使用 4- 甲基吡唑治疗人类个体的基因型特异性方法 1. 交叉引用
本申请要求 2009 年 6 月 10 日提交的美国专利申请 No.61/185,884 的利益， 将其 全部内容引入本文作为参考
2. 技术领域
本发明提供方法， 所述方法包括向表达醇脱氢酶和醛脱氢酶基因的特定多态性的 遗传亚群个体施用 4- 甲基吡唑 (4-MP) 或其生理学可接受的盐。本发明还提供预防或改善 乙醇不耐受、 减轻或改善与乙醇消耗相伴的乙醛蓄积有关的症状、 或减少由于乙醇消耗引 起的疾病或病症的风险的方法， 所述方法包括向这些亚群个体施用 4-MP 或其生理学可接 受的盐。
3. 发明背景
人类由于各种社会、 娱乐和医学目的而消耗乙醇。过量乙醇消耗引起多种组织损 伤， 所述组织包括肝脏、 脑、 骨胳和心肌， 造成大量的公共健康发病率和死亡率。
乙醇的这些作用中许多是由乙醛介导的， 乙醛在如下的两步骤途径的乙醇代谢期 间产生 ： 其中醇脱氢酶 (ADH) 将乙醇氧化成乙醛， 乙醛随后迅速地被一种线粒体肝酶醛脱 氢酶 (ALDH) 代谢成乙酸 ( 参见图 1)。
ADH 和 ALDH 基 因 显 示 多 态 性， 其 调 节 醇 氧 化 能 力 的 个 体 差 异 (Bosron 等 人， Hepatology 1986， 6， 502-510)。东亚人群携有醇脱氢酶亚型 2 的变体等位基因 (ADH2*2)， 所述醇脱氢酶亚型 2 编码具有 R47H 氨基酸取代的 ADH 酶 (Matsuo 等人， Carcinogenesis 2006， 27(5)， 1018-1023 ； Tamakoshi 等人， Alcohol 2003， 38， 407-410)。H47 ADH 酶为 “超 活性的” ， 显示出的 Vmax 比 “典型的” 等位基因 (ADH2*1) 编码的较低活性 R47 ADH 酶高约 40 倍 (Bosron 等人， Hepatology 1986， 6， 502-510 ； Yoshida 等人， Prog.NucleicAcid Res. MolI.Biol.1991， 40， 255-287)。ADH2*2 等位基因与乙醛的蓄积有关 (Crabb 等人， Proc. Nutr.Soc.2004， 63(1)， 49-63)。
而且， 在东亚人群中占优势的是编码具有 E487K 氨基酸取代的 ALDH 酶的醛脱氢 酶亚型 2 的变体等位基因 (ALDH2*2)(Chen 等人， Am.J.Hum.Genet.1999， 65(3)， 795-807)。 K487 ALDH 酶显示出降低的活性， 当与 “典型的” 等位基因 (ALDH2*1) 编码的更高活性的 E487 ALDH2 酶相比时， 其导致乙醛消除速率降低 40％ -90％， 因此， 表达突变体等位基因的 人显示出 ALDH2 活性降低或缺乏。
乙醛与急性症状比如面部潮红、 心动过速、 呼吸急促、 头晕、 恶心、 呕吐和头痛有 关， 以及提高了上消化道癌症、 乳腺癌、 肝病、 阿尔茨海默病、 高血压和心肌梗死的长期健康 Gut 2004， 55， 871-876 ； Yokoyama 等人 Jpn.J.CHn.Oncol.2003， 风险 ( 参见 Visapaa 等人， 33(3)， 111-121 ； Ohsawa 等人， J.Hum.Genet.2003， 48， 404-409 ； 和其中引用的参考文件 )。 表达具有 ALDH2 活性降低或缺乏的 ALDH2*2 等位基因的人显示出醇相关的敏感性， 例如当 饮用少量乙醇时， 面部潮红、 心动过速等 (Goedde 等人， Hum.Genet.1992， 88， 344-346 ； Xiao 等人， J.Clin.Invest.1995， 96， 2180-2186)。因此， 降低具有 ALDH2 活性降低或缺乏的人群中乙醛水平可能有助于减少当这些人群消耗乙醇时所遭受的急性系统和长期健康风险。
施用 4- 甲基吡唑 ( 也称为甲吡唑或 4-MP) 显示出改善乙醛水平升高的症状。参 见例如 WO 2005/085392 和日本未经审查的专利申请公布 No.S57-106620。然而， 日益明显 的是 4-MP 治疗不适于所有人类遗传亚群。寻找与对 4-MP 的有效治疗有益的个体遗传因素 相关的附加信息。
4. 发明简述
在 一 个 方 面， 提 供 用 于 预 防、 减轻或改善具有降低的或缺乏醛脱氢酶亚型 2(ALDH2) 活性的个体中乙醇不耐受或乙醛蓄积症状的方法。在某些实施方案中， 所述个 体也是醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) 或是醇脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2)。
在某些方面， 提供预防或改善具有降低的或缺乏醛脱氢酶亚型 2(ALDH2) 活性的 个体中乙醇不耐受症状的方法， 包括向该个体施用 4-MP 或 4-MP 的生理学可接受的盐。在 某些实施方案中， 所述个体还是醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) 或醇脱氢酶亚 型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2)。
