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1、10申请公布号CN104212827A43申请公布日20141217CN104212827A21申请号201410475782422申请日20140917201410054783120140218CNC12N15/66200601C12N15/1020060171申请人四川大学地址610065四川省成都市武侯区一环路南一段24号72发明人苏丹陈义平周明曹磊李辉艳苏小茗74专利代理机构成都虹桥专利事务所普通合伙51124代理人梁鑫54发明名称不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法57摘要本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法。该不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法包括。
2、以下步骤A、引物设计和合成；分别设计和合成两对引物，第一对为目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR，第二对为载体正向引物VF和载体反向引物VR；B、进行PCR，分别获得线性目的基因和线性目的载体DNA；C、将两次PCR产物混合放置，使线性目的基因和线性目的载体DNA自发连接成环状，得到含有目的基因的载体。本发明不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法与传统的分子克隆技术相比较，具有高速、高效、低成本，随机误差低等优点。具有广阔的应用前景。66本国优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表6页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表6页。
3、附图4页10申请公布号CN104212827ACN104212827A1/1页21不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法，其特征在于包括以下步骤A、引物设计和合成；分别设计和合成两对引物，第一对为目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR，第二对为载体正向引物VF和载体反向引物VR；B、进行PCR，分别获得线性目的基因和线性目的载体DNA；C、将两次PCR产物混合放置，使线性目的基因和线性目的载体DNA自发连接成环状，得到含有目的基因的载体。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括步骤D以步骤C所得产物转化细菌。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括步骤E挑选单克隆菌落提取质粒，进行PC。
4、R验证及测序鉴定，得到含有目的基因的载体的转化细菌。4根据权利要求13任一项所述的方法，其特征在于步骤A所述目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR中，目的基因正向引物IF含有OVERLAPI1引物和I2引物两部分，OVERLAPI1引物部分的序列与目的载体插入位置的5端的1221个碱基的序列相同，I2引物部分的序列与目的基因5端1030个碱基的序列相同；IR同样含有两个部分，分别为OVERLAPI3引物和I4引物，OVERLAPI3引物的序列与载体插入位置3端序列1221个碱基序列反向互补，I4与目的基因3端1030个碱基的序列反向互补。5根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤A所述目的。
5、基因正向引物IF的I2引物部分的序列与目的基因5端20个碱基的序列相同；目的基因反向引物IRI4与目的基因3端20个碱基的序列反向互补。6根据权利要求15任一项所述的方法，其特征在于所述载体正向引物VF和载体反向引物VR是以载体的5至3方向为参考，VF与载体待插入位置3端2430个碱基序列相同，VR与载体待插入位置5端2430个碱基序列反向互补。7根据权利要求16任一项所述的方法，其特征在于所述细菌为大肠杆菌。8根据权利要求17任一项所述的方法，其特征在于所述大肠杆菌为DMT感受态大肠杆菌。9根据权利要求18任一项所述的方法，其特征在于所述的步骤C的混合放置为在室温下进行，时间为3090分钟。。
