猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法.pdf

《猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法.pdf（14页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104056265A43申请公布日20140924CN104056265A21申请号201410332357X22申请日20140711A61K39/12200601A61K39/39200601A61P31/20200601A61P31/1420060171申请人江苏南农高科技股份有限公司地址江苏省无锡市江阴市锡澄路890号72发明人缪芬芳何叶峰孙石静何海蓉董彦鹏刘怡胡静雅74专利代理机构北京君智知识产权代理事务所11305代理人郑明54发明名称猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法57摘要本发明涉及一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征的二联疫苗及其制备方。

2、法。该二联疫苗为冻干疫苗，其中含有猪圆环病毒2型SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株活病毒，同时疫苗稀释液中加入了佐剂，可进一步提高疫苗的免疫效果。本发明提供的二联冻干疫苗抗原之间无免疫干扰作用，该疫苗成品质量检验均可达到各自单苗的质量标准；在免疫保护效果上，其效果优于单苗；该二联冻干疫苗可以简化免疫程序，降低免疫成本，减少免疫猪的应激反应，因此具有较大的市场应用价值。51INTCL权利要求书1页说明书12页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页10申请公布号CN104056265ACN104056265A1/1页21一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼。

3、吸综合征二联疫苗，其特征在于该疫苗为冻干疫苗，含有猪圆环病毒2型PORCINECIRCOVIRUSTYPE2，PCV2SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒PORCINEREPRODUCTIVERESPIRATORYSYNDROMEVIRUS，PRRSVR98株活病毒。2一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法，该方法包括以下步骤1猪圆环病毒2型抗原的制备将猪圆环病毒2型SH株种毒按V/V210接种至生长成良好单层的PK15B1细胞瓶中，加入细胞维持液，置37下培养。培养4日后收获，经冻融收获细胞培养物；对猪圆环病毒2型抗原进行超滤浓缩，使其病毒含量为10651075TCID。

4、50/ML；将检验后的猪圆环病毒2型抗原中加入终体积比为00505的丙内酯，混合均匀，4灭活2436小时，37降解24小时；2猪繁殖与呼吸综合征抗原的制备用转瓶培养MARC145细胞，待长成良好单层后，倒去培养液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株种毒原液按V/V210接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37吸附10分钟，加上细胞维持液，置37旋转培养，当病变细胞达75以上时收获细胞和细胞液，收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液病毒含量为10651075TCID50/ML；3配苗将上述灭活后的猪圆环病毒2型SH株抗原、猪繁殖与呼吸综合征活病毒R98株抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为3060的常用。

5、冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干；4疫苗稀释液的配制在PH6872PBS中加入1020的MONTANIDETMGEL佐剂W/V，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化3060分钟，制成疫苗稀释液。权利要求书CN104056265A1/12页3猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法技术领域0001本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病二联疫苗及其制备方法。背景技术0002猪繁殖与呼吸综合征PORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROME，PRRS，又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PORCINEREPRODUCTIVE。

6、ANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS，PRRSV引起的猪的一种急性、高度接触性传染病，是目前我国规模化猪场的主要传染病。猪圆环病毒2型PORCINECIRCOVIRUSTYPE2，PCV2可造成猪免疫抑制，导致机体抵抗力下降，从而诱发多种病毒和/或细菌的混合感染和继发感染。这两种疾病对养猪业危害十分严重，给养猪业造成了巨大经济损失，疫苗接种免疫仍是我国防治猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型的主要方法。目前猪用疫苗品种较多，多疫苗、多针次免疫一方面费时费力，另一方面会增加猪体的应激反应，影响免疫效果。0003目前市场上已有猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病毒病相应的单苗，需要多次分别。

7、注射，接种动物产生的应激反应强，使用不方便，而多联疫苗虽然使用比较方便，但疫苗各免疫抗原成分之间往往会产生干扰作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒感染猪体均能产生免疫抑制作用，因此在制备猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒二联疫苗时，应保证两者不产生免疫干扰现象，即不降低各自的免疫效果。发明内容0004本发明的主要目的是提供一种含有猪繁殖与呼吸综合征活病毒、猪圆环病毒2型灭活病毒的二联疫苗，可以同时防控蓝耳病、猪圆环病毒病。经动物试验证明，该二联疫苗的两种抗原之间不会产生免疫干扰作用，二联疫苗中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型产生的免疫效果优于单苗，因此该二联疫苗具有较大的应用价值。

