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1、10申请公布号CN104212891A43申请公布日20141217CN104212891A21申请号201410415448X22申请日20140822C12Q1/6820060171申请人王玉涛地址844006新疆维吾尔自治区喀什市阔纳乃则巴格路503号院8号楼2单元72发明人王玉涛韩建林罗玉柱郭丽君54发明名称一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及其应用57摘要本发明公开了一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及应用，该试剂盒包括待测样品模板DNA06L；特异微卫星上游引物02L；下游引物02L；核酸扩增体系6BUFFER1L、DNTP08L、TAQDNA聚合酶02L，最后加DDH。
2、2O至10L的混合物。本发明是在绵羊Y染色体特异区域筛选出的一个微卫星位点，该位点经应用在公羊上能够扩增出产物，而在母羊样本上无扩增产物。经进一步研究公羊群体，具有一定多态性，说明利用该位点既可以进行绵羊早期胚胎性别鉴定，有可以用于绵羊父系起源进化研究。51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表2页附图2页10申请公布号CN104212891ACN104212891A1/1页21一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒，其特征在于，包括待测样品模板DNA06L；特异微卫星上游引物02L；下游引物02L；。
3、核酸扩增体系6BUFFER1L、DNTP08L、TAQDNA聚合酶02L，最后加DDH2O至10L的混合物。2一种权利要求1所述绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤待测样品DNA提取、PCR扩增、PCR产物琼脂糖电泳检测、SDSPAGE检测和PCR产物测序，具体为1待测样品DNA提取，选取公羊和母羊血液样品，利用酚氯仿法提取待测样品基因组DNA，经纯度检测，稀释至100NG，以满足PCR扩增要求；2PCR扩增在本试剂盒中加入待测DNA样品进行PCR扩增，扩增条件是94预变性3分钟，94变性30秒，585退火30秒，72延伸30秒，共30个循环；3PCR产物琼脂糖。
4、电泳检测，取PCR产物2L和6BUFFER3L混匀加入2琼脂糖凝胶中，在电压120V，电流80A下电泳30分钟，经紫外检测拍照，结果公羊均有扩增产物，母羊无扩增产物；4SDSPAGE检测，取公羊PCR产物与变性剂去离子甲酰胺，以37的比例混合，在95条件下变性10分钟，然后在10丙烯酰胺凝胶电泳22小时，经固定染色脱色后，凝胶成像仪拍照，电泳条件是电压220V，内外环境温度是17；5PCR产物测序，PCR产物经纯化后送生物公司测序，验证是否具有微卫星特征。权利要求书CN104212891A1/3页3一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及其应用技术领域0001本发明属于生物学技术领域，涉及一。
5、种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及其应用。背景技术0002常染色体微卫星和MTDNA标记研究家养动物的起源，忽略了父本的遗传效应，有一定局限性。近年来，UNDERHILLPA等许多研究者意识到Y染色体上的遗传标记是研究物种起源、进化和迁移理想的工具。作为父系遗传的染色体，绝大部分为非重组区，故单倍型保持完整，不易受重组和回复突变影响，突变率低，比微卫星标记更能稳定遗传，是进化事件的忠实记录者。再者，由于染色体为单倍体，其有效群体大小远小于常染色体位点，较易产生生物群体特异的单倍型。0003关于绵羊Y染色体微卫星分子遗传标记研究，国内外文献仅发现SRYM18一个复合微卫星位点，而选用近缘物。
6、种牛的Y染色体微卫星位点INRA124、INRA126、INRA189在绵羊Y染色体上的应用研究，结果该位点引物在公羊和母羊均能扩增出产物，说明无特异性，对于YCHROMOSOMEMICROSATELLITEDNAMARK研究在人、牛水牛、马上研究较多。因此，需要挖掘绵羊Y染色体潜在微卫星位点，作为绵羊早期胚胎性别鉴定和遗传进化研究。发明内容0004为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及其应用。其技术方案如下0005一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒，包括待测样品模板DNA06L；特异微卫星上游引物02L；下游引物02L；核酸扩增体系6BUFF。
7、ER1L、DNTP08L、TAQDNA聚合酶02L，最后加DDH2O至10L的混合物。0006一种本发明所述绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒的应用，包括以下步骤待测样品DNA提取、PCR扩增、PCR产物琼脂糖电泳检测、SDSPAGE检测和PCR产物测序，具体为00071待测样品DNA提取，选取公羊和母羊血液样品，利用酚氯仿法提取待测样品基因组DNA，经纯度检测，稀释至100NG，以满足PCR扩增要求。00082PCR扩增在本试剂盒中加入待测DNA样品进行PCR扩增，扩增条件是94预变性3分钟，94变性30秒，585退火30秒，72延伸30秒，共30个循环。00093PCR产物琼脂糖电泳检测。