在某些方面， 提供预防、 减轻或改善具有降低的或缺乏醛脱氢酶亚型 2(ALDH2) 活 性的个体中与乙醛蓄积有关的症状的方法， 包括向该个体施用 4-MP 或 4-MP 的生理学可接 受的盐。在某些实施方案中， 所述个体还是醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) 或 醇脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2)。 在某些实施方案中， 所述乙醛蓄积伴有 乙醇消耗。 个体的乙醇不耐受或乙醛蓄积的症状可以为例如选自潮红、 心率升高、 心悸、 低血 压、 恶心、 头晕、 头痛、 呕吐、 腹泻、 胃不适、 共济失调和意识混淆。
在另一个方面， 提供用于降低具有减少的或缺乏醛脱氢酶亚型 2(ALDH2) 的个体 患有乙醇消耗引起的疾病或病症的可能性或风险的方法。在某些实施方案中， 所述个体还 是醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) 或醇脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ ADH2*2)。与乙醇消耗有关的病症或疾病可以包括， 例如但不限于宿醉、 酒精性胃炎、 酒精 诱导的肝损害、 上呼吸消化道癌症 (upper aerodigestive tract cancers)、 消化道癌、 乳 腺癌、 迟发性阿尔茨海默病、 高血压、 心肌梗死、 帕金森症、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症和脑缺 血。 在优选的实施方案中， 与乙醇消耗相关的疾病包括上呼吸消化道癌、 消化道癌、 乳腺癌、 迟发性阿尔茨海默病、 高血压、 心肌梗死、 帕金森症、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症和脑缺血。
在某些实施方案中， 提供降低个体由于乙醇消耗引起的疾病或病症的可能性和风 险的方法， 包括向有需要的个体施用一定量的 4-MP 或 4-MP 的生理学可接受的盐， 所述量能 有效地增强个体对乙醛的分解代谢， 从而减少个体由于暴露于乙醛引起的疾病或病症的可 能性或风险。在某些实施方案中， 乙醛是乙醇消耗的产物。
在某些实施方案中， 提供的方法包括向个体施用以每千克个体的体重计约 0.1mg 至约 5mg 的 4-MP 或等效质量的生理学可接受的盐形式的 4-MP。 在某些实施方案中， 提供的 方法包括向个体施用以每千克个体的体重计约 0.1mg 至约 4mg 的 4-MP 或等效质量的生理 学可接受的盐形式的 4-MP。在某些实施方案中， 提供的方法包括向个体施用以每千克个体 的体重计约 1mg 至约 4mg 的 4-MP 或等效质量的生理学可接受的盐形式的 4-MP。
在某些实施方案中， 提供的方法包括向个体施用以每千克个体的体重计约 0.1mg
至约 5mg、 约 0.1mg 至约 4.5mg、 约 0.1mg 至约 4mg、 约 0.1mg 至约 3.5mg、 约 0.1mg 至约 3mg、 约 0.1mg 至约 2.5mg、 约 0.1mg 至约 2mg、 约 0.1mg 至约 1.5mg、 约 0.1mg 至约 1mg、 约 0.1mg 至约 0.5mg、 约 1mg 至约 4.5mg、 约 1mg 至约 4mg、 约 1mg 至约 3.5mg、 约 1mg 至约 3mg、 约 1mg 至约 2.5mg、 约 1mg 至约 2mg、 约 1mg 至约 1.5mg、 约 0.1mg 至约 3mg、 约 0.5mg 至约 2mg、 或约 2mg 至约 4mg 的 4-MP， 或等效质量的生理学可接受的盐形式的 4-MP。
在某些实施方案中， 提供的方法包括向个体施用以每千克个体的体重计约 0.1mg、 约 0.5mg、 约 1mg、 约 1.5mg、 约 2mg、 约 2.5mg、 约 3mg、 约 3.5mg、 约 4mg、 约 4.5mg 或约 5mg 的 4-MP， 或等效质量的生理学可接受的盐形式的 4-MP。
在某些实施方案中， 4-MP 是口服施用的。
在某些实施方案中， 4-MP 是在个体消耗乙醇之前口服施用的。
在某些实施方案中， 4-MP 是在个体消耗乙醇之前约两小时至约十五分钟口服施用 的。
在其它的实施方案中， 4-MP 是与个体消耗乙醇同时或在个体消耗乙醇之后口服施 用的。
在某些实施方案中， 个体的乙醇消除率的降低％相对于未施用 4-MP 的个体的乙 醇消除率为不超过约 10％。
在某些实施方案中， 所述方法包括施用有效量的 4-MP， 相对于未施用 4-MP 的个 体， 其减少了乙醛蓄积约 25％至约 60％。
在某些实施方案中， 所述方法包括施用一定量的 4-MP 或 4-MP 的生理学可接受的 盐， 其有效地降低或抑制了个体中醇脱氢酶的乙醇 - 氧化活性。
在某些实施方案中， 施用有效量的 4-MP 的盐酸盐。
在某些实施方案中， 在施用 4-MP 之前， 测定个体的 ALDH2 和 ADH2 基因型。
在另一个方面， 提供包含 4-MP 或其生理学可接受的盐和生理学可接受的赋形剂 的组合物， 其适于向个体口服给药。
