使用可选剪接在真核细胞中表达多肽多聚体的方法和构建物.pdf

本发明提供了使用单一表达载体在真核细胞中生产多种多肽，诸如抗体或抗体片段的方法。所述表达载体经过改造包含在单一启动子控制下的两种或多种表达盒，其中所述表达盒具有容许其可选剪接并以期望比例表达成两种或多种独立基因产物的剪接位点。公开了所述载体用于在真核宿主细胞中高效表达重组抗体的用途，以及此类抗体在诊断性和治疗性应用中的用途。

1.  一种表达载体，其包含：
启动子；
5’UTR；
单一剪接供体；
内含子；
第一剪接受体；
编码第一多肽的第一外显子；
第二剪接受体；和
编码第二多肽的第二外显子，
其中，所述启动子可操作连接所述第一和第二外显子，
在进入细胞后，所述单一剪接供体与所述第一剪接受体剪接，形成容许所述第一外显子转录的剪接转录物，并与所述第二剪接受体剪接，形成容许所述第二外显子转录的剪接转录物，且
所述第一多肽和所述第二多肽由所述剪接转录物表达。

2.  权利要求1的载体，其中所述启动子是CMV启动子。

3.  权利要求1的载体，还包含与所述第一外显子或第二外显子可操作连接的聚腺苷酸化信号。

4.  权利要求1的载体，其中所述载体还包含一个或多个额外剪接受体和编码额外多肽的额外外显子，其中在进入细胞后，所述单一剪接供体与所述额外剪接受体剪接，形成容许所述额外外显子转录的额外剪接转录物，且所述额外多肽由所述额外剪接转录物表达。

5.  权利要求1的载体，其中所述第一或第二外显子或二者编码选择标记。

6.  权利要求1的载体，其中所述第一和第二多肽形成多聚体。

7.  权利要求6的载体，其中所述多聚体蛋白质是异二聚体、异三聚体或异四聚体。

8.  权利要求1的载体，其中所述第一多肽以相对于所述第二多肽约10∶1至约1∶10的频率表达。

9.  权利要求1的载体，其中所述第一多肽以相对于所述第二多肽约3∶1至约1∶3的频率表达。

10.  权利要求1的载体，其中所述第一多肽以相对于所述第二多肽约1∶1的频率表达。

11.  权利要求1的载体，其中所述第一或第二剪接受体包含任何一种选自下组的序列：SEQ ID NO：1-28。

12.  权利要求11的载体，其中所述剪接供体和所述第二剪接受体衍生自CMV，而所述第一剪接受体包含任何一种选自下组的序列：SEQ ID NO：1-28。

13.  权利要求1的载体，其中所述载体是病毒载体。

14.  权利要求1的载体，包含SEQ ID NO：29。

15.  包含权利要求1的载体的真核细胞。

16.  权利要求15的细胞，其中所述载体整合到所述细胞的染色体DNA中。

17.  权利要求15的细胞，其中所述载体是附加体。

18.  权利要求15的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。

19.  权利要求18的细胞，其中所述细胞选自下组：幼仓鼠肾细胞、成纤维细胞、骨髓瘤细胞、NS0细胞、PER.C6细胞或CHO细胞。

20.  权利要求19的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

21.  用于生产多肽的方法，所述方法包括在培养物中培养权利要求15的细胞并由所述培养物分离所述第一多肽和所述第二多肽。

22.  通过权利要求21的方法生产的第一多肽和第二多肽。

23.  包含权利要求22的第一多肽和第二多肽的组合物，还包含药学上可接受载体。

24.  用权利要求23的组合物治疗有所需要的患者的方法。

25.  一种表达载体，其包含：
启动子；
5’UTR；
单一剪接供体；
内含子；
第一剪接受体；
编码第一抗体多肽或其片段的第一外显子；
第二剪接受体；和
编码第二抗体多肽或其片段的第二外显子，
其中，所述启动子可操作连接所述第一和第二外显子，
在进入细胞后，所述单一剪接供体与所述第一剪接受体剪接，形成容许所述第一外显子转录的剪接转录物，并与所述第二剪接受体剪接，形成容许所述第二外显子转录的剪接转录物，且
所述第一抗体多肽或其片段和所述第二抗体多肽或其片段由所述剪接转录物表达且缔合形成抗体或抗体片段。

26.  权利要求25的载体，其中所述第一外显子或所述第二外显子或二者编码抗体片段。

27.  权利要求25的载体，其中所述第一多肽是抗体重链或其片段，而所述第二多肽是抗体轻链或其片段。

28.  权利要求25的载体，其中所述第一多肽是抗体轻链或其片段，而所述第二多肽是抗体重链或其片段。

29.  权利要求27的载体，其中所述轻链或重链或二者是鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。

30.  权利要求28的载体，其中所述轻链或重链或二者是鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。

