强免疫原性重组内源性因子的制备方法及应用.pdf

本发明公开了一种强免疫原性重组内源性因子的制备方法，该方法为：利用DNA shuffling技术对内源性因子的免疫原性进行基因改组，然后从重组后的基因中筛选表达具有较高免疫原性内源性因子的基因序列。本发明为改造自身抗原提供了一种新的方向，并且可以由获得的强免疫原性内源性因子中挑选合适的制备抗多种肿瘤的疫苗，具有较高的经济及社会效益。

1.  一种强免疫原性重组内源性因子的制备方法，其特征在于，该方法为：利用DNA shuffling技术对内源性因子的免疫原性进行基因改组，然后从重组后的基因中筛选表达具有较高免疫原性内源性因子的基因序列。

2.  根据权利要求1所述强免疫原性重组内源性因子的制备方法，其特征在于：所述DNA shuffling技术中选取多个基因或基因家族用于基因改组，所述基因或基因家族来源于不同物种且种属间具有同源性的基因。

3.  根据权利要求2所述强免疫原性重组内源性因子的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)获取用于基因改组的多个物种中待改组的内源性因子的基因片段，其中，多个物种中包含了待增强内源性因子免疫原性的目的物种；
(2)对步骤(1)获得的基因片段进行酶切，得到片段大小在10～100bp的DNA小片段；
(3)以DNA小片段互为模板和引物进行PCR扩增，得到大小不等的PCR产物片段；
(4)以PCR产物片段作为模板，利用混合引物进行PCR扩增，得到扩增片段，所述混合引物是根据步骤(1)中得到的多个物种的基因片段中同源性片段的前后序列进行设计所得，每个物种各有一对引物；
(5)利用扩增片段构建表达载体，转化菌种后，利用根据所述目的物种中内源性因子的基因片段所设计的引物对，对转化菌种中所含基因进行PCR检测筛选，得到一组具有较高免疫原性的内源性因子基因；
(6)通过对步骤(5)得到的一组具有较高免疫原性的同源性 因子基因进行筛选表达，得到强免疫原性重组内源性因子。

4.  权利要求1或2或3所述强免疫原性重组内源性因子的制备方法在制备抗肿瘤疫苗及与内源性因子表达增加相关疾病的疫苗中的应用。

5.  一种强免疫原性重组VEGF的制备方法，其特征在于：该方法为：利用DNA shuffling技术对VEGF的免疫原性进行基因改组，得到重组VEGF，其中选取的用于基因改组的基因家族分别来自小鼠、大鼠、鸡、兔、猴、狗、人中的任意3个或3个以上。

6.  权利要求5所述强免疫原性重组VEGF的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)获取用于基因改组的小鼠、大鼠、鸡、人的VEGF的基因片段；
(2)利用DnaseΙ酶对步骤(1)获得的基因片段进行酶切，得到片段大小在10～100bp的DNA小片段；
(3)以DNA小片段互为模板和引物进行PCR扩增，得到大小不等的PCR产物片段，其中，PCR扩增条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、55℃45秒和72℃50秒进行55个循环，最后以72℃10分钟结束；
(4)以PCR产物片段作为模板，利用混合引物进行PCR扩增，得到扩增片段；
其中，所述混合引物包含四对引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9～16所示；PCR扩增条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、60℃45秒和72℃50秒进行35个循环，最后以72℃10分钟结束；
(5)利用扩增片段构建表达载体，转化菌种后，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.17、18所示的人引物对，对转化菌种中所含基因进行PCR检测筛选，得到一组具有较高免疫原性的内源性因子基因；其中，PCR条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、66℃45秒和72℃50秒进行35个循环，最后以72℃10分钟结束；