在某些实施方案中， 所述组合物可以用于预防、 减轻或改善具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的个体中乙醇不耐受的症状或与乙醇消耗相伴的乙醛蓄积相关的症状。在某些 实施方案中， 所述组合物可以用于降低具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的个体由于乙醇消耗 引起的疾病或病症的风险。
在进一步的方面， 提供 4-MP 或其可药用盐在用于预防、 减轻或改善具有降低的或 缺乏 ALDH2 活性的个体中乙醇不耐受的症状或与乙醇消耗相伴的乙醛蓄积相关的症状的 用途， 任选地在制备药物中的用途。
在更进一步的方面， 提供 4-MP 或其可药用盐在用于降低具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的个体中由于乙醇消耗引起的疾病或病症的风险中的用途， 任选地在制备药物中的用 途。 5. 附图说明
图 1. 乙醇的代谢。
图 2. 在给药 1mg/kg 4-MP( 实心圆 ) 之后， 具有降低的 ALDH2 活性的个体中测量 的平均血清乙醛浓度图， 所述个体还是 ADH2*1/ADH2*1 纯合的或 ADH2*1/ADH2*2 杂合的 ； 与安慰剂比较 ( 空心圆 )。
图 3. 在给药 1mg/kg 4-MP( 实心圆 ) 之后， 具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的个体 中测量的平均血清乙醛浓度图， 所述个体还是 ADH2*2/ADH2*2 纯合的 ； 与安慰剂比较 ( 空心 圆 )。
图 4. 在给药 4-MP( 实心圆 ) 之后， 具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的所有个体的平 均血清乙醛浓度图 ； 与安慰剂比较 ( 空心圆 )。
6. 术语
通常， 本文所用的命名和本文所述的药物化学、 生物化学和药理学实验方法是本 领域众所周知且通用的方法。除非另外规定， 本文所用的所有技术和科学名词通常具有本 申请所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。 如果本文所用的术语存在多个定 义， 除非另有说明， 以本章节中的定义为准。
如本文使用的 “约” 指 +/-10％的范围。例如， “约 4mg 的 4-MP” 指 3.6mg 至 4.4mg 范围的 4-MP。
术语 “个体” 指动物， 比如哺乳动物， 包括但不限于 ： 灵长类 ( 例如人 )、 猴、 牛、 绵 羊、 山羊、 马、 狗、 猫、 兔、 猪、 鹿、 熊、 大鼠、 小鼠等。在优选的实施方案中， 个体为人。 如本文使用的术语 “治疗” 或 “处理” 指减轻或消除病症和 / 或其伴随症状的方法。
在某些实施方案中， 术语 “预防” 指使个体免受患病症和 / 或其伴随症状的方法。 某些实施方案中， 术语 “预防” 指降低个体患病症和 / 或其伴随症状的可能性或风险的方 法。
如本文使用的术语 “生理学可接受的盐” 指本发明的化合物的相对无毒的、 无机酸 和有机酸加成盐。
如本文使用的术语 “乙 醇 消 耗 相 伴 的 乙 醛 蓄 积 的 症 状”指 当 醛 脱 氢 酶 亚 型 2(ALDH2) 活性降低或缺乏的个体在消耗乙醇时经历的任何症状。症状可以包括， 但不限于 潮红、 心率升高、 心悸、 低血压、 恶心、 头晕、 头痛、 呕吐、 腹泻、 胃不适、 共济失调和意识混淆。
术语 “醛脱氢酶亚型 2(ALDH2) 活性降低或缺乏的个体” 指作为 ALDH2 基因的变体 ALDH2*2 等位基因纯合的或杂合的携带者的个体， 如在 Goedde 等人， Hum.Genet.1992， 88， 344-346 和 Xiao 等人， J.Clin.Invest.1995， 96， 2180-2186 中描述的， 将其全部内容引入本 文作为参考， 或当通过 Xiao 等人， J.Clin.Invest.1995， 96， 2180-2186 中描述的醛脱氢酶 活性试验测定时， 表达任何呈现出较正常 ALDH2 酶活性低的变体 ALDH2 酶的个体。
术语 “个体是醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) 或醇脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2)” 指作为 “典型的” ADH2*1 等位基因的纯合的或杂合的携带者 的个体。
如本文使用的 “乙醇不耐受” 其中个体经历乙醇消耗伴有的乙醛蓄积症状的病症。
如本文使用的 “乙醇消除率” 指个体摄取乙醇之后个体血流中乙醇浓度随时间的 降低。 典型地， 乙醇消除率可以表示为术语毫摩尔乙醇 / 千克个体体重 / 小时。 采血和分析 血液中乙醇水平的技术是本领域技术人员所熟知的。参见， 例如 Inoue 等人， Alcoholism ： Clinical and Experimental Research1984， 8， 319-322， 将其全部内容引入本文作为参考。 “乙醇消除率的变化％” 可以如下计算 ：