31.  权利要求25的载体，其中所述第一抗体多肽或其片段以相对于所述第二抗体多肽或其片段约3∶1至约1∶3的频率表达。

32.  权利要求25的载体，其中所述第一抗体多肽或其片段以相对于所述第二抗体多肽或其片段约1∶1的频率表达。

33.  权利要求25的载体，其中所述第一剪接受体或所述第二剪接受体包含任何一种选自下组的序列：SEQ ID NO：1-28。

34.  权利要求33的载体，其中所述剪接供体和所述第二剪接受体衍生自CMV，而所述第一剪接受体包含任何一种选自下组的序列：SEQ ID NO：1-28。

35.  权利要求25的载体，其中所述载体是病毒载体。

36.  权利要求25的载体，包含SEQ ID NO：29。

37.  包含权利要求25的载体的真核细胞。

38.  权利要求37的细胞，其中所述载体整合到所述细胞的染色体DNA中。

39.  权利要求37的细胞，其中所述载体是附加体。

40.  权利要求37的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。

41.  权利要求40的细胞，其中所述细胞选自下组：幼仓鼠肾细胞、成纤维细胞、骨髓瘤细胞、NS0细胞、PER.C6细胞或CHO细胞。

42.  权利要求41的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

43.  用于生产抗体或抗体片段的方法，所述方法包括在培养物中培养权利要求37的细胞并由所述培养物分离所述第一多肽和所述第二多肽。

44.  通过权利要求43的方法生产的抗体或抗体片段。

45.  包含权利要求44的抗体或抗体片段的组合物，还包含药学上可接受载体。

46.  用权利要求45的组合物治疗有所需要的患者的方法。

使用可选剪接在真核细胞中表达多肽多聚体的方法和构建物
                        发明背景
发明领域
本文公开的发明的某些实施方案涉及使用可选剪接在体外和在体内在真核细胞中表达多肽多聚体的载体和方法。还包括用于生成包含这些载体的细胞的方法，以及这些载体及由其表达的多肽用于治疗疾病和用于在体内或在体外高效生产此类多聚体蛋白质的用途。
背景和相关技术的描述
多肽多聚体是一起形成复合物的两条或多条多肽的装配物。构成复合物的多肽通常是不同的。抗体是典型的多肽多聚体，因为它们由一起形成四聚体复合物的两条抗体轻链多肽和两条抗体重链多肽构成。
在宿主细胞中表达多肽多聚体是富有挑战性的过程，因为必须小心协调构成多肽多聚体的每种不同多肽的表达。例如，为了在真核细胞中表达抗体，必须将编码抗体轻链的第一基因和编码抗体重链的第二基因导入细胞，并在可接受的比例范围内表达。同一细胞或培养系统中不能接受的抗体轻链与重链表达比例可导致期望的多聚体复合物的生产高度无效，或是导致对细胞或生物体毒性。
过去用于在真核细胞中表达多肽多聚体的方法包括导入两种或多种载体，每种载体分开编码构成多肽多聚体的每种不同多肽。每种载体通常携带驱动复合物一种多肽表达的启动子，而且至少一种载体通常编码选择标记。然后，将载体连续或一起导入细胞(通常通过转染)，并就两种选择标记的表达对细胞进行共选择。
在另一种方法中，将构成多肽复合物的每种多肽的编码序列与启动子一起插入单一载体。此方法消除了操作多种载体的需要，但是仍然没有消除每种编码序列间启动子竞争的可能性。同样，此方法通常不能解决以可接受的比例表达构成蛋白质多聚体的各种多肽从而实现蛋白质多聚体的高效表达的问题。
如此，在上述两种方法中，不能始终在宿主细胞中实现两种产物的一贯比例。这可能是由于诸如下列因素，不同启动子活性、启动子竞争最佳表达所需要的细胞因素、蛋白质多聚体成分多肽的转录和/或翻译效率、和/或导入细胞的每种载体的拷贝数的差异。
还已经开发了利用单一剪接供体和剪接受体的剪接载体。美国专利号5,043,270公开了一种小基因，它表达选择标记，如DHFR，且具有包含编码目的蛋白质的基因的内含子。美国专利号5,561,053公开了倒转占位(inversesituation)，其中编码目的蛋白质的基因在编码序列的5’端含有内含子。此内含子含有以剪接供体和受体为界的编码选择标记的基因。这种类型的内含子表达载体还描述于Lukas，B.K.等，Nucleic Acids Res.24：1774-1779，1996。美国专利申请公开号2005/0019925A1公开了具有融合选择标记的类似内含子载体。它还公开了两对剪接供体和剪接受体用于表达超过一种目的蛋白质的用途。然而，所有这些发表的构建物依赖成对的剪接供体和剪接受体，即单一剪接受体有一个剪接供体来匹配。每一种这些构建物的效力依赖所有位点的高效剪接。没有涉及使用单一剪接供体来激活超过一个剪接受体的可选剪接以表达多种多肽。另外，没有提出需要以不同比例表达多肽或者替换不同剪接受体以控制多肽的相对表达。
因此，需要以一贯比例连接两种或多种基因的表达使得所得基因产物高效生成和装配的构建物。
                         发明概述
通过经由可选剪接的使用连接两种或多种基因的表达，本发明解决了使用一种表达载体在宿主细胞中表达多肽多聚体的上述问题。因此，可使用具有一个启动子的单一载体来驱动可剪接成两种或多种不同mRNA转录物的前mRNA的表达，使得所述两种或多种mRNA转录物编码不同多肽。如此，两种或多种产物的相对表达不受独立启动子的不同活性、启动子竞争或载体拷贝数的影响。
具体而言，本发明提供了用于将使用单一启动子来驱动单一前mRNA转录的单一表达载体导入真核细胞的方法，所述前mRNA随后可选剪接成两种或多种不同基因产物，它们随后可翻译成两种或多种不同多肽。在一个实施方案中，所述基因产物编码多聚体蛋白质的多肽亚基。在另一个实施方案中，所述基因产物是构成抗体的抗体轻链和重链。
因此，本发明具有几项优势，包括但不限于下列各项：
-提供了用于表达多种多肽，特别是异聚体多肽诸如抗体或抗体片段的载体；
-在真核细胞诸如动物细胞或酵母细胞中生产多种多肽，例如抗体重链和轻链多肽的有效方法；
-生产用于诊断性或治疗性应用的重组抗体的有效方法；和
-通过所述方法生产的重组抗体，用于治疗需要重组抗体治疗的受试者。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了以5’至3’或顺流方向包含启动子，如CMV启动子；5’非翻译区(UTR)，提供如加帽信号；剪接供体；内含子；第一剪接受体；编码第一多肽的第一外显子；第二剪接受体；和编码第二多肽的第二外显子的表达载体，其中所述启动子可操作连接所述第一和第二外显子。剪接位点(即供体和受体)可以是天然存在的剪接位点、经过改造的剪接位点，例如合成的剪接位点、规范的或共有的剪接位点、或非规范的剪接位点，如隐蔽剪接位点。每个外显子还可包含聚腺苷酸化信号。
在此，术语“第一”或“第二”在用于遗传元件诸如外显子、内含子、任何剪接位点等时仅仅用于彼此鉴别和区分各种元件，并非涉及所述元件在基因内的实际线性位置或编号或是编码蛋白质多聚体各个多肽成分的前mRNA分子的表达顺序。
在另一个实施方案中，所述载体包含一个剪接供体和超过一个剪接受体，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多剪接受体。每个剪接受体与紧挨着位于该剪接受体下游的外显子相连。因此，所述载体包含超过一个外显子，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多外显子。
在一个实施方案中，所述第一多肽是抗体重链，而所述第二多肽是抗体轻链，或者，所述第一多肽是抗体轻链，而所述第二多肽是抗体重链。
在一个相关实施方案中，所述重链和/或轻链是鼠源的、嵌合的、人源化的或人的。所述轻链和重链可包含氨基酸改变，诸如在如Fc区中引入或消除糖基化位点。
在另一个实施方案中，所述第一和第二多肽以约20∶1至约1∶20、约15∶1至约1∶15、约12∶1至约1∶12、约10∶1至约1∶10、约9∶1至约1∶9、约8∶1至约1∶8、约7∶1至约1∶7、约6∶1至约1∶6、约5∶1至约1∶5、约4∶1至约1∶4、约3∶1至约1∶3、约2∶1至约1∶2、或约1∶1的比例表达。在具体的实施方案中，所述第一和第二多肽以约20∶1、约19∶1、约18∶1、约17∶1、约16∶1、约15∶1、约14∶1、约13∶1、约12∶1、约11∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9、约1∶10、约1∶11、约1∶12、约1∶13、约1∶14、约1∶15、约1∶16、约1∶17、约1∶18、约1∶19、或约1∶20的比例表达。该比例的测定通常使用本领域认可的技术来测定，诸如逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或Northern印迹(用于测量转录物的相对量)或免疫印迹或酶联免疫吸附测定法(ELISA)技术(用于测量多肽的相对量)。
在一个实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28。
在一个相关实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO：29。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含能够表达两种或多种可选剪接基因产物的上述载体的真核细胞。
在一个实施方案中，本发明的可选剪接载体整合到细胞的染色体DNA中，而在另一个实施方案中，所述载体是附加体。在相关实施方案中，本发明的可选剪接盒或构建物整合到细胞的染色体DNA中。在另一个相关实施方案中，本发明的可选剪接盒或构建物是附加体。在另一些其它相关实施方案中，本发明的可选剪接载体包含病毒载体。
在另一个实施方案中，含有本发明载体的真核细胞是哺乳动物细胞，诸如例如幼仓鼠肾细胞、成纤维细胞、骨髓瘤细胞、NSO细胞、PER.C6细胞或CHO细胞，或是昆虫细胞，诸如例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞、甘蓝银纹夜蛾(Tricoplusia ni)(Tn.TnHigh-Five)细胞或家蚕蛾(Bombyx mori)(BMN)细胞。或者，含有本发明载体的真核细胞是酵母细胞，例如糖酵母(Saccharomyces)细胞、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)细胞或毕赤酵母(Pichia)细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产多肽的方法，所述方法包括培养含有本发明可选剪接载体或表达盒或构建物的上述细胞，随后由所述细胞培养物分离所述第一和所述第二多肽。