8、。0005为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案00061一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，该疫苗为冻干疫苗，含有猪圆环病毒2型PORCINECIRCOVIRUSTYPE2，PCV2SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒PORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS，PRRSVR98株活病毒。00072本发明所涉及的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法，包括以下步骤00081猪圆环病毒2型抗原的制备00091将检验合格的猪圆环病毒2型SH株种毒按V/V210接种至生长成良好单层的PK15B1细胞瓶中，加入细胞维持。

9、液，置37下培养。培养4日后收获，置20下冻融3次，收获细胞培养物；00102对猪圆环病毒2型抗原进行超滤浓缩后使其病毒含量为10651075TCID50/说明书CN104056265A2/12页4ML；00113猪圆环病毒2型抗原中加入终体积比为00505的丙内酯，混合均匀，4灭活2436小时，37降解24小时；00122猪繁殖与呼吸综合征抗原的制备0013用转瓶培养MARC145细胞，待长成良好单层后，倒去细胞液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株种毒原液按V/V210比例接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37吸附10分钟，加上细胞维持液，置37旋转培养，当病变细胞达75以上时收获细胞和细胞液，。

10、收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液病毒含量为10651075TCID50/ML；00143配苗将上述灭活后的猪圆环病毒2型SH株抗原与猪繁殖与呼吸综合征活病毒R98株抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为3060的常规冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干；00154疫苗稀释液的配制在PH6872PBS中加入1020的MONTANIDETMGEL佐剂W/V，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化3060分钟，制备疫苗稀释液。0016本发明详细实施方式0017一、疫苗制备00181猪圆环病毒2型抗原液的制备与检验00191接毒将检验合格的PCV2SH株种毒按V/V3接种至生长成良好单层的PK15B1细胞瓶中，。

11、加入细胞维持液，置37下培养。培养4日后收获，置20下冻融3次，收获细胞培养物，取少量样品进行无菌检验及病毒含量的测定。收获后病毒液置于20保存。00202无菌检验按中国兽药典中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典2010年版三部，中国农业出版社，2011年，本发明以下称中国兽药典附录进行检验，抗原液无菌生长。00213病毒含量测定将PCV2SH株病毒液用含4犊牛血清的DMEM细胞维持液作10倍系列稀释，取105、106、1073个稀释度，分别接种PK15B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100L/孔，同时设立正常细胞对照，置37含5CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2M。

12、MOL/L的D氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时后进行间接免疫荧光试验，具体方法如下00221病毒稀释与接种将PCV2病毒液用含4犊牛血清的DMEM细胞维持液作10倍系列稀释，取105、106、1073个稀释度，分别接种PK15B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100L/孔，同时设立正常细胞对照，置37含5CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2MMOL/L的D氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时。00232细胞固定弃去营养液，用PBS001MOL/L，PH值70洗涤细胞3次；加入冷丙酮80丙酮，20双蒸水，150L/孔，置28下作用。

13、30分钟。00243加入PCV2抗体弃去丙酮，置室温下干燥，用PBS洗涤1次，加入120稀释的PCV2抗体，50L/孔，置37下作用1小时。00254加入FITC标记的SPA弃去孔内液体，用PBS洗涤5次，加入1100稀释的FITC标记的SPA，50L/孔，置37下作用1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤5次。说明书CN104056265A3/12页500265镜检观察将上述细胞培养板置荧光显微镜下观察。正常细胞对照孔应无荧光物质着染；有绿色荧光物质着染的细胞孔，判为PCV2感染阳性。00276计算TCID50统计每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性的孔数，根据KARBER法计算病毒TCID5。

14、0。00284浓缩根据病毒含量测定的结果，对PCV2抗原进行适当倍数的超滤浓缩，对浓缩后抗原进行无菌检验、病毒含量的测定。经检验，该抗原液无菌生长，病毒含量为1070TCID50/ML。00295灭活将检验合格的病毒液中加入终体积为02的丙内酯，4灭活24小时，37降解4小时获得灭活抗原。取少量灭活后病毒液进行无菌检验及灭活检验。00306灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，置37下吸附1小时，弃去病毒液，加入新的细胞维持液，置37下继续培养2日，无细胞病变CPE，连续盲传3代后，用IFA法检测，无绿色PCV2阳性细胞产生。00312猪繁殖与呼吸综合征抗原液的制备及检验003。