其中 EtOH 代表乙醇， 小于 100 的乙醇消除变化％量为 EtOH 消除变化％的减少量。 也可以例如基于利用个体消耗的乙醇量、 个体的体重和自乙醇消耗开始的时间段的运算法 则计算血液乙醇水平， 或者， 作为另一个实例， 如本领域技术人员已知的， 可以从个体呼吸 的分析推断出血液乙醇水平等。如本文使用的 “乙醛蓄积” 指消耗乙醇的个体中乙醛的生 成。 采血技术和血液中乙醛水平的分析技术是本领域技术人员所熟知的。 参见， 例如 Inoue 等人， Alcoholism ： Clinical and Experimental Research 1984， 8， 319-322。 也可参见， 例 如 Stowell， Clin.Chim.Acta.1979， 98， 201-5， McCarver-May 等人， Journal of Analytical Toxicology 1997， 21， 134-141 和 Nagy 等人， RapidCommunications in Mass Spectrometry 2004， 18， 2473-2478， 将其全部内容引入本文作为参考。在具有降低的或不存在 ALDH2 活性 的个体中， 乙醛蓄积的最大浓度典型地出现在乙醇消耗后十五分钟到一小时。当本文使用 “乙醛蓄积变化％” 时， 其应当理解为指具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的个体中乙醛的最大 浓度变化， 可以如下计算 ：
其中小于 100 的乙醛蓄积变化％量为乙醛蓄积变化％的减少量。如本领域技术人 员已知的， 还可以从个体呼吸的分析或其它参数比如心率或潮红等可测量的生理变化推断 血液乙醛浓度。如本文定义的， 当指定 4-MP 的质量时， 例如 “2mg 的 4-MP” ， 该数量指游离 碱形式的 4-MP 的等效质量。因此， 例如， 如果在本文公开的方法中， 施用 2mg 给定盐形式的 4-MP， 则本领域技术人员可以使用 4-MP 的盐形式的分子量和 4-MP 的游离碱形式的分子量 进行必要的转换， 以确定获得 2mg 游离碱形式的 4-MP 的等效质量所需 4-MP 盐形式的实际 质量。 作为另一个实例， 如果在本文公开的方法中施用 2mg 游离碱形式的 4-MP， 则不需要转 换。
如本文使用的术语 “有效量” 指当接触例如醇脱氢酶时 ( 或作为另外的例子， 当施 用至个体时 )， 足以产生所需的或有益的效果的 4-MP 或其生理学可接受的盐的量。在某些 实施方案中， 所述 “有效量” 为例如， 减少或改善个体中与乙醇消耗伴有的乙醛蓄积相关的 症状的量， 或降低个体由于乙醇消耗所引起的疾病或病症的可能性或风险的量。
如本文使用的术语 “症状” 与 “征兆” 可互换。因此， 如本文使用的 “症状” 指身体 状况， 其指示患有具体的疾病或病症的个体可检测到的、 或个体之外的其他人在没有来自 所述个体的语言信息情况下仍可检测到的具体疾病或病症 ( 例如， Longman Dictionary of Contemporary English， 1995， 第三版 )。
如本文使用的术语 “AUC” 指在向个体施用 4-MP 之后血清乙醛浓度对时间曲线图 的曲线下面积。在某些实施方案中， AUC 限定为 0 至 8 小时 (AUC0-8H)。
如本文使用的术语 “AUC 平均值” 指在向样本人群的个体施用 4-MP 之后平均血清 乙醛浓度对时间曲线图的曲线下面积。在某些实施方案中， AUC 平均值限定为 0 至 8 小时 (AUC0-8H 平均值 )。
如本文使用的术语 “Cmax” 指向个体施用 4-MP 之后的最大血清乙醛浓度。
如本文使用的术语 “Cmax 平均值” 指向样本人群的个体施用 4-MP 之后的平均最大 血清乙醛浓度。
如本文使用的术语 “P- 值” 指获得一定结果的可能性。P- 值越小， 可能性越小， 因 此结果的统计学显著性越大。在某些实施方案中， 0.05 的 P- 值相当于获得一定结果的 5％ 概率。
如本文使用的术语 “SE” 指样本人群的平均标准误差。在某些实施方案中， SE 可 以指由于样本人群中测量的样本数据计算的标准偏差估计值。
7. 发明详述
本发明提供用于降低或改善个体中与乙醇消耗伴有的乙醛蓄积相关的不利生理 学症状的严重性或预防该不利生理学症状的方法， 其中所述个体为表达醇脱氢酶和醛脱氢 酶基因的特定多态性的遗传亚群成员。
如下阐述的， 提供的方法包括施用 4-MP 或 4-MP 的生理学可接受的盐。不希望受 到任何具体理论或机制的限制， 据信 4-MP 起到抑制醇脱氢酶 (ADH) 以减少由于乙醇消耗引 起的乙醛生产的蓄积的作用。不希望受到任何具体理论或机制的限制， 据认为如下鉴定的 乙醇不耐受人类个体的某些遗传亚群将更可能得益于本文描述的方法， 而如下鉴定的乙醇 不耐受人类个体的其他遗传亚群较低可能地得益于本文描述的方法。 7.1. 预防或改善表达 ALDH2 和 ADH2 基因的特定多态性的人类个体的遗传亚群中 乙醇不耐受的或乙醛蓄积的症状的方法
在 一 个 方 面， 提 供 用 于 预 防、 减轻或改善具有降低的或缺乏醛脱氢酶亚型 2(ALDH2) 活性的个体中乙醇不耐受或乙醛蓄积的症状的方法。在某些实施方案中， 所述 个体还是醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) 或醇脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2)。
在某些实施方案中， 所述方法包括向个体施用 4- 甲基吡唑 (4-MP)。
4- 甲基吡唑 (4-MP， 也称为甲吡唑 ) 是由化学品供应商市售可获得的， 所述化学品 供应商包括例如 Sigma Aldrich(St.Louis， MO)， 也可以以市售可获得量的药物级水平容易 地合成。
