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1、(10)申请公布号 CN 103333822 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103333822 A *CN103333822A* (21)申请号 201310233630.9 (22)申请日 2013.06.13 CCTCC NO ： M 2013209 2013.05.15 C12N 1/20(2006.01) C12P 7/56(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (71)申请人 中南林业科技大学 地址 410004 湖南省长沙市韶山南路 498 号 (72)发明人 王义强 马国辉 王启业 钟洁 张伟涛 林丽云 陈章靖 (74)专利代理机构 长沙。
2、市融智专利事务所 43114 代理人 袁靖 (54) 发明名称 一 株 用 于 乳 酸 发 酵 的 戊 糖 乳 杆 菌 LacticUVC-02 及其应用方法 (57) 摘要 本发明公开了一株用于乳酸发酵的戊糖乳 杆菌 LacticUVC-02 及 其 应 用 方 法， 该菌 株 名 称 为 戊 糖 乳 杆 菌 （Lactobacillus pentosus） LacticUVC-02， 其保藏号为 CCTCC NO ： M2013209。 该菌株由戊糖乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） ATCC8041 经多次紫外诱变、 反复筛选获得， 该菌 株不仅能利用葡萄糖发酵生产。
3、乳酸， 而且能利用 木质纤维蒸汽爆破材料发酵产乳酸， 具有成本低、 产量高、 市场前景好等优点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103333822 A CN 103333822 A *CN103333822A* 1/1 页 2 1. 一株用于乳酸发酵的戊糖乳杆菌 LacticUVC-02， 其特征在于， 为戊糖乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） LacticUVC-02， 保藏号为 C。
4、CTCC NO ： M2013209。 2. 权利要求 1 所述的戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 的应用方法， 其特征在于， 采用所述的 戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 对葡萄糖进行发酵产乳酸。 3. 根据权利要求 2 所述的应用方法， 其特征在于， 所述的戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 通 过以下步骤来生产乳酸 ： 将所述戊糖乳杆菌lacticUVC-02菌株接入种子培养基中， 在37条件下培养10-14小 时得种子液 ； 将种子液按体积百分比 6% 的接种量接入葡萄糖发酵培养基中， 发酵培养基的 初始 pH 值为 5-7， 摇床转速为 120-160rpm， 装液量为发酵。
5、容器体积的 60-95%， 在 37条件 下发酵培养 3-5d， 发酵液经分离纯化获得乳酸。 4. 根据权利要求 3 所述的应用方法， 其特征在于， 所述种子培养基是由以下含量组 分组成 ： 眎蛋白胨 10.00g/L， 酵母提取物 5.00g/L， 牛肉膏 10.00g/L， 葡萄糖 20.00g/L， 山 梨醇酐单油酸 1.00g/L， 柠檬酸铵 2.00g/L， MnS04H2O0.05g/L， CH3COONa3H2O7.73g/L， Na2HPO412H2O5.04g/L， 蒸馏水定容至 1L， 灭菌。 5. 根据权利要求 3 所述的应用方法， 其特征在于， 所述发酵培养基是由以下含。
