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使用包含抗体 - 受体组合的多特异性结合蛋白的组合物和 方法
    背景技术 血管发生是从现有血管形成新血管。其在发育中起必要作用。在成人中， 血管发 生在创伤愈合过程中发生以在损伤或创伤后对组织恢复血流。 血管发生也在肿瘤形成和其 它疾病， 包括类风湿性关节炎， 动脉粥样硬化， 牛皮癣， 糖尿病性视网膜病和黄斑变性中起 重要作用。( 参见， 例如， Fan 等人， Trends Pharmacol.Sci.16 ： 57， 1995 ； Folkman， Nature Med.1 ： 27， 1995)。
     生理或病理条件下新血管的生长需要血管发生的活化剂和抑制剂的协调作用。 血 管发生的活化剂包括血管内皮生长因子 -A(VEGF-A)， 成纤维细胞生长因子 (FGFs)， 胎盘生 长因子 (PlGF)， 和肝细胞生长因子 (HGF) 和一些细胞因子如白介素 -8(IL-8)。血管发生的 内源性抑制剂包括血小板反应蛋白、 内皮他丁、 血管他丁和白介素 -12。血管发生的活化剂 和抑制剂之间的平衡生理和病理血管发生过程中向活化剂倾斜。
     VEGF-A 为生理和病理血管发生的关键调节剂。其通过调节内皮细胞的增殖、 迁移 和存活在血管的规格、 形态形成、 分化和体内稳态方面起到重要作用。 ( 参见， 例如， Ferrara 等人， Nat Med 9 ： 669， 2003.)。研究表明 VEGF-A 在多种人肿瘤中高度表达。( 参见， 例如， Ellis 和 Hicklin， Nat.Rev.Cancer 8 ： 579， 2008)。 VEGF-A 表达通过低氧诱导因子 1(HIF-1) 转录因子调节。 ( 参见， 例如， Wang 和 Semenza， J.Biol.Chem.270 ： 1230， 1995)。 肿瘤细胞的 快速增殖和差的血液流动导致肿瘤中的低氧 - 传导性环境， 导致 VEGF-A 的快速上调。( 参 见， 例如， Brahimi-Horn 和 Pouyssegur， Bull.Cancer 93 ： E73， 2006)。
     已描述了由不同的 mRNA 剪接变体编码的 121， 145， 165， 189 或 206 个氨基酸长度 的 5 种人 VEGF-A 亚型 (VEGF-A121-206)， 它们都能刺激内皮细胞的有丝分裂发生。 这些亚型在 生物活性、 受体特异性、 以及对细胞表面及细胞外基质关联的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 ( 该 蛋白聚糖作为 VEGF-A 的低亲和力受体起作用 ) 的亲和力方面不同 ： VEGF-A121 不结合至肝 素或硫酸乙酰肝素 ； VEGF-A145 和 VEGF-A165(GenBank Acc.No.M32977) 都能结合至肝素 ； 而 VEGF-A189 和 VEGF-A206 对肝素和硫酸乙酰肝素显示最强的亲和力。VEGF-A121、 VEGF-A145 和 VEGF-A165 以可溶形式分泌， 尽管大多数 VEGF-A165 仅限制于细胞表面和细胞外基质蛋白聚 糖， 而 VEGF-A189 和 VEGF-A206 保持与细胞外基质相关联。VEGF-A189 和 VEGF-A206 都可通过 被肝素或肝素酶处理释放， 这表明这些亚型是通过蛋白聚糖连接于细胞外基质的。细胞结 合的 VEGF-A189 也可被蛋白酶如纤维蛋白溶酶所裂解， 导致活性可溶的 VEGF-A110 的释放。 人 VEGF-A165 是丰度最高而且是有生物活性的形式， 它的 Asn74 被糖基化， 并且典型地作为 46kDa 的 23kDa 亚单位同型二聚体表达。
     已 鉴 定 出 了 与 VEGF-A 相 互 作 用 的 4 种 细 胞 表 面 受 体。 这 些 包 括 VEGFR-1/ Flt-1(fins 状 酪 氨 酸 激 酶 -1 ； GenBank Acc.No.X51602 ； De Vries 等 人， Science 255 ： 989-991， 1992) ； VEGFR-2/KDR/Flk-1( 包 含 受 体 / 胎 肝 激 酶 -1 的 激 酶 插 入 域 ； GenBank Acc.Nos.X59397(Flk-1) 和 L04947(KDR) ； Terman 等人， Biochem.Biophys.Res.Comm.187 ： 1579-1586， 1992 ； Matthews 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 9026-9030， 1991) ；