在某些实施方案中， 在施用 4-MP 之前， 测定个体的 ALDH2 和 ADH2 基因型。
在某些实施方案中， 所述方法包括向个体施用约 1mg 至约 4mg 的 4-MP/ 千克个体 的体重。
在某些实施方案中， 在所述方法中使用的化合物是 4-MP 的游离碱。在其他实施方 案中， 可以在所述方法中使用 4-MP 的生理学可接受的盐。在某些实施方案中， 可以在本文 描述的方法中使用 4-MP 盐酸盐。
4-MP 可以单独施用或与其它物质或活性剂组合施用。在某些实施方案中， 施用如 下所述包括 4-MP 及其它成分的组合物。
可以根据本领域技术人员已知的任何技术施用 4-MP。在某些实施方案中， 可以透 皮递送 4-MP。 在优选的实施方案中， 个体可以向自身自己施用 4-MP。 在优选的实施方案中， 可以口服施用 4-MP。当口服施用时， 4-MP 可以为固体形式， 例如如粉末、 片剂、 胶囊等或液 体形式。
在某些实施方案中， 施用 4-MP 的含量可以为约 0.1mg/kg 至约 5mg/kg。在某些实
施方案中， 施用 4-MP 的量可以为约 0.1mg/kg 至约 4mg/kg。在某些实施方案中， 施用 4-MP 的量可以为约 1mg/kg 至约 5mg/kg。在某些实施方案中， 施用 4-MP 的量可以为约 1mg/kg 至约 4mg/kg。如本领域技术人员理解的， 如本文描述的施用 4-MP 的量是基于以千克表示 的个体的质量计的。在某些实施方案中， 向醛 ALDH2 活性降低或缺乏的个体施用约 0.1mg/ kg、 约 0.5mg/kg、 约 1.5mg/kg、 约 2mg/kg、 约 2.5mg/kg、 约 3mg/kg、 约 3.5mg/kg、 约 4mg/kg、 约 4.5mg/kg 或约 5mg/kg 的 4-MP。在某些实施方案中， 施用 4-MP 的量可以为约 0.1mg/kg 至约 3mg/kg 的范围、 0.5mg/kg 至 2mg/kg 的范围或 2mg/kg 至 4mg/kg 的范围。在某些实施 方案中， 施用 4-MP 或其生理学可接受的盐的量可以有效地降低或抑制个体中醇脱氢酶的 乙醇氧化活性。
在某些实施方案中， 可以在个体消耗乙醇之前施用 4-MP。 在某些实施方案中， 可以 在个体消耗乙醇之前约 1 分钟、 约 15 分钟或约 1 小时施用 4-MP。在某些实施方案中， 可以 在个体消耗乙醇之前约 2 小时至约 15 分钟口服施用 4-MP。
在某些实施方案中， 可以在消耗乙醇的同时施用 4-MP。 在某些实施方案中， 可以在 消耗乙醇之前或之后立即施用 4-MP。在某些实施方案中， 可以在个体消耗乙醇之后向个体 施用 4-MP。
特别有利的是使具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的个体血液中的乙醛的峰浓度最 小化， 而不会同时降低乙醇消除的速率， 以便避免个体相对长时期处于乙醇影响下的后果。 如下讨论的， 采用本文预期的一定剂量的 4-MP， 约 0.1mg/kg 至约 4mg/kg 之间， 对乙醇消除 率的降低百分数的影响可忽视不计或最小化。
在某些实施方案中， 提供包括施用 4-MP 的方法， 其中乙醇消除的降低百分数为约 0％、 约 1％、 约 2％、 约 3％、 约 4％、 约 5％或约 6％至不超过约 10％。 例如， 如果没有用 4-MP 处理的个体具有的乙醇消除率为 2.50mmol/kg/hr， 并且当施用 4-MP 时具有的乙醇消除率 为 2.30mmol/kg/hr， 则乙醇消除的降低百分数为 8％。
在某些实施方案中， 提供方法， 其可以使个体乙醇消除率的降低百分数从不降低 或乙醇消除率减低 1-2％至个体的乙醇消除率降低小于约 7％、 约 8％、 约 9％或约 10％。 在 某些实施方案中， 提供的方法引起乙醇消除降低约 5％至约 10％。在某些实施方案中， 个体 的乙醇消除率的降低百分数为与未用 4-MP 处理的个体的乙醇消除率相比不超过约 10％。
采用本发明方法中预期的 4-MP 剂量， 在具有降低的 ALDH2 活性的个体中的血液乙 醛浓度峰值的降低百分数可以降低。
在某些实施方案中， 与未向个体施用 4-MP 相比， 提供的方法可以减少具有降低的 或缺乏 ALDH2 活性的个体中乙醛蓄积约 50％至约 60％。在某些实施方案中， 乙醛蓄积峰值 可以有效地消除或减少约 95％、 90％、 85％、 80％、 75％、 70％、 65％、 60％、 55％、 50％、 45％、 40％、 35％、 30％、 25％、 20％、 15％、 10％或约 5％。
在某些实施方案中， 提供的方法预防或改善个体中的乙醇不耐受或乙醛蓄积的症 状， 所述症状选自潮红、 心率升高、 心悸、 低血压、 恶心、 头晕、 头痛、 呕吐、 腹泻、 胃不适、 共济 失调和意识混淆。
7.2. 降低表达 ALDH2 和 ADH2 基因的特定多态性的人类个体的遗传亚群中个体由 于乙醇消耗引起的疾病或病症的可能性或风险的方法
在另一个方面， 提供用于减少具有降低的或缺乏醛脱氢酶亚型 2(ALDH2) 活性的个体中由于乙醇消耗引起的疾病或病症的可能性或风险的方法。在某些实施方案中， 所述 个体还是醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) 或醇脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2)。