6、 量组分组成 : 葡萄糖 93.1g/L、 酵母浸粉 5.2g/L、 碳酸钙 29.4g/L、 蛋白胨 10.0g/L、 Na2HPO412H2O5.0g/L、 MgSO40.2g/L、 MnSO450mg/L， 蒸馏水定容至 1L， 灭菌。 6. 权利要求 1 所述的戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 的应用方法， 其特征在于， 采用所述的 戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 对蒸汽爆破材料进行发酵产乳酸。 7. 根据权利要求 6 所述的应用方法， 其特征在于 ： 将所述戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 菌 株接入种子培养基中， 在 37条件下培养 10-14 小时得种子液 ； 将种。
7、子液按体积百分比 6% 的接种量接入含有蒸汽爆破材料的发酵培养基中， 发酵培养基的初始 pH 值为 4.0-6.5， 摇 床转速为 120-160rpm， 温度 35-50、 装液量为发酵容器体积的 60-95%， 发酵培养 3-5d， 发 酵液经分离纯化获得乳酸。 8. 根据权利要求 7 所述的应用方法， 其特征在于 ： 所述种子培养基是由以下含量的组 分组成 ： 眎蛋白胨 10.00g/L， 酵母提取物 5.00g/L， 牛肉膏 10.00g/L， 葡萄糖 20.00g/L， 山 梨醇酐单油酸 1.00g/L， 柠檬酸铵 2.00g/L， MnS04H2O0.05g/L， CH3COONa。
8、3H2O7.73g/L， Na2HPO412H2O5.04g/L， 蒸馏水定容至 1L， 灭菌。 9. 根据权利要求 7 所述的应用方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养基是由以下含 量的组分组成 : 杨木爆破渣 50g/L、 酵母浸粉 5g/L， 酵母粉 5g/L， 眎蛋白胨 10g/L， Na2HPO412H205g/L， MgSO40.2g/L， MnS04H2O0.05g/L， CaCO330g/L， 蒸馏水定容至 1L ； 高压 灭菌后添加纤维素酶， 纤维素酶的载入量为 15FPIU/g。 10. 根据权利要求 9 所述的应用方法， 其特征在于 ： 所述的杨木爆破渣的制备 ： 将杨木 。
9、切片， 粉碎至 20 目， 填装入蒸汽爆破装置的爆破反应器中 ； 开启蒸汽发生器， 蒸汽到达预设 温度 210， 通入爆破反应器 ； 在预设蒸汽压力 3MPa 下维压 20min， 瞬间释放压力， 爆破完 成， 然后将爆破液烘干至无水收集备用。 权 利 要 求 书 CN 103333822 A 2 1/6 页 3 一株用于乳酸发酵的戊糖乳杆菌 LacticUVC-02 及其应用 方法 技术领域 0001 本 发 明 属 于 应 用 微 生 物 领 域， 涉 及 一 株 用 于 乳 酸 发 酵 的 戊 糖 乳 杆 菌 （Lactobacillus pentosus） lacticUVC-02 及。
10、其发酵产乳酸的应用方法。 背景技术 0002 乳酸 （Lactic acid） ， 又名丙醇酸， 是一种于自然界广泛存在的有机酸， 在人体、 动 植物、 微生物体内普遍存在。乳酸及其衍生物可广泛应用于食品、 化工、 纺织、 制革、 电子、 医药以及农业等诸多领域。近年来可生物降解塑料的研究与开发引起了国内外的广泛重 视。作为乳酸的聚合物聚乳酸， 以其优良的生物可降解性及良好的使用特性 （如无毒、 强 度高、 可塑性强且具有生物相容性等） ， 被认为是传统塑料的理想代替物之一。传统的乳酸 发酵常以粮食作物为底物， 而用粮食 （如玉米等） 为原料生产生物材料和生物化学品不符合 我国人多地少的国情。。
11、而我国木质纤维素资源丰富， 大多都未能得到有效利用 （如被焚烧） 。 如利用这些纤维素资源作为原料制备乳酸， 不仅可以解决环境污染问题， 同时降低了乳酸 的生产成本， 具有显著的经济效益和社会效益。 发明内容 0003 本发明的目的之一是提供一种能发酵产乳酸的戊糖乳杆菌菌株， 该菌株名为戊糖 乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） LacticUVC-02， 保藏号为 CCTCC NO ： M2013209。该菌株 由戊糖乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） ATCC8041 经多次紫外诱变、 反复筛选获得。该菌 株的菌落呈灰白色， 圆形， 菌落边缘不光滑。
