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1、10申请公布号CN104195262A43申请公布日20141210CN104195262A21申请号201410491821X22申请日20140924C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12N15/11200601C12R1/64520060171申请人天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心地址300461天津市滨海新区保税区京门大道158号72发明人胡佳续郭京泽刘鹏王金成罗加凤廖芳黄国明54发明名称拟茎点霉RNA聚合酶RPB1基因扩增引物及其设计方法和应用57摘要本发明公开了拟茎点霉RNA聚合酶RPB1基因扩增引物及其设计方法和应用。本发明设计的是针对拟茎点霉属真。
2、菌的通用引物。其上游引物PHR1F有43个碱基CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物PHR1R有43个碱基AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。本发明设计的拟茎点霉RNA聚合酶基因扩增引物可以快速的对拟茎点霉属真菌进行大规模的遗传背景分析，为我国拟茎点霉的种类鉴定、地理种群鉴别或检验检疫工作提供了重要的工具。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表1页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表1页附图1页10申请公布号CN10419526。
3、2ACN104195262A1/1页21拟茎点霉RNA聚合酶RPB1基因扩增引物，其特征是将测序序列和扩增序列结合在一起，是一对针对拟茎点霉属真菌的通用引物，其上游引物PHR1F有43个碱基CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG；下游引物PHR1R有43个碱基AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。2权利要求1所述扩增引物的设计方法，其特征包括如下步骤找出已测定全序列的60种拟茎点霉RPB1基因，去掉不完全和部分序列，进行同源性比较，寻找保守序列，选取扩增序列，并在5端加入测序序列，从而获得一对通。
4、用引物。3权利要求1中所述拟茎点霉RNA聚合酶RPB1基因扩增引物在种类鉴定、地理种群鉴别或口岸检验检疫中的应用。权利要求书CN104195262A1/4页3拟茎点霉RNA聚合酶RPB1基因扩增引物及其设计方法和应用技术领域0001本发明涉及拟茎点霉真菌鉴别技术领域，具体的说，涉及拟茎点霉RNA聚合酶RPB1基因扩增引物及其设计方法和应用。背景技术0002拟茎点霉属（PHOMOPSIS（SACC）BUBAK）是半知菌亚门（DEUTEROMYCOTINA）、腔孢纲（COELOMYCETES）、球壳孢目SPHAEROPSIDALES、球壳孢科（SPHAEROPSIDACEAE）中的重要真菌属，其有。
5、性态为间座壳属（DIAPORTHE），含有400多个不同的种、呈世界性分布，主要集中在热带和亚热带地区。拟茎点霉属真菌是农业和林业上重要的病原菌，寄主植物共74科，可引起多种植物病害，例如溃疡、烂茎、果腐、叶枯、枝枯、根腐、树皮坏死等。此外，该属的部分种类还是植物的重要内生菌和腐生菌，甚至可以危害人或其他哺乳动物，在生态系统中占有重要的地位。0003RNA聚合酶DNADEPENDENTRNAPOLYMERASES在基因表达的过程中扮演着很重要的角色。早在1984年以前,生物化学家就已经在真核生物中成功地分离出3种RNA聚合酶。其中，RNA聚合酶II由12个亚基组成RPB1RPB12，负责转录生。
6、成HNRNA和MRNA。RPB1THELARGESTRNAPOLYMERASESUBUNIT基因负责编码RNA聚合酶II的大亚基,具有单拷贝和进化速率慢的特点。0004RPB1基因片段与其他基因片段如ITSINTERNALTRANSCRIBEDSPACER、RPB2、EFELONGATIONFACTOR等相结合，目前已广泛地应用于真菌的分类和系统发育研究。RPB1基因适用于亲缘关系较近、外形相似的真菌间的分析比较，在拟茎点霉真菌种类鉴定、地理种群鉴别或口岸检验检疫中具有重要应用。发明内容0005本发明的目的在于提供一对可高效扩增拟茎点霉RPB1基因的扩增引物。0006本发明的另一个目的是提供上。