在某些实施方案中， 在该方法中使用的化合物为 4-MP 的游离碱。在其它的实施方 案中， 可以在所述方法中使用 4-MP 的生理学可接受的盐。在某些实施方案中， 可以在本文 描述的方法中使用 4-MP 盐酸盐。
在某些实施方案中， 所述方法包括向个体施用约 1mg 至约 4mg 的 4-MP/ 千克个体 的体重。
在某些实施方案中， 在施用的 4-MP 之前， 测定个体的 ALDH2 和 ADH2 基因型。
在某些实施方案中， 所述方法有效地增加了个体的乙醛的分解代谢， 从而降低了 个体由于暴露于乙醛引起的疾病或病症的可能性或风险。
在某些实施方案中， 乙醛是个体消耗乙醇的产物。
在某些实施方案中， 所述疾病或病症包括上呼吸消化道癌、 消化道癌或乳腺癌。 在 另一个实施方案中， 所述上呼吸消化道癌包括食管癌、 口咽癌、 下咽癌、 喉癌、 头癌或颈癌。 在一个进一步的实施方案中， 所述消化道癌包括胃癌或结肠癌。 在某些实施方案中， 所述疾病或病症包括迟发性阿尔茨海默病、 高血压、 心肌梗 死、 帕金森病、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症和脑缺血。
8. 实施例
8.1. 降低表达 ALDH2 和 ADH2 基因的特定多态性的人类个体遗传亚群的乙醛浓度
该实施例证实 4-MP 在表达 ALDH2 和 ADH2 基因的特定多态性的人类个体遗传亚群 中起减少乙醇消耗伴有的乙醛蓄积的作用。
8.1.1 方法
进行盲的、 个体内对照、 单剂量、 剂量递增的研究， 以研究 4-MP 缓解具有先天乙醇 代谢改变症状的个体在乙醇暴露下的乙醛相关毒性。
对于该研究人群， 选择 32 名 (n ＝ 32) 日本血统的健康人类个体， 21 至 50 岁， 已知 由于在乙醇消耗后潮红、 心悸和 / 或恶心的病史而对乙醇不耐受， 并且对皮肤乙醇斑贴试 验显示出阳性结果。
随机选择二十四名个体 (n ＝ 24)， 口服施用 1mg/kg、 3mg/kg、 或 5mg/kg 的 4-MP， 之 后 30 分钟施用口服剂量的 20％乙醇 (5mg/kg)。剂量方案显示在表 1 中。
表1： 4-MP 的剂量方案
4-MP 的剂量 1mg/kg 3mg/kg 5mg/kg
4-MP， 之后乙醇 12 名个体 4 名个体 8 名个体 乙醇， 之后 4-MP 4 名个体 4 名个体使用相同的方案， 其中采用安慰剂代替 4-MP， 二十四名随机选择的个体的每名充当其自身对照。
然后， 二十四名随机选择的个体接受采血， 在乙醇消耗之后的选定时间点， 分析采 集血液的乙醛水平。
对 于 乙 醛 分 析， 通 过 用 内 标 ( 乙 醛 -d4) 稀 释， 用二硝基苯肼的盐酸溶液对 乙 醛 衍 生 化， 液 - 液 分 配 和 溶 剂 交 换 制 备 血 样。 所 述 衍 生 化 形 成 乙 醛 - 二 硝 基 苯 肼 (DNPH) 衍生物， 其显著地升高分子的沸点， 因此， 其比乙醛本身相对稳定 (Nagy 等人， Rapid Communications in Mass Spectrometry 2004， 18， 2473-2478)。 使 用 Jones Chromatography(Grace-Vy dac)， 保持在设定为 28℃的箱体中的 50mm×2.1mm， 3μm 柱分 离衍生化分析物。 使用两种流动相， 梯度组成为 30 ∶ 70 乙腈∶水对 90 ∶ 10 的乙腈∶水与 0.1％甲酸。用装备质谱仪的高效液相色谱 (HPLC/MS/MS) 检测衍生化的分析物。使用具有 1/× 加权的杂质标准品的线性回归曲线拟合进行定量， 所述杂质标准品是由乙醛在水中的 稀释液制备的。注射 2μL 的样品和标准品。
然后， 在印地安那州大学 (Indiana University) 的 Alcohol ResearchCenter， 使 用 (i) 基因组 DNA 分离和 (ii) 等位基因鉴别的 TaqMan 测定， 将所有 32 名个体基因分型为 ALDH2 和 ADH2。 i. 基因组 DNA 分离 ： 首先， 使用分离 PCR- 质量水平的基因组 DNA 的 “HotSHOT” 方 法分离 DNA(Truett 等人， Biotechniques 2000， 29(1)， 52， 54)。 简而言之， 将点在滤纸 (3mm 圆形 ) 上的血液置于 96 孔板的孔中， 与 75μL 的 25mM NaOH/0.3mM EDTA 溶液混合， 并加热 到 95℃ 40 分钟， 接着用 75μL 的 40mM Tris-HCl(pH5) 溶液中和。对于每次 PCR， 使用 1-5 微升。