在该方法的一个实施方案中，所述第一和第二多肽形成多肽多聚体，诸如抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过该方法生产的上述肽多聚体，用于制造用于治疗或预防疾病或紊乱的药物。
在另一个实施方案中，本发明提供了在体内将所述可选剪接载体或可选剪接盒或构建物投递至患者。
在另一个实施方案中，本发明提供了以回体(ex vivo)将所述可选剪接载体或可选剪接盒或构建物投递至患者的细胞或组织。在相关实施方案中，本发明还提供了将包含所述可选剪接载体或可选剪接盒或构建物的患者细胞或组织返还患者体内。
根据下文详述和权利要求，本发明的其它特征和优势对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
                        附图简述
图1显示了本发明可选剪接载体的结构和功能方面的示意图，所述载体设计成容许单一启动子来驱动单一前mRNA的转录，它随后可以可选剪接成两种或多种转录物。所述两种或多种转录物随后翻译成两种或多种相应多肽。
图2显示了本发明的表达载体在用于表达抗体轻链和重链且它们随后装配形成成熟四聚体抗体时的示意图。
图3是为了在真核细胞中生产抗体而设计成由单一启动子表达抗体轻链和重链的本发明可选剪接载体的质粒图谱。该质粒图谱还指出了剪接位点、克隆位点、聚腺苷酸化序列、及用于在真核细胞中进行选择(DHFR)和在原核细胞中进行扩增(β-内酰胺酶)的标记的位置和取向。还可参见SEQ IDNO：29，它提供了载体主链的序列。
图4显示了所测试第一剪接受体的剪接位点、内含子和外显子区(分别是小写和大写)的序列，及相应的质粒名称和序列标识符。
                        发明详述
为了提供对说明书和权利要求的清楚理解，下文方便的提供了下列定义。
定义
术语“第一多肽”和“第二多肽”指希望其共表达的多肽。这些包括例如由多个多肽亚基构成的多聚体蛋白质的多肽“链”。这些多聚体蛋白质可以是在自然界中发现的，例如本领域所描述的。当然，术语“第一多肽”和“第二多肽”还可在将来用于描述本领域目前尚未描述过的多聚体蛋白质。这些多聚体蛋白质还可以是人造的，如由在自然界中通常发现不缔合的多肽构成。另外，所述多肽可以是不缔合在一起的，但是为了一些功能目的而共表达，例如选择标记和目的多肽的共表达。另外，所述多肽可以是天然序列或突变的，诸如通过氨基酸添加、删除或替代。本领域普通技术人员将容易的认识到本发明的载体适用于广泛的多肽，而且能够使用标准分子生物学技术修改所述载体以适应这些多肽的使用。
术语“抗体”或“抗体片段”指多肽或多肽片段的装配物，它们具有针对靶多肽或受体的结合活性，或者具有期望的效应物功能。通常，此类装配物至少包括抗体轻链和重链的可变区，例如Fab片段，或是两条抗体轻链和两条抗体重链，四条链一起形成四聚体抗体(L:H:H:L)，其可变区能够结合抗原。本发明的抗体可以是本领域知道的任何形式，例如鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。还可以修饰本发明的抗体以具有其它特征，诸如改变的糖基化位点或Fc区。
术语“UTR”意为非翻译区，指转录成前mRNA和成熟mRNA非翻译区的核酸序列区段。5’UTR通常担当转录物的5’末端，以起动mRNA转录物翻译成多肽的7-鸟、7-甲基鸟苷帽进行修饰或“加帽”。
术语“以...比例表达”指表达成转录物或多肽的基因产物的产量比例。该比例的测定通常使用本领域认可的技术来测定，诸如逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或Northern印迹(用于测量转录物的相对量)或免疫印迹或酶联免疫吸附测定法(ELISA)技术(用于测量多肽的相对量)。
在某些实施方案中，所述第一和第二多肽以约20∶1至约1∶20、约15∶1至约1∶15、约12∶1至约1∶12、约10∶1至约1∶10、约9∶1至约1∶9、约8∶1至约1∶8、约7∶1至约1∶7、约6∶1至约1∶6、约5∶1至约1∶5、约4∶1至约1∶4、约3∶1至约1∶3、约2∶1至约1∶2、或约1∶1的比例表达。在具体的实施方案中，所述第一和第二多肽以约20∶1、约19∶1、约18∶1、约17∶1、约16∶1、约15∶1、约14∶1、约13∶1、约12∶1、约11∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9、约1∶10、约1∶11、约1∶12、约1∶13、约1∶14、约1∶15、约1∶16、约1∶17、约1∶18、约1∶19、和/或约1∶20的比例表达。
术语“第一外显子”指编码多肽或多肽区的编码序列或核酸序列，而术语“第二外显子”指编码第二多肽区的不同的第二编码序列或核酸序列。本发明的第一和第二外显子还包含5’剪接受体序列。
术语“宿主细胞”或“真核宿主细胞”指使用本发明的表达系统生成或表达所述第一和第二外显子的基因产物的任何真核细胞。这包括例如哺乳动物细胞，诸如幼仓鼠肾细胞、成纤维细胞、骨髓瘤细胞(如NS0细胞)、人PER.C6细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。可用于表达的昆虫细胞包括例如草地夜蛾(Sf9)细胞、甘蓝银纹夜蛾(Tn.TnHigh-Five)细胞或家蚕蛾(BMN)细胞。可用于表达的酵母细胞包括例如糖酵母细胞、裂殖糖酵母细胞或毕赤酵母细胞。此类细胞易于从公开的和商业性的来源获得，诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。
术语“内含子”指进行转录且存在于前mRNA中但由剪接机制根据剪接供体和剪接受体的序列切除因而在成熟mRNA转录物中不存在的核酸序列区段。
术语“可操作连接”指各成分处于容许它们以其设定方式发挥功能的相互关系的并置方式(如功能性连接)。
术语“聚腺苷酸化信号”指RNA转录物中存在的、在存在酶聚腺苷酰转移酶时容许转录物聚腺苷酸化的核酸序列。本领域知道许多聚腺苷酸化信号，它们可用于本发明。实例包括人变体生长激素聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号和牛生长激素聚腺苷酸化信号。
术语“启动子”指足以指导转录的最小序列，优选在真核细胞中。可用于本发明的启动子包括例如提供高水平表达的病毒、哺乳动物、昆虫和酵母启动子，如哺乳动物巨细胞病毒或CMV启动子、SV40启动子、或本领域知道的适用于在真核细胞中表达的任何启动子。
术语“剪接位点”指能够被真核细胞的剪接机制识别而适于切割和/或与相应剪接位点连接的特定核酸序列。剪接位点容许切除前mRNA转录物中存在的内含子。通常，将剪接位点的5’部分称为剪接供体，而将3’相应剪接位点称为受体剪接位点。术语剪接位点包括例如天然存在的剪接位点、经过改造的剪接位点，例如合成的剪接位点、规范的或共有的剪接位点、和/或非规范的剪接位点，例如隐蔽剪接位点。
术语“与...剪接”指剪接供体与剪接受体相互作用从而容许剪接机制(如剪接体)剪接转录物。如上所述，剪接即切除转录物中以剪接供体和剪接受体为界的部分(内含子)。对于每条转录物，剪接供体只与一个剪接受体剪接。对于可选剪接，在转录物集合中，剪接供体与超过一个剪接受体剪接。例如，剪接供体可与一条转录物的第一剪接受体剪接，但是在另一条转录物上，剪接供体与第二剪接受体剪接，生成转录物的异质集合(heterogeneouspool)。
术语“剪接转录物”指在剪接供体和第一或第二任一剪接受体之间已进行过剪接的、包含第一或第二外显子的、由本发明可选剪接载体转录的RNA。
术语“载体”指在导入宿主细胞或宿主细胞提取物后能够赋予基因产物以表达的核酸分子(DNA或RNA任一)。此术语可与“可选剪接载体”、“表达载体”、“表达盒”或“构建物”互换。此类载体或表达盒或构建物可包含本发明的可选剪接元件以及用于在细胞中扩增载体、载体侵入细胞和后续表达的额外序列、选择标记、或任何其它功能性元件。此类元件是本领域众所周知的，而且可根据需要使用标准分子生物学技术互换。
术语“病毒载体”或其变化(诸如“腺病毒载体”)指包含本发明的可选剪接载体或表达盒或构建物的减毒型或复制缺陷型病毒颗粒。如下文更为详细描述的，此类病毒载体可用于将本发明的可选剪接载体或表达盒或构建物插入宿主细胞。
详述
1.概观
通过提供包含驱动两个或多个外显子表达的单一启动子的载体或表达盒或构建物，其中所述外显子经过改造可选剪接成两种或多种可表达转录物，本发明部分提供了用于在真核细胞中表达两种或多种基因产物的方法。如此，所述载体或表达盒或构建物适用于表达两种或多种多肽，特别是多肽多聚体，例如通常作为两条轻链和两条重链抗体多肽的装配物的抗体(或抗体片段)。
此外，因为本发明的载体或表达盒或构建物使用单一启动子来驱动前mRNA的表达，它随后可选剪接成两种或多种基因产物，本发明避免了多个启动子的使用、因使用多个启动子的启动子竞争、或独立启动子的不同活性。
另外，经由多个剪接受体的使用，本发明具有如下优势，即在真核细胞中以期望比例提供多种基因产物的表达，使得例如所得多肽装配物，例如四聚体抗体高效生成。
另外，本发明提供了通过改变剪接元件，特别是第一剪接受体的序列来改变所编码多肽的表达比例。改变所表达多肽比例的能力通过以最佳数量提供多肽而容许更加有效的多聚化或多肽的其它功能性方面。如此，本发明的载体或表达盒或构建物容许以足以生成一种或多种期望蛋白质的数量表达所述多肽。
如此，本发明还提供了适用于使用可选剪接表达多肽多聚体，如抗体的载体，以及包含所述载体的细胞和由此类细胞生成的抗体及其在例如在受试者例如人类患者中预测、诊断、预防、改善或治疗紊乱或疾病中的用途。
另外，本发明提供了适用于通过将载体直接或经由回体(ex vivo)技术投递至受试者而在体内表达多肽的载体。
2.用于表达多肽多聚体的载体或表达盒或构建物的设计
