌、 肝癌。 8.根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述淋巴水肿包括原发性淋巴水肿、 继发 性淋巴水肿等。 9.根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述乳糜性积液包括乳糜尿、 乳糜腹水或 乳糜胸。 权 。
7、利 要 求 书 CN 106267240 A 2 1/10 页 3 淋巴示踪用异硫蓝注射液及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于药物制剂领域， 具体涉及淋巴示踪用异硫蓝注射液及其制备方法。 背景技术 0002 恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见疾病， 全世界每年新增癌症病人为 800 万， 世界卫生组织国际癌症研究中心日前公布的一份研究报告称， 根据目前癌症的发病趋势， 2020 年全世界癌症发病率将比现在增加 50， 全球每年新增癌症患者人数将达到 1500 万 人。前哨淋巴结 (SLN) 是最先接受肿瘤区域淋巴引流并最先发生肿瘤转移的第一站淋巴 结。 如果前哨淋巴结无转移， 该区域其他。
8、淋巴结发生转移的可能性很小， 此时可缩小手术范 围。 反之如果前哨淋巴结已发生肿瘤转移， 则癌细胞可能已发生扩散， 此时则需要扩大手术 全面清扫。有研究表明， 前哨淋巴结发生 “跳跃” 转移的可能性微乎其微。因此， 可通过前 哨淋巴结状态来反映该区域淋巴结状态。 准确判断前哨淋巴结转台是诊断肿瘤是否扩散和 制定治疗方案的重要依据。与传统淋巴结清扫术相比， 前哨淋巴结活检 (SLNB) 是通过一定 的技术手段对前哨淋巴结进行定位， 再以微侵入的方式将其取出进行活检， 从而判断该区 域淋巴结状态。 该技术可避免手术不必要的扩大， 减少病人痛苦， 是肿瘤外科上的一个重大 突破。 0003 然而肿瘤区。
9、域淋巴结通常隐匿在结缔组织中， 与周围重要的管道系统和器官关系 密切， 容易造成误伤， 手术难度增加。因此， 淋巴示踪剂目前在国内外恶性肿瘤的临床治疗 中已发挥着至关重要的作用， 在原发病灶附近注射淋巴示踪剂， 可迅速将恶性肿瘤附近的 淋巴结染色。 0004 1. 使临床淋巴结的清扫与活检更安全更高效。 0005 2. 减少组织损伤， 缩短手术时间， 且达到彻底清扫淋巴结的目的。 0006 3. 对于肿瘤患者的生存期延长及预后生存质量的提高有着重要的价值。 0007 常用的前哨淋巴结活检的方法有染料法、 核素法和二者联合应用三种。核素法 因价格昂贵、 需专业仪器等原因限制了其在临床中的应用。染。
10、料法因其操作简便、 价格适 当而在临床上应用更为广泛。目前国内唯一批准上市应用于临床的淋巴示踪剂是纳米炭， 商品名为卡纳琳， 主要用于胃癌区域引流淋巴结的示踪。该制剂是使用纳米炭 ( 平均粒 径 150nm)、 聚乙烯吡咯烷酮和生理盐水制备而成的纳米混悬注射液。纳米炭示踪的基本原 理是纳米炭被巨噬细胞吞噬后不进入血管而进入淋巴管内， 并沿淋巴引流途径着色， 从而 实现淋巴系统， 特别是淋巴结的示踪作用。但不可否认的是， 纳米炭不被代谢， 进入血液和 淋巴循环有堵塞毛细管的危险， 且对于癌组织质地较硬、 脆， 直接瘤内注射可引起瘤组织坏 死、 脱落而引起出血。由于其粒径较大， 无法到达 N3、 。
11、N4 远站淋巴结及细小淋巴结， 对细微 淋巴结的清扫作用并不理想。 对于一些较为晚期的病例， 肉眼可辨的肿大淋巴结， 可能是由 于区域淋巴管已为癌细胞栓塞， 致引流受阻因而黑染并不满意。 0008 此外， 临床上常用的淋巴示踪剂还有亚甲蓝。 亚甲蓝， 又名次甲蓝， 美蓝， 为一氧化 还原剂， 根据其在体内的不同浓度， 对血红蛋白有两种不同的作用。 高浓度时可抑制氰化物 说 明 书 CN 106267240 A 3 2/10 页 4 对组织中毒的毒性。近年来， 亚甲蓝作为淋巴示踪剂已广泛应用于乳腺癌、 宫颈癌、 结直肠 癌、 胃癌、 甲状腺乳头癌等多种癌症手术治疗中。 但已有研究表明， MB在淋。
12、巴管中吸收不佳， 采用 MB 作为染料行乳腺癌前哨淋巴结活检的成功率并不一致， 有的在 90以上， 有的仅为 69 ； 由于注射液中亚甲蓝以溶解状态存在， 组织间隙及血管等被广泛染色而发生弥散现 象， 不能有效的勾勒出病灶范围， 影响手术视野观测 ； 且亚甲蓝消除迅速， 维持蓝染时间短， 不利用手术中定位寻找淋巴结。 0009 异硫蓝(Isosulfan Blue， IB)， 2， 5-二磺酸三苯甲烷单钠盐， 是一种蔷薇苯胺类染 料。化学结构式如图 1 所示 ； 0010 分子式 ： C27H31N2O6S2Na 0011 分子量 ： 561.13 0012 性状 ： 本品为蓝色或类蓝色结晶性。
