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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201710053542.9 (22)申请日 2017.01.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106857251 A (43)申请公布日 2017.06.20 (73)专利权人 浙江农林大学 地址 311300 浙江省杭州市临安市环城北 路88号 (72)发明人 童再康 楼雄珍 黄华宏 张俊红 林二培 (74)专利代理机构 北京智为时代知识产权代理 事务所(普通合伙) 11498 代理人 王加岭 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) 。
2、审查员 李世超 (54)发明名称 一种闽楠体细胞胚及不定芽诱导方法 (57)摘要 本发明公开了一种闽楠体细胞胚及不定芽 诱导方法， 包括以闽楠未成熟种子为材料， 剥取 未成熟种子幼胚为外植体， 进行体细胞胚诱导、 增殖培养产生次生胚， 或者进行胚性愈伤的诱 导、 分化不定芽等技术环节。 本发明首次建立了 闽楠未成熟合子胚的体细胞胚及胚性愈伤的诱 导、 培养技术体系， 明确取材最佳时间， 筛选出优 良体细胞胚、 胚性愈伤诱导培养基、 增殖培养基、 体细胞胚萌发培养基、 分化培养基， 有效提高了 体细胞胚诱导率、 增殖率、 体细胞胚萌发率、 分化 系数等， 有助于缓解闽楠种苗供应严重不足的现 状。。
3、 此外， 本发明胚性愈伤的成功诱导， 为进行体 细胞融合、 种质资源保存、 基因转化及优良杂交 组合扩繁提供了技术保证。 权利要求书1页 说明书6页 CN 106857251 B 2018.10.09 CN 106857251 B 1.一种闽楠体细胞胚诱导方法， 其特征在于， 包括： 以闽楠未成熟种子为材料， 剥取未 成熟种子幼胚为外植体， 进行体细胞胚的诱导、 体细胞胚增殖培养产生次生胚、 体细胞胚萌 发生根步骤； 其中， 1） 体细胞胚诱导培养基为含有下述成分的MS固体培养基： 谷氨酰胺500mg/L、 水解酪蛋 白500mg/L、 2,4-D 1.0-2.0mg/L、 6-BA0.1-1。
4、.0mg/L， 暗培养； 2） 体细胞胚增殖培养基为含有下述成分的MS固体培养基： 6-BA0.5-1.0mg/L、 NAA0.1- 1.0mg/L， 暗培养； 3) 体细胞胚萌发生根培养基为含有下述成分的MS固体培养基： 6-BA 1.0 mg/L、 IBA 0.1-0.5mg/L， 光培养。 2.根据权利要求1所述的闽楠体细胞胚诱导方法， 其特征在于， 将萌发生根的体细胞胚 小苗及时转接到不含激素的MS培养基中进行壮苗培养， 2-3个月后移栽。 3.根据权利要求1所述的闽楠体细胞胚诱导方法， 其特征在于， 所述幼胚处于球形胚阶 段。 4.根据权利要求1-3任一项所述的闽楠体细胞胚诱导方法，。
5、 其特征在于， 幼胚接种前， 将幼胚置于0.4M蔗糖溶液中， 4预处理48h。 5.根据权利要求1-3任一项所述的闽楠体细胞胚诱导方法， 其特征在于， 所述体细胞胚 诱导培养基为MS+水解酪蛋白 500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+2,4-D 1.5 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L； 体细胞胚增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L； 体细胞胚萌发生根培养基为 MS+6-BA1.0mg/L+IBA 0.1mg/L。 6.根据权利要求1-3任一项所述的闽楠体细胞胚诱导方法， 其特征在于， 体细胞胚萌发 生根阶段为光培养， 光量为105 molm-2s-1。
6、， 光周期为8hd-1。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106857251 B 2 一种闽楠体细胞胚及不定芽诱导方法 技术领域 0001 本发明属于植物生物技术领域， 具体涉及一种闽楠体细胞胚诱导、 培养方法。 背景技术 0002 闽楠(Phoebe bournei(Hemsl.)Yang)， 中国特有， 是国家二级珍稀渐危种(傅立 国， 金鉴明.中国植物红皮书稀有濒危植物， 科学出版社， 1991)。 闽楠为樟科常绿大乔木， 分 布于中亚热带常绿阔叶林地带的江西、 福建、 浙江南部、 广东、 广西等地(中国科学院中国植 物志编辑委员会中国植物志:第31卷， 北京:科学出版社， 1。
