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1、10申请公布号CN104131032A43申请公布日20141105CN104131032A21申请号201410362991822申请日20140728C12N15/84200601C12N15/63200601C12N1/21200601A01H5/00200601C12R1/0120060171申请人湖南农业大学地址410128湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学申请人湖南省烟草公司长沙市公司72发明人唐前君魏润洁肖启明蔡海林曾维爱杨红武胡新喜刘双清李魏周志成李迅74专利代理机构长沙正奇专利事务所有限责任公司43113代理人何为袁颖华54发明名称一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法及VIG。
2、S载体57摘要一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，该方法是首先制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒CP序列，如SEQIDNO1所示；再于烟苗剪叶后，喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的混合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将CP基因片段导入烟草。本发明同时提供一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的上述VIGS载体。本发明以种植普通烟草为试材，以烟田危害广泛的马铃薯Y病毒为靶标病毒进行具体实验验证，实验数据显示，导入CP基因的烟草获得良好的PVY病毒抗性。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专。
3、利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页附图3页10申请公布号CN104131032ACN104131032A1/1页21一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，该方法步骤如下1制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒CP序列，如SEQIDNO1所示；2烟苗剪叶后，喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的体积比为11的混合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将CP基因片段导入烟草。2如权利要求1所述的一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，所述VIGS载体为PTV00CP载体。3一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的VIGS载体，其特征在于，。
4、所述VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒CP序列，如SEQIDNO1所示。4含有权利要求3所述VIGS载体的菌株。5如权利要求4所述的菌株，其出发菌株为根癌农杆菌GV3101。权利要求书CN104131032A1/7页3一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法及VIGS载体技术领域0001本发明涉及利用RNA沉默技术诱导植物抗性技术，特别是一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法及VIGS载体。背景技术0002烟草是我国重要的经济作物。烟草马铃薯Y病毒病POTATOVIRUSY，PVY是烟草上的最重要病害之一。根据近年调查发现烟草PVY的危害日益严重，防治困难，严重影响烟草的产量和品质，已造成巨大的经。
