一种BTCRY71AA1操纵子基因及其编码蛋白和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103525836 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525836 A (21)申请号 201310428970.7 (22)申请日 2013.09.18 C12N 15/32(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C07K 14/325(2006.01) A01H 5/00(2006.01) A01N 47/44(2006.01) A01P 7/04(2006.01) (7。

2、1)申请人 四川农业大学 地址 611130 四川省成都市温江区惠民路 211 号四川农业大学水稻研究所 (72)发明人 郑爱萍 李平 李巧 朱军 邓其明 王世全 李双成 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 一种 Bt Cry71Aa1 操纵子基因及其编码蛋白 和应用 (57) 摘要 本发明提供了一种 Bt Cry71Aa1 操纵子基因 及其编码蛋白和应用 , 所述 Cry71Aa1 操纵子基 因的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 或为 SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代、 缺失或添加 一个或几个核苷酸且。

3、表达相同功能蛋白质的核 苷酸序列。所述 Cry71Aa1 操纵子基因编码的 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 可以用于制备 Bt 杀虫剂， Cry71Aa1 操纵子基因可以转化棉花、 玉米、 水稻、 蔬菜等农作物， 使其具备相应的抗虫活性， 从而降 低农药的使用量， 减少环境污染， 具有重要的经济 价值和应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 11 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表11页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103525836 A CN 10352583。

4、6 A 1/1 页 2 1. 一种 Bt Cry71Aa1 操纵子基因， 其特征在于， 所述 Cry71Aa1 操纵子基因包括一个 Cry71Aa1基因、 一个orf2基因以及它们之间的非编码间隔区， 所述Cry71Aa1操纵子基因具 有 （1） 或 （2） 所示的核苷酸序列 ： （1） SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列 ； （2） SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代、 缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同 功能蛋白质的核苷酸序列。 2. 权利要求 1 所述操纵子基因编码的蛋白。 3. 根据权利要求 2 所述的蛋白， 其特征在于， 所述蛋白为一种 Bt 蛋白 Cry71Aa。

5、1+orf2， 其包括蛋白Cry71Aa1和蛋白orf2， 蛋白Cry71Aa1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示， 蛋白 orf2 的氨基酸序列如 SEQ ID No.5 所示， 蛋白 orf2 为蛋白 Cry71Aa1 的分子伴侣。 4. 含有权利要求 1 所述 Cry71Aa1 操纵子基因的重组表达载体。 5. 根据权利要求 4 所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体为 pSTK-cry71Aa1-orf2。 6. 根据权利要求 5 所述的重组表达载体， 其特征在于， 构建所述重组表达载体过程中 扩增 Cry71Aa1 操纵子基因所用引物为 ： 引物 pS71-F ：。

6、 5 -GCCGGATCCA ATGAATTCATATCAAAGTGAA-3 引物 pSO-R ： 5 -GGG GTCGACTTAACGTTTATATCCTTGACTA-3 。 7. 含有权利要求 4-6 任一项所述重组表达载体的宿主细胞。 8. 含有权利要求 3 所述蛋白的杀虫剂。 9. 权 利 要 求 1 所 述 的 Cry71Aa1 操 纵 子 基 因 或 权 利 要 求 3 所 述 的 Bt 蛋 白 Cry71Aa1+orf2 在提高转基因植物抗虫性中的应用。 10. 根据权利要求 10 所述的应用， 其特征在于， 所述应用为将 Cry71Aa1 操纵子基因 与表达载体连接， 得到能。

7、够表达 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 的重组表达载体， 再通过转基因方 法将所述重组表达载体导入植物， 得到含有 Cry71Aa1 操纵子基因的转化体， 表达 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2， 提高植物抗虫性。 权 利 要 求 书 CN 103525836 A 2 1/8 页 3 一种 Bt Cry71Aa1 操纵子基因及其编码蛋白和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种 Bt Cry71Aa1 操纵子基因及其编码蛋白 和应用。 背景技术 0002 在人类生产过程中， 虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。为了 减少这些损失， 多年来， 对。

