本发明涉及生产富锗人参培养物及方法。 人参、灵芝、构杞等名贵中药除各自含有独特的药化成分外，其共同点都是富含锗。尤其人参，野山参与栽培参（园参）不仅价格悬殊，野山参的功效也比栽培参强得多，然而二者的人参皂甙等主要成分的含量和组成大致近同，所不同在于野山参还含有栽培参所缺少的具有高度生理活性的成分，国外研究认为，就在于野山参细胞含有大量的锗（浅井一彦，锗与人生，1969;森下敬一，锗与健康，1985）。在自然界，植物包括人参吸收和积累锗是相当缓慢而长期的过程，往往需要十几年、几十年，甚至更长的时间才能积累到显示生理活性的水平。据张树功等（高锗人参及其药理活性研究，1992）研究，一般栽培人参（6年生）中锗含量不超过0.1ppm，在田间进行的富锗栽培试验中，经2年富锗处理的人参含量只达到3～4ppm。经负压渗入法富锗处理的人参锗含量也只达到17.8ppm。而高药效含锗人参培养法（日本，特许公报昭63-21472）所达到的人参锗含量亦仅在10ppm左右。然而，浅井一彦所报导的野山参锗含量则达到767ppm。
本发明的目的在于运用人参组织和细胞培养中载体导入的方法生产一种安全、不含2、4-D成分、富集锗的高药效人参栽培物。
本发明涉及的人参组织和细胞培养方法是由人参幼苗的幼茎作外植体，在含2、4-D2mg/L、6-BA1mg/L的MS培养基上诱导脱分化形成愈伤组织，将这种茎愈伤组织培养在含2、4-D2mg/L和6-BA0.1～0.5mg/L的MS培养基上诱导分化出再生根，将再生根培养在含2、4-D2mg/L和6-BA1mg/L的MS培养基上，再次诱导脱分化形成再生根愈伤组织，或再由再生根愈伤组织制备悬浮细胞。以上培养，不论是进行固相培养还是悬浮培养，除了一般常规培养条件外，最佳培养条件是：（1）.2.5～3%蔗糖加0.5%葡萄糖;（2）.培养温度22～24℃;（3）.每天16小时光照;（4）.光照强度1500～2000Lx。
在最佳培养条件下筛选快速生长细胞系，将人参细胞进行悬浮培养，培养7～20天将培养细胞置板于固体培养基上，培养14～20天，挑选出生长快而大的细胞团块单独培养。培养20天后，将培养物用酶法离析成单细胞，再进行置板培养，培养20天后再挑选出生长快而大地细胞团单独培养。如此重复3～5次，即可筛选出生长快速的细胞系，作为培养材料。
尽管2、4-D对人参培养物的生长和人参皂甙含量有十分密切的关系，人参培养物含有2、4-D对人体是不利的，生产的人参培养物不得含有2、4-D成分，或使其残留量减少到最低限度。在MS培养基（液）中逐步减少2、4-D的添加量，对人参培养物进行无2、4-D驯化培养，经15～18代驯化培养获得能够在无2、4-D培养基（液）上正常生长的无2、4-D细胞系，无2、4-D细胞系的人参皂甙含量仍高于3.5%。
本发明使人参培养物富集锗的方法是在培养基（液）中添加锗化合物进行供锗培养，并选择了一种理想的化合物乙二胺四乙酸及其盐作为载体，将含锗的盐结合于载体上后加入MS培养基（液）中，载体将锗导入人参细胞，使人参细胞大量富集锗，根据需要还可以控制富集量。乙二胺四乙酸载体浓度在50mM浓度内对细胞是无毒害的，不影响培养物的生长，对其他代谢过程也没有不利影响。
本发明所用的锗化合物包括二氧化锗、醋酸锗、柠檬酸锗、酒石酸锗、锗酸钠，还有有机锗，如羧乙基锗倍半氧化物（Ge-132）。这些无机锗化合物对人参细胞有毒害作用，添加浓度一般在5～200ppm，锗盐以1∶2摩尔数与乙二胺四乙酸混合，在酸性条件下进行结合反应，然后按不同的供锗浓度添加于MS培养基（液）中，培养物在最佳培养条件下进行供锗培养，一个培养周期中人参培养物富集锗量可达到31～813ppm。所用的含锗盐中以锗酸钠为最好。
人参细胞富集锗和人参皂甙生物合成是二个独立的生理生化过程，在不造成细胞毒害的供锗浓度范围内，不论是载体供锗还是无载体供锗，人参培养物的皂甙含量基本上无差异。
用本发明的方法获得的富锗人参培养物进行动物药效试验，市售甲等生晒参为对照，所试验的抗肿瘤、抗利尿、降血糖等几项指标都显著优于对照。
实例1：
将购自吉林省通化地区的人参当年收获的干燥种子，用100ppm赤霉素浸种3天，在湿砂中15～18℃催芽，待种子裂口时播种于砂箱中。当苗长至8～10cm高时取幼茎，将幼茎切段，每段2～2.5cm长，在0.5%HgCl2浸6分钟杀菌，再以无菌水洗涤18分钟去除残留的HgCl2，然后接种于高压灭菌的MS培养基上，MS培养基含有2、4-D2mg/L和6-BA1mg/L，于25℃每天16小时光照下培养，7天后开始形成愈伤组织，诱导率91.5～100%。将幼茎愈伤组织转移到含2，4-D2mg/L、6-BA0.1～0.5mg/L的MS培养基上，诱导形成了再生根。将再生根切下置于含2，4-D2mg/L和6-BA1mg/L的MS培养基上，诱导形成了愈伤组织，用这种再生根愈伤组织作为本发明的起始培养材料。
