一种基于DNA条形码技术的市售哈蟆油药材检验方法技术领域
本发明涉及中药材检验方法，具体涉及一种基于DNA条形码技术的市售哈蟆油药
材检验方法。
背景技术
哈蟆油(Ranae oviductus)系蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria
chensinensis David)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得，主要成分有蛋白质、氨基酸、脂肪
酸、磷脂、激素及维生素等，具有补肾益精，养阴润肺之功效。用于病后体弱，神疲乏力，心悸
失眠，盗汗，痨嗽咳血。目前市场上来源于其他蛙类和蟾蜍类输卵管的类似品或伪品较多。
据2015版中国药典记载，当前哈蟆油药材的鉴定方法有性状鉴定、高效液相色谱法和膨胀
度测定法。性状鉴定易受采集加工、储存等因素影响，性状差异较大，主观性较强；高效液相
色谱法包含1-甲基海因检测和对照品色谱峰比对，易受生长环境、发育阶段和色谱技术本
身的分离和侦测能力限制，使用单一成份鉴定具有局限性，同时近缘物种的化学成份和色
谱峰差异较小，不易直接观察；膨胀度测定法易受样品粉碎度、水温、浸泡时间等因素的影
响，且哈蟆油膨胀倍数个体差异较大，重复性和稳定性较差。
中药材DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认、相对较短的DNA序列来进
行物种鉴定的一种分子生物学技术。目前中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已经纳入
2015版中国药典，但尚未应用于具体中药材鉴定，也缺乏哈蟆油药材DNA条形码鉴定的具体
实施方法。
当前哈蟆油药材的鉴定方法有性状鉴定、高效液相色谱法和膨胀度测定法，客观
性、稳定性、准确性存在一定局限。同时，尚未出现市场化的中药材DNA条形码分子鉴定方
法。
发明内容
有鉴于现有技术中哈蟆油药材的鉴定方法有性状鉴定、高效液相色谱法和膨胀度
测定法，客观性、稳定性、准确性存在局限的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种
基于DNA条形码技术的市售哈蟆油药材检验方法。
本发明的基于DNA条形码技术的市售哈蟆油药材检验方法，方法包括以下步骤：
1)现场抽样；
2)将现场抽样的样品进行实验室取样；
3)获得实验室取样样品的COI条形码序列；
4)将获得的COI条形码序列与中国林蛙COI特征条形码序列进行比对；
5)根据比对结果判断基原物种真伪，即是否与2015版中国药典收载物种一致。
进一步地，步骤1)中的现场抽样为：
针对小包件，碎油和粉末都对1个部位取样1份；线油取样1支；块油取样1块；
针对中包件，碎油和粉末都对3个部位取样3份；线油对3个部位取样3支；块油对3
个部位取样3块；
针对大包件，碎油和粉末都对5-10个部位取样5-10份；线油对5-10个部位取样5-
10支；块油对5-10个部位取样5-10块。
进一步地，步骤2)中的实验室取样为：
针对碎油和粉末：每一份现场抽样的样品混匀后均分为3份，1/3供实验室分析用，
另1/3供复核用，其余1/3留样保存；
针对线油：每一份现场抽样的样品均分为3段，1/3供实验室分析用，另1/3供复核
用，其余1/3留样保存；
针对块油：每一份现场抽样的样品均分为3份，1/3供实验室分析用，另1/3供复核
用，其余1/3留样保存。
进一步地，步骤3)包括：对实验室取样的样品进行DNA提取；对提取获得的DNA进行
PCR扩增；对PCR扩增的产物进行测序及拼接。
进一步地，正品哈蟆油药材的基原物种为中国林蛙，哈蟆油混伪品的基原物种至
少包括中华大蟾蜍和黑龙江林蛙。
进一步地，步骤4)中的中国林蛙的COI特征条形码序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，步骤4)中所述获得的COI条形码序列与SEQ ID No.1所示的序列比对，
碱基差异不超过2％，其基原物种为中国林蛙。
进一步地，中华大蟾蜍的COI特征条形码序列如SEQ ID No.4所示，该特征序列与
SEQ ID No.1所示的序列碱基差异为21.9％。
进一步地，黑龙江林蛙的COI特征条形码序列如SEQ ID No.5所示，该特征序列与
SEQ ID No.1所示的序列碱基差异为12.6％。
本发明首次建立市售哈蟆油DNA条形码分子鉴定法，其客观性、稳定性、准确性好。
本发明的优势在于，提供了中国林蛙特征条形码序列，通过给出的具体评判标准，能准确鉴
定市售哈蟆油药材的真伪，即是否与2015版中国药典收载物种一致。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目
的，不用于限制本发明的保护范围。
基于DNA条形码技术的市场哈蟆油药材检验检测方法，包括哈蟆油药材的现场抽
样方法、实验室取样方法、中国林蛙特征条形码序列、基原物种真伪判定标准。
实施例1市场抽样
1.1哈蟆油药材包件外观检查
抽取样品前，应核对证照、品名、产地、规格、等级及包件式样，检查包装的完整性、
清洁程度以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，详细记录。凡有异常情况的包件，应