8、农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治， 但由于化学 农药的长期、 大量使用， 造成了对环境的污染， 农副产品中农药残留量增加， 给人类的生存 和健康带来了危害。此外， 化学农药在杀灭害虫的同时， 也杀伤了天敌及其它有益物， 破坏 了生态平衡。与化学防治相比， 生物防治具有安全、 有效、 持久的特点。并且避免了化学防 治带来的一系列问题。因此， 生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中， 苏云金 芽孢杆菌是目前世界上用途最广、 产量最大的一类环境友好型微生物杀虫剂。 0003 苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis， 简称 Bt） 是一种革兰氏阳性细菌， 它。

9、 的分布极为广泛， 在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体， 又 名杀虫晶体蛋白 （Insectididal crystal proteins， 简称 ICPs） ， ICPs 是由 cry 基因编码 的， 对敏感昆虫有强烈毒性， 而对高等动物和人无毒性。目前在农田害虫、 森林害虫及卫生 害虫的防治中 Bt 已成为化学合成农药的有力替代品， Bt 还是转基因抗虫工程植物重要的 基因来源。 0004 自 1981 年 Schnepf 从菌株 HD-1 中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来， 人们已经分离克隆了 630 多种编码杀虫晶体蛋白的基因， 根据编码的氨基酸序列同源性。

10、， 它们被分别确定为不同的群、 亚群、 类和亚类 (Crickmore N,et al.Microbiol Mol Biol Rev,1998,62:807-813;http:/www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。 现目 前分为72个类群。 一般而言,Cry蛋白都是由单个操纵元编码的， 如Cry1,Cry2,Cry3,Cry4 和 Cry9 等毒蛋白， 这些基因编码的杀虫晶体蛋白分子量为 130-140kD;Cry54 和 Cry56 等基 因编码的杀虫晶体蛋白分子量为70-80kDa。 随着对Bt杀虫基因研究的深入， 一些具有两个 操纵。

11、元编码的杀虫基因蛋白被予以发现， 这些具有两个编码框的基因在第一个基因后面有 一个具有相同编码方向的 orf2 共同组成这个基因的操纵子。这类操纵子基因由三个部分 组成， 分为 cry 基因编码 60-80kDa Cry 蛋白 ； 由 orf2 编码的 50-60kDa 的蛋白 , 以及位于 这两个蛋白之间的30-140bp的非编码序列。 目前具有两个操纵元的杀虫基因蛋白有Cry5A d1,Cry10Aa1,Cry19Aa1,Cry24Ba1,Cry39Aa1,Cry44Aa1,Cry44Aa1,Cry30Db1 和 Cry30Ba1。 在以前的研究中这类的毒性蛋白只对蚊虫具有很好的杀虫活性。。

12、有些研究者认为 orf2 具 有稳定 cry mRNA 的作用， 或者其编码的 ORF2 蛋白可能作为一个分子伴侣， 有助于 cry 蛋 白晶体的形成 （Rosso ML,1997.Appl Environ Microbiol63:4449-4455） ； 有些研究者则 认为 ORF2 蛋白对于稳定晶体构型具有重要的作用 （J.Eleazar Barboza-Corona,2012. Appl Environ Microbiol78(6):2005-2012） ， 这类蛋白的形成可能是在进化过程中由于插 入序列或者是点突变造成的。ORF2 蛋白与 Cry1、 Cry4、 Cry7、 Cry8、。

13、 Cry9 等大分子量 Cry 说 明 书 CN 103525836 A 3 2/8 页 4 蛋白的 C 端相类似， 因此一些大分子的 cry 基因在进化过程中由于基因突变等因素造成完 整的基因序列被分为两部分， 形成由两个基因组成的 cry 操纵子基因 （Thorne L,1986.J Bacteriology.166:801811） 。 0005 分子伴侣是细胞中一大类蛋白质， 是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋 白质， 它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装， 但不构成这些蛋白质结构执 行功能时的组份。 0006 以前的研究表明， Cry1,Cry2 和 Cry9 蛋白对鳞。

14、翅目害虫有很好的杀虫毒性， cry1 类基因就被广泛的应用于转基因作物。以 Bt 杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有 50 多年的历史， 最初一直没有检测到昆虫对 Bt 的抗性， 但是， 上世纪 80 年中期开始， 抗性问 题不断在实验室及田间试验中得到证实 （McGaughey,W.H.1985.Science.229:193-195） ， 原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的 Bt 以及 Bt 转基因抗虫植物的应用造成昆虫种 群长期受到杀虫剂的选择压力。1985 年， McGaughey 报道仓库谷物害虫印度谷螟 （Plodia interpunctella）在 Dipel(Bt sub。