15、21抗原制备用转瓶培养细胞，待长成良好单层后，倒去细胞液，将种毒原液按V/V2比例接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37吸附10分钟，加上细胞维持液，置37旋转培养。每日观察2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75以上时收获细胞和细胞液，在20以下保存。收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液进行无菌检验及病毒含量测定。00332病毒含量测定将病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取104、105、1063个稀释度，各接种于96孔培养板MARC145细胞单层，200L/孔，置于5CO2温箱37培养5日，观察细胞病变，根据REEDMUENCH法计算病毒TCID50。00344配苗、分装及冻干0035将上述灭活好。

16、的猪圆环病毒2型抗原与猪繁殖与呼吸综合征活病毒抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为50的冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干。0036冻干保护剂中成分为W/V蔗糖为20，脱脂奶粉为5。00375疫苗稀释液的制备0038在PBSPH6872中加入10的MONTANIDETMGEL佐剂购自法国SEPPIC公司W/V，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化3060分钟，制备疫苗稀释液。0039PBS的成分为015MOL/LNACL，0025MOL/LNA2HPO4，0005MOL/LKH2PO4。0040二、疫苗成品检验0041一成品检验00421性状检验0043微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加疫苗稀。

17、释液后迅速溶解。00442无菌检验、支原体检验0045按中国兽药典附录进行检验，疫苗无菌、无支原体生长。00463安全检验0047将疫苗用疫苗稀释液稀释成每毫升含10头份，肌肉注射1421日龄PRRSV抗体阴性、PCV2抗体与抗原阴性健康仔猪3头，每头1ML，观察14日，无异常临床反应。00484效力检验说明书CN104056265A4/12页600491猪圆环病毒2型部分0050小鼠免疫试验法用56周龄PCV2ELISA抗体阴性健康雌性清洁级BALB/C小鼠PCV2ELISA抗体不高于15015只，分成3组，每组5只。用疫苗稀释液将冻干疫苗稀释至05头份/ML，第1组和第2组分别皮下接种参考。

18、疫苗圆环疫苗和待检疫苗，每只02ML，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种；第3组不接种，作空白对照。各组小鼠均隔离饲养观察。首免后5周采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体，对照组应全部为阴性，待检疫苗免疫组抗体平均效价应不低于参考疫苗免疫组抗体平均效价，参考疫苗免疫组抗体平均效价应不低于1800。00512猪繁殖与呼吸综合征部分0052病毒含量将MARC145细胞培养于细胞瓶中，每隔2日用含10犊牛血清DMEM营养液按12扩大培养；测定疫苗病毒含量前48小时，将该细胞传代接种于96孔培养板，置于5CO2温箱37培养2日，形成细胞单层；按瓶签注明头份，将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含。

19、1头份，再用细胞维持液做10倍系列稀释，取104、105、1063个稀释度病毒液，接种于96孔细胞培养板MARC145细胞单层，每个稀释度重复4孔，02ML/孔；然后将细胞板放置于5CO2温箱37培养5日，观察细胞病变CPE，根据REEDMUENCH法计算TCID50。每头份应不低于1050TCID50。00534剩余水分测定0054按中国兽药典附录进行测定，剩余水分含量应不超过40，说明剩余水分合格。00555鉴别检验0056将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份，接种于96孔细胞板MARC145细胞，2孔/样品，100L/孔，37吸附1小时，加入含4犊牛血清的DMEM细胞维持液，同时设定空白。

20、细胞对照，在5CO2温箱37培养24小时；弃去营养液，用PBS缓冲液001MOL/LPH值为70洗涤细胞3次；加入冷丙酮80丙酮，20双蒸水，200L/孔，430分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用PBS缓冲液洗涤1次；加入1500稀释的美洲型PRRSV单克隆抗体购自美国VMRD公司，50L/孔，371小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次；加入1100稀释的FITC标记羊抗鼠IGG购自武汉博士德公司，50L/孔，371小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次，于荧光显微镜下观察。接毒细胞胞浆均有绿色荧光，空白对照组孔细胞浆内无荧光物质着染，说明疫苗中抗原均为PRRSV。00576外源病毒检验。