5、济损失。目前生产上烟草PVY病毒病缺乏有效的防治措施，对烟草花叶病毒防效较好的药剂如宁南霉素、病毒A等对烟草PVY的防治效果非常有限，烟草PVY无药可防，导致农民滥用药、误打药，造成药害和烟叶中农药残留，污染环境，严重影响烟草产业的可持续发展。因此，生产上迫切需要一种新的方法来有效防治烟草PVY，保障烟草的生产安全。病毒诱导的基因沉默VIRUSINDUCEDGENESILENCING，VIGS应用于植物病毒病害的防治可能是解决此问题的有效途径之一。0003病毒诱导的基因沉默VIRUSINDUCEDGENESILENCE，VIGS是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒基因组CDNA导入植株并表达。
6、后，诱发RNA介导的防御机制RNAMEDIATEDDEFERENCE，RMD，同时诱发与插入片段同源基因的表达沉默。早在20世纪2030年代期间，人们就发现感染了病毒温和株系的植株可以抵御随后的温和株系及与其亲源关系相近的强毒株系病毒的侵染，即交叉保护现象。进一步研究发现，交叉保护现象是由于病毒诱导产生了RNA沉默，使植株产生了对该病毒的抗性，即病毒诱导的基因沉默。后来在转基因植株中出现了类似的现象，即病毒接种的初期，病毒正常增殖，接种叶片表现出被病毒感染的症状。但随着病毒在植株中的系统扩散，植株的新生叶片中虽仅含有少量的转入基因，但表现出对该病毒的抗性。RNA沉默广泛存在于真核生物中，包括真。
7、菌、藻类、昆虫、植物、原生动物、无脊椎动物和脊椎动物等。大量实验证明，病毒诱导的基因沉默是植物抗病的可能机制，VIGS与动物干扰RNAINTERFERENCE，RNAI机理上有许多相似之处，双链DSRNA是基因沉默的关键因子，VIGS启动时一般先形成双链DSRNA，DSRNA首先被称为DICER一种RNAIII酶的核酸酶降解为不同长度的小RNA，然后这些小RNA分子与RNA诱导的沉默复合体RNAINDUCEDSILENCINGCOMPLEX,RISC结合并引导RISC降解同源MRNA。2124NT的小MRNA在调节基因的表达和保护基因组中发挥着作用，这些小分子RNA能够作为沉默信号分子被放大，。
8、且植物和动物体内有不同的放大机制，通过提高DSRNA的量可以明显增强VIGS的效果。将靶病毒基因片段插入VIGS病毒载体烟草脆裂病毒TOBACCORATTLEVIRUS,TRV，插入片段随着TRV的侵染进入植物基因组，转录成DSRNA，随TRV的在植物体内的扩展产生大量DSRNA，病毒侵染植物，导致侵入病毒的靶向同源基因降解，抑制靶病毒的侵染。0004RATCIFF等将其改造成TRV的RNA1PTV00和RNA2PBNTRA6CDNA的双元表达载体，并利用TRV载体成功使转基因烟草的绿色荧光蛋白基因沉默。TRV是目前应用最广的VIGS载体，具有沉默效率高且效果持久、各种组织均可产生沉默等优点，。
9、介导基因沉默同时说明书CN104131032A2/7页4不会带来病毒诱导的症状，改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染,因而已被广泛应用于烟草、番茄、马铃薯、碧冬茄、辣椒等多种茄科植物。0005病毒外壳蛋白COATPROTEIN,CP是ORF编码的最后一个蛋白，包被病毒RNA，对病毒起保护作用。CP分为三个区域暴露在病毒粒子表面的N端、C端和中间区域。中间区域较为保守，与病毒组装、胞间连丝排通极限及细胞到细胞的移动有关。CP的N端区域最易变异，参与病毒在植物细胞间长距离的移动。CP的N端包含一个保守的氨基酸序列DAG，该基序通过与HCPRO互作参与和蚜虫口针的结合，因此CP对。
10、蚜虫的传毒很重要。此外，CP还参与调控病毒RNA复制、扩增等过程。0006选用对蚜虫传毒有重要影响的CP基因作为抗马铃薯Y病毒的靶标基因，干扰病毒的组装、移动和传播，达到防病毒效果。但到目前为止，通过基因沉默原理，特异性的沉默马铃薯Y病毒CP基因使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法还未见报道。发明内容0007本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，以及该方法涉及到的VIGS载体。0008为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，该方法步骤如下00091制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序。