ii. 等位基因鉴别的 TaqMan 测定 ： 等位基因鉴别测定使用多重 ( 每个反应超过一 个引物 / 探针对 )、 终点 ( 在 PCR 工艺结束时收集数据 ) 测定。每个测定混合物包含用 VIC 或 FAM 荧光报告染料标记的两种不同的 TaqMan 探针 (Applied BioSystems， Foster City， CA)， 所述 VIC 或 FAM 荧光报告染料偏好地结合所述等位基因之一。通过报告染料的荧光水 平确定每种样品的基因型， 并与相同基因型的其它样品归类在图表中。每个反应包含 5μL 的 2×TaqMan Universal PCR Mastermix， 无 AmpEraseUNG， 3.75μL 水， 0.25μL 40× 测定 混合物和 1μL DNA 样品。每个 96 孔板上包括八或十一个对照品 ： 两个无模板对照品， 两个 或三个杂合样品， 两个或三个纯合样品。在 MJ Research PTC-200 热循环器中进行热循环。 然后， 在 ABI PRISM(R)7300 Sequence Detection System(SDS) 仪器中分析 PCR 产物。SDS 软件 1.3.1 将原始数据转化成纯染料组分， 并将等位基因鉴别结果绘制成等位基因 X 对比 等位基因 Y 的散布图 ( 例如， ADH2*1 对比 ADH2*2) ； 从该图表可见每个基因型呈点丛存在。
基于如上所述的 ALDH2 和 ADH2 基因分型， 发现个体分成七种基因型组 (A、 B、 C、 D、 E、 F和G组)：
A组： 醛脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ALDH2*1/ALDH2*2)， 且醇脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ADH2*1/ADH2*1) ； 该组有两名个体 (n ＝ 2) ；
B组： 醛脱氢酶亚型 2*2 纯合的 (ALDH2*2/ALDH2*2)， 且醇脱氢酶亚型 2*1 纯合 的 (ADH2*1/ADH2*1) ； 该组有一名个体 (n ＝ 1) ； C组： 醛脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ALDH2*1/ ALDH2*1)， 且醇脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2) ； 该组有四名个体 (n ＝ 4) ；
D组： 醛脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ALDH2*1/ALDH2*2)， 且醇脱氢酶亚型 2*1
和 2*2 杂合的 (ADH2*1/ADH2*2) ； 该组有六名个体 (n ＝ 6) ；
E组： 醛脱氢酶亚型 2*1 纯合的 (ALDH2*1/ALDH2*1)， 且醇脱氢酶亚型 2*2 纯合的 (ADH2*2/ADH2*2) ； 该组有五名个体 (n ＝ 5) ；
F组： 醛脱氢酶亚型 2*1 和 2*2 杂合的 (ALDH2*1/ALDH2*2)， 且醇脱氢酶亚型 2*2 纯合的 (ADH2*2/ADH2*2) ； 该组有十三名个体 (n ＝ 13) ； 和
G组： 醛脱氢酶亚型 2*2 纯合的 (ALDH2*2/ALDH2*2)， 且醇脱氢酶亚型 2*2 纯合的 (ADH2*2/ADH2*2) ； 该组有 1 名个体 (n ＝ 1) ；
表 2 显示 32 名个体中每名的 ADLH2 和 ADH2 基因型。
表2： 研究个体的 ADLH2 和 ADH2 基因型
将从上述 7 组中各组的个体的血样测量出的乙醛浓度数据比较作为基因型的函数。 8.1.2 结果
8.1.2.1.A 组和 D 组
图 2 给出了在给药 1mg/kg 4-MP 后， 具有降低的 ALDH2 活性的六名个体 (n ＝ 6) 中测定的平均血清乙醛浓度以及与安慰剂比较的图表， 所述个体还是 ADH2*1/ADH2*1 纯合 的或 ADH2*1/ADH2*2 杂合的 (A 组和 D 组 )。
表 3 给出了使用本领域技术人员已知的标准数学模型， 由图 2 的数据计算的 “Cmax 平均值” 和 “AUC0-8H 平均值” 的药代动力学参数。P- 值和标准误差是由数据的统计分析确 定的， 也列在表 3 中。
表3： 由图 2 中列出的数据计算的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值
图 2 证实了在施用 1mg/kg 4-MP 之后， 在具有降低的 ALDH2 活性的个体中， 由于 饮用乙醇引起的血液中平均乙醛峰浓度可降低， 所述个体还是 ADH2*1/ADH2*1 纯合的或 ADH2*1/ADH2*2 杂合的。
表 3 证实了相对于在 4-MP 不存在下的那些个体饮用乙醇后的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值， 在施用 1mg/kg 4-MP 之后， 在具有降低的 ALDH2 活性的个体中， 由于饮用乙醇引起 的血液中的乙醛浓度的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值可显著地降低， 所述个体还是 ADH2*1/ ADH2*1 纯合的或 ADH2*1/ADH2*2 杂合的。例如， 根据表 3， 相对于安慰剂， Cmax 平均值从 64.7±8.4μg/mg 降低至 41.3±5.2μg/mg， AUC0-8H 平均值从 186±14.8μg*hr/mL 降低至 162±18.7μg*hr/mL。Cmax 平均值的降低代表降低约 36％。
这些结果证实 1mg/kg 的 4-MP 在减少具有降低的 ALDH2 活性的个体的某些遗传亚 群中乙醇消耗伴有的乙醛蓄积方面是有效的， 所述个体例如还是 ADH2*1/ADH2*1 纯合的或 ADH2*1/ADH2*2 杂合的那些个体。8.1.2.2.
