本发明涉及包含免疫刺激量的至少两种免疫增强剂的药物组合物，涉及该药物组合物在诱导针对肿瘤特异性抗原的免疫应答中的用途、其在原位肿瘤破坏疗法中的用途，并且涉及这些药物组合物，其用于治疗患有癌症的哺乳动物。
癌症是用于描述赘生性生长的泛称。赘生物被认为是组织的不正常的、通常为去分化的形式，该组织通常以高于正常的速度增殖。在大多数情况下，赘生性细胞侵入周围组织，而且此外它们转移并在身体的其他部位继续生长。
对赘生性块（肿瘤）的局部和区域治疗（如外科手术）不会影响可能的转移。因此，需要额外的疗法，如使用细胞毒性药物治疗。这种治疗一般称为化学疗法。
另一种方法在于诱导针对肿瘤特异性抗原的体液免疫应答，该方法常被称为癌症免疫疗法。成功诱导这种针对肿瘤特异性抗原的免疫学应答的好处在于其将持续一定时间并最终消除肿瘤在身体其他部位的定位，而这是无法通过局部肿瘤治疗解决的。针对肿瘤抗原的体液免疫应答的系统性综述由Reuschenbach，M.等人发表于CancerImmunol.Immunother.58：1535-1544(2009)。有时候，报道了针对一种或几种自身肿瘤抗原的自发体液免疫应答。在其他情况下，体液免疫应答被有意诱导，例如通过分离肿瘤细胞、这些细胞在体外生长并随后杀死所述细胞、接着在存在免疫刺激剂的条件下将该细胞注射入患者中。
局部治疗当然是治疗实体瘤的第一个步骤。这在传统上通过肿瘤切除实现。另一种方法是原位肿瘤破坏。原位肿瘤破坏的特征在于所述肿瘤未被移除而是坏死。原则上，照射是原位肿瘤破坏的一种形式，但已经开发了许多其他肿瘤破坏的方法。常用方法为例如：光动力疗法，该疗法使用光敏化合物及其随后的激光活化的组合；通过激光、微波、电流、超声、高强度聚焦超声或射频波的原位加热；或冷疗法：通过冷冻使组织坏死。
原位肿瘤破坏将被破坏的肿瘤块遗留在体内。这使得有可能在被破坏的肿瘤原位尝试并建立针对肿瘤特异性抗原的免疫学应答（癌症免疫疗法）。成功诱导这种针对肿瘤特异性抗原的免疫学应答的好处在于没有来自肿瘤的材料要被分离、体外生长并注射回患者内。
与从基于非自身抗原的疫苗开发中了解到的相反，诱导针对肿瘤特异性抗原的免疫学应答远非易事，无论采用何种方法诱导该免疫学应答。基本上，肿瘤抗原主要是身体的正常组分：自身抗原。因此免疫系统就这点而论将下调自身指导的免疫应答（self-directedimmuneresponse）从而导致自身抗原的耐受状态。
因此，开发癌症免疫疗法需要非常特定的方法，该方法基于免疫增强。免疫增强是增强免疫应答的泛称，所述增强通过增加免疫应答发展的速度和／或程度和／或通过延长其持续时间来实现。
目前，非甲基化的胞苷鸟苷寡脱氧核苷酸(CpGODN)被认为是能够诱导针对肿瘤特异性抗原的免疫应答的免疫增强化合物的最优选特定组。
这些胞苷鸟苷寡脱氧核苷酸起着toll样受体9（TLR9）激动剂的作用。CpG基序脱颖而出是因为其优先诱导Th1应答和肿瘤特异性的CD8+T淋巴细胞。TLR9主要由B细胞和树突细胞（DC）表达，这些细胞内化并直接响应CpG基序。当触发TLR9时，DC成熟并迁移至引流淋巴结，在该处它们将抗原呈递给T和B淋巴细胞。重要的是，这些DC获得独特的、将捕获的抗原在MHCI类分子上呈递的能力，这是一个被称作交叉呈递的过程，该过程对于有效活化肿瘤特异性CTL是至关重要的。因此，CpGODN施用已经据报道在预防性环境中防止肿瘤的长出(outgrowth)，并且还可以根除小鼠体内确立的肿瘤。Nierkens，S.等人(CancerRes.68:5390-5396(2008))以及由Roux,S.等人(CancerImmunol.Immunoth.57:1291-1300(2008))。不过，尽管防止肿瘤长出和根除确立的肿瘤是显著的，但是其并未在所有经治疗的动物中观察到。
因此，正在寻找进一步提高CpGODN的功效水平的方法。
本发明提供了提高CpGODN的功效水平的方法。
此时惊奇地发现：当CpGODN与3’,5’-环二鸟苷酸（通常称为环状二GMP或简称为c-di-GMP）组合时，观察到这两个组分令人惊讶地更高的免疫增强效果，从而造成了存活率的显著改善。已知TLR9及其激动剂在诱导针对肿瘤特异性抗原的免疫学应答中的关键作用的情况下，确实令人惊讶的是，尽管c-di-GMP与TLR9机制根本无关系，但结果在其与CpGODN组合时却非常适合诱导针对肿瘤特异性自身抗原的免疫学应答。