6、10根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的混合放置的时间3060分钟。11根据权利要求110任一项所述的方法，其特征在于所述的目的载体为质粒。权利要求书CN104212827A1/12页3不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法技术领域0001本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法。背景技术0002继人类全基因组测序图谱完成后，多个物种的全基因组序列图谱亦被相继完成。基因序列的一级结构信息，为人类探索单个基因及相关蛋白结构、功能提供了信息基础。由此，人类进入了后基因组研究时代。然而，面对海量的基因序列信息，传统分子克隆技术效率低下，成本耗费过高，随机误差较大，已。
7、经不能满足科研需求，分子克隆技术的瓶颈限制了对各物种基因的全面深入的分析和研究。随着更多物种的全基因组测序工作的完成，以及更多新物种的发现，后基因组研究迫切需要出现一种全新的高通量分子克隆技术。0003在传统的分子克隆方法的基础之上，出现了很多新的基因克隆方法，其中包括使用同源重组序列、特异性连接头、快速连接酶等新技术。但所有这些新方法的建立，都需要使用相应的生物工程酶，如各类重组酶、T4连接酶、限制性内切酶等。这些生物工程酶的使用，增加了实验流程的复杂性性，同时也加大了实验成本。为了解决分子克隆实验流程复杂，费用高，质量控制难度大等瓶颈问题，本领域需要在分子克隆的方法学上有新的突破。发明内容。
8、0004本发明要解决的技术问题是本领域分子克隆需采用多种生物工程酶，导致实验流程复杂，费用高的问题。0005本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法。0006该不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法包括以下步骤0007A、引物设计和合成；分别设计和合成两对引物，第一对为目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR，第二对为载体正向引物VF和载体反向引物VR；0008B、进行PCR，分别获得线性目的基因和线性目的载体DNA；0009C、将两次PCR产物混合放置，使线性目的基因和线性目的载体DNA自发连接成环状，得到含有目的基因的载体。0010进一步的，上述方法还包括。
9、步骤D以步骤C所得产物转化细菌。0011更进一步的，上述方法还包括步骤E挑选单克隆菌落提取质粒，进行PCR验证及测序鉴定，得到含有目的基因的重组载体。0012其中，上述方法步骤A所述目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR中，目的基因正向引物IF含有OVERLAPI1引物和I2引物两部分，OVERLAPI1引物部分的序列与目的载体插入位置的5端的1221个碱基的序列相同，I2引物部分的序列与目的基因5端1030个碱基的序列相同；IR同样含有两个部分，分别为OVERLAPI3引物和I4引物，OVERLAPI3引物的序列与载体插入位置3端序列1221个碱基序列反向互补，I4与目的说明书CN104。
10、212827A2/12页4基因3端1030个碱基的序列反向互补，其中I1与I3碱基数量相等，碱基数量1221个均可。0013优选的，上述方法步骤A所述目的基因正向引物IF的I2引物部分的序列与目的基因5端的前20个碱基的序列相同；目的基因反向引物IRI4与目的基因3端的最后20个碱基的序列反向互补。0014其中，上述方法步骤A所述载体正向引物VF和载体反向引物VR是以载体的5至3方向为参考，VF与载体待插入位置3端的2430个碱基序列相同，VR与载体待插入位置5端2430个碱基序列反向互补。0015本发明的两对引物设计的方法可参见示意图10。0016其中，上述方法中的细菌为大肠杆菌。优选为DM。