本发明的方法采用使用(以5’至3’或顺流方向)包含启动子；5’非翻译区(UTR)(它可以包含或不包含编码序列)；单一5’剪接供体；以3’剪接受体结束的内含子，所述3’剪接受体以优选约5-95％的效率使用(取决于期望的产物比例)(例示性的3’剪接受体效率包括但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％)；含有第一基因和，任选地，聚腺苷酸化信号的外显子；以效率高于50％(在优选的实施方案中，3’剪接受体的效率高于75％(如80％、85％、90％、95％或100％)，效率高于85％(如90％、95％或100％)，效率高于90％(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)，或者，在高度优选的实施方案中，效率高于95％(如96％、97％、98％、99％或100％)的3’剪接受体结束的内含子序列；和含有第二基因和，任选地，聚腺苷酸化信号的外显子的载体(见图1)。可将本发明的载体、表达盒或构建物导入宿主细胞，它在其中生成可选剪接mRNA转录物。这些两种或多种mRNA转录物编码不同的多肽，它们随后以足以生成一种或多种期望多聚体蛋白质的数量表达。如果需要，可经由合适剪接位点的选择，如较弱或较强的剪接受体来改变两种或多种产物的比例。在具体的实施方案中，可经由只选择第一剪接受体来改变两种或多种产物的比例。
通常，前mRNA剪接涉及精确切除内含子序列，且部分基于剪接机制如剪接体对内含子-外显子边界处特定序列即供体和受体剪接位点的识别。这些边界序列通常符合共有序列，内含子5’端的MAG/GURAGU(SEQ IDNO：30)和内含子3’端的Y₁₀NCAG/G(SEQ ID NO：31)(其中M＝A或C，标有下划线的是不变的核苷酸，Y₁₀＝10个连续的C或T核苷酸，而N＝任何核苷酸)。内含子和外显子中的序列以及内含子长度也已证明在剪接效率中发挥作用(参见如Chabot，B.，Trends in Genetics 12：472-478，1996)。
在本发明的某些实施方案中，可选剪接能够调控由本发明载体或表达盒或构建物的外显子编码的每种多肽的表达。对于每条独立的剪接转录物，剪接供体只与一个剪接受体剪接，或者根本不剪接。然而，可选剪接形成转录物的异质集合，因为剪接供体可与一条转录物上的第一剪接受体剪接，而与另一条转录物上的第二剪接受体剪接。如此，单一剪接供体与多个剪接受体的剪接将调控细胞中由本发明载体或表达盒或构建物生成的第一和第二(或更多)外显子的剪接转录物水平。不同剪接转录物水平的相对数量将取决于剪接供体多么频繁的连接特定剪接受体，这称为剪接事件效率。特定剪接事件在转录物中发生的频率越高，则表示与该剪接事件相关的剪接供体和剪接受体效率越高或越强。
在本发明的某些实施方案中，优选的是，剪接供体和3’末端剪接受体(例如第二剪接受体)高度有效，因此整体剪接高度有效且第一剪接受体的强度控制剪接外显子转录物的相对水平。未剪接转录物的翻译效率通常很低，因此最大限度剪接促进多肽表达。例如，如果剪接供体和第二剪接受体高度有效，那么大多数新生mRNA将被剪接。如果第一剪接受体强(即高效)，那么细胞内将存在相对较高水平的包含第一外显子的剪接转录物，导致第一多肽较之第二多肽高比例表达。。如果第一剪接受体较弱，那么细胞内将存在相对较低水平的包含第一外显子的剪接转录物，导致第一多肽较之第二多肽低比例表达。因为翻译高度依赖包含指定外显子的剪接转录物的水平，所以由第一或第二外显子编码的多肽的表达依赖利用紧挨着外显子上游的剪接受体的剪接水平。因此，在某些实施方案中，因为剪接影响包含由本发明载体或表达盒或构建物编码的每种外显子的成熟转录物的水平，所以使用可选剪接来调控由外显子编码的多肽的表达。
剪接供体和剪接受体在本领域是众所周知的，且任何剪接供体和剪接受体都可用于本发明。这些元件尤其可在本领域中找到或衍生自共有序列，或是根据经验插入、删除或替代核苷酸，或是使用能够预测剪接序列的软件，诸如2.4版Netgene2。可在本发明中对此类剪接元件测试合适性，诸如使用实施例中描述的方法。本发明部分引入和改进此类序列以经由遗传工程在真核细胞中实现两种或多种期望重组基因产物的可选剪接。
本发明的载体或表达盒或构建物可用于表达多种异多聚体蛋白质。实例包括但不限于异二聚体诸如糖蛋白激素(如绒毛膜促性腺激素(CG)、促甲状腺素(TSH)、促黄体素(LH)、和促卵泡素(FSH))或整联蛋白家族的成员。还可使用由两对相同亚基组成的异四聚体。适宜异四聚体的实例包括抗体、胰岛素受体(α2β2)和转录起始因子TFIIE(α2β2)。另外，使用生成2∶1表达比例的剪接受体对，载体或表达盒或构建物可用于表达异三聚体，诸如淋巴毒素α1β2。通过组合不同剪接受体改变表达比例可生成能够以不同比例表达多聚体的载体或表达盒或构建物，容许许多不同异多聚体蛋白质的高效表达。在某些实施方案中，根据剪接供体和/或剪接受体信号的序列来预测表达比例。在其它实施方案中，根据经验确定表达比例。
此外，可使用本发明的可选剪接系统用于生成多肽多聚体例如抗体的基因序列可从许多不同来源获得。例如，多种人蛋白质基因可从公众可获得的基因序列保藏物和/或质粒、克隆、细胞等的保藏物获得。许多蛋白质序列和蛋白质编码序列已经发表，且可由这些序列诸如本文所述合成合适的基因。或者，可使用本领域认可的技术选择并培养蛋白质生成细胞系。在其它实施方案中，基因序列是经由登录订阅的数据库获得的。本领域普通技术人员将知道许多方法适于获得基因序列信息。
例如，可通过标准技术从最初生成抗体的杂交瘤细胞或从其它转化细胞分离编码抗体的RNA，诸如异硫氰酸胍提取和沉淀，后续离心或层析。在需要时，可通过标准技术从总RNA分离mRNA，诸如在寡dT纤维素上进行的层析。适于这些目的的技术对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。
编码抗体轻链和重链的cDNA可依照众所周知的方法使用逆转录酶和DNA聚合酶同时或分开制备。可用共有恒定区引物或以例如发表的抗体轻链和重链DNA和氨基酸序列为基础的更特异引物起始。如上所述，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况中，可用共有引物或较大同源探针诸如小鼠恒定区探针筛选文库。
或者，抗体和抗体片段可使用衍生自众所周知的计算机建模技术的序列合成。此类建模技术可用于预测在由保守氨基酸序列定义的指定抗体框架的背景下将结合预测配体结构的抗体序列。通过使用这种已知关系，本领域技术人员能够设计期望抗体或抗体片段的氨基酸序列，然后合成编码期望多肽的核酸序列。此类设计的抗体或抗体片段称为“合成的”。
本发明的组合物和方法适于任何抗体，或实际上任何多链或多聚体蛋白质。与本发明的这个实施方案相容的寡核苷酸合成技术是本领域普通技术人员所熟知的，且能够使用几种商品化自动化合成仪任何一种来进行。另外，编码本文列出的几种重链和轻链类型的DNA序列可经由商业DNA卖主获得。然后可改变或修饰使用任何上述方法获得遗传材料以提供与本发明及此类抗体的期望用途相容的抗体。
多种不同抗体类型可依照本发明表达。例如，对某一抗原如肿瘤相关抗原、病原体、或涉及自身免疫病的自身抗原具有特异免疫反应性的抗体或抗体片段。可修饰抗体(或其片段)使得一个或多个恒定区删除或以其它方式改变，从而提供期望的功能活性诸如血清半衰期、或效应物功能。Kuby，J.，《Immunology》，第3版，W.H.Freeman and Co.，1997中描述了许多此类抗体。
适于使用本发明的方法在真核细胞中表达的抗体包括五个截然不同的抗体类别：IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。虽然所有五类都属于本发明的范围之内，但是下面的讨论主要针对IgG类分子。本领域普通技术人员能够容易的使下面的讨论适应其它类别的免疫球蛋白。IgG分子通常包含两条相同的抗体轻链，每条分子量约23kD，和两条相同的抗体重链，每条分子量约53-70kD。在图2所示构造中，链间二硫键连接这四条链。另外，抗体轻链和重链二者都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。在这点上，本领域普通技术人员将领会，抗体轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学特性，诸如分泌、经胎盘迁移、Fc受体结合、补体结合、和其它效应物功能。
轻链分为入κ或λ链。可发现每类重链或与κ或与λ轻链结合。一般而言，轻链和重链彼此共价键合，且在由杂交瘤、B细胞或经过遗传工程改造的宿主细胞生成免疫球蛋白时两条重链的“尾”部通过共价二硫键彼此键合(见图2)。N端是可变区，而C端是恒定区。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其中还有亚类。这条链的本质决定抗体的“分类”是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。免疫球蛋白亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，已经充分鉴定且已知赋予功能特化。应当理解本发明的第一外显子或第二外显子可用于二选一地编码抗体轻链或重链，只要所得载体编码一条轻链和一条重链。
抗原结合位点由每条VH和VL链上的三个互补决定区(CDR)决定。每个单体抗体上存在的六个CDR是较短的非连续氨基酸序列，它们的具体占位使得抗体在水性环境中采取三维构象时形成抗原结合位点。重链和轻链可变区的剩余部分在氨基酸序列上显示较低的分子间可变性，称为框架区。框架区大部分采取β-折叠构象，而CDR形成连接β-折叠结构的环，且在有些情况中构成β-折叠的一部分。如此，框架区的作用是形成支架，通过链间非共价相互作用为正确取向的六个CDR提供定位。由定位的CDR形成的抗原结合位点决定与免疫反应性抗原上表位的表面互补性。此互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。
抗体片段适于使用本发明的可选剪接载体或表达盒或构建物表达。此类片段是期望抗体的任何一个或多个部分，且可包括如Fab片段、F(ab’)₂片段、和Fc片段。另外，抗体片段可包括单链抗体或包含少于全长四聚体抗体蛋白质的其它抗体衍生多肽。
本领域普通技术人员将领会，使用本发明的可选剪接载体或表达盒或构建物表达的抗体可包含提供抗体与选定抗原结合的任何类型的可变区。在这点上，可变区可包含任何类型的哺乳动物的或衍生自能够诱导引起体液应答并生成针对期望抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。因此，经修饰抗体的可变区可以是例如鼠源的、非人灵长类的、或人源的。在衍生自不同物种时，通常是鼠源可变区与人源恒定区融合，将该抗体称为嵌合抗体。在优选的实施方案中，抗体的可变区和恒定区二者都是人源的。在其它选定实施方案中，相容抗体的可变区(通常衍生自非人来源)可进行改造或特定剪裁以改进分子的结合特性(如亲和力成熟)或降低免疫原性。在这点上，可用于本发明的可变区可进行人源化或以其它方式改变，即经由包含引入的DNA或氨基酸序列。此类具有自另一种物种移植的CDR的人抗体称为人源化抗体。另外，可变区可以是经过改造的，或合成的，正如先前所述。任何上述抗体可进一步修饰以具有改变的糖基化位点、适于PEG化的位点、和/或赋予抗体以改变的效应物功能的位点，如改变的补体结合、改变的Fc受体结合、和/或改变的免疫细胞相互作用活性。