11、列为马铃薯Y病毒CP序列，如SEQIDNO1所示；00102烟苗剪叶后喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的体积比为11的混合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将CP基因片段导入烟草。0011本发明同时提供一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的VIGS载体，所述VIGS载体的靶标序列为CP序列，如SEQIDNO1所示。0012本发明还保护转化有上述VIGS载体的菌株，其出发菌株为根癌农杆菌GV3101。0013本发明目的在于，以烟草马铃薯Y病毒脉坏死株系为材料，构建靶向CP基因的VIGS载体，诱发烟草自身防御机制的同时，干扰烟草马铃薯Y病毒在植物体内的复制、运输、致病性和传播，并使病毒失。
12、去保护作用，达到防御烟草马铃薯Y病毒病的目的。本发明区别现有技术的思路是构建的使烟草产生马铃薯Y病毒抗性的VIGS载体的沉默对象是入侵病毒的CP基因，而非植物本身基因。0014本发明以种植普通烟草为试材，以烟田危害广泛的马铃薯Y病毒为靶标病毒进行具体实验验证，实验数据显示，喷施菌液的烟草获得良好的PVY病毒抗性。基于本发明的构思，说明书中记载的实验方法的指导以及本领域普通技术人员所具备的常规实验技能，本领域技术人员可以将本发明的方法应用到多种烟草病毒病，这种应用都在本发明请求保护的范围内。附图说明0015图1是含PVYCP基因片段载体的构建。0016图2是含马铃薯Y病毒脉坏死株系马铃薯总RNA。
13、提取的电泳图。0017其中从左至右，第16泳道含马铃薯Y病毒脉坏死株系马铃薯总RNA提取，可以说明书CN104131032A3/7页5观察到有明显的两条带，证明RNA提取成功，可进行反转录；第7泳道2KPLUSMARK。0018图3是马铃薯Y病毒CP基因PCR扩增电泳图。0019其中，M2KPLUSMARK；1退火温度50；2退火温度52；3退火温度54；4退火温度56；5退火温度58；6阴性对照。0020图4是PTV00CP载体质粒酶切电泳图。0021其中，1PTV00CP质粒；2PTV00CP质粒酶切；M2KPLUSMARK。0022图5是大田验证PTV00CP的转入。0023其中，12阴。
14、性对照；324田间试验随机采样，反转录后用PTV00R/PTV00FPCR扩增；M2KPLUSMARK。0024图6是接种实验。0025其中，A、C表示含VIGS载体的被试烟苗，与正常烟苗无异；B、D表示喷施清水对照，有明显的脉坏死、花叶症状。具体实施方式0026本发明中所有引物皆由上海生工生物工程公司合成。0027实施例1PVY的CP基因的克隆及测序验证0028马铃薯Y病毒POTATOVIRUSY,PVY是马铃薯Y病毒属中的典型种，对马铃薯、烟草等重要经济作物危害相当严重，特别是PVY坏死株系PVYN可以造成寄主植物提前死亡而绝产。PVYCP基因序列如SEQIDNO1所示。0029本发明针对。
15、马铃薯Y病毒PVY脉坏死株系的CP基因设计引物CPF5GAGGATCCGCATTCAACCAAATCTCAACA3如SEQIDNO2所示，CPR5TAGGTACCGCATAGCGAGCCAAACTTCC3如SEQIDNO3所示，下划线部分为引入的酶切位点，采用PCR方法克隆PVY的CP基因，具体步骤如下0030提取含马铃薯Y病毒总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪检测其质量和浓度，见图2，通过反应体系RNA50NG5UG、ANCHOREDOLIGODTPRIMER1UL、2TSRECTIONMIX10UL、ENZYMEMIX1UL、GDNAREMOVER1UL、去RNA水补足至20UL进行。
16、反转录成CDNA。0031利用引物CPF/CPR，以该马铃薯Y病毒CDNA为模板，进行PCR扩增，获得PVYCP基因片段，见图3。其中，PCR反应体系为10PCR缓冲液2UL、DNA模板1UL、DNTP16UL、上下游引物各08UL、TAQ酶04UL、去离子水补足至20UL；PCR反应条件为943MIN预变性，9430SEC变性；506830SEC退火；721MIN延伸目的片段大于500BP用1分钟，小于500BP用40秒，35个循环，7210MIN，4保存。0032对PCR产物PVYCP基因片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收该PVYCP基因片段，将该回收片段与载体T1CLONINGVECTOR。
