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1、(10)申请公布号 CN 103497911 A (43)申请公布日 2014.01.08 CN 103497911 A (21)申请号 201310399109.2 (22)申请日 2013.09.05 CCTCC M 2012484 2012.11.27 C12N 1/20(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 9/04(2006.01) C12P 7/22(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 中国科学院成都生物研究所 地址 610041 四川省成都市武侯区人民南路 四段九号 (72)发明人 吴中柳 刘艳 汤脱险 裴小琼 (。
2、74)专利代理机构 成都赛恩斯知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 51212 代理人 张帆 肖国华 (54) 发明名称 金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性 中间体生产 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 株 金 黄 杆 菌 （Chryseobacterium sp.CA49， 保 藏 号 为 CCTCC M2012484） 及该菌基因组编码的一种羰基还原酶 ChKRED20， 并利用该菌原始菌株或该种羰基还原 酶作为生物催化剂制备阿瑞匹坦手性醇中间体 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇。产物 的对映体过量值大于 99.9%。以 ChKRED20 粗酶粉 可催。
3、化高达 200g/L 的底物， 24h 内获得 99% 以上 转化率， 且辅酶循环体系简单、 廉价， 产物分离提 纯容易， 回收率高， 极具工业应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103497911 A CN 103497911 A 1/1 页 2 1. 一种保藏号为 CCTCC M2012484 的金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 。。
4、 2. 一种从权利要求 1 所述的金黄杆菌 CA49 （Chryseobacterium sp.CA49） 中调取出来 的羰基还原酶 ChKRED20， 其特征在于其核苷酸序列为如 SEQ No.1 所示， 其氨基酸序列为如 SEQ No.2 所示。 3.权利要求1所述的金黄杆菌CA49作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙 酮生成 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇中的应用。 4.权利要求2所述的羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲 基苯乙酮生成 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇中的应用。 权 利 要 求 书 C。
5、N 103497911 A 2 1/7 页 3 金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产 技术领域 0001 本发明属于应用微生物与酶工程领域， 具体涉及一株金黄杆菌及其基因组编码的 一种新型羰基还原酶， 并利用该菌或者这种羰基还原酶作为生物催化剂生产阿瑞匹坦手性 中间体。 背景技术 0002 光学活性 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇是 Merk 公司研发的药物阿瑞 匹坦 （Aprepitant， 商品名 “Emend” ） 的关键手性中间体。阿瑞匹坦的主要功能是预防和治 疗化疗引起的急性或延迟性呕吐。 0003 目前制备该手性中间体的主流工艺是化学合成。近年来。
6、， 随着生物催化技术 的不断发展， 研究者们积极探索采用酶催化前手性酮的方法生产该中间体， 筛选到了一 些对映体选择性 99% 的微生物菌株， 包括 Lactobacillus Kefir、 Aspergillus niger （Tetrahedron ： Asymmetry， 2006,17,2000-2005） ， Penicillium expansum（Tetrahedron ： Asymmetry， 2009,20,2759-2763） ，Leifsonia xyli HS0904（Appl Microbiol Biotechnol,2011,90,1897-1904） ， 氧 化 。