环状二GMP是细胞内发信号分子，存在于多种细菌物种中(Amikam,D.等人，J.Bacteriol.171:6649-6655(1989),Ross,P.等人，Nature325:279-281(1987)以及D’Argenio,D.A.等人，Microbiology150:2497-2504(2004))。
环状二GMP能够针对各种细菌感染刺激哺乳动物中增强的保护性先天免疫(Ogunniyi,A.D.等人，Vaccine26:4676-4685(2008)和KaraolisD.K.R.等人，Inf.AndImmun.75:4942-4950(2007))。
近来Gray,P.M.等人特别描述了将c-di-GMP作为疫苗免疫增强剂的用途(CellularImmunology278:113-119(2012))。在该发表的论文中，将c-di-GMP与其他已知疫苗免疫增强剂LPS、CpGODN以及基于铝盐的常规免疫增强剂进行了比较。
然而，在本领域中已知c-di-GMP主要是在经典的非自身接种疫苗背景下被用作包含细菌性病原体的疫苗中的免疫增强剂。已有发表的论文描述了c-di-GMP对基础的和GF刺激的人结肠癌细胞体外增殖的抑制作用。(Karaolis,D.K.R.等人，BBRC329:40-45(2005))。
不过，很可能由于上述原因，c-di-GMP从未被提示当作免疫增强剂与CpGODN组合用于自身指导的免疫应答。
自1994年，就已经描述了将CpGODN用于免疫刺激（美国专利US6429199）。CpG基序主要具有5’-X1-C-pG-X2-3’结构。已知CpG基序5’-Pu-Pu-CpG-Pyr-Pyr是最具免疫增强作用的基序之一(Scheule,R.K.,AdvancedDrugDeliveryReviews44:119-134(2000))。基本上，它们的长度为8-80个碱基并包含至少一个非甲基化的CpG基序。
在不同动物物种中效率上的细小差别是常见的。仅举一例：人TLR9最优地由CpG基序G-T-CpG-T-T触发，而小鼠TLR9则更优地由G-A-CpG-T-T触发(Krieg,A.M.,NatureMedicine9:831-835(2003)。
Rankin,R.等人在AntisenseandNucleicAcidDrugDevelopment11:333-340(2001)中已经描述了用于七种兽医的和三种实验室的物种的最优CpG基序。Wernette,C.M.等人在VeterinaryImmunol.AndImmunopath.84:223-236(2002)中描述了有效刺激犬科动物和猫科动物免疫细胞增殖的CpG基序。Ameiss,K.A.等人在VeterinaryImmunol.AndImmunopath.110:257-267(2006)中已经特别描述了CpG基序在家禽中的应用。
更多的CpGODN在WO2012/089800，WO2012/160183和WO2012/160184中有述。具有不同CpG基序的CpGODN可以容易地在市面上购得，并且如果需要，它们容易被合成。可以特别在上面提到的出版物和实施例部分中找到CpGODN的合适的量。
因此，本发明的第一个实施方案涉及药物组合物，其包含免疫刺激量的至少两种免疫增强剂以及可药用载体，其中第一免疫增强剂为CpGODN，第二免疫增强剂为3’,5’-环二鸟苷酸（c-di-GMP）。
关于确定c-di-GMP和CpGODN的合适的量，可以如下这么说：
就c-di-GMP而言，非常合适的量将在100μg/kg重量与50mg/kg重量之间的范围内。更合适的量将在500μg–5mg/kg的范围内。仅举一例：就在小鼠中使用而言，30μgc-di-GMP/(50g的)小鼠的量将是非常合适的量。就在人类中使用而言，可比的合适的量将是45mgc-di-GMP/人。
就CpGODN而言，以微克计的合适的量特别取决于CpGODN的长度。任何CpGODN的分子量大体上同303xn相关，其中ｎ为该CpGODN中核苷酸的数目。仅举一例：1mM的CpGODN二十聚体将为约6μg。