(6)通过对步骤(5)得到的一组具有较高免疫原性的同源性因子基因进行筛选表达，得到强免疫原性重组VEGF。

7.  权利要求5或6所述强免疫原性重组VEGF的制备方法所获得的强免疫原性重组VEGF。

8.  权利要求5所述强免疫原性重组VEGF的制备方法在制备抗肿瘤疫苗以及抗视网膜血管性疾病疫苗中的应用。

9.  一种强免疫原性重组VEGF蛋白抗原，其蛋白序列如SEQ ID NO.20所示。

10.  权利要求9所述强免疫原性重组VEGF蛋白抗原的核苷酸编码序列。

强免疫原性重组内源性因子的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地指一种强免疫原性重组内源性因子的制备方法及应用。
背景技术
血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)在正常生理情况下如胚胎形成及病理情况下如肿瘤的生长均有表达，参与新生血管的形成。
血管生成是一个多步骤的复杂过程，需要大量细胞因子的协调作用，其中VEGF是起核心作用的血管形成正调控因子。其具有促进血管内皮细胞增殖、存活及迁移和诱导血管生成、增强血管通透性及血管舒张等作用。在正常的生理情况下，血管生长是受一系列作用因子严格控制的，这些因子既可以开启血管生成也可以抑制血管生成。然而，在肿瘤生长过程中这种平衡却被打破，在瘤块不断长大的过程中必须要有足够的氧气和营养供应，这时就需要大量新生血管的形成来满足要求，肿瘤细胞本身或者刺激机体相关细胞大量表达VEGF。所以这就提示人们或许可以通过研制抗VEGF的药物来达到广谱抑制甚至治疗肿瘤的效果。
目前，以VEGF/VEGFR为靶标的抗肿瘤药物的研发已取得了很大进展，有多种药物已批准上市或正在临床试验中。最开始的关于抗VEGF药物的研究都是基于被动免疫基础上，其中作为第一批被美国FDA批准并投入临床使用的抗血管生成类药物贝伐单抗就是一种针对VEGF-A的人源化鼠单克隆抗体。它与传统化学疗法联合使用在临床治疗中可有效的抑制多种人类肿瘤细胞的生长，如结直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、非小细胞型肺癌、肝癌等。至今 已有多种抗血管生成单克隆抗体被证实具有抗肿瘤的临床疗效，但这些药物不仅昂贵，而且由于血浆半衰期短抗血管能力有限，临床治疗经常需要大剂量长期静脉摄入，由此带来较多毒副反应，使患者需要住院治疗及特殊护理，这些都给患者及医疗体系带来巨大的经济负担。随着分子免疫学及肿瘤免疫学的迅猛发展，肿瘤治疗性疫苗因其特异性高针对性强且毒副作用小等特点，已经成为恶性肿瘤主动免疫治疗发展的重要方向，特别是以VEGF/VEGFR为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗取得了令人鼓舞的研究进展。
但是，由于VEGF本身是机体的内源性因子，存在免疫耐受机制而很难诱导产生抗体或抗体效价较低，所以研究VEGF疫苗首要解决的问题就是怎样提高VEGF疫苗的免疫原性。有研究者将异源的VEGF用于免疫动物，如用非洲爪蟾的VEGF免疫小鼠，但免疫后并未检测到有效的抗VEGF抗体。免疫学中常用的增强较弱抗原免疫原性的方法是将该抗原成分连接到有强抗原特性的蛋白载体，或是配以佐剂。有研究者将VEGF蛋白与其它免疫原性较强的蛋白相偶联进行融合表达，如来自于破伤风毒素的辅助T细胞表位，来自结核分支杆菌的热休克蛋白65等，但得到的融合蛋白仍然不能激发有效的免疫反应，不能产生高效价的抗VEGF抗体和显著的抗瘤效果。古巴研究者将VEGF与来自于脑膜炎奈瑟球菌的膜蛋白进行融合表达，用于免疫动物，经检测可以诱导产生一定效价的抗VEGF抗体，但是效果仍然不甚理想，如存在抗体效价较低，需连续多次(多达8～10次以上)免疫等问题，且与VEGF融合表达的脑膜炎奈瑟球菌的膜蛋白，其安全性仍有待进一步证实。因此，采用新的方法和策略，得到更为有效及安全的VEGF抗原，从而打破机体的免疫耐受，诱导产生高效价的抗体，获得良好的抗瘤效果，是研发以VEGF为靶标的抗肿瘤疫苗的关键。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不能有效解决上述自身抗原 的弱免疫原性的缺陷，提供一种可增强自身蛋白抗原免疫原性的方法及该方法的应用。