7、微 杆 菌 Microbacterium oxydans C3（专 利 号 ZL201010271579.7） ， 以及选择性稍差的热带假丝酵母菌 Candida tropicalis20216（ee 值 92%， Tetrahedron,2004,60,789-797）等。但是， 这些报道都是以微生物菌株全细胞 作为生物催化剂， 可转化的底物浓度较低， 目前仅有 Leifsonia xyli HS0904 转化的底 物浓度较高， 最高可转化 的底物浓度为 51g/L， 30h 的转化率为 91.8%（J.Microbiol. Biotechnol.2013,23(3),343-350） 。考。
8、虑产物分离纯化成本问题， 这些菌株的转化能力与 实际应用还有较大的距离。 0004 为获得高效的前手性酮催化工艺， 首先应解决高效高选择性酶源问题， 从环境中 筛选新型微生物菌株作为催化剂是常用的有效途径之一。 然而原始菌株直接转化可能存在 安全性、 遗传稳定性问题， 原始菌株可能继续利用醇产物导致产物产量低以及原始菌株内 的其他酶可能对底物作用生成副产物等问题， 因此将原始菌株的关键羰基还原酶基因克隆 并异源表达， 以重组菌或者酶用于生物转化则可避免上述问题， 且这种催化体系较为简单， 稳定， 产物分离提纯容易， 易于工业化。 发明内容 0005 本发明的目的是公开一种新筛选的金黄杆菌 CA。
9、49 （Chryseobacterium sp.CA49） ， 及其所产高活力高对映选择性羰基还原酶 ChKRED20， 并利用该菌或者该酶还原底物 3,5- 双三氟甲基苯乙酮制备光学纯 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇， 从而以生物 催化的方法制备高光学纯度的阿瑞匹坦手性中间体。该菌从果园土壤中富集、 分离并经过 多轮筛选后获得。关于该菌的保藏信息是 ： 保藏号为 CCTCC M2012484 ； 分类命名为金黄杆 菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） ； 于 2012 年 11 月 27 日在中国典型培养物保藏中心 保藏， 地址是湖北省武汉。
10、市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。 说 明 书 CN 103497911 A 3 2/7 页 4 0006 基于上述发明目的， 本发明首先提供一种金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） ， 保藏编号为 CCTCC M2012484） 。 0007 本发明还提供了上述金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 的筛选方法， 所述筛选方法为 ： 于果园采集土样， 以3,5-双三氟甲基苯乙酮为唯一碳源， 经2轮富集筛选 获得可能的产酶菌株。 将初筛菌株培养后， 以休止细胞为催化剂转化底物， 测定产物生成量 和产物对映体过量值， 并将产物对映体过。
11、量值高的菌株进行进一步的鉴定， 得到本发明涉 及的金黄杆菌。 0008 本发明还提供一种上述金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 作为生物催 化剂在转化底物 3,5- 双三氟甲基苯乙酮生成 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇中 的应用。 0009 具体地， 上述用途的操作方法为 ： 将筛选的金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 培养后， 收集菌体， 以休止细胞作为催化剂， 并添加异丙醇和葡萄糖作为辅酶循环 底物， 底物 3,5- 双三氟甲基苯乙酮经生物转化后得到 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 。