11、T感受态大肠杆菌。0017其中，上述方法步骤C所述的混合放置为在室温下进行，时间为3090分钟。进一步的，所述的混合放置的时间3060分钟。0018其中，上述方法中所述的载体为质粒。0019本发明不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法与传统的分子克隆技术相比较，具有高速、高效、低成本，随机误差低等优点。与目前已有的快速克隆方法相比具有更明显的优势，即在整个实验流程中，无需使用任何限制性内切酶，连接酶、重组酶体系等工程酶，仅需使用DNA聚合酶。尤为可贵的是该技术连接头设计方法独特，不受商业载体中限制性酶切位点的限制，可以将基因插入到质粒任何位置，可以大大扩展分子克隆使用的载体的种类，可对载体进行任何。
12、改造0020此外本发明方法的过程极为简便，将过去一个熟练技术人员需要三到四天的工作，缩短到2天内完成，工作时间缩短了3050。实验成本耗费降低可达50，成功效率达到90。具有广阔的应用前景。附图说明0021图1、反应序号AECOICDOMAIN，两次PCR，获得线性目的基因和线性目的载体。0022图2、挑取反应序号A所得的载体转化大肠杆菌DMT得到的单克隆菌落提取质粒，PCR鉴定；PLASIMID1为质粒提取结果，PCROFPLASIMID1为该质粒PCR验证结果。0023图3、反应序号BPC109，分别两次PCR得到的线性目的基因和线性目的载体0024图4、挑取反应序号B所得的载体转化单克隆。
13、菌落提取质粒，PCR鉴定；PLASIMID1为质粒提取结果，PCROFPLASIMID1为该质粒PCR验证结果。0025图5、反应序号CBCRP1，两次PCR分别获得的目的基因和线性目的载体。0026图6、挑取反应序号C中连接头为18BP和21BP所得的载体转化大肠杆菌DMT得到的单克隆菌落提取质粒，PCR鉴定，BCRP118和BCRP121PCR验证结果分别为连接头为18BP和21BP时的验证结果，可以看到连接头为18BP时阳性克隆率达75，连接头为21BP时阳性克隆率可达100。0027图7、挑取反应序号C中连接头为12BP所得的载体转化大肠杆菌DMT得到的单克隆菌落提取质粒，PCR鉴定，。
14、PLASIMID1为质粒提取结果，PCROFPLASIMID1为该质粒PCR验证结果。0028图8、挑取反应序号C中连接头为15BP所得的载体转化大肠杆菌DMT得到的单克说明书CN104212827A3/12页5隆菌落提取质粒，PCR鉴定，PLASIMID1为质粒提取结果，PCROFPLASIMID1为该质粒PCR验证结果。0029图9、DMT感受态细胞与DH5感受态细胞的比较实验结果，DH5感受态细胞必须和DPNI配合使用。0030图10、引物设计原理示意图。0031图11、孵育连接原理示意图。具体实施方式0032本发明方法具体而言可按以下方式实现0033A、引物设计和合成；分别设计和合成两。
15、对引物，第一对为目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR，第二对为载体正向引物VF和载体反向引物VR；0034B、进行PCR，分别获得线性目的基因和线性目的载体DNA；0035C、将两次PCR产物混合放置，使线性目的基因和线性目的载体DNA自发连接成环状，得到含有目的基因的载体。0036进一步的，根据克隆工作的要求，本发明方法可以包括步骤D或E。D以步骤C所得产物转化细菌。E挑选单克隆菌落提取质粒，进行PCR验证及测序鉴定，得到含有目的基因的重组载体。0037本发明方法的关键之处在于步骤A。本发明的两对引物设计的方法和工作原理可参见图10和图11。0038具体而言，步骤A所述目的基因正向引物。
16、IF和目的基因反向引物IR中，目的基因正向引物IF含有OVERLAPI1引物和I2引物两部分，OVERLAPI1引物部分的序列与目的载体插入位置的5端的1221个碱基的序列相同，I2引物部分的序列与目的基因5端1030个碱基的序列相同；IR同样含有两个部分，分别为OVERLAPI3引物和I4引物，OVERLAPI3引物的序列与载体插入位置3端序列1221个碱基序列反向互补，I4与目的基因3端1030个碱基的序列反向互补，其中I1与I3碱基数量相等，碱基数量1221个均可。0039优选的，上述方法步骤A所述目的基因正向引物IF的I2引物部分的序列与目的基因5端的前20个碱基的序列相同；目的基因反。