     神 经 纤 毛 蛋 白 -1(Gen Bank Acc.No.NM003873)， 和 神 经 纤 毛 蛋 白 -2(Gen Bank Acc. No.NM003872)。VEGF121 和 VEGF165 结 合 VEGFR-1 ； VEGF121、 VEGF145 和 VEGF165 结 合 VEGFR-2 ； VEGF165 结合神经纤毛蛋白 -1 ； 而 VEGF165 和 VEGF145 结合神经纤毛蛋白 -2。( 参见， 例如， Neufeld 等人， FASEB J.13 ： 9-22， 1999 ； Stacker 和 Achen， Growth Factors 17 ： 1-11， 1999 ； Ortega 等 人， Fron.Biosci.4 ： 141-152， 1999 ； Zachary， Intl.J.Biochem.Cell Bio.30 ： 1169-1174， 1998 ； Petrova 等人， Exp.Cell Res.253 ： 117-130， 1999)。
     人们对 VEGF-A 对于几类重要癌症的发生的重要性的认识终于导致了一种人源 化 VEGF-A 单克隆抗体 AVASTINTM 在最近被批准用于与化学治疗联合治疗转移性结肠直 肠癌、 非小细胞肺癌和转移性乳腺癌。( 参见， 例如， Hervitz 等人， N.Engl.J.Med.350 ： 2335-2342， 2004 ； Sandler 等人， N.Engl.J.Med.355 ： 2542-2550， 2006 ； Miller 等人， 2008)。 TM 类似的， LUCENTIS ( 一种人源化单克隆抗体片段 ) 最近被批准用于治疗新生血管 ( 湿型 ) 年龄相关的黄斑变性 (AMD)， 这反映了 VEGF-A 在新生血管性眼病的发病机理中的重要性。
     成纤维细胞生长因子 (FGFs) 为一个肝素结合性生长因子的家族， 在哺乳动物中 具有 22 个家族成员 (FGF1-14， 16-23)。FGF 在多种生物功能如细胞增殖、 分化、 迁移、 血管 发生和肿瘤发生中起重要作用。它们通过结合、 二聚化、 并且活化细胞表面 FGF 受体而发挥 它们的多效生物作用。( 参见， 例如， Eswarakumar 等人 Cytokine Growth Factor Rev.16 ： 139-149， 2005)。哺乳动物中有四种 FGF 受体基因， fgfR1-fgfR4。FGFRs 的细胞外域包含 三个免疫球蛋白状域。FgfR1-FgfR3 的膜近端 Ig 环处的可变剪接产生更多的变体。该环 N- 端的一半由不变的外显子 (IIIa) 编码， 且另外一半由选自称为 IIIb 或 IIIc 的外显子编 码。 FGF 配体和受体的过表达和 FGF 受体中的突变体与许多类型的癌症相关， 所说的 癌症包括前列腺、 乳腺、 卵巢、 膀胱、 结肠直肠、 胰腺、 肝、 肺、 成胶质细胞瘤癌症， 多发性骨髓 瘤和白血病。( 参见例如， Grose 等人， Cytokine Growth Factor Rev.16 ： 179-186， 2005)。 FGF1， 2， 6， 8b， 9 和 17 在前列腺肿瘤组织中过表达， 且 FGF8b 和 17 的表达水平与肿瘤阶段、 级别和预后不良相关 (Dorkin 等人， Oncogene 18 ： 2755-2761， 1999 ； Gnanapragasam 等人， Oncogene 21 ： 5069-5080， 2002 ； Heer 等人， J Pathol.204 ： 578-586.2004)。FGF9 促使前列 腺癌 - 诱导的新骨形成且可参与雄激素受体 - 阴性的前列腺癌在骨中成骨细胞的进展 (Li 等人， J Clin Invest.118 ： 2697-2710， 2008)。FGFR1 和 FGFR4 在前列腺肿瘤组织中过表 达， 且 FGFR2IIIb 至 IIIc 的亚型转换促进前列腺癌起始和进展 (Giri 等人， Clin Cancer Res.5 ： 1063-1071， 1999 ； Wang 等人， Clin.Cancer Res.10 ： 6169-6178， 2004 ； Kwabi-Addo 等 人， Prostate 46 ： 163-172， 2001)。FGF1， 2， 8 在乳腺肿瘤组织中过表达。