13、粉末， 具有金属光泽。无臭。有引湿性。本品在 水中易溶解， 乙醇中溶解， 三氯甲烷中不溶。 0013 IB是第一个也是唯一一个被FDA批准用于淋巴管造影术的染料。 它是一种生理惰 性染料， 没有药理作用。经皮下注射后， IB 在软组织中弥散度低， 并与间质蛋白微弱结合， 选择性的与淋巴管结合， 因此淋巴管和淋巴结可被明显蓝染从而与周围组织区分开来， 具 有简便、 快捷、 直观等特点， 是国外最常用的染料示踪剂， 成功率可达到 90以上。 发明内容 0014 本发明提供了一种异硫蓝注射液的制备方法， 可增加淋巴摄取率， 提高淋巴示踪 染色效果， 减少药物进入血液循环的比例。 0015 该注射液作。
14、为优良淋巴示踪剂的优势在于 ： (1) 快速染色， 准确定位。小鼠体内试 验证明， 异硫蓝能在皮下注射 5min 内蓝染一、 二、 三级淋巴结， 10min 达最强蓝染效果 ； (2) 满足手术蓝染时间需要。小鼠实验证明， 异硫蓝在皮下注射 2h 内能维持肉眼可见蓝染状 态， 满足临床需要 ； (3) 组织间隙不弥散 ； (4) 注射部位可快速消除， 不产生蓄积和残留。 0016 异硫蓝注射液的处方为 ： 0017 0018 0019 本发明中所用到的主要辅料为 pH 调节剂和渗透压调节剂。其中， pH 调节剂为磷 酸氢二钠、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾中的一种或几种， 其中优选磷。
15、酸氢二钠、 磷 酸二氢钾中的一种或几种， 磷酸氢二钠用量为0.21.0(g/mL)， 优选为0.50.8 (g/mL) ； 磷酸二氢钾用量为 0.2 0.6 (g/mL)， 优选为 0.2 0.4 (g/mL)。混合比 例为磷酸氢二钠 ： 磷酸二氢钾 1:1 4:1， 优选 1:1 3:1， 最佳 2.44:1。 0020 所述渗透压是影响淋巴示踪效果的重要因素。淋巴管内皮细胞间的连接有重叠、 说 明 书 CN 106267240 A 4 3/10 页 5 嵌插、 端端三种方式， 重叠连接最多， 相邻的淋巴内皮细胞呈叠瓦状连接， 彼此可重叠几个 微米， 重叠连接的方式松散， 缺乏连接复合体， 。
16、从而使构成连接的两个内皮细胞在功能需要 时可相互改变位置， 形成开放连接。 淋巴内皮细胞这种非紧密连接方式可形成 “微阀” 或 “入 口阀” 的作用。因此， 当组织间隙压力过大时， 淋巴管扩张，“阀门” 因此被打开。这说明， 当 组织间隙渗透压增高时， 可提高组织液进入淋巴管的可能， 因此渗透压是影响淋巴示踪注 射液的一个重要因素。本发明使用的渗透压调节剂为氯化钠、 葡萄糖、 PEG、 甘露醇中的一 种或几种， 其中优选氯化钠、 葡萄糖中的一种或几种， 其用量为氯化钠 0.25 4.0 (g/ mL)， 优选为 1.2 2.8 (g/mL)， 最佳为 2.0 (g/mL) ； 葡萄糖 1 15。
17、 (g/mL)， 优选 为 5 12 (g/mL)， 最佳为 10 (g/mL)。从而调节渗透压约在 300-1500mmol/kg 范围 内， 优选为 600-1200mmol/kg， 最佳为 900mmol/kg。在此比例下， 可获得淋巴示踪效果更好， 且不产生局部注射刺激性的异硫蓝注射液。 0021 制备工艺如下 ： 0022 1)浓配 ： 称取处方量的磷酸盐pH调节剂和渗透压调节剂， 加入处方量80的注射 用水， 搅拌约 15-20min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 15-20min 使溶解， 投入 0.1 0.5针用活性炭， 于 40 60 ( 优选 50 ) 搅拌吸附 1。
18、0 30min( 优选 20min)。 0023 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约10-15min。 经0.22m微孔滤膜过滤， 检验 可见异物。 0024 3)灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封(110mL每支)。 121灭菌15min。 检漏， 灯检。 0025 所述异硫蓝注射液可用于描绘定位淋巴结及淋巴管的示踪术方面的应用。 包括黑 色素瘤、 乳腺癌、 胃癌、 卵巢癌、 肠癌、 睾丸癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 甲状腺癌、 肺癌、 肝癌等恶性 肿瘤 ； 原发性及继发性淋巴水肿 ； 乳糜。
19、尿、 乳糜腹水或乳糜胸等。 附图说明 0026 图 1、 异硫蓝结构式 ； 0027 图 2、 皮下注射 10min 后异硫蓝氯化钠注射液各组淋巴结染色情况 (n 5) ； 0028 图 3、 皮下注射 10min 后异硫蓝葡萄糖注射液各组淋巴结染色情况 (n 5) ； 0029 图 4、 注射脚掌病理切片 ： (A) 空白脚掌 ； (B)196mmol/kg 组 ； (C)938mmol/kg ； (D)1503mmol/kg 组。 具体实施方式 ： 0030 实施例 1 ： 异硫蓝注射液的制备 0031 1.1 处方 ： 0032 说 明 书 CN 106267240 A 5 4/10 页。