12、， 不透明， 湿润， 隆起， 质地均匀， 直径约在 0.5mm 左右， 有特殊气味 ； 戊糖乳杆菌为长杆形， 以单个或链状存在， 革兰氏染色阳性。 0004 本发明的目的之二提供一种上述戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 的应用方法， 采用所 述的戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 对葡萄糖进行发酵产乳酸。 0005 所述的戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 通过以下步骤来生产乳酸 ： 0006 将所述戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 菌株接入种子培养基中， 在 37条件下培养 10-14 小时得种子液 ； 将种子液按体积百分比 6% 的接种量接入葡萄糖发酵培养基中， 发酵 培养基的。
13、初始 pH 值为 5-7， 摇床转速为 120-160rpm， 装液量为发酵容器体积的 60-95%， 在 37条件下发酵培养 3-5d， 发酵液经分离纯化获得乳酸。 0007 所述种子培养基是由以下含量组分组成 ： 眎蛋白胨 10.00g/L， 酵母提取物 5.00g/ L， 牛肉膏 10.00g/L， 葡萄糖 20.00g/L， 山梨醇酐单油酸 1.00g/L， 柠檬酸铵 2.00g/L， MnS04H2O0.05g/L， CH3COONa3H2O7.73g/L， Na2HPO412H2O5.04g/L， 蒸馏水定容至 1L， 灭 菌。 0008 所述发酵培养基是由以下含量组分组成:葡萄糖。
14、93.1g/L、 酵母浸粉5.2g/L、 碳酸 钙 29.4g/L、 蛋白胨 10.0g/L、 Na2HPO412H2O5.0g/L、 MgSO40.2g/L、 MnSO450mg/L， 蒸馏水定 容至 1L， 灭菌。 说 明 书 CN 103333822 A 3 2/6 页 4 0009 本发明的目的之三是还提供另一种所述的戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 的应用方 法， 采用所述的戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 对蒸汽爆破材料进行发酵产乳酸。 0010 具体过程如下 ： 将所述戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 菌株接入种子培养基中， 在 37 条件下培养 10-14 小时得种。
15、子液 ； 将种子液按体积百分比 6% 的接种量接入含有蒸汽爆破 材料的发酵培养基中， 发酵培养基的初始 pH 值为 4.0-6.5， 摇床转速为 120-160rpm， 温度 35-50、 装液量为发酵容器体积的 60-95%， 发酵培养 3-5d， 发酵液经分离纯化获得乳酸。 0011 所述种子培养基是由以下含量的组分组成 ： 眎蛋白胨 10.00g/L， 酵母提取物 5.00g/L， 牛肉膏10.00g/L， 葡萄糖20.00g/L， 山梨醇酐单油酸1.00g/L， 柠檬酸铵2.00g/L， MnS04H2O0.05g/L， CH3COONa3H2O7.73g/L， Na2HPO412H2。
16、O5.04g/L， 蒸馏水定容至 1L， 灭 菌。 0012 所述发酵培养基是由以下含量的组分组成:杨木爆破渣50g/L、 酵母浸粉5g/L， 酵 母粉5g/L， 眎蛋白胨10g/L， Na2HPO4 12H205g/L， MgSO40.2g/L， MnS04 H2O0.05g/L， CaCO330g/ L， 蒸馏水定容至 1L ； 高压灭菌后添加纤维素酶， 纤维素酶的载入量为 15FPIU/g。 0013 所述的杨木爆破渣的制备 ： 将杨木切片， 粉碎至 20 目， 填装入蒸汽爆破装置的爆 破反应器中 ； 开启蒸汽发生器， 蒸汽到达预设温度 210， 通入爆破反应器 ； 在预设蒸汽压 力 3。