为了本发明的目的，可采用许多可选剪接表达载体系统。例如，本发明的可选剪接载体或表达盒或构建物可含有衍生自动物病毒的DNA元件，诸如人或牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(如HIV)、巨细胞病毒、或SV40病毒。另外，可通过导入一种或多种容许选择受到转染的宿主细胞的标记来选择能够将可选剪接载体或表达盒或构建物整合到其染色体中或作为附加体维持载体或表达盒或构建物的细胞。选择标记基因可以直接连接待表达的DNA序列，或者通过共转染导入同一细胞。下文讨论了适于导入本发明载体或表达盒或构建物的宿主细胞。
3.在培养物中的真核细胞中表达多肽多聚体
可使用本领域普通技术人员熟知的技术将本发明的可选剪接载体或表达盒或构建物导入适当的宿主细胞。这些包括例如转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、使用包膜DNA的细胞融合、显微注射、和病毒感染(参见如Ridgway，A.A.G.，“Mammalian Expression Vectors”，第24.2章，第470-472页，《Vectors》，Rodriguez和Denhardt编，Butterworths，Boston，Mass.，1988)。如上所述，本发明的载体或表达盒或构建物可整合到宿主细胞的染色体中，以附加体形式维持，或者瞬时表达。经转化细胞在适于生成其中所编码多肽，如抗体轻链和重链的条件下培养，并测定多肽合成。用于鉴定和测量多肽合成的例示性测定技术包括如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光共振能量转移(FRET)、放射免疫测定法(RIA)、荧光激活细胞分拣分析(FACS)、和免疫组织化学。
用于蛋白质表达的宿主细胞系优选真核起源，例如哺乳动物起源，或者酵母或昆虫。例示性宿主细胞系包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)系、HeLa(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、NS0(骨髓瘤)、BEC(牛肉皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、293(人肾)、PER.C6(人)、草地夜蛾(Sf9)(昆虫)、甘蓝银纹夜蛾(Tn.TnHigh-Five)(昆虫)、家蚕蛾(BMN)(昆虫)、糖酵母(酵母)、裂殖糖酵母(酵母)和毕赤酵母(酵母)。宿主细胞系通常可从商业服务机构诸如American Tissue Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)或出版的文献获得。
体外生产容许扩大规模以生成大量的使用本发明可选剪接系统生产的期望多肽，优选抗体。用于组织培养条件下的真核如哺乳动物和酵母细胞培养的技术是本领域普通技术人员所熟知的，包括同质悬浮培养，如在气升式反应器中或在连续搅拌式反应器中，或者固定化或圈闭式(entrapped)细胞培养，如在中空纤维中、微囊、在琼脂糖微珠上、陶瓷筒、或在发酵罐中。为了分离和回收依照本发明生产的多聚体蛋白质，特别是就抗体而言，可首先浓缩培养物上清液中的蛋白质(如免疫球蛋白)，如通过硫酸铵沉淀，针对吸湿材料诸如PEG透析，和经选择性膜过滤。如果必需和/或期望的话，通过惯例的层析方法纯化多聚体蛋白质(如多价抗体)的浓缩液，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素的层析、或免疫亲和层析(如蛋白质A或蛋白质G)。
本发明还涵盖在使用本发明的可选剪接系统表达时缔合生成功能性抗体的任何抗体轻链和重链序列的表达，所述功能性抗体如特异结合靶抗原诸如肿瘤相关抗原、病原体或自身抗原或者具有期望效应物功能的抗体。
重要的是，可选择可选剪接构建物中抗体轻链和重链基因的拷贝数，从而获得优选的轻链/重链比例。在某些实施方案中，轻链以范围通常为相对于重链的约10/1、约5/1、约3/1或约1/1的水平表达。在相关实施方案中，轻链和重链多肽以约20∶1至约1∶20、约15∶1至约1∶15、约12∶1至约1∶12、约10∶1至约1∶10、约9∶1至约1∶9、约8∶1至约1∶8、约7∶1至约1∶7、约6∶1至约1∶6、约5∶1至约1∶5、约4∶1至约1∶4、约3∶1至约1∶3、约2∶1至约1∶2、或约1∶1的比例表达。在具体的实施方案中，轻链和重链多肽以约20∶1、约19∶1、约18∶1、约17∶1、约16∶1、约15∶1、约14∶1、约13∶1、约12∶1、约11∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9、约1∶10、约1∶11、约1∶12、约1∶13、约1∶14、约1∶15、约1∶16、约1∶17、约1∶18、约1∶19、和/或约1∶20的比例表达。
本发明还提供了选择任何期望比例的方法，通过筛选具有不同剪接位点的载体使得如在指定细胞系中获得所述期望的比例(参见如实施例2)。这在高效表达抗体时尤其至关重要，因为已经观察到某些轻链表达水平可能有助于指导抗体重链和轻链的适当装配，而过量未成对的重链可能诱导细胞毒性。此外，轻链还在内质网中指导装配好的抗体重链和轻链折叠以生成功能性抗原结合抗体中至关重要。因此，在某些实施方案中，抗体轻链通常以相对于抗体重链的约10/1至1/1表达(例示性的轻链/重链比例包括但不限于约10/1、9/1、8/1、7/1、6/1、5/1、4/1、3/1、2/1和1/1)。
在某些实施方案中，依照本发明表达系统表达的抗体可以是对任何期望抗原特异的。优选的是，抗体将是引发治疗性效果的功能性抗体，诸如可用于治疗自身免疫性、炎性、传染性、变应性或赘生性疾病的抗体。抗体可为了协同作用而联合其它治疗剂。例如，抗体可联合如其它抗体、小分子、或用作癌症化疗剂的放射源。
在某些实施方案中，本发明的可选剪接载体或表达盒或构建物联合并非有意依赖可选剪接来表达多种多肽的其它载体或表达盒或构建物使用。
4.药用组合物
本发明还特别提供了包含使用本发明的方法和/或载体或表达盒或构建物表达的多聚体蛋白质的治疗性组合物，用于治疗有所需要的受试者或患者。本发明的组合物可经由施用通过本发明方法生成的治疗性多肽或通过包含本发明可选剪接载体或表达盒或构建物的基因疗法而用于治疗有所需要的受试者(即患者)。有所需要的受试者指患有或有风险患上可通过施用本发明组合物来治疗或预防的疾病、紊乱或状况的受试者。所述受试者可以是哺乳动物受试者。优选的受试者是人类受试者。
在某些实施方案中，此类治疗性组合物在药学上可接受载体中包含此类多聚体蛋白质。在优选的实施方案中，此类治疗性组合物在药学上可接受载体中包含至少一种本发明生产的重组抗体或抗体片段。“药学上可接受载体”指至少一种通常用于施用活性成分的药用制剂成分。因此，载体可含有本领域使用的任何药用赋形剂和用于施用的任何形式媒介物。组合物可以是例如注射液、水性悬浮液或溶液、非水性悬浮液或溶液、固体或液体口服剂型、药膏、凝胶剂、油膏、皮内贴剂、乳膏、洗剂、片剂、胶囊剂、持续释放剂型、诸如此类。额外赋形剂可包括例如着色剂、掩味剂、助溶剂、悬浮剂、压模剂、肠衣、持续释放助剂、诸如此类。
本发明的试剂常常作为包含活性治疗剂和多种其它药学上可接受成分的药用组合物而施用。参见《Remintong’s Pharmaceutical Science》，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980。优选形式取决于预定施用模式和治疗应用。根据期望剂型，组合物还可包含药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，它们的定义是常用于配制动物或人类施用的药用组合物的媒介物。选择的稀释剂应不影响组合物的生物学活性。此类稀释剂的实例包括但不限于蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液和Hank氏溶液。另外，药用组合物或制剂还可包含其它载体、佐剂、或无毒的、无治疗作用的、无免疫原性的稳定剂。通常，此类组合物以治疗有效量施用，即足以对患有或有风险患上可受本发明组合物治疗影响的疾病、紊乱或状况的受试者或患者引起可检测的，优选在医学上有益的效果的数量。
依照本发明生产的多聚体蛋白质可以注射或植入制剂的形式施用，它们可以这样一种方式配制以容许持续释放活性成分。在一个优选的实施方案中，此类多聚体蛋白质是抗体。一种例示性组合物包含5mg/ml单克隆抗体，在由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成且用HCl调至pH6.0的水性缓冲液中配制。
通常，组合物制备成注射剂，即液态溶液或悬浮液；也可制备成适于在注射前溶解或悬浮在液态媒介物中的固体形式。如上所述，所述制剂还可在脂质体或微粒诸如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物中乳化或装囊以增强辅助效果(参见Langer，Science 249：1527，1990；及Hanes，Advanced Drug DeliveryReviews 28：97，1997)。
5.预防和治疗方法
在某些实施方案中，本发明致力于适于预防、缓解或治疗任何疾病、紊乱或状况的蛋白质的生产。此类紊乱或疾病包括癌症、癌前状态、和遗传性疾病或状况诸如肌肉营养不良。可受通过本发明方法生产的蛋白质治疗影响的疾病、紊乱或状况包括诸如下列状况，遗传病(即可归于一种或多种基因缺陷的疾病状况)、获得性病理学(即不可归于先天缺陷的病理学状况)和预防方法(即预防疾病或不期望的医学状况)。获得性病理学可以是表现为异常生理学、生物化学、细胞、结构或分子生物学状态的疾病或综合征。
可受通过本发明方法生产的蛋白质治疗影响的疾病、紊乱或状况可以是感染，包括病毒和细菌感染、过度增殖性疾病或紊乱，包括癌症和癌前状况、免疫紊乱，诸如类风湿性关节炎、遗传性免疫缺陷状况，诸如高IgM综合征、原发性或混合型免疫缺陷状况，包括特征为嗜中性粒细胞减少的状况、以及神经学紊乱、心血管紊乱，诸如缺血、和内分泌紊乱，诸如糖尿病、甲状腺紊乱和不孕不育。
可受通过本发明方法生产的蛋白质治疗影响的疾病、紊乱或状况可以是过度增殖性疾病或紊乱，包括癌症。此类疾病或紊乱可涉及任何细胞、组织或器官，包括脑、肺、鳞状细胞、膀胱、胃、胰、乳房、头、颈、肝、肾、卵巢、前列腺、结肠、直肠、食道、鼻咽、甲状腺和皮肤。癌症可以是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肉瘤或癌症。癌症可以是实体瘤，或者可涉及体液，诸如血液。