为实现上述目的，其一，本发明提供了一种强免疫原性重组内源性因子的制备方法，该方法为：利用DNA shuffling技术对内源性因子的免疫原性进行基因改组，然后从重组后的基因中筛选表达具有较高免疫原性内源性因子的基因序列。
上述方法中，所述DNA shuffling技术中选取多个基因或基因家族用于基因改组，所述基因或基因家族来源于不同物种且种属间具有同源性的基因。
上述方法中，所述DNA shuffling技术中选取的用于基因改组的基因家族优选为3个以上。
上述强免疫原性重组内源性因子的制备方法，具体地包括以下步骤：
(1)获取用于基因改组的多个物种中待改组的内源性因子的基因片段，其中，多个物种中包含了待增强内源性因子免疫原性的目的物种；
(2)对步骤(1)获得的基因片段进行酶切，得到片段大小在10～100bp的DNA小片段；
(3)以DNA小片段互为模板和引物进行PCR扩增，得到大小不等的PCR产物片段；
(4)以PCR产物片段作为模板，利用混合引物进行PCR扩增，得到扩增片段，所述混合引物是根据步骤(1)中得到的多个物种的基因片段中同源性片段的前后序列进行设计所得，每个物种各有一对引物；
(5)利用扩增片段构建表达载体，转化菌种后，利用根据所述目的物种中内源性因子的基因片段所设计的引物对，对转化菌种中所含基因进行PCR检测筛选，得到一组具有较高免疫原性的内源性因子基因；
(6)通过对步骤(5)得到的一组具有较高免疫原性的同源性因子基因进行筛选表达，得到强免疫原性重组内源性因子。
本发明还提供了上述强免疫原性重组内源性因子的制备方法在制备抗肿瘤疫苗及与内源性因子表达增加相关疾病的疫苗中的应用。
其二，本发明提供了一种强免疫原性重组VEGF的制备方法，该方法为：利用DNA shuffling技术对VEGF的免疫原性进行基因改组，得到重组VEGF，其中选取的用于基因改组的基因家族分别来自小鼠、大鼠、鸡、兔、猴、狗、人中的任意3个或3个以上。
上述强免疫原性重组VEGF的制备方法，具体地包括以下步骤：
(1)获取用于基因改组的小鼠、大鼠、鸡、人的VEGF的基因片段；
(2)利用Dnase Ι酶对步骤(1)获得的基因片段进行酶切，得到片段大小在10～100bp的DNA小片段；
(3)以DNA小片段互为模板和引物进行PCR扩增，得到大小不等的PCR产物片段，其中，PCR扩增条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、55℃45秒和72℃50秒进行55个循环，最后以72℃10分钟结束；
(4)以PCR产物片段作为模板，利用混合引物进行PCR扩增，得到扩增片段；
其中，所述混合引物包含四对引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9～16所示；PCR扩增条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、60℃45秒和72℃50秒进行35个循环，最后以72℃10分钟结束；
(5)利用扩增片段构建表达载体，转化菌种后，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.17、18所示的人引物对，对转化菌种中所含基因进行PCR检测筛选，得到一组具有较高免疫原性的内源性因子基因；其中，PCR条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、66℃45 秒和72℃50秒进行35个循环，最后以72℃10分钟结束；