17、MPa 下维压 20min， 瞬间释放压力， 爆破完成， 然后将爆破液烘干至无水收集备用。 0014 发明的有益效果或特点 0015 由于戊糖乳杆菌 lacticUVC-02（保藏号 ： CCTCC NO:M2013209） ， 为戊糖乳杆菌 ATCC8041 经多次紫外诱变、 反复筛选获得的新菌株， 其遗传稳定性好， 乳酸产量高。该菌不 仅能利用葡萄糖发酵生产乳酸， 而且能利用木质纤维蒸汽爆破材料发酵产乳酸， 具有成本 低、 产量高、 市场前景好等优点。 0016 戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 0017 保藏日期 ： 2013 年 5 月 15 日 0018 保藏单位名称 ： 中国典。
18、型培养物保藏中心 0019 保藏单位简称 ： CCTCC 0020 保藏号 ： CCTCC NO ： M2013209 附图说明 0021 图 1 为紫外诱变 ATCC8041 原生质体初筛图 ； 0022 图 2 为戊糖乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） lacticUVC-02 菌落形态图 ； 0023 图 3 为乳酸标准曲线。 具体实施方式 0024 以下实施例旨在进一步说明本发明， 而不是限制本发明。 0025 实施例 1 0026 戊糖乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） lacticUVC-02 的分离筛选。 0027 原始菌种来源 ： 0。
19、028 美国典型培养物保藏中心 lactobacillus pentosus ATCC8041。 0029 筛选方法 : 说 明 书 CN 103333822 A 4 3/6 页 5 0030 1） 原生质体制备 ： 0031 （1） 分别取 10mL 液体种子培养物于灭过菌的离心管中 ,4000r/min 离心 15min ； 0032 （2） 用无菌生理盐水洗涤收集的菌体 2 次 ； 0033 （3） 加入 3mL 含溶菌酶的渗透压稳定剂中， 将制备的菌酶混合液在 30的条件下 酶解 2h ； 0034 （4） 将酶解液 3000r/min 离心 15min, 取上清液收集原生质体， 将原。
20、生质体悬浮于 10ml 渗透压稳定剂中备用。 0035 2） 紫外诱变 0036 取经高渗溶液稀释后原生质体溶液 , 用快速混匀器混匀 , 倒 5mL 该菌液于直径 9mm 的培养皿中 , 并在磁力搅拌下 , 在距离 35cm, 功率 20W 的紫外灯下 , 分别进行 40s 时 间段的紫外照射。 诱变结束后， 将照射过后的原生质体溶液涂布在高渗再生培养基上， 37 条件下恒温避光培养 72h。 0037 3） 初筛 0038 在确定紫外线照射时间的基础上， 将照射后的原生质体稀释涂布于原生质体再生 培养基上， 72h 后用无菌牙签将菌落转接在筛选平板上。培养基为绿色， 菌株的代谢产物乳 酸会。
21、使菌落周围 pH 值降低， 形成黄色显色圈 （见图 1） 。2d 后， 挑取显色圈较大的菌株直接 进行复筛。4） 复筛 0039 将初筛得到的显色圈较大的菌株通过摇瓶发酵， 每个菌株接 3 瓶， 37培 养， 72h 后测其乳酸产量 （见表 1） 。由表中数据可知， 经过复筛， 突变株 lacticUVC-02 和 lacticUVD-05 产量较对照高 15% 以上。以下实验同时将突变株 lacticUVC-02 和 lacticUVD-05 进行传代培养， 检验其稳定性。 0040 表 1 复筛结果 0041 菌株编号乳酸产量 (g/L) 对照 （ATCC8041）54.120.15 La。