单独检验并拍照。
1.2哈蟆油药材包件抽样量
不论包件多少均逐件取样。
1.3哈蟆油药材每一包件取样量
1)小包件(不足100g或不足20支)：
碎油和粉末：包件中的1个部位，取样1份，约5g
线油：1支
块油：1块，约5g
2)中包件(不足500g或不足100支)：
碎油和粉末：包件中的3个部位，取样3份，共约10g
线油：包件中的3个部位，3支
块油：包件中的3个部位，3块，共约10g
3)大包件(大于500g或大于100支)：
碎油和粉末：包件中的5-10个部位，取样5-10份，共约20-100g
线油：包件中的5-10个部位，5-10支
块油：包件中的5-10个部位，5-10块，共约20-100g。
注意：同一包件不同部位抽取的样品无需混合混匀。
实施例2实验室取样方法和实验检验方法
注意：如无特殊说明，以下处理针对每个取样部位的1份样品，多份样品需单独处
理，不可交叉。
2.1最终抽取的供检验用样品量
碎油和粉末：混匀后均分为3份，1/3供实验室分析用，另1/3供复核用，其余1/3留
样保存。
线油：均分为3段，1/3供实验室分析用，另1/3供复核用，其余1/3留样保存。
块油：均分为3份，1/3供实验室分析用，另1/3供复核用，其余1/3留样保存。
2.2实验室分析用样品
称样量：约5mg。
2.3DNA提取方法
取哈蟆油药材约5mg，置入2.0mL离心管，加入500μL含0.1％～2％盐酸的水，使用
研磨杵反复研磨30秒左右，至无明显颗粒并混匀。
加入360μL含1％～2.5％的十二烷基磺酸钠、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙
酸钠的缓冲液和40μL蛋白酶K(20mg/mL)裂解样品，使用涡旋混合仪混匀30秒左右，56℃孵
育至溶液澄清，每半小时颠倒混合样品2～3次，或者使用水浴振荡器。
加入400μL含10～20mM甘氨酸和10mM已二胺四乙酸的缓冲液，涡旋混匀30秒。
加入700μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30sec，室温
下以最高速度离心5min。
小心将上清液转移至一新的离心管，加入700μL氯仿/异戊醇(24:1)，在涡旋混合
器上剧烈振荡混匀30秒，室温下以最高速度离心5分钟。
加入等体积无水乙醇，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30秒，室温下静置2～5min。
小心将上清液转移至一新的离心管，加入1/10体积的3mol/L PH 5.2的乙酸钠，在
涡旋混合器上稍加振荡或用手指轻弹离心管壁几次使之混匀。
加入2～2.5倍体积冰冷的无水乙醇或等体积异丙醇，在涡旋混合器上振荡混匀，
冰浴5min，室温下以最高速度离心5min。
弃去上清，加入1mL预冷的70％乙醇洗涤沉淀1～2次。
沉淀在真空干燥器或者真空旋转蒸发器中干燥，或者小心吸去上清夜，将离心管
倒置于一张纸上，常温自然干燥。
加入50μL ddH2O溶解，获得提取的DNA，在4℃或-20℃保存备用。
2.4PCR扩增
以上述提取获得DNA为模版，以正向引物LWF01(SEQ ID No.2)：5’-TCTC TACT
AATC ATAA AGA YATYGG-3’；反向引物LWR01(SEQ ID No.3)：5’-TAAA CTTC AGGG TGAC
CAAARAATCA-3’进行扩增。引物中，R代表可以是A或G；Y代表可以是C或者T。
其中，引物对LWF01和LWR01用于扩增COI序列中的部分序列，也即扩增DNA条形码。
PCR反应条件为：
94℃1分钟；94℃1分钟，54℃，1.5分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟。
2.5序列测定使用基于Sanger测序原理的ABI 3130/3130XL、3730/3730XL、3500/
3500XL等第一代测序仪进行测序。本领域技术人员可知，其他的测序技术也可用于进行PCR
产物的测序。
2.6序列拼接及质量控制
使用Codoncode Aligner等基于测序质量拼接的软件进行序列拼接。
去除引物区后，一致性(Consensus)序列平均质量值需大于Q40，质量值小于Q30的
碱基不超过1％。
2.7基原物种真伪判定
任何抽样部位所获得的序列与哈蟆油(中国林蛙Rana temporaria chensinensis
David)特征COI序列碱基差异均不得超过2％，即为来自中国林蛙的哈蟆油，与2015版中国
药典收载基原物种一致。
其中，哈蟆油(中国林蛙Rana temporaria chensinensis David)COI特征序列如
下所示(SEQ ID No.1)：
AACCCTCTACCTAATCTTCGGGGCCTGAGCCGGCATGGTCGGAACAGCCCTAAGCCTTCTTATTCGAGC
AGAATTAAGCCAACCGGGAACTCTCTTGGGGGACGACCAGATCTACAATGTTATCGTCACTGCCCACGCATTTGTAA
TGATTTTCTTTATAGTCATACCAATCCTAATCGGGGGCTTTGGTAACTGACTAATCCCCATGATGATTGGAGCCCCT