21、0058按中国兽药典规定，用荧光抗体检测法及红细胞吸附法进行外源病毒检验。每批疫苗抽取23瓶，分别用生理盐水恢复，并稀释至2头份/ML，加入等量蓝耳特异性血清由南京农业大学姜平教授提供，混合，37中和1H。分别接种至细胞单层达75以上的VERO、MDBK、ST细胞，每瓶接种1ML，补充适量营养液。另取VERO、MDBK、ST细胞各1瓶不接种，作为阴性对照，5CO2温箱37培养，连续传代2次，传代后收获的培养物用荧光抗体法、红细胞吸附试验进行外源病毒检测。0059荧光抗体检测法收获的细胞培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞单层的6孔板，每种细胞接种1个孔，同时将分别接种100TCID50PP。

22、V、CSFV、BVDV病毒的细胞做为阳性对照，培养57日后，按试剂盒所述猪瘟病毒间接免疫荧光抗体检测试剂盒、猪细小病毒间接免说明书CN104056265A5/12页7疫荧光抗体检测试剂盒、牛病毒性腹泻间接免疫荧光抗体检测试剂盒购自中国兽医药品监察所进行荧光检测，阳性对照见特异性荧光，阴性对照无特异性荧光，样品接种孔无特异性荧光，则样品为阴性。0060红细胞吸附试验将收获的培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞中，培养7日后，PBS洗涤，加入02V/V豚鼠红细胞和鸡红细胞等量混合悬液，分别在4、25放置30分钟，PBS洗涤，显微镜下检查红细胞吸附情况，不出现红细胞吸附现象判为合格。00617真。

23、空度测定0062测定疫苗的真空度，各疫苗瓶内均出现紫色辉光，说明疫苗真空度检验合格。0063二疫苗稀释液的无菌检验0064取疫苗稀释液按中国兽药典2010年版附录中方法进行检验，疫苗稀释液中无菌生长。0065本发明涉及的微生物资源信息0066猪繁殖与呼吸综合征病毒PORCINEREPRODUCTIVERESPIRATORYSYNDROMEVIRUSR98株，由南京农业大学姜平教授提供，该毒株为我国商品化猪繁殖与呼吸综合征活疫苗R98株的生产用种毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株由南京农业大学姜平教授提供，为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗R98株的检验用毒株，该苗由中华人民共和国农业部批准为三类新兽药农。

24、业部公告1222号，20090612发布。猪圆环病毒2型PORCINECIRCOVIRUS2，PCV2SH株保藏号为CGMCCNO2389由南京农业大学姜平教授提供；PK15B1株细胞，由南京农业大学姜平教授提供，该毒株和细胞为我国商品化猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株的生产用种毒和细胞，该疫苗由中华人民共和国农业部批准为二类新兽药农业部公告1448号，20100827发布。0067本发明的有益效果00681猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒感染猪体均能产生免疫抑制作用，二者的混合感染或相互继发感染可导致发病率和死亡率升高，对养殖场造成巨大经济损失，本发明提供的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病。

25、毒二联疫苗可同时预防两种疫病，确保疫苗的使用效果。00692在现有技术中，猪繁殖与呼吸综合征疫苗和猪圆环病毒疫苗都是分开免疫的，需要多次分时注射，动物可产生较强的应激反应，也增加了工作量。本发明提供的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒二联疫苗可减少了免疫次数，避免多次接种免疫出现的不良反应，同时还大大简化了免疫程序，降低免疫成本。00703采用GEL佐剂作为稀释液来配合二联疫苗使用，安全性好，并可产生更好的免疫反应，抗体维持时间更长，免疫效果更佳。实施例0071为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不局限于本发明的应用范围，下面实施例中。

26、未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。0072实施例10073猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗的制备说明书CN104056265A6/12页80074以猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗13001、13002、13003批为例00751猪圆环病毒2型抗原液的制备与检验00761将PCV2SH株CGMCCNO2389，由南京农业大学姜平教授提供种毒按V/V3接种至生长成良好单层的PK15B1细胞由南京农业大学姜平教授提供瓶中，加入4犊牛血清DMEM细胞维持液V/V，置37下培养。培养4日后收获，置20下冻融3次，收获细胞培养物，取少量样品进行无菌检验及病毒含量的测定。。