可受通过本发明方法生产的蛋白质治疗影响的疾病、紊乱或状况可以是遗传上继承的疾病，诸如亨庭顿氏病(Huntington’s disease)、双相型障碍(bipolar disorder)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、腕管综合征(Carpal TunnelSyndrome)、囊性纤维化、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-MerzbacherDisease)、多发性硬化或迪谢内肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy)。
可受通过本发明方法生产的蛋白质治疗影响的疾病、紊乱或状况可以是传染病，诸如结核病、疟疾、黄热病、或由乙肝病毒、疱疹病毒、人免疫缺陷病毒等感染引起的疾病。
在具体的实施方案中，本发明还特别致力于适于预防或治疗紊乱或疾病如免疫系统的紊乱或疾病的抗体或抗体片段的生产。
因此，在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可用于预防或治疗免疫紊乱，包括例如肾小球肾炎、硬皮病、硬化、多发性硬化、狼疮肾炎、动脉粥样硬化、炎性肠病、变态反应或类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可用于治疗或预防炎性紊乱，包括但不限于阿耳茨海默氏病、重度哮喘、特应性皮炎、恶病质、CHF缺血、冠状动脉再狭窄、克罗恩氏病、糖尿病肾病、淋巴瘤、银屑病、纤维化/辐射诱发的、幼年型关节炎、中风、由外伤引起的脑或中枢神经系统炎症、和溃疡性结肠炎。
可用依照本发明生产的抗体或抗体片段来预防或治疗的其它炎性紊乱包括由于角膜移植、慢性阻塞性肺病、丙型肝炎、多发性骨髓瘤和骨关节炎的炎症。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗原结合片段可用于预防或治疗瘤形成，包括但不限于膀胱癌、乳房癌、头和颈癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、黑素瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、胃癌、白血病/淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。其它瘤形成疾病包括宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、非鳞状细胞肺癌和前列腺癌。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可用于预防或治疗神经变性性紊乱，包括但不限于阿耳茨海默氏病、中风、和外伤性脑或中枢神经系统损伤。其它神经变性性紊乱包括ALS/运动神经元疾病、糖尿病性周围神经病、糖尿病性视网膜病、亨庭顿氏病、黄斑变性和帕金森氏病。
在临床应用中，根据展现疾病或紊乱的至少一种体征或症状来鉴定具有上述疾病之一或有患上述疾病之一风险的受试者。以足以治疗例如上文所述的疾病或紊乱的至少一种症状的数量施用本发明的至少一种抗体或其抗体片段或者包含至少一种本发明抗体或其抗原结合片段的组合物。
因此，本发明的蛋白质适于作为治疗剂在受试者中产生有益治疗响应的条件下施用于受试者，例如用于预防或治疗疾病或紊乱，例如本文所述。
本发明的治疗剂通常是基本上纯的，不含不想要的杂质。这意味着试剂通常是至少约50％w/w(重量/重量)纯，以及基本上不含干扰性蛋白质和杂质。试剂有时是至少约80％w/w纯，且更优选至少90％或约95％w/w纯。然而，使用常规蛋白质纯化技术，例如本文所述，可获得至少99％w/w的同质肽。
所述方法可用于无症状患者和目前显示疾病症状的患者二者。此类方法使用的抗体可以是人源的、人源化的、嵌合的或非人源的抗体或其片段(如抗原结合片段)，且可以是单克隆的或多克隆的。
在另一个实施方案中，本发明的特色是与药学上载体一起作为药用组合物施用依照本发明方法生产的抗体。或者，可通过施用编码至少一条抗体链的多核苷酸将抗体施用于受试者。所述多核苷酸在受试者中表达，生成抗体链。因此，所述多核苷酸编码抗体重链和轻链。所述多核苷酸在受试者中表达，生成重链和轻链。在例示性实施方案中，对受试者监测受试者血液中所施用抗体的水平。
6.基因投递
本发明还涵盖基因疗法，由此为有所需要的患者提供包含可选剪接载体的核酸。可治疗、改善或预防与上文关于使用通过本发明方法生产的多肽进行治疗所述相同的疾病、紊乱和状况。将DNA转移或投递至细胞以表达基因产物蛋白质的各种方法，其它地方称为基因疗法，公开于“Gene Transferinto Mammalian Somatic Cells in vivo”，N.Yang，Crit.Rev.Biotechn.12(4)：335-356，1992，将其引入本文作为参考。基因疗法涵盖将DNA序列导入体细胞或种系细胞以用于回体(ex vivo)或体内疗法。基因疗法的功能是替换基因，提高正常或异常基因功能，及抗击感染性疾病和其它病理学状况。
通过基因疗法来治疗这些医学问题的策略包括治疗性策略，诸如鉴定缺陷基因，然后添加功能性基因以替换缺陷基因的功能或加强略有功能的基因；或是预防性策略，诸如添加其产物蛋白质将治疗该状况或将使得组织或器官更易受到治疗方案影响的基因。或者，可转移赋予免疫力的基因，诸如通过在本发明的可选剪接载体中提供针对特定抗原的抗体。
用于基因疗法的基因转移方法分成三大类：物理的(如电穿孔、直接基因转移和微粒轰击)、化学的(基于脂质的载体或其它非病毒载体)和生物学的(病毒衍生载体和受体摄取)。例如，可使用非病毒载体，包括复合有DNA的脂质体。此类脂质体/DNA复合物可直接静脉内注射到患者体内。认为脂质体/DNA复合物在肝中集中，在此它们将DNA投递给巨噬细胞和Kupffer细胞。这些细胞长期存活，并因此提供所投递DNA的长期表达。另外，基因的载体或“裸露的”DNA可直接注射到期望器官、组织或肿瘤中以靶向投递治疗性DNA。
基因疗法方法学还可通过投递部位来描述。用于投递基因的基础方法包括回体(ex vivo)基因转移、体内基因转移和体外基因转移。在回体基因转移中，从患者采集细胞并在细胞培养物中培养。将DNA转染到细胞中，在数量上扩增转染细胞，然后植回患者体内。在体外基因转移中，方法是相同的，只是转染细胞是在培养物中生长的细胞，诸如组织培养细胞，而非来自各个患者的细胞。
体内基因转移涉及在细胞位于患者体内时将DNA导入患者细胞。方法包括使用病毒介导的基因转移，其中使用非感染性病毒将基因投递到患者体内，或者将裸露的DNA注射到患者体内某部位并由一定百分比的细胞摄取，在该细胞中表达基因产物蛋白质。另外，本文描述的其它方法，诸如使用机械或化学方法，也可用于本发明核酸的体内转移。
DNA投递的机械方法包括直接注射DNA，诸如将DNA显微注射到生殖细胞或体细胞中，由压缩空气推动投递DNA包被的微粒，诸如“基因枪”中使用的金微粒，及无机化学方法，诸如磷酸钙转染。另一种方法，配体介导的基因疗法，涉及将DNA与特定配体复合，形成配体-DNA偶联物，以将DNA投递至特定细胞或组织。
基因疗法的化学方法可涉及化学制品以结合细胞和/或运送DNA穿过细胞膜，诸如促融合脂质囊泡诸如脂质体或用于膜融合的其它囊泡、DNA掺入阳离子脂质中的脂质微粒诸如脂转染试剂、或多赖氨酸介导的DNA转移。脂转染试剂或细胞转染试剂，结合带负电荷的DNA的基于脂质的阳离子，构成能够穿越细胞膜的复合物并在细胞内部提供DNA。另一种化学方法使用基于受体的胞吞作用，它涉及使特定配体结合细胞表面受体并将它包裹和转运穿过细胞膜。配体结合DNA，而整个复合物转运进入细胞。将配体-基因复合物注射到血流中，然后具有受体的靶细胞将特异结合配体，并将配体-DNA复合物转运到细胞内。
许多基因疗法方法学采用病毒载体以将基因导入细胞，而且能够进行改造以包含本发明的可选剪接载体。例如，经过改变的逆转录病毒载体已经用于回体(ex vivo)方法以将基因导入外周的和浸润肿瘤的淋巴细胞、肝细胞、表皮细胞、肌细胞、或其它体细胞。然后将这些经过改变的细胞导入患者以由插入的DNA提供基因产物。
病毒载体还已经用于使用体内方案将基因导入细胞(参见如Eck，S.L和J.M.Wilson，“Gene Based Therapy”，《Goodman & Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics》，第9版，pp.77-101，McGraw-Hill，New York，1996)。为了指导外来基因的组织特异性表达，可使用已知具有组织特异性的顺式作用调控元件或启动子。或者，这可以通过在体内将DNA或病毒载体原位投递至特定解剖学部位来实现。例如，在体内将基因转移至血管是通过在动脉壁的选定部位植入体外转导的内皮细胞来实现的。病毒感染同样表达基因产物的周围细胞。可将病毒载体直接投递至体内部位，例如通过导管，由此只容许某些区域受到病毒的感染，并提供长期的、部位特异的基因表达。通过将经过改变的病毒注射到通向器官的血管中，还在乳房组织和肝组织中验证了使用逆转录病毒载体的体内基因转移。
已经用于基因疗法方案的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、其它RNA病毒诸如脊髓灰质炎病毒或辛德比斯病毒(Sindbis virus)、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、SV40、牛痘和其它DNA病毒。复制缺陷型鼠逆转录病毒载体和腺病毒载体是最广泛使用的基因转移载体。鼠白血病逆转录病毒由与核核心蛋白质和聚合酶(pol)复合，装入蛋白质核心(gap)并由决定宿主范围的糖蛋白包膜(env)围绕的单链RNA构成。逆转录病毒的基因组结构包括由5’和3’长末端重复序列(LTR)包围的gag、pol和env基因。逆转录病毒载体系统利用这样的事实，即倘若在包装细胞系中反式提供病毒结构蛋白质，那么含有5’和3’LTR和包装信号的最小载体足以容许载体包装、感染和整合到靶细胞中。逆转录病毒载体用于基因转移的根本优势包括在大多数细胞类型中的高效感染和基因表达，精确的单拷贝载体整合到靶细胞染色体DNA中，和逆转录病毒基因组的易操作性。
