菘蓝4香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族编码序列及应用.pdf

本发明提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的三段编码序列，分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：其序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。本发明还提供了一种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶松脂素的生物合成的应用。本发明在育种和生物能源方面具有重要的应用价值。

1.  编码菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的核苷酸序列，其特征在于：
其中，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

2.  菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：
其序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。

3.  一种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶松脂素的生物合成的应用。

菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族编码序列及应用
技术领域
本发明涉及菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的核苷酸序列及其应用，本发明还涉及菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列，属于生物技术领域。
背景技术
菘蓝为十字花科植物，其根入药，即为常用中药板蓝根，有清热解毒，凉血利咽等功效，应用十分广泛，主要制剂有板蓝根颗粒、板蓝根含片等，临床用于流行性感冒、流行性乙型脑炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、带状疱疹等。化学成分及药理活性研究表明落叶松脂素是菘蓝发挥抗病毒功效的重要活性物质基础。因此，提高落叶松脂素的含量是获得抗病毒活性高的优良菘蓝品系的关键，具有重要的应用价值；同时，落叶松脂素属于木脂素类成分，降低菘蓝中落叶松脂素的含量，减少木质化的程度，能有效降低以其作为原料转化为生物燃料的难度，对于生物能源的生产也具有重要意义。
植物次生代谢工程是利用基因工程和分子生物学方法阐明植物次生代谢产物生物合成的机制，了解清楚代谢途径和相关酶的信息，对控制生物合成路径的基因进行调控，从而达到在分子水平上改造代谢途径，调控目标产物的定向合成，趋利避害，提高或降低植物中特定化合物产量的目的。经文献检索发现，4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）对落叶松脂素的生物合成起到了非常重要的调控作用，是木脂素代谢工程的重要靶点。因此，从菘蓝中分离获得4-香豆酰辅酶A连接酶并利用其进行目标性的代谢调控，一方面有可能打破落叶松脂素生物合成限速瓶颈，获得落叶松脂素高产的高品质菘蓝株系；另一方面有可能降低以落叶松脂素为代表的木脂素的含量，减少菘蓝木质化的程度，为生物能源的生产提供有效的原材料。目前尚未发现与本发明所提及的菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白及应用的相关报道。
发明内容
本发明提供了编码菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：其序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶松脂素的生物合成的应用。
发明作用与效果
本发明提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的三段编码序列，分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：其序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶松脂素的生物合成的应用。
附图说明
图1是Ii4CL蛋白的氨基酸序列与拟南芥中4CL蛋白氨基酸序列的比对；
图2是Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3融合蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中原核表达的SDS-PAGE检测；
图3是Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3经纯化的融合蛋白的SDS-PAGE检测；
图4是抑制Ii4CL1的株系与野生型株系的Ii4CL1的相对表达量；
图5是抑制Ii4CL1的株系与野生型株系的落叶松脂素的含量对比；
图6是抑制Ii4CL2的株系与野生型株系的Ii4CL2的相对表达量；
图7是抑制Ii4CL2的株系与野生型株系的落叶松脂素的含量对比；
图8是抑制Ii4CL3的株系与野生型株系的Ii4CL3的相对表达量；以及
图9是抑制Ii4CL3的株系与野生型株系的落叶松脂素的含量对比。
具体实施方式
<实施例一>菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶家族基因的克隆
1.组织分离
菘蓝（I.indigotica）叶片采集自第二军医大学药学院植物园，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。
2.mRNA的分离
取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，使用TRIzol(TRIzol Reagents,Gibco,NY,USA)试剂抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。
3.基因克隆(Cloning of the gene)
3.1.第一链cDNA的合成
3.2.菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶家族基因（Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3）编码区的PCR扩增
根据GenBank登录的4CL基因家族的编码序列（Genbank accessionNo.GU937875，Genbank accession No.KC430622，Genbank accession No.KC430623），设计扩增出完整编码框的上下游引物分别为：
4CL1-F:ATGGAGAAATCCGGCTACGG;(SEQ ID No.7)
4CL1-R:TCACATCTTGGATCTT ACTT;(SEQ ID No.8)
4CL2-F:ATGGTGCTCCAACAACAACA;(SEQ ID No.9)
4CL2-R:CTACTTAGGGTACTCG GTTT;(SEQ ID No.10)
4CL3-F:ATGCAGAAACAGAGCAGCAA;(SEQ ID No.11)
4CL3-R:TTAGTTCACCAACCCA GTTG(SEQ ID No.12)
并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建表达载体。以第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。 ··A序列测定由上海博亚或晶泰生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank登录的菘蓝4CL基因编码序列一致（表1至3）。
表1.菘蓝Ii4CL1基因的全长cDNA及氨基酸序列