27、收获后病毒液置于20保存。00772无菌检验按中国兽药典附录中方法进行检验，抗原液均无菌生长。00783病毒含量测定将PCV2SH株病毒液用含4犊牛血清的DMEM细胞维持液V/V作10倍系列稀释，取105、106、1073个稀释度，分别接种PK15B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100L/孔，同时设立正常细胞对照，置37含5CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2MMOL/LD氨基葡萄糖盐酸、4犊牛血清V/V的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时后进行间接免疫荧光试验，具体方法如下00791病毒稀释与接种将PCV2病毒液用含4犊牛血清的DMEM细胞维持液作10倍系列稀释。

28、，取105、106、1073个稀释度，分别接种PK15B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100L/孔，同时设立正常细胞对照，置37含5CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2MMOL/L的D氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时。00802细胞固定弃去营养液，用PBS001MOL/L，PH值70洗涤细胞3次；加入冷丙酮80丙酮，20双蒸水，150L/孔，置28下作用30分钟。00813加入PCV2抗体弃去丙酮，置室温下干燥，用PBS洗涤1次，加入120稀释的PCV2抗体，50L/孔，置37下作用1小时。00824加入FITC标记的SPA弃去孔内液体，用PBS。

29、洗涤5次，加入1100稀释的FITC标记的SPA，50L/孔，置37下作用1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤5次。00835镜检观察将上述细胞培养板置荧光显微镜下观察。正常细胞对照孔应无荧光物质着染；有绿色荧光物质着染的细胞孔，判为PCV2感染阳性。00846计算TCID50统计每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性的孔数，根据KARBER法计算病毒TCID50。0085经检测制备的K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株抗原的病毒含量分别为1060TCID50/ML、1065TCID50/ML、10566TCID50/ML。00862猪圆环病毒2型抗原液的浓缩、灭活及检验0。

30、0871浓缩根据病毒含量测定的结果，对PCV2SH株抗原进行超滤浓缩，对浓缩后抗原进行无菌检验、病毒含量的测定。经检验，K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株抗原液均无菌生长，病毒含量分别为1070TCID50/ML、10733TCID50/ML、1065TCID50/ML。00882灭活将检验合格的病毒液中加入终体积比为02的丙内酯，4灭活24小时，37降解4小时获得灭活抗原。取少量灭活后病毒液进行无菌检验及灭活检验。00893灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15B1细胞，置37下吸附1小时，弃去病毒液，加入4犊牛血清的DMEM细胞维持液V/V，置37下继续培。

31、养2日，无细胞病变CPE，连续盲传3代后，用IFA法检测，K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株说明书CN104056265A7/12页9抗原样品均无绿色细胞PCV2阳性产生，说明灭活检验合格。00903猪繁殖与呼吸综合征抗原液的制备及检验00911用转瓶培养细胞，待长成良好单层后，倒去细胞液，将PRRSVR98株种毒原液按V/V2比例接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37吸附10分钟，加上细胞维持液，置37旋转培养。每日观察2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75以上时收获细胞和细胞液，在20以下保存。收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液R98株进行无菌检验及病毒含量测定。009。

32、22病毒含量测定将病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取104、105、1063个稀释度，各接种于96孔培养板MARC145细胞单层，200L/孔，置于5CO2温箱37培养5日，观察细胞病变，根据REEDMUENCH法计算病毒TCID50。此次实验得到的三批抗原NK13001、NK13002、NK13003病毒含量为10745TCID50/ML、1072TCID50/ML、10745TCID50/ML、。00934配苗、分装及冻干0094将上述灭活好的猪圆环病毒2型SH株抗原与猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株活病毒抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为50的冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干。0。

33、095冻干保护剂中成分为W/V蔗糖为20，脱脂奶粉为5。00965疫苗稀释液的制备0097在PBSPH6872中加入10的MONTANIDETMGEL佐剂W/V，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化30分钟，制备疫苗稀释液。0098PBS的成分为015MOL/LNACL，0025MOL/LNA2HPO4，0005MOL/LKH2PO4。0099实施例20100猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗的检验0101以猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗13001、13002、13003批为例01021性状检验0103对按上述方法所制的三批二联疫苗进行性状检验，疫苗为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁。