当然，CpGODN的合适的量也取决于该CpG的式。非常强的免疫增强CpGODN可以以低于较弱CpGODN的量施用。
仅作为一项说明：平常的免疫增强CpGODN二十聚体如本领域熟知的CpG1668(‘5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’)的合适的量将在20μg/kg重量与50mg/kg重量之间的范围内。更合适的量将在500μg–5mg/kg的范围内。
就可比的CpGODN四十聚体而言，这将意味着在1000μg–10mg/kg之间。
c-di-GMP和CpGODN通常被置于可药用载体内施用。该载体优选地为液体，c-di-GMP和CpGODN易于溶解于其中。非常合适的载体为水和生理盐（PBS）溶液。
因此，仅举一例：根据本发明且适用于人类治疗的药物组合物可以例如包含溶于100μlPBS中的45mgc-di-GMP和75mgCpGODN。
实施例提供了更多关于c-di-GMP和CpGODN的合适的量的信息。引用的文献提供了更多在各种情况下的合适的量的例子。
这种包含免疫刺激量的c-di-GMP和CpGODN两者的药物组合物可以以多种方法用于诱导针对肿瘤特异性抗原的免疫应答。这可以例如是如上所述与体外培养的肿瘤细胞组合使用，或与上面提到的肿瘤破坏方法组合使用。
因此本发明的第二个实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其用于诱导针对肿瘤特异性抗原的免疫应答。
据发现，在肿瘤内或周围、在肿瘤破坏的时刻或其左右联合施用c-di-GMP和CpGODN在原位肿瘤破坏后诱导非常显著的针对肿瘤特异性抗原的免疫学应答。该免疫应答是持久的，并且显著强于由每个单独的免疫增强剂诱导的免疫应答。其因而非常适用于消除转移的细胞，即使这些细胞已经潜伏在体内。
此外，该免疫应答看来足够强烈以防止相同类型肿瘤细胞的增殖，即使是在治疗后的几周有意地施用相当大量的这些肿瘤细胞。
因此，本发明的此实施方案的一个优选形式涉及根据本发明的药物组合物，其用于原位肿瘤破坏疗法，所述疗法包括肿瘤破坏的步骤和施用所述药物组合物的步骤。
不言而喻，本发明在人和兽医医学领域同样适用。
用词“免疫刺激量的免疫增强剂”应当从广义上解释。这种量的免疫增强剂能够刺激免疫系统。该刺激可以例如（但不是必需地）反映为细胞因子生产中的增加，如１型干扰素（IFN）和白细胞介素12（IL12），如实施例部分所示。
再一次，正如上面提到的，不言而喻，本发明在人和兽医医学领域同样适用，尽管建议（但非强制性的）将所用的CpG基序与本发明所用于的动物物种相匹配。这可以在以上汇总的出版物的基础上容易地完成。
原则上，肿瘤破坏的步骤和施用根据本发明的药物组合物的步骤可以在时间上不同的时刻或相同的时间进行。然而，从理论上讲，本着“活化”免疫系统的目的，人们将期望：在实施肿瘤破坏之前几天或更好是一周或甚至两周或更多周使用所述药物组合物来调理(conditioning)肿瘤将是优选的途径。
然而令人惊奇地发现：如果在肿瘤破坏后，在肿瘤破坏后的数天内，优选在肿瘤破坏后的一天内，更优选12小时内，甚至更优选6小时内，还甚至更优选2小时内施用所述药物组合物，则免疫刺激的水平优于当所述步骤顺序颠倒时(NierkensS,denBrokMH,SutmullerRP,GrauerOM,BenninkE,MorganME,FigdorCG,RuersTJ,AdemaGJ.CancerRes.2008Jul1;68(13):5390-6)。
当在肿瘤破坏前约两小时与破坏时刻之间施用所述药物组合物时，也得到非常好的结果。这是因为破坏后，由于破坏引起的赘生性块结构改变，可能使其更难以接近或进入。
在肿瘤破坏前两小时与肿瘤破坏后两小时之间的时间间隔内施用所述药物组合物，被称为手术前后施用。
因此，此实施方案的一个优选形式涉及药物组合物，其用于原位肿瘤破坏疗法，所述疗法包括肿瘤破坏的步骤和施用根据本发明的药物组合物的步骤，其特征在于所述步骤的顺序如下：
a.肿瘤破坏，和
b.施用根据本发明的药物组合物。
此实施方案的更优选形式涉及上面提到的顺序的所述步骤，其中在肿瘤破坏后的24小时内、12小时内或甚至6小时内（优选级依次递增）施用所述药物组合物。