22、cticUVA-1461.860.05 LacticUVB-0261.750.08 LacticUVB-1162.410.11 LacticUVC-0264.170.14 LacticUVC-0462.920.19 LacticUVC-1363.010.09 LacticUVD-0564.320.25 LacticUVD-0962.130.12 说 明 书 CN 103333822 A 5 4/6 页 6 0042 5） 遗传稳定性 0043 对筛选获得 2 个高乳酸的突变株进行继代培养， 连续继代 8 次， 每代 5 个平行， 测 其乳酸， 观察其稳定性 （表 1、 表 2、 表 3、 表 。
23、4） 。通过方差分析， 比较突变株 lacticUVC-02 和 lacticUVD-05的遗传稳定性， 结果表明， lacticUVC-02的稳定性比lacticUVD-05的稳定性 好， 且 lacticUVC-02 发酵能力远远大于其他菌株， 将其选为发酵所需优良新菌株。 0044 所述种子培养基成分为:眎蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L， 牛肉膏10g/L， 葡萄糖 20g/L， 山梨醇酐单油酸 1g/L， 柠檬酸铵 2g/L， MnSO4H2O0.05g/L， CH3COONa3H2O7.73g/L， Na2HPO412H2O5.04g/L。121高压灭菌 15min。 004。
24、5 所述筛选培养基成分为 ： 眎蛋白胨 10g/L， 酵母提取物 5g/L， 牛肉膏 10g/L， 葡萄糖 20g/L， 山梨醇酐单油酸 1g/L， 柠檬酸铵 2g/L， MnSO4H2O0.05g/L， CH3COONa3H2O7.73g/L， Na2HPO412H2O5.04g/L， 0.01溴钾酚绿。121高压灭菌 15min。 0046 所述高渗培养基成分为 ： 用0.7mol/L NaCl配制MRS培养基， 上层含2%琼脂， 下层 含 3% 的琼脂。 0047 所述渗透压稳定剂 ： 0.7mol/L NaCl 溶液。 0048 所述戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 的形态学特征总。
25、结如下 : 菌落呈灰白色， 无渗出 液 ； 菌丝质地呈地毯状， 菌落边缘不光滑。有特殊气味。 0049 所述戊糖乳杆菌 lacticUVC-02 的生理生化总结特征如下 : 在 MRS 肉汤培养基可 分解蛋白陈、 酵母膏 ； 在葡萄糖培养基中可发酵葡萄糖。 0050 表 2 突变株 LacticUVC-02 遗传稳定性 0051 0052 表 3 突变株 LacticUVC-02 方差分析 0053 差异源平方和自由度均方FP-valueF crit 组间6.38070.9111.580.1772.31 组内18.467320.577 总计24.84639 0054 表 4 突变株 Lacti。
26、cUVD-05 遗传稳定性 说 明 书 CN 103333822 A 6 5/6 页 7 0055 0056 表 5 突变株 LacticUVD-05 方差分析 0057 差异源平方和自由度均方FP-valueF crit 组间29.11174.1594.640.0012.31 组内28.695320.897 总计57.80639 0058 实施例 2 0059 戊糖乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） lacticUVC-02 的发酵产乳酸实验 0060 1、 发酵方法 0061 A: 纯种接种于 MRS 平板培养基中， 37培养 3 天 ； 0062 B: 取一环平皿培。
27、养菌落接种于含 10mL 种子培养基的 25mL 试管中， 37静置培 养 10h 为一级种子液。取 1mL 一级种子液接种于含 100mL 种子培养基的 250mL 锥形瓶 中， 37摇床 150r/min 培养 10h 即为二级种子 ； 所述种子培养基成分为 : 眎蛋白胨 10g/ L， 酵母提取物 5g/L， 牛肉膏 10g/L， 葡萄糖 20g/L， 山梨醇酐单油酸 1g/L， 柠檬酸铵 2g/L， MnSO4H2O0.05g/L， CH3COONa3H2O7.73g/L， Na2HPO412H2O5.04g/L， 水定容至 1L。121 高压灭菌 15min。 0063 C: 根据以。