F 组和 G 组
图 3 给出了在给药 1mg/kg 4-MP 之后， 具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的六名个体 (n ＝ 6) 中测定的平均血清乙醛浓度的图表以及与安慰剂的比较， 所述个体还是 ADH2*2/ ADH2*2 纯合的 (F 组和 G 组 )。
表 4 给出了使用本领域技术人员已知的标准数学模型， 由图 3 中的数据计算的 “Cmax 平均值” 和 “AUC0-8H 平均值” 的药代动力学参数。P- 值和标准误差是从数据的统计分 析确定的， 也列在表 4 中。
表4： 由图 3 中列出的数据计算的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值
图 3 证实了在施用 1mg/kg 4-MP 之后， 在具有降低的 ALDH2 活性的个体中， 由于饮 用乙醇引起的血液中平均乙醛峰浓度没有降低， 所述个体还是 ADH2*2/ADH2*2 纯合的。
表 4 证实了相对于在 4-MP 不存在下的那些个体饮用乙醇后的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值， 在施用 1mg/kg 4-MP 之后， 在具有降低的 ALDH2 活性的个体中， 由于饮用乙醇引起 的血液中乙醛浓度的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值没有显著地降低， 所述个体还是 ADH2*2/ ADH2*2 纯合的。
这些结果显示具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的个体的某些遗传亚群， 例如还是 ADH2*2/ADH2*2 纯合的那些个体几乎不会从施用一定剂量的 4-MP( 例如 1mg/kg 的 4-MP) 受 益。该结果表明乙醇不耐受人类个体对施用 4-MP 存在差异性反应。
8.1.2.3.A 组、 B 组、 D 组、 F 组和 G 组
图 4 给出了在给药 1mg/kg、 3mg/kg 或 5mg/kg 的 4-MP 之后， 具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的 23 名个体 (n ＝ 23， A 组、 B 组、 D 组、 F 组和 G 组 ) 中平均血清乙醛浓度的图 表和与安慰剂的比较。
表 5 给出了使用本领域技术人员已知的标准数学模型， 由图 4 的数据计算的 “Cmax 平均值” 和 “AUC0-8H 平均值” 的药代动力学参数。P- 值和标准误差由数据的统计分析确定， 也列在表 5 中。表 5 ： 由图 4 中列出的数据计算的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值
图 4 证实了在施用 1mg/kg、 3mg/kg 或 5mg/kg 的 4-MP 之后， 具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的所有个体由于饮用乙醇引起的血液中平均乙醛峰浓度没有降低。
表 5 证实了相对于在 4-MP 不存在下的那些个体饮用乙醇后的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值， 在施用 1mg/kg、 3mg/kg 或 5mg/kg 的 4-MP 之后， 在具有降低的或缺乏 ALDH2 活性的 个体中， 由于饮用乙醇引起的血液中乙醛浓度的 Cmax 平均值和 AUC0-8H 平均值没有显著地降 低。
这些结果显示具有 ALDH2 活性降低或缺乏的个体的某些遗传亚群， 例如还是 ADH2*2/ADH2*2 纯合的那些个体， 几乎不会从施用 1-5mg/kg 范围内剂量的 4-MP 受益。
总之， 上述研究表明向乙醇不耐受人类个体施用 4-MP 存在差异性反应 ： 与乙醇 不耐受人类个体的其它亚群例如具有 ALDH2 活性降低且还是 ADH2*2/ADH2*2 纯合的个体 相比， 乙醇不耐受人类个体的某些遗传亚群， 例如具有降低的 ALDH2 活性且还是 ADH2*1/ ADH2*1 纯合的或 ADH2*1/ADH2*2 杂合的个体很可能从施用 1-5mg/kg 的 4-MP 中受益。
8.2. 向人类个体示例性施用 4-MP
下述实施例描述了向人类个体示例性施用 4-MP。
将游离碱、 液体形式的 4-MP 与橙汁混合以制备 0.5％ (w/v) 的 4-MP 溶液。4-MP 可以贮存在具有结合配药杯的容器中， 该配药杯具有标记指示将对待施用 4-MP 的不同体 重人类使用的不同量溶液。对于将饮用乙醇的体重约 75kg 且具有降低的或缺乏 ALDH2 活 性的人， 将约 60 毫升的 4-MP 倒入配药杯中， 具有降低的或缺乏 ALDH2 的人可以在饮用酒精 前数分钟或数小时从该杯饮用所述 4-MP 溶液。
虽然本发明已通过用于清楚理解目的的图示和实施例的方式较详细地进行了描 述， 对本领域技术人员显而易见的是可实施某些改变和修饰。 因此， 说明书和实施例不应该 被看作是限制本发明的范围， 本发明的范围由附加的权利要求来描述。
将本说明书引用的所有出版物和专利申请在此均引入本文作为参考， 如同各个出 版物或利专利申请特别地或分别指出引入作为参考一样。