槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法技术领域
本发明涉及非酒精性脂肪性肝病的病理及发病机制研究领域，特
别涉及槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α
基因的方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)
是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其
病理学改变与酒精性肝病相似，但患者无过量饮酒史，疾病谱包括
非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化和肝细
胞癌。随着肥胖和代谢综合征在全球的流行，NAFLD的发病率呈逐
年增加。在我国NAFLD呈现高发病率和低龄化趋势。NAFLD的发
病机制尚不十分明确，目前广泛接受的是Day和James提出的“二
次打击”学说，认为肝细胞脂肪积聚和脂肪变性构成“初次打击”进
一步在细胞内脂质过氧化和氧化应激、炎性细胞因子等因素作用下形
成“二次打击”,诱导了肝脏炎症反应、肝细胞变性坏死和肝纤维
化/肝硬化的发生。目前观点认为治疗NAFLD的首要目标是改善
IR，次要目标是防止二次打击和肝功能失代偿，减少或防止肝癌、
肝硬化及并发症的发生。
脂质在肝脏中的蓄积是NAFLD的特征，也是其发生发展的关键
环节。硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)是脂质合成的核心酶，催
化单不饱和脂肪酸的合成。Wang等通过建立高脂饮食诱导的NAFLD
模型证实，槲皮素能够抑制肝脏脂酸的合成，减轻肝脏脂质蓄积。肝
X受体α基因(FXR-α)是细胞内重要的核受体。研究证实FXR-α参
与了胆固醇和甘油三酯的合成、吸收、转运、排泄等过程，在胆固醇、
甘油三酯代谢中起关键作用。
目前治疗NAFLD尚无特效药物，且现临床使用的大部分药物在
治疗的同时还存在一定副作用，疗效也无法肯定。NAFLD患病率在
我国逐年升高，亟需找到一种安全、有效、价廉物美的治疗药物。槲
皮素(quercetin)是从植物中提取除的一种黄酮类化合物，广泛存在
于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在。大量研究证明槲
皮素是一种安全性很高的药物，且槲皮素具有抗炎、抗氧化、减少脂
质合成、改善胰岛素抵抗等作用，有望成为治疗NAFLD的潜在药物，
目前尚无槲皮素对SCD1和FXR-α影响的报道。本研究拟通过高脂喂
养建立NAFLD动物模型观察槲皮素对NAFLD的治疗作用；通过动
物模型研究SCD1和FXR-α在NAFLD中的作用；在动物模型上观察
槲皮素对NAFLD的治疗效果及NAFLD中槲皮素的疗效是否与调节
SCD1和FXR-α的表达有关，为槲皮素的进一步临床研究提供理论基
础。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供槲皮素
调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法，
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受
体α基因的方法，通过采用高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型；
之后利用光镜、HE染色观察各组大鼠治疗前后组织学的变化；从而
检测各组小鼠治疗前后SCD1、LXRα含量和活性的表达，完成槲皮
素对非酒精性脂肪性肝病干预作用的评估，了解槲皮素治疗非酒精习
惯脂肪性肝病的可能机制。
进一步的，一、实验材料
⑴实验动物:雄性SD大鼠
⑵饲料配制：普通饲料(由泸州医学院实验动物中心提供)；
高脂饲料：由88％的普通饲料，10％的猪油和2％的胆固醇组
成。
二、建立非酒精性肝病动物模型，选取48只SD雄性大鼠，正常
喂养一周，随机分为正常对照组(16只)和NAFLD组(40只)，分别给
予普通饲料和高脂饮食喂养，8周末处死NAFLD组大鼠8只和正
常对照8只,取肝脏进行病理学检查,证实造模成功后,将余下NA
FLD大鼠32只分为三组:(1)NAFLD对照组8只,继续饲以高饲
料,予以等体积生理盐水灌胃；(2)槲皮素低剂量治疗组8只,同样继
续饲以高饲料,并予槲皮素75mgkg-1·d-1灌胃给药。(3)槲皮素中
剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素300mgkg-1·d-1灌
胃给药(4)槲皮素高剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲
皮素600mgkg-1·d-1灌胃给药。12周末禁食12h后处死所有动物,
采集标本，运用生物技术及病理组织检查等进行检测诊断，常规制备