12、苯基 乙醇， 产物的对映体过量值 99%。 0010 另外， 本发明还提供一种羰基还原酶 ChKRED20。该酶是从上述金黄杆菌 CA49 （Chryseobacterium sp.CA49） 中调取出来的。 0011 本发明还提供一种上述羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在转化底物3,5-双 三氟甲基苯乙酮生成 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇中的应用。 0012 其中， 从上述金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 中关键羰基还原酶基 因 ChKRED20 的调取和生物转化包括以下步骤 ： 0013 （1） 基因 chKRED20。
13、 的调取和鉴定 ： 0014 将上述金黄杆菌 CA49 （Chryseobacterium sp.CA49） 全基因组测序 （深圳华大基因 公司完成） ， 根据测序框架图预测的基因功能， 调取出40余个可能具有羰基还原酶功能的基 因， 将这些基因用常规 PCR 方法克 隆， 并连入 pET28a（+） 载体， 转入大肠杆菌 BL21（DE3） 中以常规方法过量表达。将这些重组菌休止细胞作为催化剂转化 3,5- 双三氟甲基苯乙酮， 获得 R- 型醇产物且 ee 值大于 99% 的酶有 3 个 （ChKRED08、 ChKRED19、 ChKRED20） 。在培养 基中加入或者不加入 3,5- 双。
14、三氟甲基苯乙酮， 以新鲜培养的菌提取总 RNA， 通过 RT-PCR 分 析， 两种情况下均只有 ChKRED08 和 ChKRED20 酶的基因表达 （总 RNA 提取和 RT-PCR 方法均 为常规方法） 。同时， 测定了 ChKRED08 和 ChKRED20 酶的活力， ChKRED20 酶活是 ChKRED08 的 7 倍左右。因此， 最后确定金黄杆菌 CA49 （Chryseobacterium sp.CA49） 中关键羰基还原酶 基因为 chKRED20。 0015 其中， 上述步骤中涉及的chKRED20基因PCR扩增所用引物为 ： 正向5-GAATTCAT GGGAATTTT。
15、AGACAACAAAGTAGC-3 （酶切位点 EcoR I） ， 反向 5 -GTCGACTTAAACTGCCGTGTAGC CACC-3（酶切位点 Sal I） ； 0016 PCR 条件为， 95预变性 5min， 94变性 30s， 55退火 30s， 72延伸 1min， 30 个 循环， 最后 72延伸 10min。PCR 产物连入 pMD19T 载体构建 TA 克隆， 而后将测序正确的质 粒以 EcoR I 和 Sal I 酶切， 将其连入以同样酶消化的 pET28a （+） 空载体中， 构建重组质粒， 并转入大肠杆菌 BL21（DE3） 中， 构建重组菌。 0017 chKRE。
16、D20 基因碱基数为 750bp， 其序列为 （SEQ No.1） 说 明 书 CN 103497911 A 4 3/7 页 5 0018 ATGGGAATTTTAGACAACAAAGTAGCACTTGTTACAGGAGCAGGATCCGGAATCGGATTAGCTGTTGCT CATTCGTATGCAAAAGAAGGCGCCAAAGTTATTGTATCCGATATTAATGAAGATCACGGTAACAAAGCAGTCGAAGA CATTAAAGCACAAGGCGGGGAAGCGTCTTTT GTAAAAGCAGATACTTCAAACCCTGAAGAAGTGGAAGCTTTAGTA AAAA。
17、GAACAGTAGAAATCTACGGAAGACTTGATATTGCATGTAATAATGCGGGAATCGGTGGCGAACAGGCGCTGGC AGGCGATTACGGTCTCGACAGCTGGCGAAAAGTATTAAGCATAAATCTTGATGGCGTATTCTACGGGTGCAAATATG AGTTAGAACAAATGGAAAAAAACGGGGGCGGCGTTATTGTGAATATGGCCTCTATTCATGGTATTGTTGCTGCACCG CTTTCCTCAGCCTACACTTCTGCAAAGCACGCAGTGGTAGGGCTTACTAAAAATATAGGAGCAGAATACG。
18、GACAGAA AAATATCCGTTGCAATGCGGTGGGGCCTGCTTATATTGAAACCCCGCTGTTGGAAAGCCTGACAAAGGAAATGAAGG AAGCACTGATTTCAAAACATCCGATGGGAAGACTGGGAAAACCTGAAGAAGTAGCAGAACTGGTGTTGTTCCTGAGT TCAGAAAAATCATCTTTTATGACGGGAGGCTATTATCTTGTAGATGGTGGCTACACGGCAGTTTAA ； 0019 chKRED20 基因编码 249 个氨基酸， 序列为 （SEQ No.2） ： 0020 MGILDNKVALVTGAGS。