7、982.)。 闽楠木材芳香耐久， 淡黄 色， 材质致密坚韧， 不易反翘开裂， 易加工， 削面光滑， 纹理美观， 为上等建筑、 家具、 造船及 工艺雕刻等良好木材， 同时， 其树体高大， 四季翠绿， 是园林绿化优良树种。 可见， 闽楠具有 极高的经济价值、 社会价值、 生态价值、 观赏价值。 但闽楠现存资源极少， 保护和扩繁优异种 质资源成为该种研究的热点与重点。 0003 闽楠自然繁殖主要通过种子繁殖， 但种子大小年现象突出， 且种子在野外保存寿 命短， 发芽率极低， 因此导致闽楠资源极少。 近些年， 大量的科研工作者开始研究闽楠种苗 保育相关技术， 但多集中在闽楠种子活力、 休眠、 萌发(李。
8、铁华、 文仕知、 彭险峰等， 2003, 2009,2010)、 育苗(刘军、 姜景民、 陈益泰等， 2011)等方面， 组织培养技术虽然也有见相关报 道(曲芬霞和陈存及， 2010)， 但其增殖率较低， 而利用现代生物技术对闽楠进行胚性愈伤组 织及体细胞胚诱导培养的快繁技术未见研究报道。 目前落叶松、 云杉、 杉木等针叶树种已有 较完善的体细胞胚发生体系， 但不同树种特别是阔叶树种对体细胞胚培养技术要求差异显 著， 几乎每一树种体细胞胚培养体系的建立都需通过大量的实验来验证。 发明内容 0004 为了解决上述问题， 本发明提供一种闽楠体细胞胚诱导、 培养方法。 0005 首先， 本发明提供一。
9、种闽楠体细胞胚及不定芽诱导方法， 其中， 0006 体细胞胚诱导方法包括： 以闽楠未成熟种子为材料， 剥取未成熟种子幼胚为外植 体， 进行体细胞胚的诱导、 体细胞胚增殖培养产生次生胚、 体细胞胚萌发生根步骤； 0007 不定芽诱导方法包括： 以闽楠未成熟种子为材料， 剥取未成熟种子幼胚为外植体， 进行胚性愈伤组织的诱导、 胚性愈伤组织分化诱导不定芽、 不定芽生根步骤， 其中， 0008 1)体细胞胚诱导培养基为含有下述成分的MS固体培养基： 谷氨酰胺500mg/L、 水解 酪蛋白500mg/L、 2,4-D 1.0-2.0mg/L、 6-BA0.1-1.0mg/L， 暗培养； 0009 2)胚。
10、性愈伤组织诱导培养基为含有下述成分的MS固体培养基： 谷氨酰胺500mg/L、 水解酪蛋白500mg/L、 6-BA0.1-1.0mg/L， 暗培养； 0010 2)体细胞胚增殖培养基为含有下述成分的MS固体培养基： 6-BA0.5-1.0mg/L、 NAA0.1-1.0mg/L， 暗培养； 0011 3)胚性愈伤组织分化培养基为含有下述成分的WPM固体培养基： TDZ0.5-1.5mg/L、 IBA 0.1-0.5mg/L， 光培养。 说 明 书 1/6 页 3 CN 106857251 B 3 0012 4)体细胞胚萌发生根培养基为含有下述成分的MS固体培养基： 6-BA 1.0mg/L、。
11、 IBA 0.1-0.5mg/L， 光培养。 0013 5)不定芽生根培养基为含有下述成分的WPM固体培养基： 6-BA 1.0mg/L、 IBA 0.1- 0.5mg/L， 光培养。 0014 在本发明一个实施方案中， 将萌发生根的体细胞胚小苗及时转接到不含激素的MS 培养基中进行壮苗培养， 2-3个月后移栽小苗。 0015 其中， 选取的合子胚优选处于球形胚阶段， 实验结果表明， 选用该阶段的幼嫩合子 胚为外植体， 其体细胞胚诱导率及胚性愈伤诱导率均比较理想， 明显高于其他的合子胚阶 段。 0016 其中， 幼胚接种前， 将幼胚置于0.4M蔗糖溶液中， 4预处理48h。 0017 在本发明。
12、优选的实施方案中， 所述体细胞胚诱导培养基为MS+水解酪蛋白500mg/L +L-谷氨酰胺500mg/L+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L； 体细胞胚增殖培养基为MS+6- BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L； 体细胞胚萌发生根培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA 0.1mg/L。 0018 在本发明另一优选的实施方案中， 所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS+水解酪蛋 白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+IBA 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L； 胚性愈伤组织分化培养基为 WPM+TDZ 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L。 0019 在。