血清、肝组织石蜡切片并保留少量肝组织用于RNA的检测。
三、标本采集及处理，
A：血清分离
实验结束后，动物禁食12h，用10％的水合氯醛以0.35ml/l00g
体重经腹腔内注射麻醉后开腹，腹主动脉采血，室温静置15min，
3000rpm离心15min分离血清，-70℃冰箱冻存，备测血脂、血清转氨
酶(ALT,AST,TG,TC)等生化指标。免疫组化检测相关蛋白。
B：组织学标本制备
各组大鼠于肝右叶相同部位取0.5g肝组织置于1.5mlEP管，
-70℃冰箱保存，用于RT-PCR的检测；另取肝左叶相同部位1cm×lcm
×0.5cm组织，置于4％的多聚甲醛中固定24-48h，自来水冲洗24h，
经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋切片，常规HE染色，
光镜下观察肝组织病理学改变。
四、观察指标及检测方法：
1、一般情况：大鼠处死前后称重、体长,以及观察大鼠食欲、皮
肤、毛发情况，处死大鼠后观察肝脏形态体积、质地弹性等以及称肝
脏湿重、计算肝指数(肝湿重/体重×100％)及Lee·s指数(体重1/3
/体长×1000)。
2、血清生化测定：将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆，
采用全自动生化分析仪(OlympusAul000)测定AlT、AST、甘油三酯
(TG)、总胆固醇(TC)以及肝组织匀浆脂质水平、血清游离脂肪酸(FFA)
水平；葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)；放免法测定血清空腹胰
岛素(FINS)水平；并计算胰岛素敏感指数ISI＝ln[1/(F1NS×FBG)]。
五、病理学检查：取石蜡包埋好的肝组织，5um连续切片，常
规苏木精-伊红染色，在光镜下评估肝脂肪变性及纤维化程度、计算
炎症活动度计分。脂肪肝病理组织学诊断参考中华医学会肝脏病学分
会脂肪肝和酒精性肝病学组“非酒精性肝病诊断标准”
六、免疫组化测SCD1、LXR-α的蛋白水平
七、半定量RT-PCR技术检测肝脏SCD1、LXR-α的表达(采用
半定量RT-PCR法，按照Trizol试剂盒说明提取大鼠肝组织总RNA，
反转录合成cDNA。)
1.PCR反应引物设计和合成
PCR引物参照有关文献设计
SCD1mRNA引物：
FORWARD5'-CTACACAACCACCACCACCA-3'
REVERSE5'-CAGGGCACCCATCAGATAGT-3'
FXR-αmRNA引物：
FORWARD5’-ACAAGGCTGCCCCGACTAC-3’
REVERSE5’-TTTCTCCTGGTATGAGATAGCAAATC-3’
2.总RNA提取
采用Trizol法提取总RNA
2.1组织匀浆：
(1)[i7]切取并称重100mg-70℃保存的冰冻SD大鼠肝脏组
织置于高温高压消毒后研钵内，倒入液氮，迅速研碎；
(2)每100mg均浆组织标本中加入1ml的Trizol，混匀吹打；
(3)将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，颠倒混匀后，
室温放置5min[i8]，以彻底分离核蛋白复合体。
2.2分离阶段：每1mlTrizol加入0.2ml的氯仿，加盖好后
用手剧烈摇晃15S，充分混匀，在室温放置3min，然后离心
12,000rpm，15min，4℃。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿
相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相
占总Trizol的60％。
2.3RNA的沉淀：将上层水相转移到另一干净的EP管中，
加入等体积(0.5ml)异丙醇，室温静置10min，然后4℃，12,000rpm，
10min离心，可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，即RNA沉
淀。
2.4RNA的洗涤：小心去除上清，留取沉淀，加入1ml现配
的75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，使沉淀物混悬，4℃，8000
rpm，5min离心。
2.5RNA的再溶解：小心去除上清，RNA沉淀物室温风干后，
(不完全干燥)，加入25ml的DEPC处理过的无菌去离子水，用
枪头反复吹打几次，室温静置10min，55-60℃，测浓度后-20℃保存。
2.6紫外分光光度法检查RNA浓度和纯度：将仪器调零，取
2μl储存液加入另一个EP管中，再加入98μl灭菌注射用水，离心混
匀，以灭菌注射用水作空白对照。
2.7RNA鉴定，琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污
染情况。
用氯仿-异丙醇-75％乙醇法常规操作提取RNA，按逆转录试剂
盒说明书操作.