19、GIGLAVAHSYAKEGAKVIVSDINEDHGNKAVEDIKAQGGEASFVKADTSNPEE VEALVKRTVEIYGRLDIACNNAGIGGEQALAGDYGLDSWRKVLSINLDGVFYGCKYELEQMEKNGGGVIVNMASIHG IVAAPLSSAYTSAKHAVVGLTKNIGAEYGQKNIRCNAVGPAYIETPLLESLTKEMKEALISKHPMGRLGKPEEVAELV LFLSSEKSSFMTGGYYLVDGGYTAV。 0021 （2） 重组菌生物催化 ： 0022 挑取单克隆至 LB （含卡那霉素 50g/ml） 培养基中， 37过夜培养，。
20、 以 1% 的接种量 转接至 TB（含卡那霉素 50g/ml） 培养基中， 37培养 3h， 加入 0.5mM IPTG 诱导后， 30 继续培养至 20 36h。8000rpm， 4离心收集菌体， 用 pH 值为 7.0、 0.1M 浓度的磷酸钾缓冲 溶液洗涤 2 次， 获得湿菌体。 0023 取上述新鲜培养的湿菌体重悬于上述缓冲液， 加入底物 3,5- 双三氟甲基苯乙酮， 加入 1% 3%（w/v， 占总转化体系的质量体积百分数） 葡萄糖和 / 或 5% 异丙醇 （v/v， 占总 转化体系的体积百分数） 作为辅酶循环底物。转化体系中菌体浓度为 50 150g/L， 底物终 浓度为 1 15。
21、0g/L， 转化温度为 30， 转速为 230rpm， 转化时间为 1 24h。 0024 （3） ChKRED20 酶的辅酶依赖型和比活力测定 0025 ChKRED20 酶的纯化采用镍柱亲和层析 （Bio-Rad） 。将上述步骤 （2） 诱导培养 20 36h 后的菌体以 13,000rpm， 4离心收集， 重悬于 Buffer A（50mM 磷酸盐缓冲液， pH8.0， 300mM NaCl， 10mM 咪唑） ， 超声破碎 （超声 10s， 间隔 30s， 30 次） ， 之后以 13,000rpm， 4离心 20min， 将上清液加入已用 Buffer A 平衡的柱料中， 轻微混匀 。
22、30min， 用含有 20mM 咪唑的 Buffer A 漂洗杂蛋白， 再用含 250mM 咪唑的 Buffer A 的缓冲液洗脱目的蛋白， 最后电泳鉴 定纯度， 并用 BCA Protein Assay kit 测定蛋白浓度。 0026 辅酶依赖型的确定 ： 磷酸钾缓冲液 （0.1M， pH7.0） ， 加有 0.2mg/ml 纯酶， 10mM 底物 和 20mM NADH 或者 NADPH， 30反应 2h。等体积乙酸乙酯萃取， 测定产物的转化率。以 NADH 为辅酶时， 转化率为 76% ； 以 NADPH 为辅酶时， 转化率为 56% ； 两者的 ee 值均大于 99.9%， 因 此该。
23、酶以 NADH 为辅酶时转化率更高。 0027 比活力测定反应条件 ： 1ml 磷酸钾缓冲液 （0.1M， pH7.0） 加有 0.2mg 纯酶， 10mM 底 物和 40mM NADH， 30反应 1min。等体积乙酸乙酯萃取， 测定产物的生成量。酶活力单位定 义为 ： 1min 内催化生成 1mol 产物所需的酶量。ChKRED20 纯酶的比活力达到 43U。 0028 （4） 粗酶粉生物催化 ： 说 明 书 CN 103497911 A 5 4/7 页 6 0029 表达 ChKRED20 酶的大肠杆菌重组菌的菌体培养、 获得湿菌体的步骤同步骤 （2） 。 0030 取新鲜培养的湿菌体重。
24、悬于磷酸盐缓冲液 （pH7.0， 0.1M） ， 湿菌体终浓度为 50 150g/L， 以超声破碎机破细胞， 13,000rpm 离心后取上清液冷冻于 -80过夜， 而后用冷冻 干燥机干燥至粉状， 制成粗酶粉。转化体系为 ： 磷酸钾缓冲液 (0.1M， pH7.0)， 粗酶粉， 底物 3,5- 双三氟甲基苯乙酮， 异丙醇 （辅酶循环底物， 用量为 40%， v/v） ， Na-NAD（200mg/L） ； 转 化条件 ： 30， 100rpm， 24h。 0031 粗酶粉用量为 10g/L， 底物 3,5- 双三氟甲基苯乙酮浓度为 200g/L， 转化 24h 可实 现转化率 99%， ee 。