15、sp.kurstaik HD-1 的商品制剂 ) 的选择压力下， 繁殖 15 代后， 抗性增加 97 倍 ； 在高剂量选择压力下， 抗性可增加 250 倍。1990 年， 在夏威夷首 次证实大田中的小菜蛾对 Bt 杀虫剂产生了明显的抗性 （Tabashnik,B.E.,et al.1994. Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124） ， 上世纪 90 年代以来， 在我国应用 Bt 杀虫剂 时间较长的深圳、 广州、 上海等地， 发现 Bt 杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降， 意味着 抗性已经形成 （冯夏 .1996. 昆虫学报 ,39(3):238-244;Hoft。

16、e,H.,1988.Appl.Environ. Microbiol.54:2010-2017） 。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对 Bt 及其杀虫 晶体蛋白产生了抗性， 用选择压力数学模型预测到， 在 Bt 转基因抗虫植物选择压力的条 件下， 昆虫将会产生抗性 （Schnepf,E.,et al.1998.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806） 。另 外， 有研究证明 Bti 在大田的使用中尚未发现抗性问题 , 但是蚊虫对其抗性问题不断在 实验室中得到证实， 这种情况也可能会在大田中出现 （Georghiou G P,1997.Applied and Environme。

17、ntal Microbiology,63:1095-1101.） 。 0007 为避免抗性昆虫所造成的损失， 许多针对于这个问题的方法被提出来， 例如加大 使用剂量和多基因协同使用， 但是能从根本上解决这一问题的还是寻找新的、 高毒力、 宽杀 虫谱的 Bt 基因资源， 这对我国的生物防治有着十分重要的意义。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种 Bt Cry71Aa1 操纵子基因及其编码蛋白和应用。 0009 为了实现本发明的目的， 本发明首先提供一种 Bt Cry71Aa1 操纵子基因， 所述 Cry71Aa1 操纵子基因包括一个 Cry71Aa1 基因、 一个 orf2 基因以及它们。

18、之间的非编码间隔 区， 所述 Cry71Aa1 操纵子基因具有 （1） 或 （2） 所示的核苷酸序列 ： 0010 （1） SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列 ； 0011 （2） SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代、 缺失或添加一个或几个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核苷酸序列。 0012 应理解， 考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性， 本领域技术人员 可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。 0013 本发明通过对苏云金芽孢杆菌新菌株 HS18-1（保藏号为 CGMCC No.2718） 基因组 说 明 书 CN 103525836 A 4 3/8 页 5 。

19、和质粒测序进行研究， 发现该菌株存在一个新的 cry 操纵子基因， 设计其全长基因引物， 克 隆得到Cry71Aa1操纵子基因， 其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， 全长为3819bp， 包括一个 2151bp Cry71Aa1 基因和一个 1611bp orf2 基因以及它们之间的 57bp 非编码间隔区。 0014 其中， 所设计的全长基因引物序列如下 ： 0015 71AF ： 5 -ATGAATTCATATCAAAGTGAA-3 ; 0016 71AR ： 5 -TTAACGTTTATATCCTTGACTA-3 。 0017 其中， 所述Cry71Aa1基因的核苷酸序列如SEQ。

20、 ID NO.2所示。 orf2基因的核苷酸 序列如 SEQ ID NO.3 所示。 0018 所述 Cry71Aa1 操纵子基因包括编码蛋白 Cry71Aa1 和 orf2 的核苷酸序列。其中， Cry71Aa1 基因编码 716 个氨基酸组成的 Cry71Aa1 蛋白 ； orf2 基因编码 536 个氨基酸组成 的 orf2 蛋白。在 softberry 网站采用 bacterial sigma7.0promoter 程序对该操纵子中 的cry基因进行预测表明， 在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列， 将其命名为 Cry71Aa1。 0019 本发明的目的是提供 Cry71Aa。