20、 6 0033 1.2 制备工艺 0034 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和氯化钠， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 40搅拌吸附 10min。 0035 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0036 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 。
21、灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 6.0， 渗透压约为 278mmol/kg。 0037 实施例 2 ： 异硫蓝注射液的制备 0038 2.1 处方 ： 0039 0040 2.2 制备工艺 0041 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和氯化钠， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 40搅拌吸附 10min。 0042 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经。
22、 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0043 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 8.0， 渗透压约为 346mmol/kg。 0044 实施例 3 ： 异硫蓝注射液的制备 0045 3.1 处方 ： 0046 说 明 书 CN 106267240 A 6 5/10 页 7 0047 3.2 制备工艺 0048 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和氯化钠， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min。
23、 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 50搅拌吸附 20min。 0049 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0050 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 7.2， 渗透压约为 307mmol/kg。 0051 实施例 4 ： 异硫蓝注射液的制备 0052 4.1 试验方法 0053 取 KM 小鼠 15 只 ( 体重 2。
24、02g)， 随机分为 3 组， 分别给予剂量为 4mg/kg 实施例 1 所制异硫蓝注射液 (278mmol/kg)、 实施例 2 所制异硫蓝注射液 (346mmol/kg)、 实施例 3 所 制异硫蓝氯化钠注射液 (307mmol/kg)， 于给药后 10min 处死小鼠取各级淋巴结， 拍照并评 分记录。评分标准如下 (0-10 分 ) ： 0054 0 分 - 淋巴结颜色无改变 ； 0055 2 分 - 可见淋巴结轻微蓝染或呈轻微蓝绿色半透明状改变 ； 0056 4 分 - 可见淋巴结轻度蓝染或呈蓝绿色半透明状改变 ； 0057 6 分 - 可见淋巴结中度蓝染 ； 0058 8 分 - 可。
25、见淋巴结明显蓝染 ； 0059 10 分 - 可见整个淋巴结深度蓝染， 呈深蓝色甚至黑色。 0060 染色只要达到 4 分以上即可判为淋巴示踪阳性。 0061 4.2 试验结果 0062 由淋巴结蓝染数量及蓝染程度作为评价指标， 实施例 1、 实施例 2 及实施例 3 各组 淋巴结蓝染效果无显著差别。因此， pH 在 6.0-8.0 范围内的变化对异硫蓝淋巴摄取能力无 影响。综述所述， 选择最佳 pH 调节剂比例磷酸氢二钠 ： 磷酸二氢钾 0.66 ： 0.27为下 述实施例 pH 调节剂用量。 0063 实施例 5 ： 异硫蓝注射液的制备 0064 5.1 处方 ： 0065 说 明 书 C。
26、N 106267240 A 7 6/10 页 8 0066 5.2 制备工艺 0067 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和氯化钠， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 50搅拌吸附 20min。 0068 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0069 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 。