表2.菘蓝Ii4CL2基因的全长cDNA及氨基酸序列

表3.菘蓝Ii4CL3基因的全长cDNA及氨基酸序列

<实施例二>菘蓝Ii4CL基因家族的序列信息与同源性分析
Ii4CL1全长cDNA为1967bp(GenBank登录号:GU937875)，包含一个1629bp的开放阅读框(ORF)，编码543个氨基酸，等电点(pI)为8.59，分子量大小约为59.5kDa；
Ii4CL2全长cDNA为1975bp（Genbank登录号:KC430622)，包含一个1692bp的ORF，编码564个氨基酸，等电点(pI)为5.09，分子量大小约为62.2kDa；
Ii4CL3的全长cDNA为1932bp（Genbank登录号:KC430623），包含一个1629bp的ORF，编码543个氨基酸，等电点(pI)为5.52，分子量大小约为59.1kDa。
BLAST结果显示，Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3与其他植物的4CLs蛋白有较高的相似性。图1是Ii4CL蛋白的氨基酸序列与拟南芥中4CL蛋白氨基酸序列的比对。图中4CL蛋白特有保守位点用黑色框标记。
通过ClustalX软件，全长序列比对的结果显示，Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3都具有4CL蛋白特有的结构域，如位于Ii4CL肽链上第197-207位的11个氨基酸残基（SSGTTGISKGV）组成的Motif1，该结构域是AMP的结合位点；位于Ii4CL肽链上第389-395位的7个氨基酸残基（GEIWVRG）组成Motif2，该结构域是4CL蛋白的催化位点。由此可推测，Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3与其它植物中4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）在功能上也有很高相似性。
<实施例三>菘蓝Ii4CL家族蛋白的制备与酶活测定
根据菘蓝Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3的蛋白编码序列，分别设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5'和3'端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的Pet32a载体而定)，以便构建表达载体。将Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3在保证阅读框正确的前提下克隆至Pet32a载体。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5α，筛选鉴定得到分别含有pet32a-Ii4CL1、pet32a-Ii4CL2、pet32a-Ii4CL3表达载体的工程菌DH5α-pet32a-Ii4CL1、DH5α-pet32a-Ii4CL2、DH5α-pet32a-Ii4CL3。
分别挑取单菌落的DH5α-pet32a-Ii4CL1、DH5α-pet32a-Ii4CL2和DH5α-pet32a-Ii4CL3工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1：100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培 养4小时。取1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，沉淀和上清分别加入12%SDS-PAGE胶中电泳。图2是Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3融合蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中原核表达的SDS-PAGE检测。如图2所示SDS-PAGE检测，发现带有目的基因的阳性克隆菌株在有IPTG诱导的条件下，均有特异的目的蛋白的高表达，Ii4CL1分子量约为78kDa，Ii4CL2分子量约为80kDa，Ii4CL3分子量约为77kDa，由于空载体阴性对照表达标签蛋白（Trx·Tag^TM、His·和S·Tag^TM）分子量约为18kDa，表达蛋白去除标签蛋白的分子量与预测的Ii4CL1分子量约为60kDa，Ii4CL2分子量约为62kDa，Ii4CL3分子量约为59kDa相符，说明Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3基因在pET-32a中能成功利用载体的表达元件进行表达，并且在沉淀和上清中均有融合蛋白的表达。
按上述方法大量表达菘蓝Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3蛋白，收集上清加入一定体积的NTA-琼脂糖(Qiagen,Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次，用含20mM N,N'-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。图3是SDS-PAGE检测Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3经纯化的融合蛋白，如图3所示，经纯化和除盐后的融合蛋白经SDS-PAGE检测，呈现出清晰明显的单一条带，且分子量大小正确，证明获得了纯度较高的融合蛋白。Bradford法检测提取的菘蓝Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3蛋白的纯度。
酶活相关参数的测定：选取肉桂酸、4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸为底物，在500ul反应体系：2.5mMATP（三磷酸腺苷），2.5mM氯化镁，0.2mM辅酶A，100mM pH=7.5Bis–Tris–propane缓冲液，0.2-0.4mM底物，适量纯化蛋白中逐一反应，条件是pH=7.5，30℃。其中，肉桂酸、4-香豆酸、阿魏酸的反应时间为5分钟，咖啡酸、芥子酸的反应时间是2分钟，以10umol冰醋酸终止反应。待反应结束后，相应的辅酶A酯的生成通过紫外分光光度计检测相应波长（肉桂酸-311nm、4-香豆酸-333nm、咖啡酸-346nm、阿魏酸-345nm、芥子酸-352nm）下吸光度的增加来判断，消光系数依次为22000、21000、18000、19000和20000 mL mmol^-1cm^-1，可用来计算形成的酯的浓度。根据Lineweaver–Burk作图法，求得K_m，k_cat，k_enz。结果如表4所示：菘蓝中各4CL具有不同的酶活性，且有底物选择性。Ii4CL2可与除肉桂酸外的四种底物催化结合，且催化能力均较强；Ii4CL3与咖啡酸、阿魏酸有较强的结合能力，催化肉桂酸能力较弱，不能催化4-香豆酸和芥子酸；Ii4CL1与5种底物均不能催化结合。
表4Ii4CL蛋白的动力学参数