21、1 操纵子基因编码的蛋白。 0020 本发明的目的是提供一种 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2， 其包括蛋白 Cry71Aa1 和蛋白 orf2， 蛋白Cry71Aa1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示， 蛋白orf2的氨基酸序列如SEQ ID No.5 所示， 蛋白 orf2 为蛋白 Cry71Aa1 的分子伴侣。 0021 其中， Cry71Aa1 和 orf2 蛋白的氨基酸组成如表 1、 2。 0022 表 1Cry71Aa1 蛋白的氨基酸组成 0023 氨基酸数目百分比 %氨基酸数目 百分比 % Ala(A):434.06Met(M):81.26 Cys(C):101.28。

22、Asn(N):547.56 Asp(D):344.80Pro(P):334.03 Glu(E):385.93Gln(Q):294.49 Phe(F):315.43Arg(R):366.65 Gly(G):413.26Ser(S):637.02 His(H):142.30Thr(T):567.07 Ile(I):496.81Val(V):283.48 Lys(K):324.96Trp(W):153.25 Leu(L):618.48Tyr(Y):417.87 0024 表 2orf2 蛋白的氨基酸组成 说 明 书 CN 103525836 A 5 4/8 页 6 0025 氨基酸数目百分比 %氨基。

23、酸数目 百分比 % Ala(A):243Met(M):183.77 Cys(C):101.7Asn(N):397.24 Asp(D):376.92Pro(P):203.23 Glu(E):357.23Gln(Q):316.36 Phe(F):143.25Arg(R):184.4 Gly(G):366.72Ser(S):324.72 His(H):214.58Thr(T):386.36 Ile(I):244.42Val(V):294.77 Lys(K):326.57Trp(W):72.01 Leu(L):346.26Tyr(Y):379.41 0026 应当理解， 本领域技术人员可根据本发明公开。

24、的蛋白 Cry71Aa1（SEQ ID No.4） 和 orf2 的氨基酸序列 （SEQ ID No.5） ， 在不影响其活性的前提下， 取代、 缺失或添加一个或几 个氨基酸， 得到所述蛋白的突变序列。例如在 Cry71Aa1 操纵子基因的间隔序列区段， 将氨 基酸缺失， 替换或者增加， 都将不影响其活性， 因为间隔序列在表达过程中不参与蛋白质的 表达。因此， 本发明的 Bt 蛋白 Cry71Aa1（SEQ ID No.4） 和 orf2 蛋白 （SEQ ID No.5） 还包 括所示氨基酸序列经取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的氨基酸 序列， 从而得到具有与 Bt 蛋白。

25、 Cry71Aa1+orf2 同等活性或功能的由 Cry71Aa1+orf2 衍生得 到的蛋白质。 0027 本发明的基因和蛋白质可以从 Bt 菌株 HS18-1 中克隆或分离得到， 或者通过 DNA 或肽合成的方法得到。 0028 本发明的另一目的是提供含有所述基因的重组表达载体。 0029 以 Bt 菌株 HS18-1 的 DNA 为模板， 以 pS71-F 和 pS71-R 为引物进行扩增， 得到 cry71Aa1 基因， 其中， 引物 pS71-F 和 pS71-R 的序列如下 ： 0030 引物 pS71-F ： 5 -GCC GGATCC A ATGAATTCATATCAAAGTG。

26、AA-3 0031 引物 pS71-R ： 5 -GGG GTCGACCTACTTTGTTTTAAATAAACT-3 。 0032 以 Bt 菌株 HS18-1 的 DNA 为模板， 以 pSO-F 和 pSO-R 为引物进行扩增， 得到 orf2 基因， 其中， 引物 pSO-F 和 pSO-R 的序列如下 ： 0033 引物 pSO-F ： 5 -GCC GGATCC A ATGTATACCAATACTATGAAA-3 0034 引物 pSO-R ： 5 -GGG GTCGACTTAACGTTTATATCCTTGACTA-3 。 0035 以 Bt 菌株 HS18-1 的 DNA 为模板，。

27、 以上述 pS71-F 和 pSO-R 为引物进行扩增， 得到 说 明 书 CN 103525836 A 6 5/8 页 7 Cry71Aa1 操纵子基因。 0036 将 cry71Aa1 基因、 orf2 基因和 Cry71Aa1 操纵子基因分别插入到芽胞杆菌 - 大 肠杆菌穿梭表达载体 pSTK 上， 构建得到重组表达载体 pSTK-cry71Aa1、 pSTK-orf2 和 pSTK-cry71Aa1-orf2。 0037 本发明的另一目的是提供含有所述重组表达载体的宿主细胞。 0038 所述宿主细胞为大肠杆菌或真菌。 0039 优选地， 所述宿主细胞为植物宿主细胞， 如棉花、 玉米、 。