17、购自北京全式金生物技术有限公司连接，取10UL连接产物，转化大肠杆菌感受态细胞感受态大肠杆菌TRANST1CHEMICALLYCOMPETENTCELL购自北京全式金生物技术有限公司。根据载体上的氨苄青霉素抗性标记筛选阳性转化子，利用克隆载体检测引物M135AGGGTTTTCCCAGTCACG3，如SEQIDNO4所示，M135GTGTGAAATTGTTATCCGCTC3，如SEQIDNO5所示，按前述的PCR扩增方法和体系筛选阳性克隆，其PCR产物大小约530BP，与CP基因片段长度基本一致。将阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，结果与预期完全一致。说明书CN104131032A4/7页60。
18、033实施例2VIGS载体PTV00CP重组载体构建0034病毒载体烟草脆裂病毒TOBACCORATTLEVIRUS,TRV，RATCIFF等将其改造成TRV的RNA1和RNA2CDNA的双元表达载体，通过进一步改造成PTV00和PBNTRA6，本实验亦有保存。0035本发明中利用PTV00一组酶切位点BAMHI/KPNI，将PCR扩增获得的CP基因片段530BP连接到PTV00酶切位点中。将PTV00CP质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养，提取质粒用于根癌农杆菌转化。酶切验证如图4，可结合参见图1。测序结果显示序列构建位置正确。操作如下0036步骤1PTV00载体片段酶切与回收0037。
19、提取大肠杆菌中PTV00质粒质粒DNA的小量提取试剂盒。取25UL质粒，利用BAMHI和KPNI内切酶，采用100UL酶切体系，37酶切45MIN，回收酶切产物中3K左右长度的质粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光检测琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。回收片段标记为PTV00BAMHI/KPNI。0038步骤2PVYCP基因PCR片段酶切与回收0039分别纯化回收PCR产物得CP基因片段。各取25UL回收片段，利用KPNI和BAMHI内切酶，采用100UL酶切体系，37酶切45MIN，回收酶切产物中对应SEQIDNO1所示序列长度的质粒片段。取1UL回收片段，进行凝胶电泳判断回收质量。CP。
20、回收片段标记为CPKPNI/BAMHI0040步骤3PTV00BAMHI/KPNI和CPKPNI/BAMHI的连接与转化大肠杆菌0041取5ULCPKPNI/BAMHI和2ULPTV00BAMHI/KPNI以反应体系10T4DNALIGATIONBUFFER4UL、T4DNALIGASE1U/UL2UL、酶切回收后PCR片段10UL、载体50400NG4UL、无菌去离子水补足到20UL分别进行接连，用PCR仪进行控温，1616H。0042将链接产物进入大肠杆菌感受态细胞，参照实施例1中的PCR扩增方法和反应体系，于筛选平板加入50MG/L卡那霉素KAN为抗生素筛选阳性转化子，利用克隆载体检测引。
21、物M13/检测转化子，选择PCR检测为阳性的转化菌，测序验证得到重组载体，标记为PTV00CP。0043实施例3PTV00CP重组载体转化农杆菌GV31010044步骤1根癌农杆菌感受态细胞制备00451挑选根癌农杆菌GV3101菌落，接种于含有50MG/L的利福平的液体LB培养基中，28200RPM培养16H。00462取500ULGV3101菌液至50ML液体LB培养基中摇陪至OD600值为06左右。00473将菌液冰浴30MIN，4。5000RMP离心10MIN，收集菌。00484用40ML预冷的10甘油重悬菌体，44500RMP，离心10MIN，收集菌体。00495用20ML预冷的10。
22、甘油重悬菌体，44500RMP，离心10MIN，收集菌体。00506用10ML预冷的10甘油重悬菌体，44500RMP，离心10MIN，收集菌体。00517用2ML预冷的10甘油重悬菌体，分装每管50ML液氮速冻。80保存。0052步骤2PTV00CP电击转化进GV310100531从80冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。00542取1UL纯化后的PTV00CP质粒于15ML的离心管中，将其和01CM的电击杯说明书CN104131032A5/7页7一起置于冰上预冷。00553将100UL解冻的感受态细胞转移至15ML的离心管中，小心混匀，冰上放置10MIN。00564打开电转仪，调至MANA。