13、本发明的一个实施方案中， 体细胞胚萌发生根阶段、 胚性愈伤组织分化阶段以 及不定芽生根阶段为光培养， 光量为105 molm-2s-1， 光周期为8hd-1。 0020 本发明突破了闽楠体细胞胚、 胚性愈伤诱导培养技术， 集成了闽楠幼嫩合子胚体 细胞胚、 胚性愈伤的诱导培养技术体系， 提高了合子胚体细胞胚诱导率、 胚性愈伤诱导率、 次生胚增殖系数、 胚性愈伤分化率及体细胞胚萌发率， 从而提高出苗率。 此外， 闽楠胚性愈 伤诱导技术的攻破， 不但可以扩大不定芽繁殖系数， 而且也为将来制造人工种子和进行外 源基因的导入打下基础。 具体实施方式 0021 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发。
14、明的范围。 0022 实施例1筛选闽楠种子幼胚体细胞胚诱导培养基、 胚性愈伤组织诱导培养基 0023 以未成熟闽楠种子为材料。 洗洁剂浸泡1min， 自来水冲洗3h， 无菌水冲洗2次， 75 酒精处理30s， 无菌水冲洗34次， 20(体积比)NaClO消毒15min， 无菌水冲洗34次， 无菌 条件下取出幼胚， 0.5M蔗糖中4预处理48h， 接种于13个含有不同激素组合的MS+水解酪蛋 白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L固体培养基中进行体细胞胚发生实验。 每个处理接种3个培 养皿(规格： 90*15mm)， 每皿接种幼胚5个， 共接种15个， 4个重复。 培养室相对湿度70 5，。
15、 温度(241)， 暗培养。 0024 接种后每日观察闽楠幼胚在不同培养基上的生长情况。 第20天， 除CK外其他培养 基上的幼胚明显膨大或有凸起， 之后每日继续观察， 发现膨大的幼胚发生淡黄色、 较疏松的 胚性愈伤组织， 而凸起的小颗粒陆续地从外植体上脱落， 经显微观察， 脱落的凸起为发育良 好的初生胚， 可见， 在不同的培养条件下， 闽楠幼胚可朝两条途径发生， 直接发生体细胞胚 或发生愈伤组织。 40天后， 对每个培养基上的体细胞胚诱导率和胚性愈伤组织的出愈率进 行统计， 具体见表1。 说 明 书 2/6 页 4 CN 106857251 B 4 0025 表1不同激素组合培养基的闽楠幼胚。
16、体细胞胚诱导率及出愈率的影响 0026 0027 0028 注： 体细胞胚诱导率()发生体细胞胚的幼胚数/接种的总幼胚数*100 0029 出愈率()发生胚性愈伤组织的幼胚数/接种的总幼胚数*100 0030 从表1看出， 不同激素组合对闽楠幼胚体细胞胚诱导率及胚性愈伤组织诱导率影 响差异显著。 6号组合即2,4-D 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L的幼胚体细胞胚诱导率最高， 达到 45.00， 12号组合即IBA1 .5mg/L+6-BA 1 .0mg/L的幼胚愈伤组织诱导率最高， 达到 91.67。 从表中还可看出， 同个培养基上的出愈率均高出体细胞胚诱导率， 而且， 在6-BA浓。
17、 度一致的前提下， 相同浓度的IBA比2,4-D更有利于愈伤组织组织的诱导。 显微观察发现， 得 到的大部分体细胞胚形态正常， 具两片子叶， 而部分体细胞胚的形态异常， 通常表现为具3 片子叶或多片子叶同时着生于一个胚上。 0031 从表1可以总结得出： 有利于幼胚直接发生体细胞胚的最佳培养基为： MS+水解 酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L。 有利于幼胚发生胚 性愈伤组织的最佳培养基为MS+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+IBA 1.5mg/L+6- BA 1.0mg/L。 发生胚性愈伤组织是幼胚发育。
18、主要途径。 0032 实施例2不同幼胚发育阶段对体细胞胚诱导率、 出愈率的影响 0033 分别于2016年8月5日、 8月12日、 8月19日、 8月26日、 9月3日、 9月10日采集优株向阳 说 明 书 3/6 页 5 CN 106857251 B 5 健壮枝条种子， 以一个优株为一个重复， 选3个优株做3次重复， 每次每优株采集种子75颗， 30颗用于愈伤组织诱导， 30颗用于体细胞胚诱导， 15颗用于解剖观察， 确定各时间段的合子 胚发育阶段。 外植体前处理方法及培养环境均同实施例1。 体细胞胚诱导培养基选用MS+水 解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+2,4-D 1.。
19、5mg/L+6-BA 1.0mg/L， 愈伤组织诱导培养 基选用MS+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+IBA 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L。 每个处 理均培养40天后统计体细胞胚诱导率、 出愈率， 结果见表2。 0034 表2不同幼胚发育阶段对体细胞胚诱导率的影响 0035 0036 从表2看出， 8月19日处于球形胚阶段的幼胚体细胞胚诱导率最高， 为56.67， 8月 12日球形胚次之， 为50.00； 从表2还可看出， 球形胚阶段的愈伤组织诱导率都较高， 均高 于90， 最高的是8月5日的早期球形胚阶段的96.67。 从这些数据可看出， 有利于体细胞 胚发。
