棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8的应用.pdf

本发明涉及植物病理学和微生物基因工程领域，具体涉及棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8的应用。本发明通过基因敲除和基因互补试验，明确了基因CYC8在棉花黄萎病菌致病性、分生孢子产生、微菌核产生、黑色素积累和纤维素酶活性方面行使着重要功能。本发明所提供的基因和蛋白质的表达和修饰可作为靶位点用于设计和筛选抗真菌药剂。

1.  棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8用于筛选棉花抗黄萎病真菌药剂的应用，其中，基因CYC8的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8的应用
技术领域
本发明涉及植物病理学和微生物基因工程领域，具体涉及棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8的应用。
背景技术
棉花是关系到我国国计民生的重要经济作物之一，在国民经济发展中起到举足轻重的地位，被誉为棉花的“癌症”病害——黄萎病，是全生育期的系统性、土传维管束病害，可在整个生育期侵染危害，导致棉花大幅减产，经济损失惨重。我国主要病原菌是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)，属半知菌亚门，丛梗孢目，淡色孢科，轮枝菌属。其中，病原菌的致病机理不清，抗病育种滞后，品种抗性丧失快，缺乏环境友好且防治效果好的杀菌剂，是该病防治难度大，爆发成灾的主要原因。为了较好的控制一种植物病害，明确病原菌的侵染过程和致病机理是必要的基础性工作。
目前，棉花黄萎病侵染棉花的过程是比较清楚的，土壤中微菌核或分生孢子受棉花根系分泌物的刺激，开始萌发，产生的菌丝在寄主根表面定殖、穿过表皮、在皮层中发生及在棉花体内扩展，最终导致症状的形成。与其它病害相比，土传病害的病原真菌尤其是棉花黄萎病菌分子致病机理的研究明显滞后，因此分离鉴定致病相关基因并进行功能验证显得迫在眉睫。由于大丽轮枝菌的休眠体微菌核和分生孢子是主要的接种体，因此分离得到同时调控微菌核和分生孢子产生的致病相关基因，并进行全面的功能分析，为揭示其分子致病机理提供理论依据，也为棉花定向抗病育种提供可靠的靶位点，对有效防治棉花黄萎菌病菌具有重要意义。
细胞壁作为植物的第一道物理屏障，在防御病原菌方面起重要作用。大丽轮枝菌在侵染寄主植物时产生各种细胞壁降解酶，如果胶酶、纤维素酶等，这些细胞壁降解酶能降解寄主植物的细胞壁，打破寄主的物理屏障，有利于病原菌的定殖、传播和症状的扩展。研究表明，大丽轮枝菌菌株产生纤维素酶能力与侵染力呈显著正相关，细胞壁降解酶在大丽轮枝菌致病中作为毒力因子而起作用。应用生物信息学方法分析大丽轮枝菌VdLs.17基因组序列发现，含有大量的编码碳水化合物活性酶类(Carbohydrate-activeen-zymes)如果胶酶、纤维素酶等，这可能是大丽轮枝菌能够在广泛的寄主植物上定殖的重要原因之一。目前，已经有少数大丽轮枝菌的致病 基因的功能已经得到了分析验证。
在真核生物中，复杂的生长发育过程对环境变化的响应，常常依赖于基因表达的精细调控。一般来说，大部分基因的表达变化都是受转录水平或抑制或促进的调控。也就是转录因子结合在特异识别的DNA位点，使该基因不能表达为负调控；从靶基因上去除阻遏蛋白，RNA聚合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达为正调控(Berk et al.,1999)。
CYC8(也叫做Ssn6)是由Trumbly(1988)首次克隆得到的，该基因全长为3.5kb，编码966个氨基酸，蛋白分子量是107215D，在N端和C端分别有16个和31个谷氨酸串联结构域，是一类葡萄糖阻遏蛋白。CYC8和Tup1蛋白共同组成CYC8-Tup1抑制子，是真菌中最为重要的一类阻遏蛋白复合物,在转录水平行使着功能。作为重要的转录调控因子，虽然存在保守结构域，但是在不同真菌中起到的作用各有不同。在Saccharomyces cerevisiae中，3％的功能基因表达都受到CYC8-Tup1的不同程度的调控。缺失CYC8的突变体会表现为低生长速率、低产孢量、无法从培养基中利用胸(腺嘧啶脱氧核)苷、葡萄糖抑制作用的丧失和对胁迫环境的应答缺陷(Smith et al.,2000)。在Aspergillus niger中，Tup1-Cyc8控制细胞壁合成、发育并且影响氮源利用能力(Schachtschabe et al.,2013)。但是，CYC8对植物病原真菌致病力的影响却未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一个来源于棉花黄萎病菌的、在致病性、分生孢子产生、黑色素积累、微菌核产生和纤维素酶活性中起重要作用的基因CYC8，通过鉴定该基因可为防治棉花黄萎病害提供药物靶标。
