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1、10申请公布号CN104212836A43申请公布日20141217CN104212836A21申请号201410478757122申请日20140918C12N15/8520060171申请人东华大学地址201620上海市松江区松江新城人民北路2999号72发明人邓倩云周宇荀常雪莹王斯佳肖君华李凯74专利代理机构上海泰能知识产权代理事务所31233代理人黄志达54发明名称一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法57摘要本发明涉及一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，通过体外合成SGRNA的核苷酸单链，再经过处理得到插入片段，随后将SGRNA利用同源重组或T4连接插入到41824载。
2、体中或42230载体中，转化至大肠杆菌的感受态细胞，然后对载体进行菌落PCR检测和测序确认，得到表达载体，通过将PCR产物变性，再退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定利用CRISPRCAS9系统对MIR505基因的剪切效率。本发明为如何选择SGRNA表达载体提供参考。51INTCL权利要求书2页说明书6页序列表4页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页序列表4页附图4页10申请公布号CN104212836ACN104212836A1/2页21一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，包括1针对MIR505基因设计SGRNA，然后体外。
3、合成SGRNA的核苷酸单链，进行退火，延伸为双链DNA片段，41824载体用AFLII进行酶切，得到41824线性载体，然后41824线性载体和双链DNA片段利用同源重组的方法进行片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞DH5，涂布到1氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落，然后对单菌落进行PCR鉴定，测序，得到SGRNA表达载体，其中SGRNA的核苷酸单链为SGRNA3F5TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTAAATTGATGCACCCAGTG；SGRNA3R5ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCACTGG。
4、GTGCATCAATTTAC；或者体外合成SGRNA的核苷酸单链，退火为双链DNA片段，42230载体用BBSI进行酶切，得到42230线性载体，然后42230线性载体和双链DNA片段通过T4DNA连接酶连接进行片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞DH5，涂布到1氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落，测序，得到SGRNA/CAS9共表达载体；其中体外合成SGRNA的核苷酸单链为SGRNA3F5CACCGTAAATTGATGCACCCAGTG3；SGRNA3R5AAACCACTGGGTGCATCAATTTAC3；SGRNA4F5CACCGCAGAAACATCAATACTTCC3；SGRNA4R。
5、5AAACGGAAGTATTGATGTTTCTGC3；2将上述表达载体转染哺乳动物细胞，孵育4872H后，提取细胞基因组DNA，然后利用PCR扩增出包含MIR505基因在内的片段，然后通过将PCR产物进行变性、退火的方式形成异源杂交双链，通过T7E1酶切异源杂交双链，及2琼脂糖凝胶电泳，得到各个细胞群发生的剪切效率。2根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤1中合成SGRNA的核苷酸单链进行退火，延伸，其中PCR体系加DDH2O10UL，GTBUFFER，15UL，DNTP15UL，正负单链10P15UL，BSA02UL，TAQ酶1UL；PCR程序9。
6、52MIN，然后9530SEC，5630SEC，721MIN，为5个循环，7210MIN。3根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤1中PCR鉴定，测序中PCR鉴定的引物为41824AFLIIL5TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824AFLIIR5TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT；测序引物为41824AFLIIL5TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824AFLIIR5TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT。4根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤1中菌落。