腺病毒由与核心蛋白质复合并以衣壳蛋白质包围的线性双链DNA构成。分子病毒学的发展导致了利用这些生物体的生物学来创建能够在体内将新型基因序列转导到靶细胞中的载体的能力。基于腺病毒的载体将以高水平表达基因产物肽。腺病毒载体具有高效感染性，甚至是低滴度的病毒。另外，病毒作为无细胞病毒体具有完全感染性，所以不必注射生产者细胞系。腺病毒载体的另一项潜在优势是在有些细胞类型中实现长期异源基因表达的能力。
腺病毒载体衍生自不能进行复制的腺病毒，它们通常在E1基因中含有删除。将此类载体转染到细胞中，诸如293人胚肾细胞系，它容许E1删除的腺病毒复制。转染后，任选腺病毒载体在这些特化辅助细胞中复制并形成感染性颗粒，收集并纯化。这些颗粒能够感染广泛的宿主细胞，用于表达转基因，如本发明的可选剪接载体，但是不能在没有添加额外病毒因子的情况中复制。为了降低能进行复制的腺病毒混有腺病毒制品的可能性，可使用在病毒基因组中具有额外删除或突变的腺病毒载体，诸如E1/E3删除的载体或所有或大多数病毒基因遭到灭活的“无内容(gutless)”载体。或者，可使用含有倒置蛋白质pIX基因的腺病毒载体，正如美国申请号60/621,782和60/631,246中所述。
发现将质粒DNA注射到肌肉细胞中产生高百分比的受到转染且持续表达标记基因的细胞。质粒DNA可整合到细胞的基因组中或不然。不整合的转染DNA将容许转染和基因产物蛋白质在末端分化的、非增殖组织中表达较长一段时间而无需害怕细胞或线粒体基因组中的突变性插入、删除或改变。长期但不必永久的将治疗性基因转移到特定细胞中可为治疗或预防遗传病。可定期重复注射DNA以维持基因产物水平而受体细胞基因组中不会发生突变。不整合的外源DNA可容许一个细胞中存在多种不同外源DNA构建物，所有构建物表达各种或多种基因产物。
微粒介导的基因转移方法最初用于转化植物组织。凭借微粒轰击装置，或“基因枪”，产生原动力，将DNA包被的高密度微粒(诸如金或钨)加速至容许穿透靶器官、组织或细胞的高速率。微粒轰击可用于体外系统，或者与回体(ex vivo)或体内技术一起用于将DNA导入细胞、组织或器官。
用于基因转移的电穿孔使用电流使细胞或组织易受电穿孔介导的基因转移的影响。使用指定电场强度的简短电脉冲来提高膜的通透性，使得DNA分子能够穿透进入细胞。这种技术可用于体外系统，或者与回体或体内技术一起用于将DNA导入细胞、组织或器官。
载体介导的体内基因转移可用于将外来DNA转染到细胞中。载体-DNA复合物可方便的导入体液或血流，然后部位特异的指向体内的靶器官或组织。可使用脂质体和聚阳离子二者，诸如多赖氨酸、脂转染试剂或细胞转染试剂。可制备细胞特异的或器官特异的脂质体，由此脂质体携带的外来DNA将由靶细胞摄取。注射靶向某些细胞上的特定受体的免疫脂质体可作为常规方法用于将DNA导入携带该受体的细胞。已经使用的另一种载体系统是用于将DNA携带至肝细胞用于体内基因转移的脱唾液酸糖蛋白/多赖氨酸偶联物系统。
转染DNA还可复合有其它种类的载体，使得DNA被携带至受体细胞，然后驻留在胞质或核质中。DNA可在特定改造的囊泡复合物中偶联载体核蛋白质并直接被携带至核。
例如，可用表达抗肿瘤多肽的本发明载体转染从患者切除的肿瘤细胞，并重新导回入患者体内。转染的肿瘤细胞在患者体内生成抑制肿瘤生长的蛋白质水平。患者可以是人或非人哺乳动物。还可以通过本领域知道的物理或化学方法转染细胞，诸如电穿孔、离子穿孔(ionoporation)、或经由“基因枪”。另外，包含本发明可选剪接载体的核酸可直接注射到患者体内，无需借助载体。具体而言，可将载体DNA注射到皮肤、肌肉或血液中。
用于将本发明载体转染到患者中的基因疗法方案可以是经由将载体DNA整合到细胞的基因组中或微型染色体中，或是作为细胞胞质或核质中分开的复制或不复制DNA构建物。蛋白质表达可持续较长一段时间，或者可定期重新注射以维持细胞、组织或器官中期望的蛋白质水平或预定的血液水平。
7.治疗方案和剂量
在预防性应用中，以足以消除或降低风险、减轻严重程度、或延迟疾病发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和疾病发展过程中呈现的中间病理学表型的数量，对患有可用本发明重组蛋白质治疗的疾病例如免疫系统疾病的受试者施用药用组合物或药物。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分阻止疾病的症状(生物化学、组织学和/或行为方面的)，包括其并发症和疾病发展过程中的中间病理学表型的数量，对怀疑或早就患有此类疾病的受试者施用组合物或药物。本发明的多肽对于调控驻留在血液中的细胞表面抗原的生物学活性特别有用，其中所治疗或预防的疾病至少部分是由抗原的异常高或低生物学活性引起的。
在有些方法中，本发明组合物的施用降低或消除免疫紊乱，例如炎症。将适于实现治疗性或预防性处理的数量定义为治疗或预防有效量。在预防性和治疗性两种方案中，制剂通常以几个剂量施用直至获得足够的免疫应答。
本发明组合物用于治疗上文所述状况的有效剂量随许多不同因素而变化，包括施用手段、靶位点、受试者的生理学状态、受试者是人还是动物、施用的其它药物、及处理是预防性的还是治疗性的。通常，受试者是人，但是也可以处理非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。
可以使用本领域普通技术人员知道的配制方法在药学上可接受制剂中作为分离的和基本上纯的蛋白质和蛋白质片段提供由上文所述本发明可选剪接载体或表达盒或构建物表达的多肽和蛋白质。这些制剂可通过标准路径来施用。一般而言，可通过局部、经皮、腹膜内、颅内、脑室内、大脑内、阴道内、子宫内、口服、直肠或肠胃外(如静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内)路径来施用组合物。另外，可将多肽掺入容许持续释放化合物的生物可降解聚合物，将该聚合物植入需要投递药物的部位附近，例如肿瘤部位，或者植入是为了系统的缓慢释放多肽。还可使用渗透微泵来提供高浓度多肽的受控投递，经套管到达目的部位，诸如直接进入转移性生长或进入该肿瘤的血管供应。生物可降解聚合物及其用途详细描述于例如Brem等，J.Neurosurg.74：441-446，1991。
本发明多肽的剂量将取决于所治疗的疾病状态或状况及其它临床因素，诸如人或动物的体重和状况及化合物的施用路径。对于治疗人或动物，可施用约0.5mg/kg至500mg/kg多肽。根据多肽在特定动物或人中的半衰期，可在每天几次至每周一次之间施用多肽。还应当理解，本发明可应用于人和兽医用途二者。本发明的方法涵盖单次以及多次施用，或是同时的或是在较长一段时间里。
对于使用抗体的被动免疫，剂量范围为约0.0001-100mg/kg，且更常用的0.01-20mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在1-10mg/kg的范围内，优选至少1mg/kg。可对受试者每天、隔天、每周或依照经验分析决定的任何其它时间表施用此类剂量。一种例示性治疗需要在较长一段时间例如至少六个月里施用多个剂量。其它例示性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3-6个月一次施药。例示性剂量时间表包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg、隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在有些实施方案中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在这种情况中每种抗体的施用剂量落在所示范围内。
通常在多个时刻施用抗体。单一剂量之间的时间间隔可以是每周、每月或每年。在有些方法中，调整剂量以获得血浆抗体浓度1-1000μg/ml，而在有些方法中是25-300μg/ml。或者，可作为持续释放制剂来施用抗体，在这种情况中需要较低频率的施用。剂量和频率随抗体在受试者中的半衰期而变化。一般而言，人源抗体显示最长的半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人源抗体。
施用的剂量和频率可随处理是预防性的或治疗性的而变化。在预防性应用中，将含有本发明抗体或其混合物的组合物施用于尚未处于疾病状态的受试者以增强受试者的抵抗力。将此量定义为“预防有效量”。在此用途中，精确数量再次取决于受试者的健康和总体免疫(general immunity)状态，但是通常范围为每剂0.1-25mg，尤其是每剂0.5-2.5mg。在较长一段时间以相对稀疏的间隔施用相对较低剂量。有些受试者在其余生持续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要相对较短间隔的相对较高剂量(如每剂约1-200mg抗体，更常用5-25mg的剂量)，直至疾病的进展减缓或停止，且优选直至受试者显示疾病症状部分或完全缓解。此后，可对患者施行预防性方案。
编码抗体的核酸的剂量范围为每名受试者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg、或30-300μgDNA。感染性病毒载体的剂量将随所用病毒载体类型而变化，但体内使用将在每剂1×10⁵至1×10²⁰个病毒体之间。对于体外剂量，通常将使用每个细胞约0.5至100个病毒体。
治疗剂可通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内手段来施用以用于预防性和/或治疗性处理。蛋白质药物最典型的施用路径是血管内、皮下或肌肉内，尽管其它路径也可能是有效的。在有些方法中，将制剂直接注射到特定组织，在此积累沉积物(deposit)，例如颅内注射。在有些方法中，将抗体作为持续释放组合物或装置施用，诸如Medipad^TM装置。蛋白质药物还可经呼吸道施用，如使用干粉吸入装置。
本发明的试剂可任选联合在本发明所针对的紊乱的治疗中至少部分有效的其它制剂施用。
出于例示的目的提供下面的实施例，而不应当解释为对本发明的限制。将贯穿此说明书引用的任何专利、专利申请、专利出版物(国家的和国际的)(具体包括序列表)和参考文献的内容完整引入本文作为参考。
                           例示
贯穿实施例，使用了下列材料和方法，除非另有说明。
材料和方法