25、值 99.9%。 0032 本发明涉及的金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 可高效转化 3,5- 双 三氟甲基苯乙酮生成 R- 醇， 其关键羰基还原酶基因 chKRED20 与 NCBI 数据库中其他基因 的相似度最高 70%， 氨基酸序列的最高相似度为 76%， 与已报道的功能蛋白 （NCBI 登录号为 ： BAD99642） 的最高相似度为 51%， 为 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇生物催化合成 提供了可供选择的新型酶源。 0033 该蛋白在大肠杆菌中过量表达后制成粗酶粉， 10g/L 的酶量便可在 24h 内转化高 达 200。
26、g/L 的底物， 且转化率为 99% 以上， ee 值大于 99.9%。粗酶转化工艺简单， 以廉价异丙 醇和少量 NAD+作为辅酶循环， 产物易于分 离纯化， 回收率高达 90% 以上， 极具工业应用前 景。 0034 凡是与 ChKRED20 氨基酸相似度高于 51% 且具有催化 3,5- 双三氟甲基苯乙酮生成 (R)-1-3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 乙醇功能的酶均属于本发明的保护范围。 0035 图 1 是 ChKRED20 蛋白纯化后 SDS-PAGE 图。 附图说明 0036 以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明， 但并非 对本发明的限制。 具体实施。
27、方式 0037 实施例 1 ： 菌株筛选 0038 于某果园采集土样， 以 3,5- 双三氟甲基苯乙酮 （2g/L）为唯一碳源并添加无机 盐于 30， 230rpm 培养 7 10 天。无机盐为 ： Na2HPO42g/L， KH2PO41g/L， NH4Cl0.4g/L， MgCl20.4g/L。从富集液中取出 1% 加入到上述相同培养基中再次富集培养 7 10 天。而后 将培养液稀释 104倍， 并涂布至筛选平板上 （上述无机盐 +3,5- 双三氟甲基苯乙酮 1g/L 酵母粉0.5g/L琼脂粉15g/L） ， 30培养13天， 每支平板上可见许多微生物单菌落， 这 些菌株为可能的产酶菌株。。
28、 0039 将富集平板中的单菌落用无菌牙签逐一接入 24 孔筛选板各孔 （Costar， 美国） 进 行培养 （每孔装有发酵培养基 1ml， 发酵培养基组分 ： 蛋白胨 5g/L， 牛肉膏 1.5g/L， 酵母粉 1.5g/L， NaCl5g/L， 葡萄糖 10g/L） ， 30， 240rpm 培养 24h。6000rpm 离心收集菌体， 用磷酸 钾缓冲液 （pH7.0、 0.1M） 洗涤 2 次， 再加入 1ml 缓冲液重悬菌体， 而后加入底物 3,5- 双三氟 甲基苯乙酮 5mg， 30， 270rpm 进行生物催化筛选试验。转化 36h 后， 以 200l 乙酸乙酯萃 取。以气相手性柱。
29、分析产物的对映体过量值， 得到产 (R)- 醇菌株 5 株。其中 1 株为本发明 说 明 书 CN 103497911 A 6 5/7 页 7 涉及的金黄杆菌 （Chryseobacterium sp.CA49） ， 产物对映体过量值大于 99%。 0040 实施例 2 ： 筛选菌株的鉴定 0041 为确定该菌株分类地位并详细了解其性能， 对该菌株进行了初步鉴定。该菌株的 菌落为圆型， 光滑， 随培养时间不同， 菌落呈浅黄色到金黄色。 0042 16S rRNA 鉴定 ： 基因组 DNA 为模板， 以细菌通用引物 27f 和 1492r 扩增 16S rRNA 序列， 并将 PCR 产物直接送。
30、样测序， 获得的部分序列 （1381bp） 如下 （SEQ No.3） ： 0043 AGCTGAGCGGTAGAGTTTCTTCGGAGACTTGAGAGCGGCGTACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGC CTTTATCAGGGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCCCATAATATATAGAGTGGCATCACTTTATATTGAAA ACTGAGGTGGATAAAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCGATGATCTTTA GGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGG。
31、TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAAT ATTGGACAATGGGTTAGCGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTG TACAGGGATAAACCTATTTACGTGTAAATAGCTGAAGGTACTGTACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAG TGGTGAAATCTCACAGCTT。