(6)通过对步骤(5)得到的一组具有较高免疫原性的同源性因子基因进行筛选表达，得到强免疫原性重组VEGF。
上述强免疫原性重组VEGF的制备方法所获得的强免疫原性重组VEGF应该在本发明的保护范围内。
本发明还提供了上述增强VEGF免疫原性的方法在制备抗肿瘤疫苗以及抗视网膜血管性疾病疫苗中的应用。
其三，本发明提供了一种强免疫原性重组VEGF蛋白抗原，它的分子量为13934.76，等电点(pI)为6.69，其蛋白序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明还提供了上述强免疫原性重组VEGF蛋白抗原的核苷酸编码序列，如核苷酸序列SEQ ID NO.19。
本发明还提供了上述强免疫原性重组VEGF蛋白抗原在制备抗肿瘤疫苗以及抗视网膜血管性疾病疫苗中的应用。
本发明的原理：
肿瘤抗原大多为自身蛋白，一般来说免疫原性低下，通常的策略是使用免疫原性较强的蛋白进行偶联或融合表达，如破伤风毒素、来自于结核分枝杆菌的热休克蛋白等，或使用较强的佐剂进行免疫。然而，这些方法虽然对某些抗原有效，但并不能解决那些容易诱导免疫耐受的自身抗原，如血管内皮生长因子(VEGF)。
目前，尽管DNA shuffling已被广泛报道用于微生物酶的人工进化，但在抗原及疫苗中的成功应用还比较少。虽然有研究者将此技术用于改造病毒抗原，但未见其在改造内源性因子的抗原及疫苗中的应用。
我们利用DNA改组技术，首次将不同物种(大鼠，小鼠，人和鸡)的内源性因子的基因序列进行重组，从而得到新的融合有不同物种基因片段的重组内源性因子的VEGF蛋白疫苗。并且在理论上，内源性因子的免疫原性增强都可以通过DNA改组进行。
本发明的有益效果：
1、利用DNA shuffling技术，增强内源性因子的免疫原性，为改造自身抗原提供了一种新的方向，并且可以由获得的强免疫原性内源性因子中挑选合适的制备抗多种肿瘤的疫苗，具有较高的经济及社会效益。
2、DNA shuffling技术成熟，用其增强内源性因子的免疫原性方法简单，成功率高，可以筛选出效果较好的抗原。
3、本发明所提供的VEGF疫苗，免疫原性强、用量少、成本低、副作用小、效果好。
附图说明
图1为小鼠、大鼠、鸡及人的VEGF-A基因经DNase I酶切后的片段电泳图，大小约50bp；
图2为以图1中小鼠、大鼠、鸡及人的VEGF-A基因酶切后的50bp片段互为引物和模板，经PCR扩增得到的片段电泳图，大小100-5000bp；
图3为以图2中PCR产物为模板，分别以基于人、小鼠、大鼠和鸡四种VEGF-A基因设计的混合引物进行PCR，扩增产物电泳图，大小为500-2000bp；
图4为以图3中得到基因片段构建表达载体，转化产物以PCR检测筛选扩增片段长度700bp左右的转化子电泳图；
图5为重组大肠杆菌表达的蛋白，经镍柱亲和层析纯化得到改组的dsVEGF蛋白电泳图；
图6为基因改组得到的dsVEGF蛋白，用于免疫小鼠诱导产生的抗VEGF的抗体效价对照图；
图7为dsVEGF蛋白免疫后的各瘤块重量对照图；
图8为dsVEGF蛋白免疫后的瘤块大小对照图；
图9为dsVEGF蛋白免疫后的瘤块病理切片图；
图10为dsVEGF蛋白免疫后，瘤块切片免疫组化图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例
1、得到四个物种VEGF-A基因片段
1)提取RNA
提取不同物种VEGF-A的RNA：小鼠，肺部采集；大鼠，肺部采集；鸡，脑部采集；人，血液采集。
2)RNA反转录PCR
分别以下列序列为引物，对应的以上诉RNA为模板进行反转录PCR得到目的cDNA片段。
大鼠：
R1：GCACCCACGACAGAAGG  (SEQ ID NO.1)
R2：TCACCGCCTTGGCTTGTC (SEQ ID NO.2)
小鼠：
M1：GCACCCACGACAGAAGGAG  (SEQ ID NO.3)
M2：TCACCGCCTTGGCTTGTC   (SEQ ID NO.4)