所有乳腺癌中高 达 8.7％具有 FGFR1 基因扩增， 且该扩增为整体存活率的独立预测因素。FGFR4 过表达与 复发性乳腺癌患者的他莫昔芬治疗失败相关 ( 参见， 例如， Elsheikh 等人， Breast Cancer Res.9， 2007 ； Meijer 等人， Endocrine-Related Cancer 15 ： 101-111， 2008)。FGF1， 8， 9， 18 和 FGFR1IIIc， FGFR2IIIc， FGFR4 在卵巢肿瘤组织中过表达。FGFR3 过表达和激活突变在膀胱 癌的膀胱上皮细胞癌中有报道。在非侵入性、 低等级和阶段的膀胱肿瘤中的 FGFR3 突变与 较高的复发率显著相关。 ( 参见， 例如， Knowles， World J.Urol.25 ： 581-593， 2007)。 FGF-2， FGFR1 和 FGFR2 经常在肺的腺癌和鳞状细胞癌中过表达。FGF-2 信号途径活化可能是鳞状 细胞癌发病的早期现象 (Behrens， 等人， Clin Cancer Res.14 ： 6014-6022， 2008)。
     许多 FGF 家族成员， 包括 FGF1， FGF2， FGF4 和 FGF6， 也具有强的体外和体内促血 管生成活性， 且可通过调节肿瘤血管化而促进肿瘤进展 (Presta 等人， Cytokine Growth Factor Rev.16 ： 159-178， 2005)。在血管发生过程中在 FGF 家族和 VEGF 家族成员之间存 在密切的相互沟通 (cross-talk)。在产生自发性胰腺肿瘤的 Rip1-Tag2 转基因小鼠肿瘤 组织中， 用抗 VEGFR2 单克隆抗体阻断 VEGF 促进缺氧， 并且诱导 FGF1， FGF2 和 FGF7 的表达 (Casanovas 等人， Cancer Cell 8 ： 299-309， 2005)。 FGF 的上调与血管发生的再诱导和逃避 VEGF 阻断同时发生。 该模型中联合抑制 VEGF 和 FGF 信号传递导致进一步的肿瘤抑制， 表明 FGF 信号途径的上调对于 VEGF 靶向性治疗后的逃避机理至少部分有帮助。而且， 在多种小 鼠肿瘤模型 ( 包括 T3M4， Panc1 和 QG56 异种移植模型 ) 中阻断 VEGF 和 FGF 信号显示加和 性的或协同性的抗肿瘤作用 (Ogawa 等人， Cancer Gene Ther.9 ： 633-640， 2002)。最近， 用 泛 VEGFR 酪氨酸激酶抑制剂治疗的成胶质细胞瘤患者的临床研究显示 FGF2 的血清水平在 复发患者中比在响应阶段中的相同患者的水平高， 表明一种类似的涉及 FGF2 上调的补偿 机理 (Batchelor 等人， Cancer Cell 11 ： 83-95， 2007)。
     总之， 上述临床前数据和临床数据支持以下观点， 即阻止 VEGF 和 FGF 信号传递 途径二者的联合治疗在许多实体瘤中比单独的 VEGF 阻断可产生更好的抗肿瘤作用。这 些数据为肿瘤学中靶向这两种途径提供了强有力的概念证明性论据 (proof-of-concept rationale)。阻断这两种途径也可在其它血管发生疾病， 包括 AMD 中提供更好的功效。本 发明提供用于所述这些和其它用途的多特异性蛋白， 在本文的教导下， 其对本领域技术人 员将是显而易见的。 发明内容
     本发明提供双特异性结合蛋白， 其包含减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的抗 体 / 可溶受体双特异性结合蛋白。根据本发明， 该双特异性结合蛋白包含抗 VEGF-A 抗体 (VEGF-A 抗体 ) 部分的 VEGF-A 结合区和 FGF 受体的 FGF 结合部分， 如本文所述。本文所述 的 FGF 结合部分通常为可溶 FGF 受体 (FGFR)。本发明在某些实施方案中提供， 该双特异性 结合蛋白的可溶 FGF 受体部分包含本文所述的 FGFR3 或 FGFR2 的 FGF 受体部分。在其它实 施方案中， Fc 多肽融合至 FGFR 的 C- 端。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分和 VEGF-A 结 合部分为使用肽或多肽接头序列融合的多肽， 并且在这些情况下， 编码所述实施方案的多 核苷酸可表达为单一双特异性结合蛋白。
     本发明还提供， 双特异性结合蛋白的某些实施方案包含本文所述的 VEGF-A 抗体 部分。该 VEGF-A 抗体部分可进一步由本文所述的 scFV 多肽或 VL 和 VH 多肽构成。