此实施方案的另一优选形式涉及药物组合物，其用于原位肿瘤破坏疗法，所述疗法包括肿瘤破坏的步骤和施用根据本发明的药物组合物的步骤，其特征在于所述步骤的顺序如下：
a.手术前后施用根据本发明的药物组合物，和
b.肿瘤破坏。
关于施用药物组合物的位点或多个位点，应当做出以下考虑：
优选地，将所述药物组合物直接施用于赘生性块内。
尽管略微不那么优选，但是肿瘤周(peri-tumoral)施用也是可能的，其中将所述药物组合物施用于赘生性块周围的一个或多个位置。肿瘤周施用是在肿瘤周围，优选距离该肿瘤表面小于或等于1厘米以内施用。最优选地，肿瘤周施用在肿瘤表面上进行。在肿瘤的一侧施用是合适的，但优选地将根据本发明的药物组合物施用到肿瘤周围的两侧或更多侧上。
另一种尽管不太优选的施用是在赘生物块的引流区域皮下施用。最后，静脉内施用（优选靠近赘生性块所在位置）是可能的。
因此，所述药物组合物的施用通过以下方式（优选级依次递增）进行：静脉内施用、在赘生性块的引流区域皮下施用、肿瘤周施用或肿瘤内施用。
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其用于在患有癌症的哺乳动物中治疗癌症。
此实施方案的一个优选形式涉及根据本发明用于使用的药物组合物，其中所述哺乳动物已经接受了肿瘤破坏。
本发明的再另一个实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其用于在患有癌症的哺乳动物中治疗癌症中的手术前后施用，其中所述哺乳动物将要接受或已经接受了肿瘤破坏。
本发明的另一个实施方案涉及治疗患有癌症的哺乳动物的方法，其特征在于，所述治疗方法包括施用根据本发明的药物组合物的步骤。
本发明的又另一个实施方案涉及治疗患有癌症的哺乳动物的方法，其特征在于，所述治疗包括如下顺序的以下步骤：
a.原位肿瘤破坏，和
b.施用根据本发明的药物组合物。
本发明的再另一个实施方案涉及治疗患有癌症的哺乳动物的方法，其特征在于，所述治疗包括如下顺序的以下步骤：
a.手术前后施用根据本发明的药物组合物，和
b.原位肿瘤破坏。
实施例
实施例1
小鼠和肿瘤细胞
C57BL/6n小鼠（6-8周大）购自CharlesRiverWiga(Sulzfeld,德国)并保持在特定的位于CentralAnimalLaboratory(Nijmegen,荷兰)的无病原体栅栏条件下。无限制提供饮用水和标准实验室食物小丸，并允许小鼠在被随机分配至特定治疗组前安居至少1周。根据NijmegenAnimalExperimentsCommittee的动物护理指南进行实验。
在完全培养基(MEM,5%胎牛血清(GreinerBio-one),100U/ml青霉素G钠和100μg/ml链霉素(Pen/Strep),MEM丙酮酸钠(1mM),NaHCO3,MEM维生素,MEM非必需氨基酸(全部来自Gibco),20μM?-巯基乙醇(?-ME))中培养鼠黑色素瘤细胞系B16F10（ATCC）。
肿瘤模型和冷冻手术
将B16F10黑色素瘤细胞悬浮在PBS与Matrigel（2：1）的混合物中，并在右股处皮下注射总体积为50μl的0.5*106个细胞。当测得肿瘤直径在6-8mm（通常在9-10天）时，将该小鼠随机分配至治疗组。在异氟烷/O2/N2O麻醉下，使用液氮冷冻切除系统(CS76,Frigitronics,Shelton,CT)进行冷冻切除（Cryo），所述系统的尖端由连续的循环液氮流冷却。在两个冻融处理循环期间，肿瘤目视是冷冻的，同时保持周围健康组织的完整。为了监控对持久肿瘤保护的诱导，在冷冻切除后的40天使用15*103B16F10细胞对小鼠再次攻击。在右胁腹皮下注射处于100μlPBS中的再次攻击物(re-challenge)。当肿瘤体积超过1000mm3或当肿瘤突破皮肤屏障时，处死小鼠。
注射免疫增强剂
具有全硫代磷酸修饰的主链的CpG1668(‘5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’)购自SigmaGenosys(Haverhill,UK)。如SpehrV,WarrassR,H?cherlK,IlgT.在Appl.Biochem.Biotechnol.2011Oct;165(3-4):761-75中所述合成c-di-GMP。将CpG和/或C-di-GMP溶于PBS中进行肿瘤周注射(暂时地(p.t.)，将30μg分作两次20μl的注射遍布经切除的肿瘤)。在切除后的30min.内完成全部注射。