鸡：
C1：GCTCCGGCCCTGGGGGAT       (SEQ ID NO.5)
C2：TCACCGTCTCGGTTTTTCACATCTG (SEQ ID NO.6)
人：
H1：GCACCCATGGCAGAAGGAG  (SEQ ID NO.7)
H2：TCACCGCCTCGGCTTGTAC  (SEQ ID NO.8)
大鼠，小鼠，鸡  PCR退火温度：60℃
人              PCR退火温度：66℃
反转录PCR条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、60℃(或66℃)45秒和72℃50秒进行35个循环，最后以72℃10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度分别为大鼠495bp(SEQ ID NO.9)，小鼠567bp(SEQ ID NO.10)，鸡501bp(SEQ ID NO.11)， 人621bp(SEQ ID NO.12)。
2、DNA shuffling
1)Dnase Ι酶切
利用以下体系DNaseΙ酶切以上四种VEGF-A片段，酶切进行10分钟，95℃水浴终止10分钟。
Buffer           5μl
Dnase Ι酶        5μl
(1:1000稀释过的市售Fermentas公司Dnase Ι)
DNA                 20μl
ddH₂O               20μl
酶切后，得到50bp左右DNA片段，结果如图1，图中，泳道C：鸡的VEGF-A酶切片段；泳道H：人的VEGF-A酶切片段；泳道R：大鼠的VEGF-A酶切片段；泳道M：小鼠的VEGF-A酶切片段。
2)DNA shuffling
①利用下列体系，将四种VEGF-A基因经DNaseΙ酶切之后的DNA小片段互为模板和引物进行PCR：
物种DNA(50bp)       5μl
Mix Taq酶           25μl
ddH₂O               20μl
PCR条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、55℃45秒和72℃50秒进行55个循环，最后以72℃10分钟结束。结果如图2，电泳检测PCR扩增产物，右侧泳道为获得扩增片段长度100～5000bp，左侧泳道为DNA Marker。
②将步骤①得到的PCR产物片段作为模板，用下列基于人、小鼠、大鼠和鸡四种VEGF-A基因设计的混合引物进行PCR。引物是根据这四种种属中同源性高达95％的片段的前后序列进行设计的。
大鼠：
EF：CCGGAATTCGCACCCACGACAGAAGG
(SEQ ID NO.9)
HR：CCCAAGCTTTCACCGCCTTGGCTTGTC
(SEQ ID NO.10)
小鼠：
EF：CCGGAATTCGCACCCACGACAGAAGGAG
(SEQ ID NO.11)
HR：CCCAAGCTTTCACCGCCTTGGCTTGTC
(SEQ ID NO.12)
鸡：
EF：CCGGAATTCGCTCCGGCCCTGGGGGAT
(SEQ ID NO.13)
HR：CCCAAGCTTTCACCGTCTCGGTTTTTCACATCTG
(SEQ ID NO.14)
人：
EF：CCGGAATTCGCACCCATGGCAGAAGGAG
(SEQ ID NO.15)
HR：CCCAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTAC
(SEQ ID NO.16)
PCR条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、60℃45秒和72℃50秒进行35个循环，最后以72℃10分钟。
电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度500～2000bp，如图3，泳道1为DNA Marker；泳道2～5为PCR扩增后的产物。