17、向引物IRI4与目的基因3端的最后20个碱基的序列反向互补。0040具体而言，上述方法步骤A所述载体正向引物VF和载体反向引物VR是以载体的5至3方向为参考，VF与载体待插入位置3端的2430个碱基序列相同，VR与载体待插入位置5端2430个碱基序列反向互补。0041其中，上述方法步骤B是分别进行两次PCR。分别是将目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR与目的基因的模板进行PCR扩增得到线性的目的基因；载体正向引物VF和载体反向引物VR和线性化的载体模板进行PCR扩增得到线性化的目的载体DNA。显然，线性化的载体模板是和载体正向引物VF和载体反向引物VR相匹配的。0042其中，上述方法中的。
18、细菌为大肠杆菌。优选为DMT感受态大肠杆菌。0043其中，上述方法步骤C所述的混合放置为在室温下进行，时间为3090分钟。进一步的，所述的混合放置的时间3060分钟。0044其中，上述方法中所述的载体为质粒。说明书CN104212827A4/12页60045使用本发明涉及的引物对进行PCR反应，OVERLAPI1和OVERLAPI3分别会与目的载体形成自发的连接，组装成为环状。这就避免了传统克隆方法中连接酶的使用。OVERLAP均由PCR反应中引物设计产生，这也就避免了传统克隆方法中限制性内切酶的使用，同时也避免了酶切反应后的凝胶中线性载体的回收。这样，也不会商业载体中限制性酶切位点的限制，可。
19、以将基因插入到质粒任何位置。0046为了验证本发明方法适用于各种长度和碱基组成情况不同的目的基因，以及适用不同类型载体，进行了一系列的验证试验。0047实施例一使用本发明方法进行分子克隆0048本实施例中使用的引物序列见表1，各目的基因信息见表2。使用的载体分别有质粒载体PET28A，PTEV。各种试剂和载体均为常规市售。HSDNAPOLYMERASE和DPNI限制性内切酶均来自宝生物工程大连有限公司，DMT感受态细胞为TRANSGENDMTCHEMICALLYCOMPETENTCELL。0049表1实施例一使用的各种引物序列0050说明书CN104212827A5/12页70051说明书CN。
20、104212827A6/12页80052表2实施例一使用的目的基因的信息0053说明书CN104212827A7/12页90054说明书CN104212827A8/12页100055具体的过程为00561、根据公开的待使用的载体的序列，以及表2中待扩增的目的基因片段，按本发明方法设计和合成得到本发明方法所需的各种引物IF、IR和VF、VR，具体见表1。0057引物的设计原理参见图1000582、各次实验利用表2中记载的相应的引物对IF、IR和VF、VR分别进行两次PCR，获得线性目的基因和线性目的载体DNA片段。0059各次试验的两次PCR反应体系分别由如下成分组成1IF和IR或者VF和VR，。
21、2含有目的基因或者目的载体的DNA模板，3DNTP，4高保真DNA聚合酶PRIMESTAR，5PRIMESTAR配套使用的PCR缓冲液，6超纯水。0060反应条件为98预变性3MIN；98变性15S，退火温度TM5，时间持续30S，延伸温度为72，持续时间按1000BP/MIN设定；循环数为18。00613两次PCR产物混合孵育0062反应体系目的基因40UL50UL载体线性DNA40UL50UL，温度37，时间1H。00634、常规方法吸取23UL反应产物转化感受态的大肠杆菌DMT。00645常规方法挑取单克隆菌落提取质粒，进行PCR验证及测序鉴定，获得转化成功说明书CN104212827A。
22、109/12页11的大肠杆菌DMT。0065一使用本发明方法对不同长度的基因片段进行克隆0066实验过程00671利用表1中所提供引物按表3的设计进行PCR反应0068表3实施例一的反应条件006900702各次PCR的产物按表4的分组进行分别的混合孵育。0071表4混合孵育反应设计0072混合孵育反应序号反应物对应的PCR反应序号的产物A12B13C140073反应体系目的基因40UL50UL载体线性DNA40UL50UL，温度37，时间1H。00743常规方法吸取23UL反应产物转化感受态的大肠杆菌DMT。00754常规方法按反应序列挑取单克隆菌落提取质粒，进行PCR验证及测序鉴定，获得转。