3.逆转录成cDNA
①合成cDNA的引物可结合实际情况从OligodT-AdaptorPrimer，
Random9mers或特异性下游引物中任选一种。
按下列组成配制反转录反应液。
②按以下条件进行反转录反应。
4.PCR反应
①按下列组成配制PCR反应液。
②把B-①的反应液加入到A-②的反转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混
匀。
③按以下条件进行PCR反应
5.PCR产物半定量
反应结束后，取PCR反应液(5～10l)进行琼脂糖凝胶电泳，
确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，须将PCR
产物冷冻保存。
6.结果判定
采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。
八、Westernplot测磷酸化的LXR-α
1.蛋白质样品获得：真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温
匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
2.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3.转移：(半干式转移)
(1)电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min
×3次。
(2)膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转
膜缓冲液中10min。
(3)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC
膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精
确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸
干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将
膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入
膜染色液中50s后，在50％甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双
蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
4.免疫反应：
(1)用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(2)加入包被液，平稳摇动，室温2h。
(3)弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(4)加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆
盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1％BSA取代一抗，
其余步骤与实验组相同。
(5)弃一抗和1％BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。
(6)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M
PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。
(7)弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。
(8)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
5.实验结果分析
根据曝光显示的条带的有无、强弱，对照蛋白质分子量标准参照
物的迁移距离，可判定目的蛋白质的有无及量的多少。利用“自动灰
度扫描仪”扫描条带，计算积分光密度值，以内参照蛋白质条带的积
分光密度为校正值，可以进行半定量分析。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种槲皮素对非酒精性脂肪性肝病干预作用的研
究方法，实验表明通过制作NAFLD模型大鼠，观察槲皮素对NAFLD
大鼠的硬脂酰辅酶A去饱和酶1和肝X受体α基影响。结果显示与空
白组比较,模型组大鼠血清ALT、AST和LDL-c、TC、TG升高(P＜
0.05,P＜0.01),HDL-c降低(P＜0.01)；SCD-1基因表达降低(P＜
0.01)；与模型组比较,槲皮素能使血清ALT、AST降低(P＜
0.01),LDL-c、TC、TG降低(P＜0.05,P＜0.01),HDL-c升高(P＜
0.01)；肝组织SCD-1基因表达升高(P＜0.01)，下调LXR-a基因表
达。提示SCD-1基因表达下降、LXR-a基因表达增强参与了NAFLD
的发病机制；槲皮素治疗NAFLD大鼠疗效机制可能与槲皮素有调节
NAFLD大鼠脂代谢紊乱和促进调控基因SCD-1表达、抑制LXR-a
基因的作用有关。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
试验例：
1.通过高脂喂养建立NAFLD动物模型；
2.通过动物模型观察槲皮素对NAFLD的治疗作用及探究治
疗的合适剂量；
3.通过动物模型研究SCD1和FXR-α在NAFLD中的作用；
4.在动物模型上观对槲皮素对NAFLD的治疗效果及
NAFLD中槲皮素的疗效是否与调节SCD1和FXR-α的表达有
关。
研究方法
一、实验材料