27、每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 7.2， 渗透压约为 938mmol/kg。 0070 实施例 6 ： 异硫蓝注射液的制备 0071 6.1 处方 ： 0072 0073 0074 6.2 制备工艺 0075 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和氯化钠， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 50搅拌吸附 20min。 0076 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至。
28、稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0077 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 7.2， 渗透压约为 1503mmol/kg。 0078 实施例 7 ： 异硫蓝注射液的制备 0079 7.1 处方 ： 0080 说 明 书 CN 106267240 A 8 7/10 页 9 0081 7.2 制备工艺 0082 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和葡萄糖， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15。
29、min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 60搅拌吸附 30min。 0083 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0084 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 7.2， 渗透压约为 298mmol/kg。 0085 实施例 8 ： 异硫蓝注射液的制备 0086 8.1 处。
30、方 ： 0087 0088 8.2 制备工艺 0089 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和葡萄糖， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 60搅拌吸附 30min。 0090 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0091 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。
31、。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 7.2， 渗透压约为 911mmol/kg。 0092 实施例 9 ： 异硫蓝注射液的制备 0093 9.1 处方 ： 0094 说 明 书 CN 106267240 A 9 8/10 页 10 0095 9.2 制备工艺 0096 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾和葡萄糖， 加入处方量 80的注 射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 20min 使溶解， 投入 0.1针用活 性炭， 于 60搅拌吸附 30min。 0097 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并。
32、冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0098 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 7.2， 渗透压约为 1487mmol/kg。 0099 实施例 10 ： 异硫蓝注射液的制备 0100 10.1 处方 ： 0101 0102 10.2 制备工艺 0103 1) 浓配 ： 称取处方量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾， 加入处方量 80的注射用水， 搅拌约 15min 使溶解， 再加入处方量药物， 搅拌约 。
33、20min 使溶解， 投入 0.1针用活性炭， 于 60搅拌吸附 30min。 0104 2) 稀配 ： 浓配液经 3m 炭棒过滤后转至稀配罐中， 冲洗并合并冲洗液。补加注射 用水至稀配罐内药液体积达到规定量后， 搅拌约 10min。经 0.22m 微孔滤膜过滤， 检验可 见异物。 0105 3) 灭菌 ： 可见异物检验合格的药液充氮、 灌封 (5ml 每支 )。121灭菌 15min。检 漏， 灯检。经测定， 所得注射液 pH 约为 7.2， 渗透压约为 196mmol/kg。 0106 实施例 11 ： 异硫蓝注射液小鼠淋巴摄取研究 0107 11.1 不同渗透压淋巴示踪能力考察 0108。