23、化成功的大肠杆菌DMT。00765实验结果0077反应序号A目的基因是ECOICDOMAIN，结果参见图1、图2。反应序号B目的基因是PC109，结果参见图3、图4。反应序号C目的基因是BCRP1，结果参见图5、图6、图7、图9。0078孵育反应序号A、B、C体现的是不同长度片段进行连接反应，该实验目的在于验证不同长度目的基因是否对连接效率有所影响，从实验结果可以得出，不同长度目的基因对本文中所提出的快速克隆方法的效率并不存在显著差异，都有较高的效率，满足应用于不同长度的目的基因的重组载体的构建的要求。说明书CN104212827A1110/12页120079二DMT感受态细胞与DH5感受态细。
24、胞的比较实验00801、利用表1中所提供引物按表5设计的条件进行PCR反应，PCR结果参见图9。0081表5实施例二的反应条件00820083各次PCR产物按表6的设计进行混合孵育反应。0084表6混合孵育反应设计0085混合孵育反应序号反应物对应的PCR反应序号的产物D56E56DPNIDPNI用缓冲液0086反应体系目的基因40UL50UL载体线性DNA40UL50UL，温度37，时间1H。00872分别用常规方法吸取孵育反应产物23UL按反应序号D转化感受态的大肠杆菌DMT，按反应序号E转化感受态细胞DH5。00883常规方法按反应序号D、E挑取单克隆菌落提取质粒，进行PCR验证及测序鉴。
25、定，获得转化成功的大肠杆菌DMT和DH5，结果参见图9。00894实验结果利用DMT感受态大肠杆菌直接去除带甲基化的模板质粒，反应体系组成是两次PCR产物混合液目的基因40UL50UL载体线性DNA40UL50UL，反应条件是37温育1H；DMT感受态细胞不影响克隆效率。除本试验外，以上及以下克隆均采用DMT感受态细胞进行。0090三用不同长度的引物连接头进行克隆00911利用表1中所提供引物按表7的设计进行PCR反应。0092表7实施例三的反应条件0093说明书CN104212827A1211/12页1300942各次PCR产物按表8的设计分别进行混合孵育反应。0095表8混合孵育反应设计0。
26、096混合孵育反应序号反应物对应的PCR反应序号的产物F78G79H710I7110097反应体系目的基因40UL50UL载体线性DNA40UL50UL，温度37，时间1H。00983常规方法吸取反应序列F、G、H、I各23UL反应产物转化感受态的大肠杆菌DMT。00994常规方法按反应序列挑取单克隆菌落提取质粒，进行PCR验证及测序鉴定，获得转化成功的大肠杆菌DMT。01005实验结果0101实验结论OVERLAP为12BP时，采用该快速连接克隆方法进行BCRP1与PET28A的连接，连接成功，结果参见图7。0102实验结论OVERLAP为15BP时，采用本发明方法进行BCRP1与PET28。
27、A的连接，连接成功，结果参见图6。0103OVERLAP为18BP或者21BP时，采用本发明方法进行BCRP1与PET28A的连接，连接成功，结果参见图8。0104综上，OVERLAP在1221BP之间均可实现连接反应的成功进行。0105总的说来，本实施例验证了其中本发明方法可以成功插入不同大小DNA片段进入说明书CN104212827A1312/12页14不同载体；验证了在本发明范围涉及的不同长度的引物连接头也能克隆成功；还验证了用DMT感受态细胞取代去甲基化酶DPNI在快速分子克隆技术中的实际效果是令人满意的。在本实例中，在18个循环后，DNAPOLYMERASE保真性犹可保证，传统PCR。
28、反应往往需要30个循环，造成了非特异性产物的扩增，因此需要PCR产物的纯化，去除非特异性产物。这些在本方法中均不需要。说明书CN104212827A141/6页1500010002序列表CN104212827A152/6页160003序列表CN104212827A163/6页170004序列表CN104212827A174/6页180005序列表CN104212827A185/6页190006序列表CN104212827A196/6页20序列表CN104212827A201/4页21图1图2图3图4说明书附图CN104212827A212/4页22图5图6图7说明书附图CN104212827A223/4页23图8图9图10说明书附图CN104212827A234/4页24图11说明书附图CN104212827A24。