32、 AACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTAAGGTAGAAGTGGCTGGAAT AAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTATGTCTTAACTGAC GCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGCTAACTCGTT TTTGGGCTTTCGGGTTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACT CAAAGGA。
33、ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAG GCTTAAATGGGAATTGATCGGTTTAGAAATAGACCTTCCTTCGGGCAATTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTTACTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGGA CTCTAGTAAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTT。
34、GGGC CACACACGTAATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGT TCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTCTGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAAAAGGAG CTGC 0044 经NCBI的blast比对， 该菌与Chryseobacterium taiwanense， Chry。
35、seobacterium sp.MG-2011-139-ER、 Chryseobacterium sp.HNR12等菌株的同源性大于99%， 初步可确定为 Chryseobacterium sp. 金黄杆菌属， 实验室自编号为 Chryseobacterium sp.CA49， 2012 年 11 月 27 日在中国典型培 养物保藏中心保藏， 保藏号为 CCTCC M2012484。 0045 实施例 3 ： 金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 原始菌株生物催化 0046 菌株培养 ： 将少量金黄杆菌 CA49（Chryseobacterium sp.CA4。
36、9） 斜面种子接种于 发酵培养基中 （组分同实施例 1） ， 30， 230rpm 培养 16 24h 制备种子液， 以 0.5% 2% 的 接种量转接至发酵培养基中扩大培养， 培养条件 ： 30， 230rpm， 24 48h。 0047 休止细胞转化 ： 将第 1 步培养的菌体以 13,000rpm 离心收集， 用 pH 值为 7.0、 0.1M 浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤 2 次。转化体系包括磷酸盐缓冲液 （pH 值 7.0、 0.1M） 、 菌体、 底 物和辅酶循环底物。辅酶底物为 5% 10%（v/v） 的异丙醇和 2% 5%（v/w） 的葡萄糖。菌 体浓度为 50 200g/L， 底。
37、物终浓度为 1 50g/L， 转化温度为 30， 转速为 230rpm， 转化时 间为 5 24h。以下为几种原始菌株休止细胞转化的具体实施例 ： 0048 （1） 取菌体 0.5g 重悬于 10ml 缓冲液， 加入底物 3,5- 双三氟甲基苯乙酮 10mg， 并 说 明 书 CN 103497911 A 7 6/7 页 8 加入异丙醇 0.5ml（5%） 和葡萄糖 0.2g（2%） ， 30， 230rpm 转化 5h。以 10ml 乙酸乙酯萃 取， 取有机相气相色谱 （SGE， 澳大利亚， AC-5， 30m0.22） 测定转化率为 95.6%， 气相手性柱 （CHIRASIL-DEX C。