为了解决上述技术问题，本发明提供的棉花黄萎病菌的致病相关基因CYC8(Glucose repression mediator protein CYC8)来自大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明同时提供了上述基因CYC8的编码区序列，具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明同时提供了上述基因CYC8编码的蛋白质序列，该蛋白质序列具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本发明的通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突变体库，获得了致病力减弱的突变菌株T286。Southern杂交证实该突变菌株为T-DNA单插入 突变体。借助TAIL-PCR技术和VdLs.17的基因组数据库，获得了T-DNA插入的侧翼序列，并从野生型菌株Vd080中成功克隆得到了致病相关基因CYC8。
本发明利用农杆菌介导的方法，将CYC8敲除载体转入野生型菌株Vd080，得到了三个表型稳定的基因缺失突变体ΔCYC8-45、ΔCYC8-55和ΔCYC8-56；将CYC8互补载体导入转化子T286，获得三个回补突变体ΔCYC8-C26、ΔCYC8-C30和ΔCYC8-C36。
本发明测定了三个敲除突变体和三个回补突变体的生物学性状、胞外酶活性以及对棉花的致病性，并与野生型Vd080和转化子T286进行比较分析。结果表明：敲除突变体ΔCYC8较野生型Vd080相比，分生孢子的产量骤减，降低了一个数量级；且不产生微菌核；纤维素酶活性极显著降低，对纤维素的利用能力较野生型降低了16.0-24.7％；致病力测定结果表明，敲除突变体ΔCYC8对棉花的致病力平均降低了60.3％。而回补突变体ΔCYC8-C的上述性状得到不同程度的恢复，接近野生型。因此判断CYC8基因是棉花黄萎病菌中重要的致病相关基因，关联分生孢子和微菌核的产生、黑色素的积累，并对纤维素酶的活性有一定贡献。
附图说明
图1显示源于突变体T286中CYC8的基因信息(A T-DNA插入拷贝数分析；B TAIL-PCR电泳图；C CYC8基因结构图。
图2为CYC8敲除载体构建示意图，A CYC8融合片段获得示意图；B Gateway技术获得敲除载体pGKO2-CYC8示意图。
图3显示阳性敲除突变体ΔCYC8的获得以及与野生型Vd080和T286培养性状比较图示，A三步法构建敲除转化子的电泳图谱；B阳性敲除突变体的分子检测图谱；C RT-PCR检测CYC8的表达量；D培养性状比较图示。
图4显示野生型Vd080、T286和回补突变体ΔCYC8-C培养性状和荧光观察比较图示，第一列PDA培养基上培养性状观察；第二列显微镜普通视图；第三列荧光照片。
图5为敲除突变体ΔCYC8在不同碳源(脱脂奶粉、淀粉、纤维素)培养基上生长示意图；
图6为回补突变体ΔCYC8-C在不同碳源(脱脂奶粉、淀粉、纤维素)培养基上生长示意图。
图7显示敲除突变体ΔCYC8和回补突变体ΔCYC8-C致病力测定，AB：病情指数；CD：野生型Vd080、T286与敲除突变株侵染棉花的表型)、。
具体实施方式
实施例1：突变体T286的获得
以分离自河北辛集重病田的棉花黄萎病菌Vd080为出发菌株，将携带有pCTHyg双元载体的农杆菌，采用农杆菌介导转化(ATMT)的方法，构建容量为2000个的携带有潮霉素(HPH)抗性筛选标记的T-DNA插入突变体库。以陆地棉感病品种冀棉11为鉴别寄主，采用蛭石沙土无底纸钵定量接菌液法，测定了800个棉花黄萎病菌突变体的致病力。历经初筛和复筛两轮筛选，得到31株致病力极显著降低的突变体，并评价了其生物学性状的各项指标。结果显示，低致病力T286较野生型致病力有了大幅下降(降低了77.1％)，不产微菌核和黑色素，分生孢子产量骤减。