34、脱离，加疫苗稀释液后迅速溶解。01042无菌检验、支原体检验0105三批疫苗按中国兽药典附录中的方法进行检验，三批疫苗均无菌、无支原体生长。01063安全检验0107将三批二联疫苗用疫苗稀释液分别稀释成每毫升含10头份，肌肉注射1421日龄PRRSV抗体阴性、PCV2抗体与抗原阴性健康仔猪3头，每头1ML，观察14日，接种猪均无异常临床反应。01084效力检验01091猪圆环病毒2型部分0110小鼠免疫试验法用56周龄PCV2ELISA抗体阴性健康雌性清洁级BALB/C小鼠购自扬州大学比较医学中心PCV2ELISA抗体不高于15025只，分成5组，每组5只。用疫苗稀释液将冻干疫苗稀释至1头份/。

35、ML，第1、2、3组分别皮下接种待检疫苗，每只02ML；第4组皮下接种圆环参考疫苗SH株，本申请人生产的疫苗，为参考苗04作为对照，每只说明书CN104056265A8/12页1002ML，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种；第5组不接种，作空白对照。各组小鼠均隔离饲养观察。首免后5周采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体，检测结果显示，阴性对照组抗体效价均150，全部为阴性，13001、13002、13003批三批二联冻干免疫组抗体平均效价分别为13840、13200、13520，参考疫苗平均效价为11440见表1。0111表1二联苗猪圆环病毒2型效力试验结果011201132猪。

36、繁殖与呼吸综合征部分0114病毒含量将MARC145细胞培养于细胞瓶中，每隔2日用含10犊牛血清DMEM营养液V/V按12扩大培养；测定疫苗病毒含量前48小时，将该细胞传代接种于96孔培养板，置于5CO2温箱37培养2日，形成细胞单层；按瓶签注明头份，将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份，再用含4犊牛血清的DMEM细胞维持液V/V做10倍系列稀释，取104、105、1063个稀释度病毒液，接种于96孔细胞培养板MARC145细胞单层，每个稀释度重复4孔，02ML/孔；然后将细胞板放置于5CO2温箱37培养5日，观察细胞病变CPE，根据REEDMUENCH法计算TCID50，三批疫苗中PRRSV。

37、的病毒含量分别为10603TCID50/头份、10603TCID50/头份、10593TCID50/头份。01154剩余水分测定0116按现行中国兽药典附录进行测定，三批疫苗的剩余水分均4，达到药典标准，剩余水分检验合格见表2。0117表2不同批次二联疫苗剩余水分检测结果0118011901205鉴别检验0121将三批疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份，接种于96孔细胞板MARC145细说明书CN104056265A109/12页11胞，2孔/样品，100L/孔，37吸附1小时，加入含4犊牛血清的DMEM细胞维持液V/V，同时设定空白细胞对照，在5CO2温箱37培养24小时；弃去营养液，用PB。

38、S缓冲液001MOL/LPH值为70洗涤细胞3次；加入冷丙酮80丙酮，20双蒸水，200L/孔，430分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用PBS缓冲液洗涤1次；加入1500稀释的美洲型PRRSV单克隆抗体，50L/孔，371小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次；加入1100稀释的FITC标记羊抗鼠IGG，50L/孔，371小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次，于荧光显微镜下观察。结果显示接毒细胞胞浆均有绿色荧光，空白对照组孔细胞浆内无荧光物质着染，说明三批疫苗中抗原均为PRRSV。01226外源病毒检验0123按中国兽药典规定，用荧光抗体检测法及红细胞吸附法进行外源病毒检验。每批疫苗抽取。

39、23瓶，分别用生理盐水恢复，并稀释至2头份/ML，加入等量猪繁殖与呼吸综合征特异性血清由南京农业大学姜平教授提供，混合，37中和1小时。分别接种至细胞单层达75以上的VERO、MDBK、ST细胞购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，每瓶接种1ML，补充适量含10犊牛血清的DMEM营养液V/V。另取VERO、MDBK、ST细胞各1瓶不接种，作为阴性对照，5CO2温箱37培养，连续传代2次，传代后收获的培养物用荧光抗体法、红细胞吸附试验进行外源病毒检测。0124荧光抗体检测法收获的细胞培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞单层的6孔板，每种细胞接种1个孔，同时将分别接种100TCID50PPV、C。