GACATAGCCTTCCCCCGGATAAATAATATGAGCTTCTGGCTACTCCCACCATCCTTCTTTCTCCTCTTAGCCTCCTC
TACAGTTGAAGCTGGAGCAGGTACAGGCTGAACAGTCTATCCCCCTTTAGCTGGCAACCTAGCCCACGCGGGCCCAT
CGGTAGACCTAGCCATCTTCTCGCTACACCTGGCCGGGGTATCATCAATCCTGGGGGCAATCAATTTTATTACAACA
ATTATTAATATAAAACCCGCATCCACAACACAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCTGTTCTGATCACTGCTGT
ACTCCTGCTTCTTTCTCTCCCAGTCCTAGCCGCTGGAATTACCATACTTCTCACAGACCGAAATCTAAACACCACCT
TTTTCGACCCTGCAGGGGGAGGAGACCCAGTTCTCTACCAGCACCTATTC
对于哈蟆油的主要伪品：中华大蟾蜍油(中华大蟾蜍Bufo gargarizans Cantor)
和黑龙江林蛙油(黑龙江林蛙Rana amurensis Boulenger)，它们与中国林蛙油(哈蟆油)的
区别如下：
1)中华大蟾蜍油COI特征条形码序列如下所示(SEQ ID No.4)，该特征序列与哈蟆
油COI特征条形码序列碱基差异为21.9％：
TACTCTATATCTTATTTTTGGGGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTGCCCTTAGCCTCCTTATCCGAGC
TGAGCTGAGTCAACCAGGCTCCCTCTTGGGCGATGATCAGATCTATAATGTCATTGTTACCGCCCACGCCTTCGTCA
TAATTTTCTTTATGGTCATGCCCATCCTAATCGGAGGCTTCGGTAACTGACTTGTCCCCCTGATAATTGGGGCCCCT
GACATAGCCTTCCCCCGAATGAATAACATAAGCTTTTGATTACTCCCCCCGTCATTTCTACTCCTCTTGGCATCCGC
CGGAGTCGAAGCAGGGGCAGGAACCGGCTGAACTGTATACCCCCCTCTGGCTGGGAACCTTGCACACGCAGGCCCAT
CAGTCGACTTAACCATTTTTTCCCTCCACCTTGCGGGTGTATCATCTATCCTAGGCGCAATTAATTTTATTACAACA
ACCCTTAACATGAAGCCACCATCAATGACTCAATACCAAACACCCTTATTTGTATGATCCGTCTTGATTACTGCTGT
TTTACTCCTACTCTCCCTGCCAGTCCTCGCTGCAGGAATCACTATACTCCTCACTGACCGAAACCTAAACACAACAT
TCTTTGACCCTGCTGGCGGAGGCGACCCCATCCTCTATCAACACCTCTTT
2)黑龙江林蛙油COI特征条形码序列如下所示(SEQ ID No.5)，该特征序列与哈蟆
油COI特征条形码序列碱基差异为12.6％：
AACCCTCTATTTTATCTTCGGGGCCTGAGCCGGCATAATCGGAACAGCTCTAAGCCTCCTCATTCGAGC
GGAACTAAGTCAGCCAGGAACCCTCCTGGGAGACGATCAAATTTATAATGTCATCGTCACTGCCCACGCATTTGTAA
TAATTTTTTTTATAGTTATACCAATCCTAATTGGAGGCTTTGGCAATTGACTTATCCCCCTAATGATTGGAGCCCCT
GATATAGCTTTTCCGCGAATAAACAACATAAGCTTCTGACTACTCCCACCCTCTTTTTTCCTTCTCTTAGCCTCCTC
CATAGTTGAAGCCGGAGCAGGCACAGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCCAGCAATCTCGCCCACGCAGGCCCAT
CAGTAGACATGGCCATTTTTTCATTACATTTAGCTGGGGTATCCTCCATTCTAGGGGCCATTAATTTCATTACAACA
ATTATTAATATAAAACCCTCATCCACAACCCAATACCAAACCCCTCTCTTTGTTTGATCAGTCTTAATTACTGCTGT
TCTCCTACTTCTTTCCCTCCCTGTCCTAGCCGCCGGGATCACTATACTTCTTACAGACCGGAATCTGAACACTACCT
TCTTTGATCCTGCTGGAGGCGGAGACCCAGTTCTCTACCAACACCTATTC
实施例3市售小包件哈蟆油药材检验
1)现场抽样
小包件，随机抽取线油1支。
2)将现场抽样的样品进行实验室取样
均分为3段，1/3供实验室分析用，另1/3供复核用，其余1/3留样保存。
3)获得实验室取样样品的条形码序列(COI)