28、水稻等， 其中， 所述宿主细 胞还可以为蔬菜等农作物。 0040 本发明还提供了含有 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 的杀虫剂。 0041 通过发酵含有 Cry71Aa1 操纵子基因的表达载体的宿主细胞， 得到含有 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 的发酵液， 将其制备成杀虫剂， 用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还 可以将上述基因转化细菌或真菌， 通过大规模发酵生产 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2。 0042 本发明的另一目的是提供上述蛋白及基因的应用。 0043 本发明还提供了 Cry71Aa1 操纵子基因或 Bt 蛋白 cry71a1+orf2 在制备杀虫剂中 的。

29、应用。 0044 本发明还提供了 Cry71Aa1 操纵子基因或 Bt 蛋白 cry71Aa1+orf2 在培育转基因植 物中的应用。 0045 本发明还提供了 Cry71Aa1 操纵子基因或 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 在提高转基因植 物抗虫性中的应用。 0046 所述应用为将 Cry71Aa1 操纵子基因与表达载体连接， 得到能够表达 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 的重组表达载体， 再通过转基因方法将所述重组表达载体导入植物， 得到含 有 Cry71Aa1 操纵子基因的转化体， 表达 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2， 提高植物抗虫性。 0047 将 Cry71。

30、Aa1 操纵子基因与表达载体可操作地连接， 得到能够表达 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 的重组表达载体， 进而通过诸如农杆菌介导法、 基因枪法、 花粉管通道法等 转基因方法， 将所述重组表达载体导入植物， 得到含有 Cry71Aa1 操纵子基因的转化体， 例 如农作物或者果树等植物， 表达 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2， 使其具备并提供其抗虫活性。 0048 本领域技术人员还可以根据本发明公开的 Cry71Aa1 操纵子基因， 将其转化棉 花、 玉米、 水稻、 蔬菜等农作物， 使其具备相应的抗虫活性。例如 ： 利用密码子的简并性， 将 Cry71Aa1 操纵子基因设计具有水。

31、稻编号的密码子的基因序列， 再将合成的 Cry71Aa1 操纵 子基因序列与载体 pCAMBIA1300 连接， 通过农杆菌介导转入到水稻基因组中， 从而得到具 有抗虫活性的转基因水稻品种。 0049 本发明的 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 具有如下优点 ： 0050 本发明提供 Bt 蛋白 Cry71Aa1+orf2 是一种新的 Bt 蛋白， 具有较好的杀虫活 性， 将其用于制备转基因植物， 能够特异性杀灭害虫， 并降低农药的使用量， 降低成本， 减 少环境污染。目前还没有害虫或昆虫对该蛋白产生抗性的报道， 因此， 本发明的 Bt 蛋白 cry71Aa1+orf2 具有重要的经济价。

32、值和应用前景， 适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。 0051 其中， 所述苏云金芽孢杆菌新菌株 HS18-1 分离自四川省沐川原始森林地区土壤 中， 该菌株已于 2009 年 1 月 12 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101） 说 明 书 CN 103525836 A 7 6/8 页 8 保藏， 分类命名为苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis） ， 保藏号为 CGMCC No.2718， 已在专利号为ZL200910081594.2的发。

33、明专利申请中公开。 通过对HS18-1的毒力测试表明， HS18-1 对鳞翅目害虫、 双翅目害虫等均具有极高的毒力。 附图说明 0052 图 1 显示的是重组质粒的酶切鉴定图谱， 其中 M 为 DNA marker， 1 为插入的 cry71Aa1 基因 ； 2 为重组质粒 pSTK-cry71Aa1BamHI+SalI 双酶切产物 ； 3 为插入的 orf2 基 因 ； 4 为重组质粒 pSTK-orf2BamHI+SalI 双酶切产物 ； 5 为插入的 Cry71Aa1 操纵子基因 ； 6 为重组质粒 pSTK-cry71Aa1-orf2BamHI+SalI 双酶切产物 ； 7 为 pST。

