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1、(10)申请公布号 CN 103690519 A (43)申请公布日 2014.04.02 CN 103690519 A (21)申请号 201310705521.2 (22)申请日 2013.12.19 A61K 31/216(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军南京军区南京总医 院 地址 210002 江苏省南京市中山东路 305 号 (72)发明人 王昕 王春艳 卢光明 孟庆欣 朱飞鹏 张龙江 张志强 牛红梅 黄嘉逸 奚海燕 盛会雪 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 肖明芳 (54) 发。
2、明名称 丹酚酸 A 在制备治疗肿瘤多药耐药性药物中 的应用 (57) 摘要 本发明涉及天然药物领域， 公开了丹酚酸 A 在制备治疗肿瘤多药耐药性药物中的应用。丹酚 酸 A 具有较丹参酮类的丹参提取物水溶性好的优 点， 因此具有更好的生物利用度。 本发明公开了丹 酚酸 A 对耐药肿瘤细胞具有的显著抑制作用， 其 机制为通过上调促凋亡蛋白表达， 下调抑制凋亡 蛋白表达， 诱导耐药肿瘤细胞凋亡 ； 通过增加耐 药肿瘤细胞的活性氧表达水平， 抑制肿瘤耐药蛋 白P-gp表达， 从而克服肿瘤多药耐药细胞。 因此， 丹酚酸 A 具有制备克服肿瘤多药耐药的药物的应 用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书。
3、 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103690519 A CN 103690519 A 1/1 页 2 1. 丹酚酸 A 在制备治疗肿瘤多药耐药性药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述丹酚酸A可以用其钠盐、 镁盐、 铵盐或 钙盐替换。 3. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的肿瘤包括 P-gp 过度表达的肿瘤。 4. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的肿瘤包括实体肿瘤、 血液系统肿 瘤。 5. 根据权利。
4、要求 2 所述的应用， 其特征在于， 丹酚酸 A 的盐在药物中的含量为 50% 以 上。 6. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的药物剂型为液体制剂、 颗粒剂、 片 剂、 冲剂、 胶丸、 胶囊、 滴丸剂、 口崩制剂、 注射剂、 缓释制剂、 控释制剂或各种微粒给药系统。 权 利 要 求 书 CN 103690519 A 2 1/3 页 3 丹酚酸 A 在制备治疗肿瘤多药耐药性药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及丹酚酸 A 在抗肿瘤方面的应用， 尤其涉及丹酚酸 A 在制备治疗肿瘤多 药耐药性药物中的应用。 背景技术 0002 中国人民共和国卫生部对全国第三次死因回顾抽样调。
5、查结果表明， 恶性肿瘤是我 国居民的第 2 大死亡原因。肿瘤的发生是一个复杂、 长期的过程， 受到体内、 外多因素的影 响， 细胞通过增值、 分化、 不典型增生、 转化以及间变等过程而形成恶性细胞。 在各种肿瘤的 化疗中， 肿瘤多药耐药是影响化疗效果的一个重要因素， 并可导致复发与转移， 成为肿瘤治 疗的最大障碍， 已成为肿瘤化学治疗失败的一个主要原因。 0003 肿瘤多药耐药性是指对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时， 对其他许多结构各异、 作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象。肿瘤多药耐药的作用机制十分复杂， 主要包括以下几个方面 ：（1） 通过降低药物摄入和增加药物外流从而导致细胞内药。