细胞因子测量
使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)培养小鼠骨髓树突细胞并在培养第7天收获。在过夜温育期间，将1.2x105个细胞暴露于以下免疫增强剂：CpG16681μg/ml,c-GMP10μg/ml,c-di-GMP10μg/ml。接着，小心收获上清液并确定IL12或I型IFN生产。对于IL12，根据制造商的说明(BDBiosciences)使用了ELISA方法。I型IFN由使用L929ISRE报道细胞的标准生物测定进行确定。
统计学分析
采用时序检验（logranktest）分析了KaplanMeier存活曲线。采用带有事后（post-hoc）Bonferroni检验的ANOVA分析了细胞因子数据。
结果：
如在图1的图中清楚所示，肿瘤破坏与施用CpGODN或c-di-GMP作为免疫增强剂的组合，相比仅进行切除，导致提升的60天后存活率（约50%）（图1）。然而，肿瘤破坏与施用CpG和c-di-GMP两者作为免疫增强剂的组合，导致不寻常的、>75%的60天后存活率，强于仅施用两种个别的免疫增强剂所得到的存活率。
对DC与c-di-GMP和/或CpG温育后所产生的细胞因子的分析揭示这些免疫增强剂的组合导致I型IFN与IL12的协同生产。
已知I型IFN是在抗肿瘤环境中，树突细胞与其它细胞内的有效交叉呈递所必需的(Diamond,M.S.等人,Journ.OfExperimentalMedicine208:1989-2003(2011))。
一般已知白细胞介素IL12是一种使免疫系统趋向Th1应答（该趋向总体上有利于抗肿瘤免疫）的细胞因子。
如在图2中可见的，当使用培养基、对照c-GMP或CpG时，不产生IFN或仅产生适量的IFN。此实验中c-di-GMP的用量(10μg/ml)仅导致<50U/ml的IFN生产。然而，当CpG与c-di-GMP组合时，观察到强烈的、>200U/ml的IFN协同生产。
图3证实当使用培养基、对照c-GMP或仅c-di-GMP作为免疫增强剂时，DC不产生IL12。仅CpG自身以浓度依赖的方式导致适度水平的IL12生产。然而，当CpG与c-di-GMP组合时，发现IL12的协同生产。
图例
图1：与C-di-GMP和CpG组合的切除后的抗肿瘤记忆应答。仅采用冷冻切除，或与标示的免疫增强剂组合，处理在右股处皮下生长的确立的B16F10肿瘤。在切除后于肿瘤周区域注射含在40μlPBS中的免疫增强剂(30μg)。四十天之后，在首次用于试验的和没有肿瘤的小鼠的胁腹皮下用15000个B16F10细胞进行再攻击。该再攻击物的生长以Kaplan-Meier存活曲线描述，该曲线显示：经过与CpG或c-di-GMP组合的切除后，对肿瘤长出的增加的保护，并且当CpG与c-di-GMP组合时，有着更好的防护。相比cryo/CpG/c-di-GMP，cryo/c-di-GMP的p<0.05。
图2：当与c-di-GMP和CpG组合治疗时，DC中的I型IFN协同生产。使用GM-CSF培养小鼠骨髓树突细胞并在培养第7天收获。在过夜温育期间，将1.2x105个细胞暴露于标示的免疫增强剂或免疫增强剂的组合：CpG1μg/ml,c-GMP10μg/ml,c-di-GMP10μg/ml。接着，收获上清液并由使用L929ISRE细胞的标准生物测定确定I型IFN的生产。结果以带平均数的标准误差（sem）的平均数表示，*=p<0.001vs.所有其它柱。在三个独立的实验中均得到相似的结果。
图3：当与c-di-GMP和CpG组合治疗时，DC中的IL12协同生产。使用GM-CSF培养小鼠骨髓树突细胞并在培养第7天收获。在过夜温育期间，将1.2x105个细胞暴露于标示的免疫增强剂：CpG1μg/ml,c-GMP10μg/ml,c-di-GMP10μg/ml。接着，收获上清液并由标准ELISA方法确定IL12的生产。结果以带平均数的标准误差（sem）的平均数表示，*=p<0.001。在三个独立的实验中均得到相似的结果。