23、L，使其电压21KV。00575将此混合物转移至已预冷的点击杯中，轻轻敲击电击杯，使其混合物均匀进入电击杯的底部。00586将电击杯推入电转化仪，按4中设定的参数，听到蜂鸣后，向电击杯中迅速加入1ML的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到15ML的离心管中。0059728、200RMP震荡培养3H。00608取50100UL菌液涂布在加有抗生素KAN和RIF的LB培养基上，平板正向放置1H，28倒置培养23天，直至菌落长出。00619以实施例1中的PCR扩增方法和反应体系，利用克隆载体检测引物M13/筛选阳性克隆，阳性克隆PCR产物大小约530BP，与预期大小一致，选择PCR检测为阳性转化菌，。
24、测序验证得到根癌农杆菌阳性菌液，标记PTV00CPGV3101。0062实施例4含CP基因烟草的获得0063步骤1PTV00CP导入被试烟草0064128、200RMP培养PTV00CPGV3101和PBNTRA6GV3101菌液，摇至OD600为0406左右；00652将PTV00CPGV3101和PBNTRA6GV3101以11比例混合在一起，放置30MIN；00663选取将剪叶的烟草苗，进行剪叶，喷施2中所述的混合菌液；0067410MIN后，用清水喷施，将叶片菌液洗净；00685每隔3天喷施1次，连续喷施3次。0069步骤2被试烟草RTPCR检测0070待育苗盘烟草长至足够移苗，提取被。
25、试烟苗RNA，反转录合成CDNA，利用引物PTV00R5TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC3，如SEQIDNO6所示；PTV00F5GGCAATCAGGTGCGACAATC3，如SEQIDNO7所示，RTPCR检测CP基因是否成功转入被试烟草中。结果如图5所示，显示CP基因成果转入。0071实施列5VIGS技术处理烟草的抗性确定0072本实验原理，TRV侵染烟草引起防卫反应，同时由于TRV的侵染将PVYCP基因导入烟草，启动VIGS，PVY侵染烟草时引起CP基因同源降解，抑制PVY的侵染。0073待田间烟草进入旺长初期，摩擦接种马铃薯Y病毒脉坏死株系病毒。00741配置001M。
26、OL/L、PH70磷酸缓冲液。PBS配置KCL02G、KH2PO402G、NACL80G、NA2HPO42H2O156G、溶于1000ML三蒸水中，分装消毒，高压锅中12120MIN消毒；00752病毒制备取实验室保存含马铃薯Y病毒脉坏死株系烟草发病叶片。按1200比例加磷酸缓冲液，捣碎，双层纱布过滤后立即使用；00763借种方法选取长成新叶，在表面均匀撒上碳化硅600目，用毛笔蘸取接种悬浮液，在叶面轻度摩擦造成微伤，每株接种1片叶，接种后20MIN用清水冲洗叶面上多余的病毒汁液。接种当天温度为2030，正常栽培管理；00774病情调查与分级标准，根据国家病害调查标准GB/T233222200。
27、8。说明书CN104131032A6/7页8007800795调查时间在接种后约30D进行；00806调查记载每一鉴定植株的病情级别，并计算病情指数、防治效果。病情指数按下列公式计算0081发病率发病棵树/统计总数0082病情指数各级病株数病级值/调查总株数最高病级值0083防治效果对照病指吃力病指/对照病指。0084湖南省浏阳市永安镇烟草基地中历年PVY发病较重的烟田，烟苗3月25日移栽，覆盖地膜，行株距为1205M。选取健康、长势、土壤肥力均等的G80烟田，人工摩檫接种发病。划分4个小区，每个小区5排，每排19株，每小区共95株，共试验380株处理情况如下标记119行、3947行为空白CK。
28、组栽植剪叶后喷施清水处理的烟苗，2038行、4856行为处理CP组栽植剪叶后喷施本发明混合液处理的烟苗。4月26日全部摩檫接种PVY，30D后，调查PVY发病率，病情统计结果见下表1，结合参见图6。0085表1本发明混合液对PVY田间防治效果0086处理发病株数发病率病情指数防治效果处理一CK组737604603000处理二CP组14145811578081处理三CK组7073686900000处理四CP组212186193367940087由上表1可知，烟苗剪叶后利用本发明混合液处理的CP组，较用清水处理的CK组说明书CN104131032A7/7页9不论是发病率还是病情指数都大幅度减弱，且防效极为显著。本发明混合液对PVY田间防效均达到60以上。因此，本发明技术和施用方法对PVY的防治有一定的应用价值。说明书CN104131032A1/2页1000010002序列表CN104131032A102/2页11序列表CN104131032A111/3页12图1图2说明书附图CN104131032A122/3页13图3图4说明书附图CN104131032A133/3页14图5图6说明书附图CN104131032A14。