⑴实验动物:雄性SD大鼠
⑵饲料配制：普通饲料(由泸州医学院实验动物中心提供)；
高脂饲料：由88％的普通饲料，10％的猪油和2％的胆固醇组
成。
二、建立非酒精性肝病动物模型，选取48只SD雄性大鼠，正常
喂养一周，随机分为正常对照组(16只)和NAFLD组(40只)，分别给
予普通饲料和高脂饮食喂养，8周末处死NAFLD组大鼠8只和正
常对照8只,取肝脏进行病理学检查,证实造模成功后,将余下NA
FLD大鼠32只分为三组:(1)NAFLD对照组8只,继续饲以高饲
料,予以等体积生理盐水灌胃；(2)槲皮素低剂量治疗组8只,同样继
续饲以高饲料,并予槲皮素75mgkg-1·d-1灌胃给药。(3)槲皮素中
剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲皮素300mgkg-1·d-1灌
胃给药(4)槲皮素高剂量治疗组8只,同样继续饲以高饲料,并予槲
皮素600mgkg-1·d-1灌胃给药。12周末禁食12h后处死所有动物,
采集标本，运用生物技术及病理组织检查等进行检测诊断，常规制备
血清、肝组织石蜡切片并保留少量肝组织用于RNA的检测。
三、标本采集及处理，
A：血清分离
实验结束后，动物禁食12h，用10％的水合氯醛以0.35ml/l00g
体重经腹腔内注射麻醉后开腹，腹主动脉采血，室温静置15min，
3000rpm离心15min分离血清，-70℃冰箱冻存，备测血脂、血清转氨
酶(ALT,AST,TG,TC)等生化指标。免疫组化检测相关蛋白。
B：组织学标本制备
各组大鼠于肝右叶相同部位取0.5g肝组织置于1.5mlEP管，
-70℃冰箱保存，用于RT-PCR的检测；另取肝左叶相同部位1cm×lcm
×0.5cm组织，置于4％的多聚甲醛中固定24-48h，自来水冲洗24h，
经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋切片，常规HE染色，
光镜下观察肝组织病理学改变。
四、观察指标及检测方法：
1、一般情况：大鼠处死前后称重、体长,以及观察大鼠食欲、皮
肤、毛发情况，处死大鼠后观察肝脏形态体积、质地弹性等以及称肝
脏湿重、计算肝指数(肝湿重/体重×100％)及Lee·s指数(体重1/3
/体长×1000)。
2、血清生化测定：将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆，
采用全自动生化分析仪(OlympusAul000)测定AlT、AST、甘油三酯
(TG)、总胆固醇(TC)以及肝组织匀浆脂质水平、血清游离脂肪酸(FFA)
水平；葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)；放免法测定血清空腹胰
岛素(FINS)水平；并计算胰岛素敏感指数ISI＝ln[1/(F1NS×FBG)]。
五、病理学检查：取石蜡包埋好的肝组织，5um连续切片，常
规苏木精-伊红染色，在光镜下评估肝脂肪变性及纤维化程度、计算
炎症活动度计分。脂肪肝病理组织学诊断参考中华医学会肝脏病学分
会脂肪肝和酒精性肝病学组“非酒精性肝病诊断标准”
六、免疫组化测SCD1、LXR-α的蛋白水平
七、半定量RT-PCR技术检测肝脏SCD1、LXR-α的表达(采用
半定量RT-PCR法，按照Trizol试剂盒说明提取大鼠肝组织总RNA，
反转录合成cDNA。)
1.PCR反应引物设计和合成
PCR引物参照有关文献设计
SCD1mRNA引物：
FORWARD5'-CTACACAACCACCACCACCA-3'
REVERSE5'-CAGGGCACCCATCAGATAGT-3'
FXR-αmRNA引物：
FORWARD5’-ACAAGGCTGCCCCGACTAC-3’
REVERSE5’-TTTCTCCTGGTATGAGATAGCAAATC-3’
2.总RNA提取
采用Trizol法提取总RNA
2.1组织匀浆：
(1)[i7]切取并称重100mg-70℃保存的冰冻SD大鼠肝脏组
织置于高温高压消毒后研钵内，倒入液氮，迅速研碎；
(2)每100mg均浆组织标本中加入1ml的Trizol，混匀吹打；
(3)将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，颠倒混匀后，
室温放置5min[i8]，以彻底分离核蛋白复合体。
2.2分离阶段：每1mlTrizol加入0.2ml的氯仿，加盖好后
用手剧烈摇晃15S，充分混匀，在室温放置3min，然后离心
12,000rpm，15min，4℃。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿
相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相
占总Trizol的60％。
2.3RNA的沉淀：将上层水相转移到另一干净的EP管中，
加入等体积(0.5ml)异丙醇，室温静置10min，然后4℃，12,000rpm，
10min离心，可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，即RNA沉
淀。
2.4RNA的洗涤：小心去除上清，留取沉淀，加入1ml现配
的75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，使沉淀物混悬，4℃，8000
rpm，5min离心。
2.5RNA的再溶解：小心去除上清，RNA沉淀物室温风干后，
(不完全干燥)，加入25ml的DEPC处理过的无菌去离子水，用
枪头反复吹打几次，室温静置10min，55-60℃，测浓度后-20℃保存。
2.6紫外分光光度法检查RNA浓度和纯度：将仪器调零，取
2μl储存液加入另一个EP管中，再加入98μl灭菌注射用水，离心混