7、述引物的设计方法。0007本发明的进一步目的是提供上述引物在拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别和检验检疫中的应用。0008本发明设计的拟茎点霉RPB1基因扩增引物其上游引物PHR1F有43个碱基CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物PHR1R有43个碱基AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。0009本发明的拟茎点霉RPB1基因扩增引物设计的步骤为登陆GENBANK搜索目前已测定全序列的60种拟茎点霉RPB1基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，设计出扩增序列，并在5端加入测序序列，从。
8、而获得一对通用引物其上游引物PHR1F有43个碱基CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物PHR1R有43个碱基AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。扩增片断大小在750BP左右。说明书CN104195262A2/4页40010可扩增拟茎点霉属真菌RPB1基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下PCR反应体系为25L，内含2TAQMASTERMIX、10M的引物PHR1F和引物PHR1R、含50150NG的DNA模板溶液、DDH2O。00112TAQMASTERMIX125LPHR1F。
9、1LPHR1R1LTEMPLATE1LDDH2O95L扩增条件为94预变性3MIN，然后94变性30S，58退火30S，72延伸60S，共35个循环，最后在72充分延伸10MIN。扩增产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。0012本发明所述的拟茎点霉RPB1基因扩增引物能扩增拟茎点霉RPB1基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为750BP左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为PCR扩增产物经初步定量后，浓度达100NG/L的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为M13F4710M和RVM10M，序列分析仪为ABI3730型全自动DNA测序仪。0013与现有技术相。
10、比，本发明具有如下有益效果本发明的拟茎点霉RPB1基因扩增引物对部分拟茎点霉RPB1基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为750BP左右，经测序及与GENBANK上同源序列的比较，证实为拟茎点霉RPB1基因的扩增产物。本发明设计的拟茎点霉RPB1基因扩增引物可以快速地对多种拟茎点霉进行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为我国拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别或检验检疫工作提供了重要的工具。附图说明0014图1、图2均为PHR1F/PHR1R扩增不同拟茎点霉RPB1基因的电泳图谱。0015其中MDNA分子量标准100BPDNALADDER，N阴性对照，H。
11、2O水对照，127依次为扁桃拟茎点霉（PHOMOPSISAMYGDALIANA）、梨干枯拟茎点霉（PHOMOPSISFUKUSHII）、大豆拟茎点种腐病菌（PHOMOPSISLONGICOLLA）、苹果拟茎点菌（PHOMOPSISMALI）、芒果拟茎点霉（PHOMOPSISMANGIFERAE）、叶下珠生拟茎点霉（PHOMOPSISPHYLLANTHICOLA）、柿苗拟茎点霉（PHOMOPSISROJANA）、茶溃疡拟茎点霉（PHOMOPSISTHEAE）、茎生拟茎点霉（PHOMOPSISTRUNCICOLAMIURA）、石榴干腐菌（PHOMOPSISVERSONIANA）、葡萄生拟茎点霉菌（。
12、PHOMOPSISVITICOLA）、芦笋拟茎点霉（PHOMOPSISASPARAGI）、粽竹拟茎点霉（PHOMOPSISRHAPIDIS）、茄褐纹拟茎点霉（PHOMOPSISVEXANS）、樟拟茎点霉（PHOMOPSISCINNAMOM）、蔓绿绒拟茎点霉（PHOMOPSISPHILODENDRI）、花烛拟茎点霉（PHOMOPSISANTHURII）、黄瓜黑色根腐病菌（PHOMOPSISSCLEROTIOIDES）、栗拟茎点霉（PHOMOPSISCASTANEA）、柿拟茎点霉（PHOMOPSISDIOSPYR）、茴香拟茎点霉（PHOMOPSISFOENICULI）、十字花拟茎点霉（PHOMOP。