一般而言，本发明的实践采用分子生物学、重组DNA技术、及肿瘤学、神经学和免疫学的常规技术，尤其是如抗体技术，除非另有说明。参见如Sambrook、Fritsch和Maniatis，《Molecular Cloning》，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；Antibody Engineering Protocols，《Methods in MolecularBiology》，510，Paul，S.，Humana Press，1996；Antibody Engineering：A PracticalApproach，《Practical Approach Series》，169，McCafferty编，Irl Press，1996；《Antibodies：A Laboratory Manual》，Harlow等，C.S.H.L.Press，1999；及《Current Protocols in Molecular Biology》，Ausubel等编，John & Sons，1992。
将可选剪接载体导入真核细胞
为了在真核细胞中表达多肽，通常使用0.4cm电击杯(BioRad，Hercules，CA)在0.8ml HEBS(20mM Hepes pH 7.05、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mMNa₂HPO₄、6mM右旋糖)中以0.28kV和950μF通过电穿孔将本发明的载体导入CHO细胞。每次电击使用约5×10⁶个细胞。电击后，容许细胞在电击杯中于室温保温5-10分钟，然后转移到装有10ml无血清CHO培养基的离心管中，并以1,000rpm离心5分钟。然后将细胞沉淀物重悬于10ml无血清CHO培养基，接种T75烧瓶，并在加湿温箱中于36℃和5％CO₂保温。转染后3-5天，收获条件培养基并通过ELISA测定抗体滴度。转染进行双份。
多肽多聚体表达分析
表达分析通常使用DHFR选择来进行。转染后将稳定转染细胞在不含核苷的无血清CHO培养基中培养约2周。未用DNA转染的细胞(阴性对照)死亡，而含有选择标记的细胞生长。为了评估细胞的特定多肽多聚体生产力，更换培养基，以2×10⁵至3×10⁵个存活细胞/ml接种细胞，并容许细胞生长2-3天，然后测定抗体滴度和细胞密度。
所有滴度使用FRET测定法或者对抗体可变区特异的ELISA和/或对抗体Fc区特异的ELISA来测定。简而言之，以10μg/ml AffiniPure山羊抗人IgGFcγ片段(产品目录编号109-005-098，Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)或特定抗原的PBS溶液，以50μl/孔包被平板并于4℃保温过夜。使用前，除去包被液，并用PBS、0.05％Tween-20清洗3次，然后用200μl/孔PBS、0.05％Tween-20、1％BSA(PBST/BSA)封闭至少1小时。除去封闭液，并针对标准曲线分析样品。通常在PBST/BSA中稀释标准品和未知样品，于室温保温2小时，然后如上所述清洗。使用等分50μl/孔偶联有过氧化物酶的AffiniPure驴抗人IgG(H+L)(Jackson Immunosearch，产品目录编号709-035-149)来检测抗体的存在。将偶联物在PBST/BSA中1∶10,000稀释，并于室温保温1.5小时，然后除去，并如上所述清洗。然后加入等分100μl/孔底物(溶于0.1M乙酸钠缓冲液pH4.9的420mM四甲基联苯胺和0.05％过氧化氢)来解析结合的抗原，即与底物一起保温2分钟，随后用100μl/孔停止缓冲液2N硫酸固定。使用Softmax软件(Molecualr Devices，Sunnyvale，CA)在Molecular Devices SpectraMax Plus读板仪上于450nm读取所得吸光度。
对于FRET测定法，将50μl条件培养基样品与75μl在含1％BSA的PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水溶液，产品目录编号9280，Irvine Scientific，SantaAna，CA；BSA，Sigma，产品目录编号CA-7906)中稀释的1.67μg/mlLance^TM Eu-IDEC-152(用铕标记的IgG1单克隆抗体)(Perkin Elmer，Boston，MA)混匀。加入经标记抗体后，加入75μl在含1％BSA的PBS中稀释的含有6.67μg/ml Phycolink山羊抗人IgG(Fc特异的)_-XLAllophycocyanin(APC)偶联物(产品目录编号PJ253，Prozyme San Leandro，CA)的测定混合液。将样品加混合液在带盖的全孔未处理96孔黑板(Full well Non-Treat 96 WellBlack Plate)(产品目录编号237105，NalgeNunc International，Rochester，NY)中保温，并使用Titer Plate Shaker(滴定板摇床，产品目录编号4625，VWR#57019-600，Bamstead/Lab-Line，Melrose Park，IL)摇动超过15分钟。使用1420Multilabel Counter(多标记物计数器，Wallac，Gaithersburg，MD)以时间解析荧光模式读板，激发337nm和发射665nm。使用Softmax软件(Molecular Devices)分析数据。
                              实施例
实施例1：用于改造使用可选剪接来表达多种多肽的载体的方法
下面的实施例描述了用于构建适用于通过可选剪接在真核细胞中表达两种或多种基因产物的载体的方法。
本文描述的表达载体是美国申请号10/237,067中描述的表达载体pV80的衍生物，其含有带天然CMV剪接供体和剪接受体的天然CMV内含子。简而言之，构建了如下DNA构建物，它(以5’至3’或顺流方向)包含细胞巨化病毒立即早期1(CMV IE1)启动子，包括CMV IE1内含子(人细胞巨化病毒株AD169)前面的5’非翻译区及CMV IE1内含子的5’部分，包括天然剪接供体序列(SD)。CMV IE1内含子的经修饰3’部分包含用于方便更换可选剪接受体(SA1)的克隆多接头(SwaI-BstBI)。另外，紧挨着SA1的下游添加了第一编码序列的克隆位点(AscI)，其中克隆了人源化轻链基因，以及变体人生长激素(hGH)聚腺苷酸化区。再往下，向载体中引入了CMV IE1内含子的3’部分，包括天然剪接受体(SA2)序列。紧挨着SA2的下游添加了第二编码序列的克隆位点(BamHI)，其中克隆了人源化IgG1重链基因，以及变体人生长激素(hGH)聚腺苷酸化区。在载体中分开的位置引入了二氢叶酸还原酶(DHFR)选择标记。该选择标记衍生自pSI(Genbank编号#U47121，Promega，Madison，WI)，且在转录方面受到SV40启动子/增强子、人工内含子(与可选剪接载体分开的)和SV40晚期聚腺苷酸化序列的控制。为了在原核细胞中克隆和扩增可选剪接载体，添加了衍生自pUC19、包含β-内酰胺酶基因的序列。
图3显示了由上述改造步骤得到的载体(即pHL005)(还可见SEQ IDNO：29，它提供了AscI和BamHI位点中没有插入外显子编码序列的载体主链序列)。在此实施例中，人源化抗体轻链和重链序列已经分别克隆到AscI和BamHI位点中。此载体还容许在紧挨着第一编码序列上游的限制性位点(SwaI-BstBI)处插入各种剪接受体，从而任选改变轻链和重链表达的比例。
还构建了其它表达载体，其中删除了紧挨着剪接受体5’端的内含子部分以生成pHLP005的载体主链。pHLP005的内含子序列包含PflMI位点和BspEI位点，分别在SwaI位点5’端的约310bp和110bp处。为了生成这些删除，通过PflMI或BspEI任一的部分消化将pHLP005质粒线性化，然后用BspEI完全消化，并凝胶纯化。
为了生成具有不同第一剪接受体(SA1)的表达载体，将具有PflMI和BspEI或BspEI和BspEI相容位点的寡核苷酸(SEQ ID NOs：1-28)连接到各自pHLP005经消化载体中并给予新的载体名称(图4)。然后通过DNA序列分析验证所有构建物。
所得载体以5’至3’或顺流方向包含天然CMV剪接供体(SD)、选自SEQID NOs：1-28的第一剪接受体(SA1)、用于插入第一多肽的第一限制性位点(AscI)、作为第二剪接受体(SA2)的天然CMV剪接受体、和用于引入第二多肽的第二限制性位点(BamHI)。
使用基于引物的聚合酶链式反应(PCR)制备抗体轻链和重链序列，并使用标准遗传工程技术将所得产物引入载体。所用引物包含用于插入AscI和BamHI位点的与编码区邻接的限制性位点。例如，5’引物可以是用于轻链的TTTTGGCGCGCCATGN(20)(SEQ ID NO：32)和用于重链的TTTTGGATCCATGN(20)(SEQ ID NO：33)。3’引物可以是用于轻链的GCACGGCGCGCCCTAN(20)(SEQ ID NO：34)和用于重链的GCAGGGATCCTCAN(20)(SEQ ID NO：35)。对于这些引物，N(20)代表对编码期望重链或轻链的DNA特异的核苷酸序列。
实施例2：用于测定可选剪接效率的方法
在此实施例中，描述了用于测定使用可选剪接来表达由与不同剪接受体邻接的外显子编码的两种不同基因产物的效率的方法和构建物。
虽然剪接是由外显子/内含子接合处的共有序列介导的，但是不能仅凭这些序列来决定剪接效率的精确预报。为此，必需用经验方法来鉴定将会生成适当比例的产物的剪接受体序列，这在本文中可作为所生成多聚体蛋白质的总量来测量。因此，本发明提供了用于在任何指定细胞系中高效筛选期望剪接位点组合的便利载体。
为了生成具有可选剪接位点的各种表达载体，制备了具有平端和BstBI相容末端的寡核苷酸，用于插入pHLP005载体的SwaI和BstBI位点。通过DNA序列分析验证所有构建物。图4和序列表(即SEQ ID NOs：1-28)提供了所测试剪接位点的序列。
使用通过电穿孔实现的瞬时或稳定转染比较所生成的具有各种剪接受体的载体。用于转染的宿主细胞是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系DG44(Urlaub等，Cell 33：405-412，1983)。所有DNA使用Megaprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。转染前，DNA用乙醇(EtOH)沉淀，用70％EtOH清洗，干燥，重悬于HEBS，并在转染前定量。阴性对照不含DNA转染且用作转染对照。mAb特异ELISA和IgG特异ELISA二者都测量分泌到细胞培养物培养基中的总抗体。表1提供了瞬时转染细胞的总抗体表达水平。
结果证明，某些剪接位点，如pHLP0015和pHLP0018，在测试中在CHO细胞中瞬时生成高水平总抗体方面比其它剪接位点更有效。
表1：来自瞬时转染的抗体滴度