     在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 特别是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体 部分， 其为选自以下的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 以及选自以下的 VEGF-A 抗体部分 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6 scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1 scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其为选自以下的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 和选 自以下的 VEGF-A 结合部分 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在其它实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白包括 FGFR3 部分和 VEGF-A 抗体 部分， 其选自 FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375) (S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包括 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其 为 选 自 以 下 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 和 选 自 以 下 的 VEGF-A 结 合 部 分 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6 scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性 抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其为选自以下的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示 的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 和选 自以下的 VEGF-A 结合部分 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在其它方面， 本发明提供使用本文所述的双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白的方 法。在某些实施方案中， 该双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白可给予受试者以治疗以实体 瘤生长为特征的癌症， 如前列腺癌， 乳腺癌， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 成胶质细 胞瘤， 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和胃肠道间质瘤 (GIST)。
     本发明的这些和其它方面在参考以下发明详述和附图后将会是明显的。
     定义
     除非另有定义， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解 的所述方法和组合物的意思相同的意思。如本文所述， 以下术语和短语具有属于它们的意 思， 除非另有所述。
     “多肽” 为通过肽键结合的氨基酸残基的聚合物， 无论天然或合成产生的。少于约 10 个氨基酸残基的多肽通常称为 “肽” 。
     “蛋白质” 为包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可包含非肽组分， 如碳水 化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可通过产生蛋白质的细胞添加至蛋白质， 且将随着细胞的类型而改变。蛋白质在此根据它们的氨基酸主链结构定义 ； 取代基如碳水化合 物基团通常没有规定， 但仍然可存在。