7、PCR鉴定，测序中，PCR体系加DDH2O93UL，GTBUFFER15UL，DNTP15UL，PRIMER2P15UL，BSA02UL，TAQ酶1UL，单菌落作为模板；PCR程序952MIN，然后9530SEC，5630SEC，721MIN30SEC，40个循环，7210MIN；得到阳性克隆候选，挑单菌落摇菌得到菌液，取1ML菌液和20UL10P上下游引物，上游引物，下游引物各10P，进行双向测序。5根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤1中退火为双链DNA，体系加DDH2O85UL，正负单链10P5UL，GTBUFFER15UL；程序954MI。
8、N后，室温放置10MIN。6根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于权利要求书CN104212836A2/2页3所述步骤1中测序引物为42230BBSIR5CGACTCGGTGCCACTTTT，挑选单菌落摇菌得到菌液，取1ML菌液和20UL10P下游引物，进行单向测序。7根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤2中哺乳动物细胞为HEK293A细胞。8根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤2中孵育条件为37，5CO2的培养箱中孵育。9根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞。
9、系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤2中用PCR扩增出包含MIR505基因在内的的片段的，PCR体系加DDH2O95UL，2XHOTSTARTMIX125UL，PRIMER10P1UL，TEMPLATE2UL；PCR程序943MIN，然后9430SEC，63230SEC，721MIN，35个循环，725MIN。10根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，其特征在于所述步骤2中扩增引物为MIR505LAGTGTCAGGCCTGCTATGTT；MIR505RCTCCTGGCTTCTACTCCCTG。11根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的。
10、方法，其特征在于所述步骤2将PCR扩增得到的PCR产物利用试剂盒进行产物回收，定量，取500NG产物进行变性退火形成异源杂交双链，反应体系PCR产物500NG，T7E1BUFFER11UL，用DDH2O补充体系至11UL；反应程序9510MIN，然后9530SEC，共70个循环，每个循环温度降1，251MIN，得到异源杂交双链后，在上述体系中加入05ULT7E1酶，37反应30MIN，进行酶切。权利要求书CN104212836A1/6页4一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法技术领域0001本发明属于基因敲除方法领域，特别涉及一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法。背景技术0002。
11、1987年，日本课题组在ECOLIK12的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，在之后的研究中发现这类间隔重复序列广泛存在于细菌和古生菌的基因组中，在2002年，被科学家正式命名为规律成簇间隔短小回文重复序列CRISPR。0003CRISPR发现是一种细菌和古生菌的一种免疫系统，它是由一列短小的保守重复序列被具有相似大小的独特的DNA序列所间隔，一种独特的DNA序列叫做间隔区，这些间隔区通常来源于噬菌体或质粒DNA。CRISPR列和CASCRISPRASSOCIATED基因形成CRISPRCAS适应免疫系统57。CRISPR/CAS系统的功能是这样行使的将入侵的核酸片段作为间隔区合并入宿主基。
12、因组，随后将这些间隔区作为模板，产生小RNA分子CRRNA，这些CRRNA能够和CAS蛋白结合成为效应复合物，它能够在下一轮的侵染中将外源核酸沉默掉。0004TYPEII系统仅仅需要CAS9蛋白以前称为CAS5或CSN1就可以用于DNA干扰。TYPEII系统进行靶基因的双链断裂的步骤IPRECRRNA和TRACRRNA从CRISPR位点被转录下来；IITRACRRNA和PRECRRNA中的正向重复序列杂交形成双链，并与CAS9结合，PRECRRNA通过RNASEIII和某未知核酸酶作用形成成熟的CRRNA。该成熟的CRRNA中包含有短的间隔序列；III成熟CRRNATRACRRNA杂交双链引导。