6、物浓度 降低。 （2） 通过细胞内药物的代谢， 激活或灭活药物。 （3） 通过改变细胞内耐药靶酶的水平 或细胞内酶与药物的亲和力， 使药物失效。 （4） 加强 DNA 损伤修复功能。(5) 增强细胞抗凋 亡调节能力等。其中研究最多的是多药耐药基因 1(multidrug resistance1， mdr1) 及其编 码的耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)， P-gp的主要任务是将细胞内的药物泵出细胞外， 从而减少 药物对细胞的损伤， 因此 P-gp 蛋白是引起肿瘤细胞多药耐药的重要原因。针对多药耐药机 制， 有许多的耐药逆转剂不断地被发现， 但其毒副作用大等原因导致其无法广泛应用于临 床。因此必须。
7、寻求有效的克服多药耐药性的药物。 0004 活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 属于氧自由基， 是氧在机体还原过程中 产生的中间产物及其衍生物， 参与细胞增殖、 分化、 转化和凋亡以及细胞内重要信号途径的 传导。ROS 水平对肿瘤、 糖尿病、 神经退行性病变等氧化应激相关疾病的发生和进程具有复 杂的影响。有研究报道细胞内 ROS 水平增高， 能降低细胞内多药耐药蛋白 P-gp 的水平。通 过干预 ROS 是减少多药耐药蛋白表达， 促进耐药肿瘤细胞凋亡的有效方法。 0005 丹 酚 酸 A 是 从 中 药 丹 参 中 提 取 的 一 种 水 溶 性 有 效 单 体。
8、 成 分， 英 文 名 称 :Salvianolicacid A， 分子量 494.45， 分子式 ： C26H22O10， 其化学结构式如下丹酚酸 A 通 式。 0006 0007 丹酚酸 A 是一种具有广泛药理作用的水溶性成分， 目前研究最多的是丹酚酸 A 在 说 明 书 CN 103690519 A 3 2/3 页 4 心血管保护、 抗肝纤维化方面的作用。近期研究又发现丹酚酸 A 具有抗肿瘤活性， 能够抑制 核苷转运并增强化疗药物的抗肿瘤作用。 发明内容 0008 本发明所要解决的技术问题是提供丹酚酸 A 的新用途。 0009 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ： 0010。
9、 丹酚酸 A 在制备治疗肿瘤多药耐药性药物中的应用。 0011 发明人所研究的丹酚酸 A 比许多抗肿瘤的丹参有效单体 ( 如丹参酮及其衍生物 ) 具有更好的水溶性， 因此具有更好的生物利用度。本发明公开了丹酚酸 A 对耐药肿瘤细胞 具有较强的杀伤效果， 机制为丹酚酸 A 可以通过增加耐药肿瘤细胞的活性氧水平， 诱导耐 药肿瘤细胞凋亡， 并减少多药耐药蛋白 P-gp 的表达， 从而克服多药耐药的肿瘤细胞。 0012 有益效果 ： 本发明公开了丹酚酸 A 在制备治疗肿瘤多药耐药性药物中的应用。丹 酚酸 A 具有较丹参酮类的丹参提取物水溶性好的优点， 具有更好的生物利用度。丹酚酸 A 对耐药肿瘤细胞。
10、具有比较亲本肿瘤细胞更加显著的抑制作用， 其机制为通过增加活性氧表 达水平， 上调促凋亡蛋白表达， 下调抑制凋亡蛋白表达， 诱导耐药肿瘤细胞凋亡， 抑制肿瘤 耐药蛋白 P-gp 表达， 从而克服肿瘤多药耐药细胞。因此， 丹酚酸 A 具有制备克服肿瘤多药 耐药的药物的应用前景。 附图说明 0013 图 1 细胞毒性 MTT 实验显示丹酚酸 A 对乳腺癌细胞 MCF-7 及其多药耐药细胞 MCF-7/MDR 的生存率有剂量依赖性的抑制作用， 对多药耐药细胞 MCF-7/MDR 的抑制作用更 加明显。 0014 图 2 流 式 细 胞 仪 检 测 Annexin V/PI 双 染 凋 亡 细 胞 实。
11、 验 显 示 丹 酚 酸 A 能 诱导耐药肿瘤细胞 MCF-7/MDR 凋亡， 并具有剂量依赖性 （图中 A-F 丹酚酸 A 浓度为 0,20,40,60,80,100M)。 0015 图 3DCFH-DA 法检测细胞活性氧 ROS 水平， A 图表明耐药肿瘤细胞株具有比亲本肿 瘤细胞株更高的 ROS 水平， B 图显示丹酚酸 A 能上调耐药肿瘤细胞株活性氧 ROS 的水平， 并 具有剂量依赖性。 0016 图 4Western Blot 检测蛋白表达， 显示丹酚酸 A 能下调耐药肿瘤的凋亡抑制蛋白 Bcl-2 表达， 上调促凋亡蛋白 Bax 表达， 而使用活性氧 ROS 的清除剂 N- 乙酰。