8、，取PCR产物2L和6BUFFER3L混匀加入2琼脂糖凝胶中，在电压120V，电流80A下电泳30分钟，经紫外检测拍照，结果公羊均有扩增产物，母羊无扩增产物。00104SDSPAGE检测，取公羊PCR产物与变性剂去离子甲酰胺，以37的比例混合，在95条件下变性10分钟，然后在10丙烯酰胺凝胶电泳22小时，经固定染色脱色后，凝胶成像仪拍照，电泳条件是电压220V，内外环境温度是17。说明书CN104212891A2/3页400115PCR产物测序，PCR产物经纯化后送生物公司测序，验证是否具有微卫星特征，测序结果附后。0012本发明的有益效果0013本发明是在绵羊Y染色体特异区域筛选出的一个微卫。
9、星位点，该位点经应用在公羊上能够扩增出产物，而在母羊样本上无扩增产物。经进一步研究公羊群体，具有一定多态性，说明利用该位点既可以进行绵羊早期胚胎性别鉴定，有可以用于绵羊父系起源进化研究。附图说明0014图1为PCR反应条件；0015图2为琼脂糖检测结果；图2A为公母羊样本琼脂糖电泳检测结果图，M表示MARK；公羊样本；母羊样本，图2B为公羊样本琼脂糖电泳检测结果图，M表示MARK；公羊样本；0016图3为公羊样本PCR产物SDSPAGE结果。具体实施方式0017下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。0018血液基因组DNA提取采用传统酚氯仿抽提法00191冷冻血液在室。
10、温融化以后，取500L移至离心管中，加入等体积PBS缓冲液，混合，充分摇动，12000RPM离心10MIN，弃去上清液。00202再取500L血液移至离心管中，加入等体积PBS缓冲液，混合，充分摇动，12000RPM离心10MIN，弃去上清液。00213加入500LDNA抽提缓冲液20SDS，重悬沉淀物。00224加入蛋白酶K至终浓度为100G/ML，混匀，用封口膜封住，55水浴过夜。00235将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，缓慢的颠倒离心管10分钟，直至两相混合形成乳浊液，12000RPM离心10MIN，吸上清。00246取上清，再加入等体积苯酚氯仿异戊醇25241，缓慢的颠倒离心管10M。
11、IN，12000RPM离心10MIN，吸上清。00257取上清，加入等体积氯仿异戊醇241，缓慢的颠倒离心管10MIN，12000RPM离心10MIN，吸上清。00268取上清，加入2倍体积的无水冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA沉淀。0027912000RPM离心10MIN；弃上清，然后加4预冷的70乙醇洗两次，12000RPM离心10MIN，弃上清。002810将DNA干燥注意不能太干燥。002911加适量TE溶解，20冷冻保存备用。0030Y染色体微卫星引物设计0031利用近缘物种Y染色体特异序列比对，寻找哺乳动物Y染色体具有微卫星特征的保守序列，再利用PRIMER50设。
12、计引物，引物如下说明书CN104212891A3/3页50032上游引物5GTTGAGGACTCTTGCATCTG3，如SEQIDNO1所示。0033下游引物3CACAGGCCTAGAAGATTGAG5，如SEQIDNO2所示。0034重复序列GTN0035PCR扩增及结果检测0036一反应体系10L00376BUFFER1L0038DNTP08L0039上游引物02L0040下游引物02L0041TAQDNA聚合酶02L0042模板DNA06L0043加DDH2O至10L0044二反应条件如图1所示。0045三琼脂糖检测结果如图2所示。0046该引物在公羊能扩增出产物，但在母羊样本中未扩增出。
13、产物0047四该位点PCR产物SDSPAGE分析结果如图3所示。0048图3经分析，说明该位点具有一定多态性，可作为绵羊父系起源进化研究。0049五测序结果如SEQIDNO3所示。0050ATCTGTATTCATACGGAATATCCGTTGTGTGTGTGTGTGTGATGTCTCTGTCTGATCTTGGTATTAGAGAAATACTGACCTCATTTTGCCTGCTTATGGGGAAGAGACAAGTGGAGTGAAGGAAAAAACATTGTTGGATTTAATTTTAGTCAGGATTAGAGGGAAAAATTTAAGATGTATAATTGTGGCAAGTG0051结论0052该位点可以作为绵羊Y染色体微卫星遗传特征分析及父系起源研究，也可作为绵羊早期性别鉴定研究。0053以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。说明书CN104212891A1/2页600010002序列表CN104212891A2/2页7序列表CN104212891A1/2页8图1图2说明书附图CN104212891A2/2页9图3说明书附图CN104212891A。