匀，以灭菌注射用水作空白对照。
2.7RNA鉴定，琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污
染情况。
用氯仿-异丙醇-75％乙醇法常规操作提取RNA，按逆转录试剂
盒说明书操作.
3.逆转录成cDNA
①合成cDNA的引物可结合实际情况从OligodT-AdaptorPrimer，
Random9mers或特异性下游引物中任选一种。
按下列组成配制反转录反应液。
②按以下条件进行反转录反应。
4.PCR反应
①按下列组成配制PCR反应液。
②把B-①的反应液加入到A-②的反转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混
匀。
③按以下条件进行PCR反应
5.PCR产物半定量
反应结束后，取PCR反应液(5～10l)进行琼脂糖凝胶电泳，
确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，须将PCR
产物冷冻保存。
6.结果判定
采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。
八、Westernplot测磷酸化的LXR-α
1.蛋白质样品获得：真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温
匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
2.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3.转移：(半干式转移)
(1)电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min
×3次。
(2)膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转
膜缓冲液中10min。
(3)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC
膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精
确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸
干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将
膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入
膜染色液中50s后，在50％甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双
蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
4.免疫反应：
(1)用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(2)加入包被液，平稳摇动，室温2h。
(3)弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
(4)加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆
盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1％BSA取代一抗，
其余步骤与实验组相同。
(5)弃一抗和1％BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。
(6)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M
PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。
(7)弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。
(8)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
5.实验结果分析
根据曝光显示的条带的有无、强弱，对照蛋白质分子量标准参照
物的迁移距离，可判定目的蛋白质的有无及量的多少。利用“自动灰
度扫描仪”扫描条带，计算积分光密度值，以内参照蛋白质条带的积
分光密度为校正值，可以进行半定量分析。
通过制作NAFLD模型大鼠，观察槲皮素对NAFLD大鼠的硬脂
酰辅酶A去饱和酶1和肝X受体α基影响。结果显示与空白组比较,
模型组大鼠血清ALT、AST和LDL-c、TC、TG升高(P＜0.05,P＜
0.01),HDL-c降低(P＜0.01)；SCD-1基因表达降低(P＜0.01)；与模
型组比较,槲皮素能使血清ALT、AST降低(P＜0.01),LDL-c、TC、
TG降低(P＜0.05,P＜0.01),HDL-c升高(P＜0.01)；肝组织SCD-1
基因表达升高(P＜0.01)，下调LXR-a基因表达。提示SCD-1基因
表达下降、LXR-a基因表达增强参与了NAFLD的发病机制；槲皮素
治疗NAFLD大鼠疗效机制可能与槲皮素有调节NAFLD大鼠脂代谢
紊乱和促进调控基因SCD-1表达、抑制LXR-a基因的作用有关。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并
不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在
本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书
所限定的保护范围为准。