13、CAS9蛋白到靶DNA位点，DNA靶点需含有PROTOSPACER和必需的PAMPROTOSPACERADJACENTMOTIF，这一过程是通过CRRNA的间隔序列于PROTOSPACERDNA间形成杂化双链来完成；IVCAS9蛋白介导靶位DNA中PAM上游进行剪切，在PROTOSPACER中进行双链断裂图1。0005CRISPR/CAS9系统已在最近一年中成为最炙手可热的基因编辑工具，用于小鼠，大鼠，猕猴等哺乳动物的基因敲除研究中。00062010年，VERDUCIL等发现MIR505能通过作用于其靶标ASF/SF2可变剪接因子发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用，KARNIR。
14、等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活MTOR部分信号通路，但是ASF参与调控MTOR的具体方式还不清楚。YAMAMOTOY等在研究肿瘤多药抗性时，发现MIR505是一个新的肿瘤抑制MIRNA，与其呈现负相关的蛋白AKT3，与MTOR通路上的AKT属于同一基因家族。因此MIR505极有可能通过调控MTOR信号通路发挥其生物学功能，而MTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢，生长，增殖和存活等过程的中心调控者的作用，MTOR通路的改变与多种疾病相关。发明内容0007本发明所要解决的技术问题是提供一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，本发。
15、明方法，为如何选择SGRNA表达载体提供参考。说明书CN104212836A2/6页50008本发明的一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505的方法，包括00091针对MIR505基因设计SGRNA，然后体外合成SGRNA的核苷酸单链，进行退火，延伸为双链DNA片段，41824载体用AFLII进行酶切，得到41824线性载体，然后41824线性载体和双链DNA片段利用同源重组的方法进行片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞DH5，涂布到1氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落，然后对单菌落进行PCR鉴定，测序，得到SGRNA表达载体，其中SGRNA的核苷酸单链为0010SGRNA3F5TTCTTG。
16、GCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTAAATTGATGCACCCAGTG；如SEQIDNO10011SGRNA3R5ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCACTGGGTGCATCAATTTAC；如SEQIDNO20012或者体外合成SGRNA的核苷酸单链，退火为双链DNA片段，42230载体用BBSI进行酶切，得到42230线性载体，然后42230线性载体和双链DNA片段通过T4DNA连接酶连接进行片段插入，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞DH5，涂布到1氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落，测序，得到SGRNA/CAS9。
17、共表达载体；其中体外合成SGRNA的核苷酸单链为0013SGRNA3F5CACCGTAAATTGATGCACCCAGTG3；SEQIDNO30014SGRNA3R5AAACCACTGGGTGCATCAATTTAC3；SEQIDNO40015SGRNA4F5CACCGCAGAAACATCAATACTTCC3；SEQIDNO50016SGRNA4R5AAACGGAAGTATTGATGTTTCTGC3；SEQIDNO600172将上述表达载体转染哺乳动物细胞，孵育4872H后，提取细胞基因组DNA，然后利用PCR扩增出包含MIR505基因在内的片段，然后通过将PCR产物进行变性、退火的方式形成异源杂。
18、交双链，通过T7E1酶切异源杂交双链，及2琼脂糖凝胶电泳，得到各个细胞群发生的剪切效率。0018所述步骤1中合成SGRNA的核苷酸单链进行退火，延伸，其中PCR体系加DDH2O10UL，GTBUFFER，15UL，DNTP15UL，正负单链10P15UL，BSA02UL，TAQ酶1UL。PCR程序952MIN，9530SEC，5630SEC，721MIN5个循环，7210MIN。0019所述步骤1中PCR鉴定，测序中PCR鉴定的引物为41824AFLIIL5TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT如SEQIDNO7，41824AFLIIR5TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT如SE。