34、K 载体质粒。 0053 图 2 显 示 的 是 重 组 基 因 在 无 晶 体 突 变 株 HD73-中 表 达 的 SDS-PAGE 检 测 图 ； 其 中 M 为 蛋 白 marker ； 1 为 菌 株 HS18-1 产 生 的 粗 蛋 白 ； 2 为 含 有 电 转 重 组 质 粒 pSTK-cry71Aa1-orf2 的无晶体突变株 HD73-的表达蛋白 ； 3 为含有电转重组质粒 pSTK-cry71Aa1 的无晶体突变株 HD73-的表达蛋白 ； 4 为含有电转重组质粒 pSTK-orf2 的无 晶体突变株 HD73-的表达蛋白 ； 5 为含有电转载体 pSTK 的无晶体突变株。

35、 HD73-的表达蛋白 （阴性对照） 。 0054 图 3（A） 显示的是无晶体突变株 HD73-的扫描电镜图 ； (B) 显示的是含有重组质粒 pSTK-cry71Aa1的无晶体突变株的扫描电镜图 ； (C)显示的是含有重组载体pSTK-orf2的无 晶体突变株的扫描电镜图 ； (D) 显示的是含有重组载体 pSTK-cry71Aa1-orf2 的无晶体突变 株的扫描电镜图。 具体实施方式 0055 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0056 若未特别指明。

36、， 实施例中所用的生化试剂均为市售试剂， 实施例中所用的技术手 段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0057 实施例 1Cry71Aa1 操纵子基因的克隆 0058 本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis） 新菌株， 该菌株已于 2009 年 1 月 12 日在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心 （地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮 编 100101） 保藏， 分类命名为苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis） ， 保藏号为 CGMCC No.。

37、2718。 0059 本实施例通过如下方法克隆得到 Cry71Aa1 操纵子基因的全长序列。 0060 采用细菌基因组 DNA 纯化试剂盒 （购自康为世纪公司） 提取菌株 HS18-1 的总 DNA 作为扩增 Cry71Aa1 操纵子基因的模板， TaqMix( 购自博迈德公司 ) 用于扩增 Cry71Aa1 操 纵子基因， 设计引物序列如下 ： 0061 71AF ： 5 -ATGAATTCATATCAAAGTGAA-3 ; 0062 71AR ： 5 -TTAACGTTTATATCCTTGACTA-3 0063 25l PCR 反应体系 ： 说 明 书 CN 103525836 A 8 7。

38、/8 页 9 0064 0065 热循环反应 ： 94预变性5min ； 94变性50s， 5450s， 72延伸3.5min， 30个循 环 ； 72延伸 10min ； 4停止反应。扩增反应产物在 0.7% 琼脂糖凝胶上电泳， 置凝胶成像 系统中观察 PCR 扩增结果。结果如图 1 的第 5 泳道所示， 通过扩增得到了约为 3819bp 的序 列， 将该序列进行测序， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 与目的序列一致。 0066 实施例 2cry71Aa1 以及 orf2 蛋白的获得 0067 根据 Cry71Aa1 操纵子基因开放阅读框两端序列， 设计并合成 4 条特异引物。

39、用于 扩增 cry71Aa1、 orf2 以及完整的 Cry71Aa1 操纵子基因 （如表 3 所示） ,pS71-F 和 pS71R 用 于扩增 cry71Aa1 基因 ； pS71-F 和 pSO-R 用于扩增完整的 Cry71Aa1 操纵子基因 ； pSO-F 和 pSO-R 用于扩增 orf2 基因， 引物下划线部分碱基为 BamHI 和 SalI 酶切位点。以 HS18-1 总 DNA 为模板进行扩增， 酶切产物与同样进行双酶切后的载体 pSTK 连接， 转化 trans1-T1（购 自全式金公司） 感受态细胞， 提取其质粒酶切电泳验证插入片断大小符合预期目的片段后 （如图 1 所示。