34、 1) 试验方法 0109 取 KM 小鼠 35 只 ( 体重 202g)， 随机分为 7 组， 分别给予剂量为 4mg/kg 实施例 3 所制异硫蓝氯化钠注射液 (307mmol/kg)、 实施例 5 所制异硫蓝氯化钠注射液 (938mmol/ kg)、 实施例6所制异硫蓝氯化钠注射液(1503mmol/kg)、 实施例7所制异硫蓝葡萄糖注射液 说 明 书 CN 106267240 A 10 9/10 页 11 (298mmol/kg)、 实施例8所制异硫蓝葡萄糖注射液(911mmol/kg)、 实施例9所制异硫蓝葡萄 糖注射液 (1487mmol/kg)、 实施例 10 所制异硫蓝注射液 。
35、(196mmol/kg)， 于给药后 10min 处 死小鼠取各级淋巴结， 拍照并评分记录。 0110 2) 试验结果 0111 (1)淋巴结检出情况 ： 不同渗透压异硫蓝示踪剂小鼠淋巴结检出情况见表1。 小鼠 淋巴结染色效果图见图2、 图3。 由表中结果可以看出， 在各组中一级淋巴结均可被100检 测到 ； 二级淋巴结中， 渗透压低组检出率低， 渗透压高组检出率高 ； 三级淋巴结中， 淋巴结 检出率随渗透压增高而提高这一现象则更加明显。 0112 表 1 皮下注射 10min 后各级淋巴结检出率 (n 5) 0113 样品实施例 10 实施例 3实施例 5实施例 6实施例 7实施例 8实施例。
36、 9 一级淋巴结100100100100100100100 二级淋巴结408010010060100100 三级淋巴结/2010010020100100 0114 / ： 未检测到蓝染淋巴结 0115 (2)淋巴结染色程度 ： 不同渗透压IB示踪剂小鼠淋巴结染色效果评分汇总见表2。 由结果可见看出， 各组中一级淋巴结染色得分均 4 分， 即各示踪剂示踪效果均呈阳性 ； 二 级淋巴结中， 低渗组染色评分均低于 4 分， 呈阴性蓝染， 其余各组染色得分均 4 分， 且随高 渗增高染色得分越高， 染色效果越好 ； 三级淋巴结中， 低渗及等渗组得分均 4 分。由此可见， 对于异硫蓝注射液， 随着渗透压。
37、的增加， 淋巴结染色效果显 著提高， 表明淋巴结染色程度与异硫蓝注射液渗透压呈依赖关系。 0116 表 2 皮下注射 10min 后各级淋巴结染色评分情况 (MeanSD,n 5) 0117 样品实施例 10实施例 3实施例 5实施例 6实施例 7实施例 8实施例 9 一级淋巴结 4.70.6*5.40.5*6.40.3* 7.20.25.00.45.80.47.00.4 二级淋巴结 3.10.1*4.20.3*5.40.4* 6.20.54.00.14.90.66.00.3 三级淋巴结 /2.2*4.40.2* 5.00.42.04.20.24.70.5 0118 与实施例 4 比较， *P。
38、0.01， *P0.5 ； 与实施例 7 比较， *P0.01， *P0.5 ； 0119 / ： 未检测到蓝染淋巴结 0120 11.2 不同渗透压局部给药刺激性考察 0121 尽管提高渗透压可以增加异硫蓝注射液淋巴示踪效果， 但是另一方面， 提高渗透 压也会产生局部给药刺激性。因此， 考察不同渗透压异硫蓝注射液局部给药部位组织病理 学变化十分必要。 0122 1) 试验方法 0123 KM 小鼠随机分为 3 组 (n 5)， 分别于右后脚掌皮下注射实施例 10、 实施例 5、 实 说 明 书 CN 106267240 A 11 10/10 页 12 施例 6、 各组溶液， 给药剂量为 4m。
39、g/kg。2d 后， 颈椎脱臼处死小鼠， 取注射部位， 固定于 10 甲醛溶液中， 并进行组织病理学检测。 0124 2) 试验结果 0125 不同渗透压 IB 注射液注射部位病理切片如图 4 所示。可以看出， 196、 938mmol/kg 两组局部给药后， 并没有发生明显组织学改变 ； 当渗透压提高到 1503mmol/kg 时， 注射脚掌 产生炎症、 水肿等病理变化。该结果表明， 当 IB 渗透压低于 938mmol/kg 时， 局部皮下给药 是安全的， 不会产生炎症等刺激性反应。 因此， 从安全性角度考虑， 最终选择2.0氯化钠或 10.0葡萄糖作为异硫蓝注射液最佳渗透压处方量。 说 明 书 CN 106267240 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 106267240 A 13 2/2 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 106267240 A 14 。