19、QIDNO8；双向测序引物为41824AFLIIL5TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT如SEQIDNO9，41824AFLIIR5TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT如SEQIDNO10。0020所述步骤1中菌落PCR鉴定中PCR体系加DDH2O93UL，GTBUFFER15UL，DNTP15UL，PRIMER2P15UL，BSA02UL，TAQ酶1UL，最后挑取单菌落作为模板；PCR程序952MIN，9530SEC，5630SEC，721MIN30SEC40个循环，7210MIN。0021得到阳性克隆候选，挑单菌落摇菌得到菌液，取1ML菌液和20UL10P上下游引物上游引物。
20、，下游引物各10P，进行双向测序。0022所述步骤1中退火为双链DNA；体系加DDH2O85UL，正负单链10P5UL，GTBUFFER15UL。程序954MIN后，室温放置10MIN。0023所述步骤1单向中测序引物为42230BBSIR5CGACTCGGTGCCACTTTT如SEQ说明书CN104212836A3/6页6IDNO11，随机挑选单菌落摇菌得到菌液，取1ML菌液和20UL10P下游引物，进行单向测序。所述步骤2中哺乳动物细胞为HEK293A细胞。0024所述步骤2中孵育条件为37，5CO2的培养箱中孵育。0025所述步骤2中用PCR扩增出包含MIR505基因在内的的片段PCR体。
21、系加DDH2O95UL，2XHOTSTARTMIX125UL，PRIMER10P1UL，TEMPLATE2UL；PCR程序943MIN，9430SEC，63230SEC，721MIN35个循环，725MIN。0026所述步骤2中扩增引物为0027MIR505LAGTGTCAGGCCTGCTATGTT；如SEQIDNO120028MIR505RCTCCTGGCTTCTACTCCCTG。如SEQIDNO130029所述步骤2将PCR扩增得到的PCR产物利用试剂盒进行产物回收，定量，取500NG产物进行变性退火形成异源杂交双链；反应体系PCR产物500NG，T7E1BUFFER11UL，用DDH2O。
22、补充体系至11UL。反应程序9510MIN，9530SEC，共70个循环，每个循环温度降1，251MIN。得到异源杂交双链后，在上述体系中加入05ULT7E1酶，37反应30MIN，进行酶切。0030本发明建立一种在哺乳动物细胞系中敲除MIR505基因的方法。针对MIR505基因设计不同的SGRNA,随后分别将SGRNA插入到SGRNA表达载体质粒ADDGENE41824中，或为了提高SGRNA和CAS9蛋白的共传递，将所设计的SGRNA插入到SGRNA/CAS9共表达载体质粒ADDGENE42230中，从而也达到靶点剪切的目的。并且通过对剪切效率的检测，了解同一条SGRNA是否和CAS9蛋白。
23、共表达对靶点的剪切效率产生影响，以及针对相同基因所设计的不同SGRNA对基因的剪切效率是否不同。0031本发明首先针对MIR505基因，设计两条不同的SGRNA，其中一条的靶点在MIR5055P成熟体上游SGRNA3，而另一条的靶点位于MIR5055P成熟体中SGRNA4。在构建SGRNA表达载体时，利用体外合成方法合成两条部分碱基互补的DNA单链，随后再对其进行退火和延伸从而形成一条长的包含SGRNA在内的DNA双链片段，并且该片段两端分别于41824载体的AFLII酶切位点两端序列同源。而41824载体经AFLII酶切，将其线性化，随后利用同源重组的方法将DNA片段插入到41824载体的A。
24、FLII酶切位点处。在构建SGRNA和CAS9蛋白共表达载体时，利用体外合成两条单链核苷酸，随后在体外退火使得两条单链核苷酸通过碱基互补形成双链DNA，该双链即是特异设计的SGRNA，并在两端携带特定粘性末端。42230载体经BBSI酶切，并将线性化载体进行纯化；纯化后的线性载体分别和两条不同双链SGRNA在14过夜链接。所有构建好的载体转化制大肠杆菌感受态细胞DH5，提取质粒，经菌落PCR鉴定和测序确认SGRNA正确插入后，获得SGRNA表达载体和SGRNA/CAS9共表达载体。分别将载体转染哺乳动物细胞，利用T7E1酶切试验，验证的确在MIR505基因组上发生剪切。0032将构建好的针对M。
25、IR505的SGRNA表达载体和CAS9表达载体共转染哺乳动物细胞或将SGRNA/CAS9共表达载体转染哺乳动物细胞，72小时后，提取细胞基因组DNA。利用PCR方法扩增出包含MIR505基因在内约1KB大小的片段，再通过将PCR产物变性，再退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定利用CRISPRCAS9系统对MIR505基因的剪切效率。0033有益效果说明书CN104212836A4/6页70034本发明构建了能够在哺乳动物细胞中能够同时表达CAS9蛋白和SGRNA的载体，并且针对同一个MIR505基因设计不同GC的SGRNA，并将SGRNA插入到SGRNA/CAS9共表达载体中。