实施例2：CYC8基因的分离和克隆
2.1Southern杂交确定突变体T286T-DNA插入拷贝数 
根据T-DNA上大小约为500bp的潮霉素片段序列设计Southern杂交探针引物HygP-F/R。低致病力突变体T286的基因组DNA 5ng，NEB buffer 10μL，BamHⅠ3μL，补水至100μL。37℃消化5h，之后，65℃水浴10min，终止酶切反应。探针制备、DNA变性、转移、杂交及显色方法按照试剂盒说明书进行。
以T-DNA上的潮霉素区段做探针的Southern blot结果表明，探针在低致病力突变体T286基因组上只有一个杂交信号。说明T-DNA在突变体T286中为单拷贝插入(图1A)。
2.2TAIL-PCR技术获得失活基因信息
根据双元载体pCTHyg中T-DNA左臂(LB)和右臂(RB)内侧DNA序列，利用NCBI中的Primer Blast在线工具分别设计3′和5′步移引物R-SP1、R-SP2、R-SP3和L-SP1、L-SP2和L-SP3(表1)，结合Genome Walking试剂盒(Takara提供的简并引物AP1、AP2、AP3和AP4，步移引物与随机引物成对作为模板扩增T-DNA左右臂侧翼序列。所用反应程序及反应体系均按照试剂盒说明书操作。反应结束后，取上述第一轮、第二轮、第三轮的反应产物于1％的琼脂糖凝胶电泳上检测(图1B)。分别回收3′端和5′端第三轮TAIL-PCR特异产物，克隆测序。测序结果先与T-DNA进行两两比对，并在Verticillium dahliae Vd17基因组数据库中做BLAST分析，得知T286中被失活的基因是glucose repression mediator protein CYC8，在基因组数据库中的编号为VDAG_07052。该基因位于大丽轮枝菌的第五条染色体 上，由3201个碱基组成，包括7个外显子和6个内含子(图1C)。
表1 TAIL-PCR步移特异引物 

2.3CYC8基因的克隆和系统发育树的构建
设计致病相关基因的高特异引物CYC8FullF/R(ATGGCGATGCAGGCGCAACA/TGATCTTTGATTTATATTCA)，从强致病力、菌核型菌株Vd080基因组中扩增致病相关基因。扩增体系为：2×Mix 10μL，上下游引物各1μL，模板1μL,补水至20μL；反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min/kb，共30个循环；最后72℃延伸10min。测序结果显示，棉花黄萎病菌强毒力菌株Vd080中的CYC8基因与莴苣黄萎病菌Vd17中的VDAG_07052(VdLs.17)序列相似性高达99％。
实施例3：CYC8基因敲除突变体的获得
3.1敲除载体的构建
CYC8敲除载体的构建采用两步法：CYC8同源重组片段的获得和与基因敲除载体pGKO2-Gateway连接。
3.1.1CYC8同源重组片段的获得
(1)CYC8上下游片段和HPH功能盒的获得。以CYC8的上游2000bp和下游2000bp为模板分别设计高特异引物P1/P3和P4/P6，根据携带有trpC启动子的潮霉素基因的pCTHyg质粒的序列设计高特异引物HygRH-F/R，分别从Vd080和双元载体pCTHyg扩增得到CYC8的Up、Down和HPH功能盒(图2A，图3A)。
(2)融合片段的获得
以第一轮PCR纯化后的三种反应产物为模板，引物P3和P4中的接头和潮霉素片段的两端特异识别，使潮霉素抗性基因片段的两端与CYC8基因的上下游DNA片段首尾相接。PCR体系为：2×Trans Taq High Fidelity Mix 25μL，CYC8上下游片段各80ng，潮霉素基因片段240ng，补水至50μL；反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火2min，72℃延伸4min，共12个循环(图2A，图3A)。
(3)巢式PCR获得同源重组片段
以第二轮PCR产物为模板，以带有Gateway BP反应接头(表2中以波浪线表 示)的P2/P5为巢式引物，特异性扩增上述融合DNA片段KO-CYC8。扩增体系为：2×Trans Taq High Fidelity Mix 25μL，第二轮反应产物1μL，P2/P5各1μL，补水至50μL；反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸4min，共30个循环。