28、下葡萄糖、 杨木蒸汽爆破渣发酵的不同情况进行发酵 ； 0064 D: 发酵菌种 : 戊糖乳杆菌 lacticUVC-02。 0065 1) 葡萄糖发酵产乳酸实验 0066 将二级种子液按 6% 的接种量接入发酵培养基中， 通过正交设计优化， 发酵培养基 的初始 pH 值为 6.5， 摇床转速为 150rpm， 温度 37、 装液量 80%， 5d 后可得发酵液。乳酸含 量 64.11g/L， 与对照 （戊糖乳杆菌 ATCC8041） 的乳酸含量 54.12g/L 相比， 提高 18.5%。 0067 葡萄糖发酵培养基成分为:葡萄糖93.1g/L、 酵母浸粉5.2g/L、 碳酸钙29.4g/L、。
29、 蛋 白胨 10.0g/L、 Na2HPO412H2O 5.0g/L、 MgSO4 0.2g/L、 MnSO450mg/L， 水定容至 1L。 说 明 书 CN 103333822 A 7 6/6 页 8 0068 2) 杨木蒸汽爆破渣同步糖化发酵产乳酸实验 0069 将二级种子液按 6% 的接种量接入发酵培养基中， 同时加入纤维素酶进行同步糖 化发酵。 通过正交设计优化， 发酵培养基的初始pH值为5.7， 摇床转速为150rpm， 温度37、 装液量 80%， 5d 后可得发酵液， 测定得乳酸产量为 9.42g/L。与对照 （戊糖乳杆菌 ATCC8041） 的乳酸含量 6.10g/L 相比，。
30、 提高 54.4%。 0070 同步糖化发酵培养基成分为 ： 杨木爆破渣 50.0g/L、 酵母浸粉 5.0g/L， 酵母粉 5.0g/L，眎 蛋 白 胨 10.0g/L， Na2HPO412H205.0g/L， MgSO40.2g/L， MnS04H2O0.05g/L， CaCO330.0g/L， 水定容至 1L。高压灭菌后添加纤维素酶， 纤维素酶的载入量为 15FPIU/g。 0071 杨木爆破渣的制备 ： 将杨木切片， 粉碎至 20 目， 填装入蒸汽爆破装置的爆破反应 器中 ； 开启蒸汽发生器， 蒸汽到达预设温度 210， 通入爆破反应器 ； 在预设蒸汽压力 3MPa 下维压 20min。
31、， 瞬间释放压力， 爆破完成， 然后将爆破液烘干至无水收集备用。 0072 2、 测定方法 0073 乳酸质量浓度及含量的测定采用高效液相色谱法 0074 采用液相色谱测定发酵液中乳酸的含量 ： 0075 色谱条件 0076 色谱仪 : 安捷伦 1100（含在线脱气机， 可变波长检测器 （VWD） ， agilent1100 四元 泵） ， 色谱柱为 EDipse XDB-C18（150mm4.6mm1.d.5m） ， 流动相为 0.005mol/L H2SO4溶液， pH2.5( 用 NaOH 调节 )， 流速 1.0mL/min， 检测波长 210nm， 进样量 20m， 柱温为室温。 0。
32、077 流动相配制 0078 0.27mL 分析纯浓硫酸用水稀释并定容至 1000mL(0.005mol/L)， 用 NaOH 溶液调节 pH 值至 2.5， 然后用 0.45m 孔径的合成纤维素酯膜过滤。 0079 对照品制备及标准曲线绘制 0080 精密称取准确称取乳酸 1g 标准品放入 10mL 容量瓶中， 用超纯水溶解并定容至 10mL， 配成乳酸标准液， 然后进行稀释， 分别配成 0.5g/L， 1g/L， 2g/L， 4g/L， 5g/L， 的标准溶 液。用 0.45m 孔径的合成纤维素酯膜过滤。再分别经液相色谱检测， 以浓度为横坐标， 峰 高值为纵坐标， 绘制出的标准曲线如图 3 所示。 0081 样品的制备 : 0082 取5mL发酵液，（5000r/min， 10min） 除去碳酸钙， 加5mL0.01mol/L的硫酸溶液进行 酸解 （10min） ， 离心除去硫酸钙， 以 0.45m 的滤膜过滤， 取 1mL 滤液适量稀释即得待测液。 说 明 书 CN 103333822 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103333822 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103333822 A 10 。