26、，用于研究不同SGRNA对相同基因的剪切效率是否不同；同时SGRNA插入到SGRNA表达载体中，用于研究SGRNA是否和CAS9共传递对靶点的剪切效率有所不同；0035本发明是在42230载体的BBSI酶切位点插入合成的SGRNA片段，通过测序得到阳性克隆；同时也在41824载体的AFLII酶切位点插入合成的SGRNA片段，通过菌落PCR和测序得到阳性克隆。将得到的插入不同SGRNA的共表达载体载体转染哺乳动物细胞或SGRNA表达载体和CAS9表达载体共转染哺乳动物细胞，随后抽提被转染的细胞的基因组DNA，并利用PCR的方法扩增得到包含MIR505基因在内的片段，通过T7E1酶切试验便可确定不。
27、同GC的SGRNA的确对相同基因的剪切效率存在影响，GC偏低会相应降低其靶点的剪切效率，为以后设计和选择SGRNA提供一定参考。以及由于SGRNA/CAS9共表达载体由于提高了SGRNA和CAS9蛋白的共传递，的确能够提高靶点的剪切效率，为如何选择SGRNA表达载体提供参考。附图说明0036图1为TYPEIICRISPR介导DNA双链断裂示意图；0037图2为构建MIR505SGRNA表达载体示意图；0038图3为构建MIR505SGRNA/CAS9共表达载体示意图；0039图4为41824的SGRNA插入片段的电泳图，其中泳道1MARKER，泳道2退火延伸后的DNA片段，泳道3未退火延伸的单。
28、链核苷酸；0040图5为42230利用不同缓冲体系形成SGRNA插入片段电泳图，其中泳道1MARKER，泳道2单链核酸在H2O退火，泳道3单链核酸在酶切BUFFER中退火，泳道4单链核酸在PCRBUFFER中退火，泳道5单链核酸未退火；0041图6为41824MIR505SGRNA3载体菌落PCR结构，其中泳道1MARKER，泳道216单克隆，泳道17阴性，泳道18MARKER；0042图7为T7E1酶切试验结构，其中泳道1MARKER，泳道2375NG42230载体，125NG41824MIR505SGRNA3载体；泳道3500NG42230载体，200NG41824MIR505SGRNA3。
29、载体；泳道4750NG42230载体，250NG41824MIR505SGRNA3载体，泳道5野生型；泳道6375NG42230MIR505SGRNA3，泳道7500NG42230MIR505SGRNA3，泳道750NG42230MIR505SGRNA3，泳道9375NG42230MIR505SGRNA4，泳道10500NG42230MIR505SGRNA4，泳道11759NG42230MIR505SGRNA4。具体实施方式0043下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发。
30、明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。0044实施例100451针对MIR505基因，利用在线SGRNA设计软件设计SGRNA说明书CN104212836A5/6页800460047SGRNA3GC52；0048SGRNA4GC4300492体外合成单链核苷酸链，并形成DNA双链片段0050A41824中MIR505SGRNA3插入片段0051SGRNA3F5TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTAAATTGATGCACCCAGTG0052SGRNA3R5ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAG。
31、CTCTAAAACCACTGGGTGCATCAATTTAC0053利用PCR体系，将两条单链核苷酸退火并延伸为双链DNA片段，序列长度为98BP，并通过2琼脂糖凝胶电泳进行鉴定图4。PCR体系加DDH2O10UL，GTBUFFER，15UL，DNTP15UL，正负单链10P15UL，BSA02UL，TAQ酶1UL。PCR程序952MIN，9530SEC，5630SEC，721MIN5个循环，7210MIN。0054B42230中MIR505SGRNA3和MIR505SGRNA4插入片段0055SGRNA3F5CACCGTAAATTGATGCACCCAGTG30056SGRNA3R5AAACCA。
32、CTGGGTGCATCAATTTAC30057SGRNA4F5CACCGCAGAAACATCAATACTTCC30058SGRNA4R5AAACGGAAGTATTGATGTTTCTGC30059利用不同的缓冲，将两条单链核苷酸退火为双链DNA片段，通过2琼脂糖凝胶电泳进行鉴定图5。体系1加H2O10UL，正负单链10P5UL；体系2H2O85UL，正负单链10P5UL，GTBUFFER15UL；体系3H2O85UL，正负单链10P5UL，T7E1BUFFER15UL。程序954MIN后，室温放置10MIN。0060341824MIR505SGRNA3及42230MIR505SGRNA载体的构建。