融合片段通过Gateway BP反应整合到pGKO2-Gateway载体并转化大肠杆菌Trans 1，具体操作参照Invitrogen公司BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix说明书。筛选阳性克隆并测序验证，获得敲除载体pKO-CYC8(图2A，图3B)。引物见表2。
表2 构建敲除载体所用的引物及序列

注：下划线部分代表与Hyg-F/R反向互补的序列；波浪线部分代表Gateway BP反应的接头序列attB1和attB2；
3.2敲除突变体的获得和验证
将上述构建好的CYC8敲除载体，通过ATMT的方法导入Vd080基因组中，基于同源重组和随机插入致死的原理，T-DNA随机插入的转化子由于携带了致死基因HSVtk，该基因的产物可将F2du转化为毒性物质，导致随机插入转化子死亡，敲除转化子可以在底物F2du(5-氟脱氧尿苷)存在的情况下正常生长。
分别利用CYC8基因引物CYC-QCJC-F/R(GCGTTCGAAAAGGCCAACGA/CGTTGGTCATCGAATCGGCG)和潮霉素引物HygRH-F/R对Vd080、T286和敲除转化子进行PCR检测，结果显示，除了Vd080的基因组中拥有CYC8基因的目的条带，T286和敲除转化子中均无目的条带的出现(图3-B1)，同样除了Vd080的基因组无潮霉素条带，其他样品均扩增除了1.8kb的目的条带(图3-B2)。RT-PCR结果和上述结果一致，仅有Vd080中的CYC8基因正常表达，敲除转化子检测不到CYC8的表达(图3-C)。综上所述，阳性转化子中的CYC8基因被成功敲除，通过单孢纯化和续代培养得到△CYC8-45、△CYC8-55和△CYC8-56三株性状稳定的阳性敲除转化子(图3-D)。
实施例4：VdCYC8基因回补突变体的获得
4.1互补载体的构建
分析Vd080中CYC8基因的全长序列(包括该基因的启动子区、ORF和终止区)，结合带有氯嘧磺隆抗性的骨架互补载体pSULPH-gfp的多克隆位点，设计高特异引物CYC13-hb1F/R(GAATTCTCCTGTCGCCAACTCGATCC/CTTAAGATGCCAGCCTTGTAGCCCAT)，且在引物的5′端加上限制性内切酶识别位点的接头。其中引物CYC13-hb1F中含有EcoRⅠ的识别位点，引物CYC13-hb1R中含有AflⅡ的识别位点(下划线所示)，目的片段大小为4.3kb。利用酶切连接的方法将CYC8全长序列和pSULPH-gfp首尾相连，得到互补载体pSUL-CYC8。
4.2回补突变体的获得
互补载体pSUL-CYC8的遗传转化基本步骤与敲除载体的转化相似，采用冻融法将互补载体pSUL-CYC8转入农杆菌AGL-1，导入受体T286中，在添加有50μg/mL Cef，50μg/mL Spe，50μg/mL Hyg和50μg/mL Chl的PDA筛选培养基上进行培养，25℃培养7d后转化子菌落出现。以双元载体pSULPH-gfp中GFP基因和CYC8基因作为阳性转化子分子检测的对象，得到了3株表型稳定的回补突变体△CYC8-C26、△CYC8-C30和△CYC8-C36。由于其含有GFP标记，在荧光显微镜下观察均表现为绿色荧光(图4)。
实施例5：突变体的生物学性状分析
5.1菌落形态观察 
以野生型菌株Vd080为对照，在PDA培养基的中央滴5μL浓度为1×10⁷个/mL的突变体孢子悬浮液，每个菌株5个重复，25℃恒温静置培养10天，记录菌落的生长形态。结果显示，T-DNA插入突变体T286和敲除突变体△CYC8菌株均为白色菌丝型，CYC8回补突变体△CYC8-C为菌核产量不一的中间型(图3D和图4)，说明CYC8基因的表达与微菌核和黑色素的合成有关。
5.2生长速率测定 
分别于5d、7d、9d和11d采用十字交叉法测定菌落生长直径，计算生长速率。敲除变体的生长速率较野生型相比显著降低，其中CYC8-45长势最慢，生长速率低至2.4mm/d。而回补突变体的生长速率较敲除突变体表现出显著回升的趋势，与野生型无显著差异(表3)。说明CYC8影响棉花黄萎病菌的生长速率。
表3 野生型和突变体生长速率和粗毒素的分析


5.3粗毒素含量测定