40、SFV、BVDV病毒的细胞做为阳性对照，培养57日后，按试剂盒所述猪瘟病毒间接免疫荧光抗体检测试剂盒、猪细小病毒间接免疫荧光抗体检测试剂盒、牛病毒性腹泻间接免疫荧光抗体检测试剂盒购自中国兽医药品监察所进行荧光检测，阳性对照见特异性荧光，阴性对照物特异性荧光，样品接种孔无特异性荧光，则样品为阴性。0125红细胞吸附试验将收获的培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞中，培养7日后，PBS洗涤，加入02V/V豚鼠红细胞和鸡红细胞等量混合悬液，分别在4、25放置30分钟，PBS洗涤，显微镜下检查红细胞吸附情况，不出现红细胞吸附现象判为合格。0126结果显示三批疫苗中均无外源病毒污染。01277真空度。

41、测定0128测定三批疫苗的真空度，各疫苗内均出现紫色辉光，说明疫苗真空度检验合格。0129实施例30130疫苗稀释液的无菌检验0131取3批疫苗稀释液按中国兽药典附录进行无菌检验检验，检验结果为疫苗稀释液中无菌生长。0132实施例40133猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗与单苗免疫效果比较0134以猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗13001批为例0135选取1421日龄PRRSV、PCV2抗体阴性，PCV2抗原阴性健康仔猪35头，分为7组，每组5头，第1组免疫猪繁殖与呼吸综合征活疫苗R98株，本申请人生产的商品疫苗，批号为1304003，肌肉注射疫苗1头份；第2组免疫猪圆环。

42、病毒2型灭活疫苗SH株，本申请人生产的商品疫苗，批号为1304006，肌肉注射疫苗1ML，两周后按相同途径和剂量进行说明书CN104056265A1110/12页12第2次免疫；第3、4组免疫猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，肌肉注射疫苗1头份；第5组为非免疫蓝耳病毒攻毒组；第6组为非免疫猪圆环病毒2型攻毒组；第7组为空白对照组非免疫、非攻毒，均隔离饲养观察。01361猪繁殖与呼吸综合征病毒攻毒试验0137第1、3、5组免疫后30日，用PRRSVS1株由南京农业大学姜平教授提供1050TCID50/ML攻击，滴鼻2ML/头，连续观察28日，在攻毒后7、14、21、28日采血，用RTP。

43、CR检测仔猪血清，同时每日均测定攻毒猪体温，根据临床症状和病毒血症检测结果进行判定。仔猪体温升高40，持续23日；食欲减退，精神沉郁；或PRRSV病毒血症至少持续28日，则可判为发病。0138攻毒后，第1、3组中均有1头猪体温升高40，维持1日；第5组有3头仔猪体温升高40，持续23日；第7组空白对照组体温未有变化；由表3可知，第1组在攻毒后21日未检测到病毒血症，而二联冻干疫苗免疫组于攻毒后日14日就未检测到病毒血症，明显早于蓝耳疫苗免疫组，而非免疫攻毒组其病毒血症持续28日，由此可见，猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗其免疫效果优于猪繁殖与呼吸综合征活疫苗R98株，对PRRSVS1。

44、株的攻击起到免疫保护的作用。0139表3疫苗免疫PRRSV攻毒后病毒血症检测结果014001412猪圆环病毒2型攻毒试验0142首免后5周对所有猪称重，第2、4、6组各用PCV2SH株含1060TCID50/ML滴鼻1ML、肌肉注射2ML，隔离饲养。攻毒后第4、7日，分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白KLH/ICFA，05MG/ML，每个点接种1ML4ML/头，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ML/头；攻毒后第11日、19日腹腔再次接种巯基乙酸培养基，10ML/头。攻毒后连续观察28日，于第28日称重后扑杀，剖检。根据体温标准、相对日增重和病毒抗原检测进行判定。0143体温升高40每日上午10点左右测定仔猪体温一次，至少持续3日；根据每头猪的个体相对日增重计算每组猪的平均相对日增重，并将各组的平均相对日增重与空白对照组的平均相对日增重进行比较，当平均相对日增重显著低于空白对照组P005，B字母表示差异显著P0050148表5PCV2攻毒后体温变化及免疫组化检测结果0149说明书CN104056265A1312/12页14说明书CN104056265A14。