3)目的转化子的筛选
将步骤②得到扩增片段构建表达载体，转化大肠杆菌，之后用以下引物(根据与人的VEGF-A基因同源性高达95％的片段的前后序列进行设计的)对所含基因进行PCR检测筛选。
H1：GCACCCATGGCAGAAGGAG  (SEQ ID NO.17)
H2：TCACCGCCTCGGCTTGTAC  (SEQ ID NO.18)
PCR条件为94℃4分钟，随之以94℃45秒、66℃45秒和72℃50秒进行35个循环，最后以72℃10分钟。电泳检测PCR扩增产物，筛选长度700bp左右的扩增片段，如见图4。
本发明实施例中经筛选后得到多个免疫源性增强的重组VEGF，其中一个经实验证明效果较好的重组VEGF(dsVEGF)基因的全长为733bp(含标记序列)，详细序列见SEQ ID NO.19，其中开放阅读框位于60～478位核苷酸。根据推导出的全长VEGF的氨基酸序列，共125氨基酸残基，分子量为13934.76，pI为6.69，详细序列见SEQ ID NO.20。
3、DNA shuffling改组的重组VEGF(dsVEGF)基因的序列信息与同源性分析
将利用DNA改组技术重新组合大鼠、小鼠、鸡和人的VEGF基因之后得到的dsVEGF全长序列(SEQ ID NO.19)及其编码蛋白质(SEQ ID NO.20)用BLAST程序分别与源基因进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与四种VEGF基因均存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它分别与大鼠VEGF编码序列有96％的相似性，与小鼠的有96％的相似性，与鸡的有79％相似性，与人的有87％的相似性。在氨基酸水平上，新组合的VEGF蛋白的第53-105位氨基酸残基与大鼠和小鼠的VEGF蛋白的第1-53位氨基酸残基有100％的相似性；其第90-105位氨基酸残基与鸡的第1-16位氨基酸残基有88％的相似性；其第42-105为氨基酸残基与人的第5-68位氨基酸残基有89％的相似性。由以上可见，新组合表达的VEGF与四个源物种的VEGF在核酸和蛋白质水平上均存在一定的同源性但又有不同，为其可以打破免疫耐受机制提供了理论依据。
试验例
DNA shuffling改组的重组VEGF(dsVEGF)蛋白疫苗抗小鼠肿瘤的应用
(一)DNA shuffling改组的重组VEGF(dsVEGF)蛋白的表达及纯化
1、取3μL甘油菌BL21-pET28a-dsVEGF接种于3mL LB(卡那霉素浓度100μg/mL)培养基中，接种4瓶，37℃培养过夜。
2、按1％接种量转接于250mL 2YT(卡那霉素浓度100μg/mL)培养基中，接种4瓶，37℃，180r/min培养3h。
3、培养3h后，向每瓶中加入乳糖(终浓度2mM)；37℃，180r/min，诱导培养4h后8000r/min离心5min收集菌体。
4、用PBS缓冲液重悬菌体，充分重悬后，8000r/min离心5min，收集菌体
5、菌体的裂解：10mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，1mmol/L PMSF。1g湿菌体悬浮于10mL的裂解缓冲液中，在冰上孵育15min后，置冰上进行超声波细胞破碎，将超声包发射探头置于菌液中，工作5s，间隔2s，破碎40min。
6、在4℃，8000r/min离心30min，上清和沉淀分别取样，SDS-PAGE检测。目标蛋白形成包涵体，出现在沉淀中。
7、按每克包涵体湿重加入10ml洗涤液1(10mmol/L pH7.4的磷酸缓冲液(PB)，1％Triton X-100)，用磁力搅拌子搅拌，使沉淀重新悬浮均匀后，8000r/min离心20min，弃上清，沉淀再加入洗涤液2(2mol/L的尿素溶液)按同样的方法洗涤一次，最后用蒸馏水洗去残留的洗涤液2，沉淀备用。