a.称样量：5.15mg，置入2.0mL离心管
b.DNA提取
加入500μL含0.1％～2％盐酸的水，使用研磨杵反复研磨30秒左右，至无明显颗粒
并混匀。
加入360μL含1％～2.5％的十二烷基磺酸钠、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙
酸钠的缓冲液和40μL蛋白酶K(20mg/mL)裂解样品，使用涡旋混合仪混匀30秒左右，56℃孵
育至溶液澄清，每半小时颠倒混合样品2～3次。
加入700μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30秒，室温
下以最高速度离心5分钟。
小心将上清液转移至一新的离心管，加入700μL氯仿/异戊醇(24:1)，在涡旋混合
器上剧烈振荡混匀30秒，室温下以最高速度离心5分钟
加入等体积无水乙醇，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30秒，室温下静置5分钟。
小心将上清液转移至一新的离心管，加入1/10体积的3mol/L PH 5.2的乙酸钠，在
涡旋混合器上稍加振荡使之混匀。
加入2～2.5倍体积冰冷的无水乙醇在涡旋混合器上振荡混匀，冰浴5分钟，室温下
以最高速度离心5分钟。
弃去上清，加入1mL预冷的70％乙醇洗涤沉淀2次。
沉淀在真空干燥器或者真空旋转蒸发器中干燥。
加入50μL ddH2O溶解，在4℃保存备用。
c.PCR扩增
PCR扩增体系(25μL)：2×Taq PCR Mix：12.50μL；正向引物LWF01：1.00μL；反向引
物LWR01：1.00μL；dd H2O：8.50μL；模板DNA：2.00μL。
PCR反应条件为：
94℃1分钟；94℃1分钟，54℃，1.5分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟。
d.测序和拼接
使用ABI 3130进行双向测序，使用CodonCode Aligner 6.0.2完成序列拼接和质
量检测。获得序列如下所示：
AACCCTCTACCTAATCTTCGGGGCCTGAGCCGGCATGGTCGGAACAGCCCTAAGCCTTCTTATTCGAGC
AGAATTAAGCCAACCGGGAACTCTCTTGGGGGACGACCAGATCTACAATGTTATCGTCACTGCCCACGCATTTGTAA
TGATTTTCTTTATAGTCATACCAATCCTAATCGGGGGCTTTGGTAACTGACTAATCCCCATGATGATTGGAGCCCCT
GACATAGCCTTCCCCCGGATAAATAATATGAGCTTCTGGCTACTCCCACCATCCTTCTTTCTCCTCTTAGCCTCCTC
TACAGTTGAAGCTGGAGCAGGTACAGGCTGAACAGTCTATCCCCCTTTAGCTGGCAACCTAGCCCACGCGGGCCCAT
CGGTAGACCTAGCCATCTTCTCGCTACACCTGGCCGGGGTATCATCAATCCTGGGGGCAATCAATTTTATTACAACA
ATTATTAATATAAAACCCGCATCCACAACACAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCTGTTCTGATCACTGCTGT
ACTCCTGCTTCTTTCTCTCCCAGTCCTAGCCGCTGGAATTACCATACTTCTCACAGACCGAAATCTAAACACCACCT
TTTTCGACCCTGCAGGGGGAGGAGACCCAGTTCTCTACCAGCACCTATTC
4)所获得的条形码序列与中国林蛙COI特征条形码序列(SEQ ID No.1)完全一致。
5)该样品基原物种为正品，符合2015版中国药典。
序列表
<110> 哈尔滨市食品药品检验检测中心；中国医学科学院药用植物研究所
<120> 一种基于DNA条形码技术的市售哈蟆油药材检验方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 658
<212> DNA
<213> 中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David）
<400> 1
aaccctctac ctaatcttcg gggcctgagc cggcatggtc ggaacagccc taagccttct 60
tattcgagca gaattaagcc aaccgggaac tctcttgggg gacgaccaga tctacaatgt 120
tatcgtcact gcccacgcat ttgtaatgat tttctttata gtcataccaa tcctaatcgg 180
gggctttggt aactgactaa tccccatgat gattggagcc cctgacatag ccttcccccg 240
gataaataat atgagcttct ggctactccc accatccttc tttctcctct tagcctcctc 300