40、） ， 转入去甲基化感受态细胞 trans110( 购自全式金公司 )， 然后提取重组质粒 并采用电击转化的方法 （2.2kV、 1000、 25F） 将重组质粒转入无晶体突变株 HD73-制成 的感受态细胞。将重组质粒分别命名为 pSTK-cry71Aa1， pSTK-orf2,pSTK-cry71Aa1-orf2， 含重组质粒的转化子分别命名为 HD71,HDO,HD71O。将阳性转化子接种于 1/2LB 培养基中， 在 200r/min、 30下培养 72h， 离心培养液收集菌体， 弃上清， 用无菌水水洗菌体 3 次， 加入 30mL10mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 超声。

41、波破碎， 提取表达蛋白， 并用 SDS-PAGE 对表达蛋白进 行检测。 0068 SDS-PAGE 分析表明， 转化子 HD71O 表达两种不同分子量大小的蛋白， 一个约为 80kDa 左右的 cry71Aa1 蛋白和一个约 60kDa 的 orf2 蛋白。转化子 HD71 只表达约 75kDa 左 右的 cry71Aa1 蛋白， 而转化子 HDO 仅表达 60kDa 的 orf2 蛋白 （如图 2 所示） 。这些表达蛋 白的分子量与预测的蛋白分子量相符。 0069 表 3cry71Aa1+orf2 操纵子序列不同部分扩增引物 0070 0071 表 3 中下划线部分 GGATCC 为酶切位。

42、点 BamH I， GTCGAC 为酶切位点 Sal I。 说 明 书 CN 103525836 A 9 8/8 页 10 0072 实施例 3cry71Aa1、 orf2 及完整 Cry71Aa1 操纵子基因在 HD73-中表达的显微观察 0073 待 90% 以上的芽孢形成后收集菌体， 制片于光学显微镜下观察转化子是否会产生 晶体蛋白， 若产生晶体蛋白则采用扫描电镜观察晶体形态。 0074 通过光学显微镜和扫描电镜观察， 完整的 Cry71Aa1 操纵子基因在 HD73-中表达并 形成球形伴孢晶体， 而 cry71Aa1 基因单独在 HD73-中表达时表达量小， orf2 基因单独表达 则。

43、不能形成伴孢晶体 （如图 3 所示） 。 0075 实施例 4cry71Aa1 及 orf2 蛋白杀虫活性测定 0076 将实施例 2 获得的转化子 HD71,HDO,HD71O 的表达产物对甜菜夜蛾进行杀 虫活性测定。首先将各转化子的胞晶混合物配制成不同的浓度梯度， HD71（13.7， 24， 48， 80.3， 144.5g/mL）； HD71orf2（10.5,18.9,34.0,61.1， 110.1g/mL）； HD71+O(1.34,2.4,4.3,7.8,14.8g/mL) 然后每个浓度梯度处理分别投入 45 头甜菜夜蛾 幼虫， 每个浓度梯度的处理重复 3 次， 转化 pSTK。

44、 质粒的无晶体突变株的表达产物作为阴性 对照， 清水为空白对照 ； 12h 后统计结果， LC50用 SPSS13.0 软件分析。 0077 由表 4 可以看出 ： 转化子 HD71+O 表达产物对甜菜夜蛾具有很好的杀虫活性， LC50 为 28.61g/mL ； 转化子 HD71 表达产物对甜菜夜蛾具有一定的杀虫活性 LC50为 210.1g/ mL ； 转化子 HD71orf2 和阴性对照对甜菜夜蛾均不具杀虫活性。 0078 表 4 三种不同转化子表达蛋白对甜菜夜蛾的杀虫活性 0079 0080 注 ： 表 4 中， N 表示无杀虫活性。 0081 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施。

45、方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103525836 A 10 1/11 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103525836 A 11 2/11 页 12 0003 序 列 表 CN 103525836 A 12 3/11 页 13 0004 序 列 表 CN 103525836 A 13 4/11 页 14 0005 序 列 表 CN 103525836 A 14 5/11 页 15 00。

46、06 序 列 表 CN 103525836 A 15 6/11 页 16 0007 序 列 表 CN 103525836 A 16 7/11 页 17 0008 序 列 表 CN 103525836 A 17 8/11 页 18 0009 序 列 表 CN 103525836 A 18 9/11 页 19 0010 序 列 表 CN 103525836 A 19 10/11 页 20 0011 序 列 表 CN 103525836 A 20 11/11 页 21 序 列 表 CN 103525836 A 21 1/1 页 22 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103525836 A 22 。