8、洗涤后的包涵体沉淀，每克湿重加入10ml的8mol/L尿素溶液，再加入DTT直到DTT终浓度为10mmol/L，用磁力搅拌子搅拌6小时以上，使沉淀重新溶解和悬浮于尿素溶液中。8000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清以备用。
9、将Ni柱先用10体积左右蒸馏水洗涤后，再用缓冲液 (20mmol/L Tris.HCl，pH7.5，500mmol/L NaCl，10％甘油)平衡，缓冲液体积约为Ni柱体积的10倍。
10、将上述上清液缓慢加入Ni柱，Ni柱通过导管连接上IHID-5电脑紫外检测仪，控制液体流速为8～9滴/s，加样完毕后使其结合30min以上。
11、待结合充分后，向Ni柱中加入平衡缓冲液，直至IHID-5电脑紫外检测仪上的吸光度A值恒定不变为止，此时未结合的杂蛋白洗尽。
12、Ni柱结合完毕后再分别以含有100mmol/L和500mmol/L的咪唑的上述缓冲液洗柱子，并根据吸收值收集洗脱峰。
13、15％SDS-PAGE检测，结果见图5，图中，泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2-4：重组大肠杆菌表达的改组VEGF蛋白，箭头所示为本专利申请保护的dsVEGF蛋白。
14、将收集到的含有目的蛋白的溶液用30mm透析袋(MW：8000-14000)分别依次对含有6mol/L、4mol/L、2mol/L尿素的PBS(pH7.4)溶液和PBS(pH7.4)进行透析，每8h换一次透析液。
15、收集透析结束后的蛋白溶液，再用考马斯亮兰试剂盒定量，于-20℃分装保存备用。
(二)DNA shuffling改组的重组VEGF(dsVEGF)蛋白疫苗的抗肿瘤应用
1、动物免疫：
将昆明小鼠随机分成3组：dsVEGF蛋白+弗氏不完全佐剂(FICA)组，PBS+FICA组，PBS组，每组8只。其中蛋白溶液和PBS均与FICA1:1采用超声混合，每组免疫体积都为300μL/只/次，其中dsVEGF蛋白+FICA组每只小鼠每次的免疫剂量为100μg.。免疫方式为皮下免疫，免疫时间为0、1、2周，最后一次免疫结束后一周采血。
2、血清分离：
小鼠断尾采血，1.5mL无菌EP管收集，每管采血约150μL，全血经室温静置2～3h待血液凝固后，3000r/min离心15min收集血清，分装成小管，-20℃冻存待测。
3、血清抗原特异性IgG的检测：
采用间接ELISA法，将抗原(重组人VEGF121)用包被液稀释至10μg/mL，100μL/孔，包被ELISA板，4℃包被过夜；洗涤液洗1次，尽量除去孔中气泡，每孔加入50μL封闭液(2％BSA)，37℃封闭2～3h；100μL/孔洗涤液PBST，洗3次。抗体稀释液从1：100倍开始倍比稀释待检血清，加入包被的ELISA板，每种稀释度加3个孔，50μL/孔，37℃温育2h，洗涤液洗5次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃，60min，洗涤液洗5次，加入TMB底物(过氧化氢尿素溶液)显色液，室温避光反应10min，50μL终止液终止反应，以PBS孔作空白对照，450nm测定各孔OD值，对应各抗体效价见图6，图中，PBS：小鼠仅皮下免疫PBS缓冲液；PBS+F：小鼠皮下免疫PBS缓冲液和弗氏不完全佐剂的混合液；dsVEGF+F：小鼠皮下免疫dsVEGF抗原+弗氏不完全佐剂佐剂的混合液。
4、实验结果
免疫结束后，给各组小鼠进行腋下荷瘤，选取小鼠肝癌细胞H22，每组每只小鼠2×10⁶细胞/200μL。荷瘤16天之后，断颈椎处死小鼠，剥取小鼠腋下瘤块，称重(见图7)并照相比较各组瘤块大小(见图8)，后续做肿瘤切片HE染色观察(见图9)和抗CD31免疫组织化学检测(见图10)，图9中可见dsVEGF蛋白免疫后瘤块坏死区域增多，淋巴细胞浸润明显，图10中可见dsVEGF蛋白免疫后瘤块中被CD31染色的血管数远低于对照组，结果显示VEGF疫苗有明显的抑制小鼠肝癌生长。