20、生的幼胚阶段为8月12日到8月19日的球形胚阶段， 而有利于愈伤组织诱导的阶段为8 月5日到8月19日期间的球形胚阶段。 0037 实施例3体细胞胚增殖培养 0038 将得到的初生胚转接到增殖培养基中进行增殖培养产生次生胚， 培养基以MS为基 本培养基， 激素添加组合及增殖结果见表3。 实验设计及培养条件同实施例1。 接种后每日观 察， 20天后统计结果。 0039 表3不同增殖培养基对体细胞胚增殖的影响 0040 123456 6-BA0.50.50.51.01.01.0 NAA0.10.51.00.10.51.0 增殖系数5.0012.96.56.24.73.0 0041 注： 增殖系数产。
21、生次生胚数/接种初生胚数 0042 接种1周后发现部分初生胚表面产生类似母体的白色胚状结构， 这是通过次生胚 发生方式得到的次生胚。 20天后， 统计次生胚增殖结果， 发现2号培养基即MS+6-BA0.5mg/L+ NAA 0.5mg/L增殖系数最高， 为12.9， 显著高于其他培养基， 而其余培养基除6号最低为3.0， 各处理间的差异并不明显， 因此， 可选出最佳增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L。 0043 延长增殖培养的时间， 可发现闽楠的次生胚极易发生， 即使是已经成熟变绿的体 细胞胚， 或是已萌发的体细胞胚， 均可观察到次生胚的发生。 次生胚发生一旦开始。
22、， 得到的 次生胚上又可以产生新的次生胚， 这种不断循环的次生胚重复发生在增殖培养基上可以长 说 明 书 4/6 页 6 CN 106857251 B 6 期持续， 使次生胚数量快速增加。 实验还发现， 有规律的继代培养(40天左右继代一次)有利 于次生胚的产生和保持。 0044 实施例4胚性愈伤组织的分化培养 0045 将获得的胚性愈伤组织转接到分化培养基上进行分化培养实验。 培养基以WPM为 基本培养基， 添加不同浓度的TDZ、 6-BA、 IBA生长调节剂， 具体见表4。 每个处理接种3个培养 皿， 每皿接种5块胚性愈伤组织， 重复3次。 培养室相对湿度705， 温度(241)， LED。
23、 光下培养， 光量在105 molm-2s-1左右， 光周期为8hd-1， 培养35天后统计不定芽再生 数。 0046 表4不同培养基上的分化系数 0047 0048 0049 分化系数产生的不定芽数/接种的外植体数 0050 从表4看出， 胚性愈伤组织在6号培养基即WPM+TDZ1.5mg/L+IBA 0.5mg/L上的不定 芽再生系数最高， 为4.7， 5号培养基次之， 为3.9， 从表中可发现， 低浓度的TDZ及6-BA均不利 于不定芽的发生， 随着其浓度的升高， 不定芽再生系数增高， 可见， TDZ及6-BA是不定芽发生 的关键因子。 0051 待不定芽高度达到2-3cm时， 将不定芽。
24、转接到WPM+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1或者WPM +6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L的生根培养基中， 实验结果表明， 成苗率可达90以上。 0052 实施例5体细胞胚的萌发 0053 将实施例3获得的次生胚转入萌发培养基进行萌发试验。 培养基以MS为基本培养 基， 添加不同浓度的TDZ、 6-BA、 IBA生长调节剂， 具体见表5。 实验设计及培养条件同实施例 4。 培养45天后统计萌芽率和生根等生长情况。 0054 表5不同激素组合对体细胞胚萌发的影响 说 明 书 5/6 页 7 CN 106857251 B 7 0055 0056 注： 萌芽率()发芽的体细。
25、胞胚数/接种的总体细胞胚数*100 0057 从表5看出， 7号培养基即MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L萌芽率最高， 为63.9， 8 号培养基即MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L次之， 为38.6， 而其它培养基均较低。 观察体 细胞胚萌发情况， 发现胚芽萌动后2-3天， 胚根即开始萌动， 在萌发培养基上培养一个月左 右， 将幼苗转接到无添加激素的MS培养基中， 发现植株可快速健壮的生长， 培养2-3个月后 幼苗可移栽。 0058 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 106857251 B 8 。