<实施例四>通过调控菘蓝Ii4CL家族蛋白的表达改变落叶松脂素的生物合成
根据Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点，PCR扩增产物反向插入至表达载体pCAMBIA1304，构建基因抑制表达载体，再分别将其转入发根农杆菌C58C1中，利用叶盘法技术转化菘蓝。
1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落,接种于2ml YEB液体(100mg/L Kan+40mg/L Rif)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；
2.室温下4,000g离心10min；
3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600=0.5左右；
4.取生长两周左右的菘蓝的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；
5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；
6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；
7.将叶片转到除菌培养基上（1/2B5+Cef500mg·L^-1）于（25土1）℃暗培养，约15d后，从叶片伤口边缘长出发根（独立编号），每隔7d继代一次；
8.挑选潮霉素筛选后仍生长良好的发根系，每个单克隆发根进行独立编号。野生型发根依次编号为WT1、WT2……；转Ii4CL1的发根依次编号为D1、D2……;转Ii4CL2的发根依次编号为E1、E2……;转Ii4CL3的发根依次编号为F1、F2……
9.将编号过的发根继代到1/2B5＋Cef250mg·L^-1的固体培养基上，不再添加筛选压以利于发根生长，并不断降低Cef浓度（250mg·L^-1→150mg·L^-1→100mg·L^-1→50mg·L^-1→0mg·L^-1），直到完全除菌进行1/2B5培养基液体培养 获得Ii4CL转基因的发根系。
分别根据Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3的全长编码序列，设计实时定量Realtime-PCR的引物，检测转基因发根中各个Ii4CL的表达水平；并用HPLC对发根中目标化合物落叶松脂素进行含量测定。结果如图4至图9所示，图中WT代表野生型发根；D、E、F株系分别代表抑制表达Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3的转基因发根。图4和图5显示抑制表达4CL1对落叶松脂素的含量几乎没有影响；图6和图7显示抑制表达4CL2显著提高了转基因发根中落叶松脂素的含量，提高最多的株系含量达到92.2μg/g，是野生型株系的约2.5倍；图8和图9显示抑制表达4CL3能显著降低落叶松脂素的含量，含量最少的株系仅有13.8μg/g，是野生型株系的约0.4倍。因此应用中可以通过调控不同的4CL基因的表达水平获得不同积累水平的落叶松脂素。
通过上述方法调节落叶松脂素的意义在于：一方面，落叶松脂素是重要的抗病毒活性成分，可通过抑制表达4CL2提高落叶松脂素的含量，获得抗病毒有效成分高的优良株系。
另一方面，落叶松脂素属于木脂素类成分，抑制表达4CL3能显著降低落叶松脂素的含量，减少木质化的程度，从而能有效降低其作为原料转化为生物燃料的难度，对于生物能源的生产具有重要意义。