将人参再生根愈伤组织放入含0.5～1.0%果胶酶的MS培养液中，调节PH至4.0～4.5，35℃保温30～60分钟，并轻轻摇动，愈伤组织即离析出单细胞和微细胞团块，用90～120目尼龙滤布滤去大团块，离心收集并用MS培养液离心洗涤2～3次，然后悬浮于MS培养液中，即可进行人参细胞悬浮培养。
实例2：
人参再生根愈伤组织或悬浮细胞培养物生物合成人参皂甙的能力与培养基中2、4-D浓度有密切关系。在MS培养基（液）中逐步减少2、4-D添加量，对人参培养物进行无2、4-D驯化培养，每代培养2周，经18代驯化的人参培养物能够在无2、4-D培养基上正常生长，而其人参皂甙含量仍能保持在相当水平，如表1。
表1人参培养物无2，4-D驯化培养
驯化代数 第0代 第3代 第6代 第9代 第12代 第15代 第18代
2,4-D添加 0.5 0.2 0.1 0.05 0.01 0.005 0
量(mg/L)
人参皂甙 11.6 10.2 8.8 7.4 5.6 4.8 4.2
含量(%)
实例3：
在MS培养基（液）中分别加入不同形式的锗化合物，其浓度（以Ge计）为0、5、10、50、100、200ppm，在最适条件下进行培养。不同形式的锗化合物对细胞表现出不同程度的毒害作用，尤其二氧化锗毒性最大（表2），其他如锗酸钠、醋酸锗、柠檬酸锗、酒石酸锗，低浓度时对细胞生长略有促进，高浓度时则抑制细胞生长（表2）。羧乙基锗倍半氧化物（Ge-132）是一种有机锗化合物，相比之下其对细胞的毒性最小（表2）。
表2各种锗化合物对人参细胞生长的影响（%）
锗浓度(ppm) 0 5 10 50 100 200
二氧化锗 100 94.6 82.3 44.7 - -
醋酸锗 100 108.7 104.4 93.4 86.4 61.7
锗酸钠 100 106.3 102.6 92.4 87.2 66.4
柠檬酸锗 100 112.4 108.3 94.2 82.5 59.2
酒石酸锗 100 105.6 102.4 94.6 88.3 62.7
Ge-132 100 114.4 117.3 108.8 102.6 98.6
将锗酸钠、醋酸锗、柠檬酸锗和Ge-132分别加入MS培养基（液）中，使其浓度为100ppm，在最适条件下进行人参细胞悬浮培养和固相培养，培养周期结束后收集培养物，用0.2N NaCl溶液洗涤3次，然后烘干至恒重，测定其含锗量，结果如表3。
表3人参培养物对不同形式锗的富集量（ppm）
培养物 醋酸锗 锗酸钠 柠檬酸锗 酒石酸锗 Ge-132
固相培养 8.8±2.1 6.2±1.4 10.2±1.6 5.4±1.3 13.6±2.7
悬浮培养 13.3±2.3 10.7±1.8 14.3±1.8 8.5±1.7 17.8±3.6
注：非供锗培养（对照）的人参培养物含锗量为0～0.01ppm。
实例4：
以乙二胺四乙酸作为锗化合物的载体，将锗导入人参细胞。取乙二胺四乙酸二钠37.42克溶于少量水中，取锗酸钠8.17克溶于少量水中。二种水溶液混合，以HCl调到酸性，使发生结合反应，然后定容到200ml，配成含锗母液，锗浓度为16.3mg/ml。将含锗母液加入MS培养基（液）中，使浓度分别为5、10、50、100、200ppm，在最适条件下进行人参培养物培养，培养周期结束后收集培养物，测定其含锗量，结果如表4。
表4不同供锗浓度下载体导入人参培养物的锗量（ppm）
供锗浓度 5 10 50 100 200
锗含量 31.2±4.2 52.6±4.8 296.7±16.7 522.4±33.6 813.3±52.4
注：非载体供锗（对照）人参培养物的含锗量为0～0.01ppm。
比较例：
按药理试验常规，进行富锗人参培养物药理活性动物试验。
动物：昆明种小白鼠。
人参：市购品，上海药材公司制品，甲级生晒参，含锗量为0～0.17ppm，水煎提取3次，合并提取液，浓缩至1∶2（参/水）。
富锗人参培养物，含锗量237ppm，水煎提取3次，合并提取液，浓缩至1∶2（参/水）。
表5抗缺氧作用
组别 存活时间(分钟) P值
对照 58.38±15.76
人参 84.72±16.58 <0.01
富锗人参培养物 123.17±17.26 <0.001
表6 降血糖作用
组别 血糖(mg/dl) P值
对照 87.42±27.15
高糖对照 140.12±11.78 <0.01
人参 131.56±8.79 >0.05
富锗人参培养物 103.47±7.26 <0.01
表7 对实验肿瘤S180的抑制作用
组别 瘤重(g) 抑制率(%) P值
对照 1.83±0.38
人参 1.60±0.46 12.3 >0.05
富锗人参培养物 1.02±0.62 44.2 <0.05