12、半胱氨酸 (NAC) 干预后， 其诱导耐药肿瘤凋亡的能力降低。 0017 图 5Western Blot 检测蛋白表达， A 图为耐药肿瘤细胞株具有比亲本肿瘤细胞株 更高的耐药蛋白 P-gp 表达水平， B 图显示丹酚酸 A 能下调肿瘤耐药蛋白 P-gp 表达， 而使用 活性氧 ROS 的清除剂 N- 乙酰半胱氨酸 (NAC) 干预后， 其下调能力降低， 说明其抑制耐药蛋 白 P-gp 的机制是上调活性氧 ROS 的水平。 具体实施方式 0018 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发 明， 本领域的技术人员容易理解， 而不应当也不会限制本发明中所详细描述的权。
13、利要求。 说 明 书 CN 103690519 A 4 3/3 页 5 0019 以下实施例所用的丹酚酸 A（纯品）购自上海友思生物技术有限公司， 含量 99.4%， -20保存。使用前， 新鲜配置含药物的溶液。 0020 实施例 1 ： 0021 MTT 法检测丹酚酸 A 对人乳腺癌细胞 MCF-7 及其耐药细胞 MCF-7/MDR 增殖影响作 用。取对数生长期人乳腺癌细胞 MCF-7 及其耐药细胞 MCF-7/MDR， 接种于 96 微孔培养板， 细胞数为5103/孔， 在37、 5CO2， 孵箱中培养12小时后， 分组加药， 每个浓度设立平行 孔， 阴性对照加生理盐水， 24小时后， 每。
14、孔加MTT10l(5mg/ml)， 又于孵箱培养4小时， 弃上 清， 每孔加入DMSO100l， 振荡至沉淀完全溶解， 在490nm下测每孔光密度(OD)值。 细胞毒 性 MTT 实验显示丹酚酸 A 对乳腺癌细胞 MCF-7 及其多药耐药细胞 MCF-7/MDR 的生存率有剂 量依赖性的抑制作用， 对多药耐药细胞 MCF-7/MDR 的抑制作用更加明显。结果见图 1。 0022 实施例 2 ： 0023 流式细胞术检测丹酚酸 A 诱导 MCF-7/MDR 细胞凋亡的。将 MCF-7/MDR 细胞接种于 6 孔板中， 12h 后用丹酚酸 A 处理细胞 24h， 吸弃各孔中含有药物的培养基， 用 。
15、PBS 洗 2 遍， 按 Annexin V-FITC 试剂盒说明操作， 利用流式细胞仪上机检测， 结果显示丹酚酸 A 能诱导 耐药肿瘤细胞 MCF-7/MDR 凋亡， 并有剂量依赖性。结果见图 2。 0024 实施例 3 ： 0025 荧 光 分 光 光 度 法 检 测 丹 酚 酸 A 作 用 下 细 胞 内 活 性 氧 自 由 基 (reactive oxygenspecies， ROS) 的变化。将 MCF-7/MDR 细胞接种于 24 孔板中， 细胞贴壁后用丹酚酸 A 处理细胞 24h 吸弃各孔中含有药物的培养基， 用 PBS 洗 2 遍， 按照活性氧检测试剂盒要求 步骤加活性氧自由基。
16、荧光探针 DCFH-DA， 用荧光分光光度法检测荧光强度。结果见图 3B。 0026 实施例 4 ： 0027 Western Blot 检测丹酚酸 A 对 Bcl-2 和 Bax 蛋白表达的影响。MCF-7/MDR 细胞以 不同浓度的丹酚酸 A 处理后， PBS 洗涤细胞， 放置冰板上， 细胞刮子将细胞刮下收集， 加入细 胞裂解液和蛋白酶抑制剂， 在冰上裂解10min， 13200rpm， 离心15min， 取上清液。 SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离蛋白质， 将蛋白转移到醋酸酯膜上， 常规一抗和二抗孵育后用持久性化 学发光底物 (Thermo scientific 公司 ) 检测蛋白表达， 。
17、结果表明丹酚酸 A 能下调耐药肿瘤 的凋亡抑制蛋白 Bcl-2 表达， 上调促凋亡蛋白 Bax 表达， 而使用活性氧 ROS 的清除剂 N- 乙 酰半胱氨酸 (NAC) 干预后， 丹酚酸 A 诱导耐药肿瘤凋亡的作用下降。蛋白表达结果见图 4。 0028 实施例 5 ： 0029 Western Blot 检测丹酚酸 A 对耐药蛋白 P-gp 表达的影响。Western Blot 检测 步骤同上， 结果显示丹酚酸 A 能下调肿瘤耐药蛋白 P-gp 表达， 而使用活性氧 ROS 的清除剂 N- 乙酰半胱氨酸 (NAC) 干预后， 其抑制耐药蛋白 P-gp 的能力降低。结果见图 5B。 说 明 书 CN 103690519 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103690519 A 6 2/2 页 7 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103690519 A 7 。