tacagttgaa gctggagcag gtacaggctg aacagtctat ccccctttag ctggcaacct 360
agcccacgcg ggcccatcgg tagacctagc catcttctcg ctacacctgg ccggggtatc 420
atcaatcctg ggggcaatca attttattac aacaattatt aatataaaac ccgcatccac 480
aacacaatac caaacacccc tgttcgtctg atctgttctg atcactgctg tactcctgct 540
tctttctctc ccagtcctag ccgctggaat taccatactt ctcacagacc gaaatctaaa 600
caccaccttt ttcgaccctg cagggggagg agacccagtt ctctaccagc acctattc 658
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LWF01
<400> 2
tctctactaa tcataaagay atygg 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LWR01
<400> 3
taaacttcag ggtgaccaaa raatca 26
<210> 4
<211> 658
<212> DNA
<213> 中华大蟾蜍（Bufo gargarizans Cantor）
<400> 4
tactctatat cttatttttg gggcctgagc aggaatagta ggaactgccc ttagcctcct 60
tatccgagct gagctgagtc aaccaggctc cctcttgggc gatgatcaga tctataatgt 120
cattgttacc gcccacgcct tcgtcataat tttctttatg gtcatgccca tcctaatcgg 180
aggcttcggt aactgacttg tccccctgat aattggggcc cctgacatag ccttcccccg 240
aatgaataac ataagctttt gattactccc cccgtcattt ctactcctct tggcatccgc 300
cggagtcgaa gcaggggcag gaaccggctg aactgtatac ccccctctgg ctgggaacct 360
tgcacacgca ggcccatcag tcgacttaac cattttttcc ctccaccttg cgggtgtatc 420
atctatccta ggcgcaatta attttattac aacaaccctt aacatgaagc caccatcaat 480
gactcaatac caaacaccct tatttgtatg atccgtcttg attactgctg ttttactcct 540
actctccctg ccagtcctcg ctgcaggaat cactatactc ctcactgacc gaaacctaaa 600
cacaacattc tttgaccctg ctggcggagg cgaccccatc ctctatcaac acctcttt 658
<210> 5
<211> 658
<212> DNA
<213> 黑龙江林蛙（Rana amurensis Boulenger）
<400> 5
aaccctctat tttatcttcg gggcctgagc cggcataatc ggaacagctc taagcctcct 60
cattcgagcg gaactaagtc agccaggaac cctcctggga gacgatcaaa tttataatgt 120
catcgtcact gcccacgcat ttgtaataat tttttttata gttataccaa tcctaattgg 180
aggctttggc aattgactta tccccctaat gattggagcc cctgatatag cttttccgcg 240
aataaacaac ataagcttct gactactccc accctctttt ttccttctct tagcctcctc 300
catagttgaa gccggagcag gcacaggctg aacagtttac cccccactag ccagcaatct 360
cgcccacgca ggcccatcag tagacatggc cattttttca ttacatttag ctggggtatc 420
ctccattcta ggggccatta atttcattac aacaattatt aatataaaac cctcatccac 480
aacccaatac caaacccctc tctttgtttg atcagtctta attactgctg ttctcctact 540
tctttccctc cctgtcctag ccgccgggat cactatactt cttacagacc ggaatctgaa 600
cactaccttc tttgatcctg ctggaggcgg agacccagtt ctctaccaac acctattc 658