33、0061A41824载体用AFLII进行酶切，线性化后的载体41824和双链SGRNA3通过同源重组的方法进行片段插入，并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5，涂布到1氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落，用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定，41824AFLIIL5TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824AFLIIR5TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT00622的琼脂糖凝胶电泳鉴定，短片段说明没有MIR505SGRNA3片段插入，出现长片段说明有MIR505SGRNA3插入。菌落PCR鉴定中PCR体系加DDH2O93UL，GTBUFFER15UL，DNTP15UL，PRIM。
34、ER2P15UL，BSA02UL，TAQ酶1UL，最后挑取单菌落作为模板。PCR程序952MIN，9530SEC，5630SEC，721MIN30SEC40个循环，7210MIN。0063为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆进行测序鉴定。双向测序引物41824AFLIIL5TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT，41824AFLIIR5TTGTACAAGAAAGCTGGGTCT。得到候选阳性克隆，挑单菌落摇菌得到菌液，取1ML菌液和20UL10P上下游引物上游引物，下游引物各10P，交由生物公司进行商业双向测序。说明书CN104212836A6/6页90。
35、064B42230载体用BBSI进行酶切，线性化后的载体42230和退火后的SGRNA3和SGRNA4通过T4DNA连接酶连接进行片段插入，并转化制大肠杆菌感受态细胞DH5，涂布到1氨苄抗性的琼脂糖LB平板至长出菌落。由于插入片段过小无法用菌落PCR方法进行区分，因此通过测序的方法鉴定阳性克隆。单向测序引物42230BBSIR5CGACTCGGTGCCACTTTT0065441824MIR505SGRNA及42230MIR505SGRNA对HEK293A细胞转染0066实验前将HEK293A细胞以15105细胞/孔的密度铺于24孔板中，确保各孔细胞生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数。
36、中期，细胞汇合度在6070时进行转染。41824MIR505SGRNA和42230两个载体以不同的浓度梯度共转染HEK293A细胞，同42230MIR505SGRNA载体也以不同浓度梯度转染HEK293A细胞。转染后细胞质37，5CO2的培养箱中孵育72小时。00675利用CRISPRCAS9能够在MIR505基因位置发生剪切0068使用动物基因组DNA快速抽提试剂盒提取细胞的基因组DNA，利用PCR的方法扩增包含MIR505基因在内的长片段，扩增引物MIR505LAGTGTCAGGCCTGCTATGTT,MIR505RCTCCTGGCTTCTACTCCCTG。对扩增产物进行纯化处理后，各取5。
37、00NG纯化后PCR产物，通过将产物变性再退火复性的方法形成异源杂交双链。通过T7E1酶切异源杂交双链，以及跑2琼脂糖凝胶电泳，得到各个细胞群发生的剪切效率。0069PCR扩增出包含MIR505基因在内的的片段。PCR体系加DDH2O95UL，2XHOTSTARTMIX125UL，PRIMER10P1UL，TEMPLATE2UL。PCR程序943MIN，9430SEC，63230SEC，721MIN35个循环，725MIN。0070将PCR扩增得到的PCR产物利用试剂盒进行产物回收，定量。取500NG产物进行变性退火形成异源杂交双链反应体系PCR产物500NG，T7E1BUFFER11UL，用。
38、DDH2O补充体系至11UL。反应程序9510MIN，9530SEC，共70个循环，每个循环温度降1，251MIN。得到异源杂交双链后，在上述体系中加入05ULT7E1酶，37反应30MIN，进行酶切。0071结果如图7所示，13和57使用相同GC的SGRNA，由于57是SGRNA和CAS9蛋白是共表达的，所以一定程度上提高其在靶点的剪切效率。57和810使用不同GC的SGRNA，并且都是SGRNA和CAS9蛋白共表达的，结果由于810的SGRNA的GC为43，相对偏低，因此其在靶点的剪切效率也较低。0072因此在使用CRISPRCAS9系统进行MICRORNA敲除时，在选择SGRNA是去GC应为50左右，并且提高SGRNA和CAS9蛋白的共传递能够一定程度的提高其基因敲除效率。说明书CN104212836A1/4页1000010002序列表CN104212836A102/4页110003序列表CN104212836A113/4页120004序列表CN104212836A124/4页13序列表CN104212836A131/4页14图1说明书附图CN104212836A142/4页15图2说明书附图CN104212836A153/4页16图3图4图5说明书附图CN104212836A164/4页17图6图7说明书附图CN104212836A17。