38、B， 瓦里安 25m0.25） 测定产物 ee 值大于 99%。 0049 0050 产物数据如下 ： 0051 无色液体， D25=+21.6(c=1, 乙腈 ); 0052 ee99%(CHIRASIL-DEX CB, 柱 温 :120 ，进 样 器 ： 260 ，检 测 器 ： 280 ， t=8.403min); 0053 1H NMR(600MHz,CDCl3):7.84(s,2H,Ar-H),7.78(s,1H,Ar-H),5.04(q,J=6.54Hz ,1H,-CH),1.99(br,1H,OH),1.55(d,J=6.54Hz,3H,-CH3) 0054 （2） 取菌体 1.。
39、0g 重悬于 10ml 缓冲液中， 加入底物 100mg， 葡萄糖和异丙醇添加量 同上， 转化条件和分析方法也同上。底物的转化率为 91.5%， 产物对映体过量值大于 99%。 0055 （3）取菌体 1.5g 重悬于 10ml 缓冲液中， 加入底物 500mg， 并加入异丙醇 1.0ml （10%） 和葡萄糖 0.5g（5%） ， 30， 230rpm 转化 24h。以 10ml 乙酸乙酯萃取， 经气相色谱分 析， 底物的转化率为 90.8%， 产物对映体过量值大于 99%。 0056 实施例 4 ： 羰基还原酶 ChKRED20 重组菌全细胞生物催化 0057 羰基还原酶 ChKRED20。
40、 重组菌的培养方法和菌体收集方法见说明书发明内容部 分。 0058 （1） 取菌体0.5g， 重悬于10ml磷酸盐缓冲液， 加入底物10mg和0.1g葡萄糖， 30， 230rpm转化2h。 以10ml乙酸乙酯萃取， 经气相色谱分析， 底物的转化率为30.1%， 产物对映 体过量值大于 99.9%。 0059 （2） 取菌体 0.5g， 重悬于 10ml 磷酸盐缓冲液， 加入底物 10mg， 0.2g 葡萄糖和 0.5ml 异丙醇， 30， 230rpm 转化 1h。以 10ml 乙酸乙酯萃取， 经气相色谱分析， 底物的转化率为 29.5%， 产物对映体过量值大于 99.9%。 0060 （3。
41、）取菌体 1.0g， 重悬于 10ml 磷酸盐缓冲液， 加入底物 500mg 和 0.2g 葡萄糖， 30， 230rpm转化24h。 以10ml乙酸乙酯萃取， 经气相色谱分析， 底物的转化率为88.2%， 产 物对映体过量值大于 99.9%。 0061 （4） 取菌体 1.0g， 重悬于 10ml 磷酸盐缓冲液， 加入底物 500mg 和 0.5ml 异丙醇， 30， 230rpm转化24h。 以10ml乙酸乙酯萃取， 经气相色谱分析， 底物的转化率为79.1%， 产 物对映体过量值大于 99.9%。 0062 （5） 取菌体 1.5g， 重悬于 10ml 磷酸盐缓冲液， 加入底物 1500。
42、mg 和 0.5ml 异丙醇， 30， 230rpm转化24h。 以10ml乙酸乙酯萃取， 经气相色谱分析， 底物的转化率为46.1%， 产 物对映体过量值大于 99.9%。 0063 实施例 5 ： 羰基还原酶 ChKRED20 纯酶生物催化 0064 转化体系 ： 磷酸钾缓冲液 （0.1M， pH7.0） ， 纯酶浓度 2g/L， 底物 3,5- 双三氟甲基苯 乙酮， 异丙醇 40%（v/v） ， Na-NAD200mg/L， 30生物转化。反应结束后用等体积乙酸乙酯萃 说 明 书 CN 103497911 A 8 7/7 页 9 取， 气相色谱分析转化率和 ee 值， 结果见表 1。 0。
43、065 表 1 羰基还原酶 ChKRED20 纯酶对不同浓度底物转化 0066 0067 实施例 6 ： 羰基还原酶 ChKRED20 粗酶粉生物催化 0068 粗酶粉的制备方法及转化体系见说明书发明内容部分， 表 1 为添加不同的粗酶量 和高浓度底物时得到的产物转化率和 ee 值。在未经优化的情况下， 酶量为 10g/L 时， 24h 内可转化 200g/L 底物， 转化效率 99% 以上 ； 酶量为 2g/L 时， 转化效率也可达 94%， 且 e 均 99.9%。 同时， 将产物过硅胶柱纯化回收， 在实验室条件下可实现90%以上的回收率。 因此， 该酶催化工艺极具经济效益， 具备很强的工业应用潜力。粗酶粉对不同浓度底物转化情况 见下表 2。 0069 表 2 粗酶粉对不同浓度底物转化情况 0070 说 明 书 CN 103497911 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 103497911 A 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 103497911 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 103497911 A 12 。