13、SISCRUCIFERAE）、杏拟茎点霉（PHOMOPSISAMYGDALI）、苘麻拟茎点霉（PHOMOPSISABUTILONIS）、仙人掌拟茎点霉（PHOMOPSISCACTI）、橡胶拟茎点霉（PHOMOPSISHEVEAE）、小麦拟茎点霉（PHOMOPSISCONTROVERSA）。说明书CN104195262A3/4页5具体实施方式0016登陆GENBANK搜索目前已测定线粒体DNA全序列的60种拟茎点霉RPB1基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，设计出扩增序列，并在5端加入测序序列，从而获得一对针对拟茎点霉属真菌RPB1基因的通用引物其上游引物PHR1F有43个碱基CGCCA。
14、GGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物PHR1R有43个碱基AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。扩增片断大小在750BP左右。0017可扩增拟茎点霉属真菌RPB1基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下PCR反应体系为25L，内含2TAQMASTERMIX、10M的引物PHR1F和引物PHR1R、含50150NG的DNA模板溶液、DDH2O。00182TAQMASTERMIX125LPHR1F1LPHR1R1LTEMPLATE1LDDH2O95L扩增条件为94预变性3MIN，然后94变性30。
15、S，58退火30S，72延伸60S，共35个循环，最后在72充分延伸10MIN。扩增产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。0019本发明所述的拟茎点霉RPB1基因增引物能扩增拟茎点霉RPB1基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为750BP左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为PCR扩增产物经初步定量后，浓度达100NG/L的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为M13F4710M和RVM10M，序列分析仪为ABI3730型全自动DNA测序仪。0020本发明的拟茎点霉RPB1基因扩增引物对部分拟茎点霉RPB1基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产。
16、物大小为750BP左右，经测序及与GENBANK上同源序列的比较，证实为包含拟茎点霉RPB1基因的扩增产物。其主要扩增的拟茎点霉真菌包括以下种类扁桃拟茎点霉（PHOMOPSISAMYGDALIANA）、梨干枯拟茎点霉（PHOMOPSISFUKUSHII）、大豆拟茎点种腐病菌（PHOMOPSISLONGICOLLA）、苹果拟茎点菌（PHOMOPSISMALI）、芒果拟茎点霉（PHOMOPSISMANGIFERAE）、叶下珠生拟茎点霉（PHOMOPSISPHYLLANTHICOLA）、柿苗拟茎点霉（PHOMOPSISROJANA）、茶溃疡拟茎点霉（PHOMOPSISTHEAE）、茎生拟茎点霉（PH。
17、OMOPSISTRUNCICOLAMIURA）、石榴干腐菌（PHOMOPSISVERSONIANA）、葡萄生拟茎点霉菌（PHOMOPSISVITICOLA）、芦笋拟茎点霉（PHOMOPSISASPARAGI）、粽竹拟茎点霉（PHOMOPSISRHAPIDIS）、茄褐纹拟茎点霉（PHOMOPSISVEXANS）、樟拟茎点霉（PHOMOPSISCINNAMOM）、蔓绿绒拟茎点霉（PHOMOPSISPHILODENDRI）、花烛拟茎点霉（PHOMOPSISANTHURII）、黄瓜黑色根腐病菌（PHOMOPSISSCLEROTIOIDES）、栗拟茎点霉（PHOMOPSISCASTANEA）、柿拟茎点霉。
18、（PHOMOPSISDIOSPYR）、茴香拟茎点霉（PHOMOPSISFOENICULI）、十字花拟茎点霉（PHOMOPSISCRUCIFERAE）、杏拟茎点霉（PHOMOPSISAMYGDALI）、苘麻拟茎点霉（PHOMOPSISABUTILONIS）、仙人掌拟茎点霉（PHOMOPSISCACTI）、橡胶拟茎点霉（PHOMOPSISHEVEAE）、小说明书CN104195262A4/4页6麦拟茎点霉（PHOMOPSISCONTROVERSA）。其电泳图谱如图1、图2所示，从而可对拟茎点霉真菌进行分析鉴别。说明书CN104195262A1/1页7SEQUENCELISTING天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心拟茎点霉RNA聚合酶RPB1基因扩增引物及其设计方法和应用2014092PATENTINVERSION33143DNA人工合成1CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG43244DNA人工合成2AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA44序列表CN104195262A1/1页8图1图2说明书附图CN104195262A。