以野生型菌株Vd080为对照，在40mL查式培养基中滴5μL突变体孢子悬浮液，25℃，150r/min振荡培养25d后，取菌液1.5ml 13000r/min，离心30min。取上清，依据考马斯亮蓝G-250法，以牛血清蛋白为标准蛋白作标准曲线，用酶标仪(Synergy HT，美国BioTek公司)测定黄萎病菌毒素的蛋白浓度作为粗毒素含量。结果显示，敲除突变体和回补突变体的粗毒素含量均比野生型低，敲除和回补突变体的粗毒素分泌量差异不大(表3)。说明CYC8在棉花黄萎病菌粗毒素产量方面的贡献甚微。
5.4分生孢子产量测定
以野生型菌株Vd080为对照，在40mL查式培养基中滴5μL突变体孢子悬浮液，25℃，150r/min振荡培养6d后，借助血球计数板测定其产孢量。结果显示，在培养到第6天时，T286和敲除突变体的产孢量较野生型Vd080有大幅下降，有一个数量级的差异，回补突变体的产孢量略低于野生型，但是较敲除突变体和T286都有了大幅回升。随着培养时间的延长，菌株的产孢量处于动态变化当中，或呈现先增后减，或呈现逐步减少。到了第14天，敲除突变体较野生型相比产孢量仍有一个数量及的降低(表4)。表明，CYC8的表达影响棉花黄萎病菌分生孢子的产量。
表4 野生型和突变体产孢量的分析

实施例6：突变体胞外酶活性的测定
取5μL浓度为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液，分别置于脱脂奶粉、纤维素、淀粉为唯一碳源的培养基中，每个菌株3个重复，25℃恒温静置培养11天，记录菌落的生长形态。并分别于3d、5d、7d、9d和11d采用十字交叉法测定菌落生长直径，计算生长速率。以野生型Vd080菌株为对照，通过比较菌落周围透明圈的有无或大小判断突变体菌株间胞外酶活性差异。
在不同碳源(脱脂奶粉、纤维素、淀粉)培养基中，敲除突变体△CYC8不产微菌核和黑色素，再次说明该基因在微菌核形成过程中起到关键作用，而不是受某种碳源的诱导。通过在不同碳源上的生长来判断敲除突变体△CYC8胞外酶活性和野生型的差异，结果显示：野生型、敲除突变体和T286在脱脂奶粉培养基上的生长速率无显著差异，说明CYC8的缺失没有影响棉花黄萎病菌的蛋白酶活性；敲除突变体的淀粉酶活性产生了小幅下降，但是总体来说，和野生型相比没有达到显著差异；而△CYC8以纤维素为唯一碳源的培养基上的生长速率比野生型Vd080平均降低了20％，且达到了差异显著水平(图5，表5)。而回补突变体ΔVdCYC8-C在各种碳源的培养基中的生长速率则明显回升，与野生型Vd080相比差异不显著(图6，表5)。说明CYC8基因影响控制棉花黄萎病菌纤维素酶活性。
表5 野生型和突变体胞外酶分泌生长速率分析

实施例7：突变体的致病力测定
采用沙土蛭石无底纸钵定量蘸根接种法测定突变体的致病力变化，选用感病陆地棉品种冀棉11作为寄主，在第一片真叶平展时接种，每钵接种10ml孢子浓度为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液。将野生型棉花黄萎病菌菌株Vd080和T-DNA插入突变体T286作为对照，每个菌株设置3个重复，每个重复28-30株棉苗。接种后15天、18天和24天调查并计算棉株病情指数。
结果表明，野生型菌株Vd080接种仅7天后，棉花叶片开始出现萎蔫,黄化，24天后出现了多数棉株死亡，病情指数高达48.79±3.11(P<0.01)。而3个缺失CYC8 的敲除突变体对棉花的致病力明显减弱，接种12天后才出现病叶，且病情发展缓慢，敲除突变体△CYC8-45、△CYC8-55和△CYC8-5624天后的病情指数分别为17.67、23.42和18.22，较野生型相比病情指数极显著下降64.6％、53.7％和62.6％，病指平均降低60.3％(图7，表6)。CYC8缺失敲除突变体和T-DNA插入突变体对棉花的侵染能力和在寄主体内的扩展能力都受到了明显的抑制和削弱，说明CYC8在棉花黄萎病菌致病力方面的贡献突出，为一个重要的致病相关基因。回补突变体△CYC8-C在接种后第9天开始出现萎蔫病叶，第15天的致病力和野生型相比差异不显著，其中△CYC8-C26和△CYC8-C30的致病力还略高于野生型。但是回补突变体之后的病情发展稍比野生型延迟，在接种后第24天，除了△CYC8-C26的致病性和野生型相当，病情指数达到43.1，△CYC8-C30和△CYC8-C36较突变体T286也得到了大幅回升，分别为32.4和38.4，说明CYC8的回补对突变体T286致病力的恢复起到了关键作用(图7，表6)。敲除突变体和回补突变体的致病力结果表明，在棉花黄萎病菌中，CYC8是一个重要的致病相关基因。
表6 野生型和突变体病情指数分析