     术语 “氨基 - 端” 和 “羧基 - 端” 在本文使用以表示多肽中的位置。当上下文允许 时， 这些术语用于以具体的多肽序列或的部分为参考表示近似或相关的位置。 例如， 位于多 肽中相关序列的羧基 - 端的某一序列是与该相关序列的羧基端相邻， 而不一定位于完整多 肽的羧基端。
     如本文所述， “核酸” 或 “核酸分子” 是指多核苷酸， 如脱氧核糖核酸 (DNA) 或核糖 核酸 (RNA)， 寡核苷酸， 聚合酶链反应 (PCR) 产生的片段， 和连接、 分裂、 核酸内切酶作用， 和 核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可由单体构成， 该单体为天然存在的核 苷酸 ( 如 DNA 和 RNA)， 或天然存在的核苷酸的类似物 ( 例如， 天然存在的核苷酸的 α- 对 映体形式 )， 或两者的组合。修饰的核苷酸可在糖部分和 / 或嘧啶或嘌呤碱基部分具有 变化。糖修饰包括， 例如， 用卤素、 烃基、 胺和叠氮基代替一个或多个羟基， 或糖可官能化 为醚或酯。而且， 整个糖部分可用立体上和电子上类似的结构， 如氮杂 - 糖和碳环的糖类 似物代替。碱基部分的修饰的实例包括烃基化嘌呤和嘧啶、 酰基化嘌呤或嘧啶， 或其它众 所周知的杂环的代替物。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯 键的类似物包括硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 硒代磷酸酯， 硒代磷酸酯， 苯胺基硫代磷酸酯 (phosphoroanilothioate)， 苯胺基磷酸酯 (phosphoranilidate)， 氨基磷酸酯， 等。 术语 “核 酸分子” 也包括所谓的 “肽核酸” ， 其包括连接至聚酰胺主链的天然存在的或修饰的核酸碱 基。核酸可为单链或双链。
     如本文所述， 术语 “拮抗剂” 表示在某个生物环境中减少另一化合物的活性的化合 物。例如， VEGF-A 拮抗剂为减少 VEGF-A 的生物活性的化合物， 且 FGFR 拮抗剂为减少 FGF 的生物活性的化合物。因为 VEGF-A 和 FGF 两者的活性取决于多种分子 ( 包括配体、 受体和 信号转导物 ) 的相互作用， 拮抗剂可通过直接作用于 VEGF-A 或 FGF， 或通过作用于同源生 物途径中的另一分子来减少活性。例如， FGF 拮抗剂可通过以下方式减少 FGF 活性， 例如， 通过结合至受体本身， 通过结合至其配体之一， 通过干扰受体二聚体化， 或通过干扰受体磷 酸化。拮抗剂包括但不限于抗体、 可溶受体、 和结合至配体或其受体， 或以其他方式干扰配 体 - 受体相互作用和 / 或其它受体功能的非蛋白质化合物。
     术语″受体″表示细胞相关的蛋白质， 其结合至生物活性分子 ( 即， 配体 ) 且介导 配体对细胞的作用。膜结合的受体以多域或多肽结构为特征， 其包含细胞外配体 - 结合域 和通常在信号转导中涉及的细胞内效应物结构域。配体与受体的结合导致受体中构象变 化， 导致效应物结构域和细胞中其它分子的相互作用。该相互作用进而导致细胞中代谢变 化。 与受体 - 配体相互作用相关的代谢事件包括基因转录、 磷酸化、 脱磷酸化、 环状 AMP 产生 的增加、 细胞钙动员、 膜脂质动员、 细胞粘附、 肌醇脂质的水解和磷脂的水解。通常， 受体可 为膜结合的、 可溶的或核内的 ； 单体的 ( 例如， 甲状腺刺激激素受体， β- 肾上腺素能受体 ) 或多聚体的 ( 例如， PDGF 受体、 生长激素受体、 IL-3 受体、 GM-CSF 受体、 G-CSF 受体、 红细胞 生成素受体和 IL-6 受体 )。
     “可溶受体” 是不结合于细胞膜的受体多肽。最常见的情况下， 可溶受体是缺乏跨 膜和胞浆域的配体 - 结合受体多肽。可溶受体可包括另外的氨基酸残基， 如提供多肽的纯 化或提供用于多肽连接至底物的位点的亲和标签。 许多细胞表面受体具有天然存在的可溶对应物， 它们是通过蛋白水解产生或从可变剪接的 mRNAs 翻译的。当受体多肽分别缺少跨 膜和细胞内多肽区段的足够部分以提供膜锚定或信号转导时， 称该受体多肽基本上没有跨 膜和细胞内多肽区段。
     如本文所述， 术语″ Fc- 融合蛋白″表示兼具异源蛋白质的结合特异性与免疫球 蛋白恒定域的效应物作用的抗体状分子。结构上， Fc- 融合蛋白包含具有所需结合特异性 的氨基酸序列 ( 其不同于抗体的抗原识别和结合位点 ( 即， 为″异源的″ ))， 和免疫球蛋白 恒定域序列的融合。Fc- 融合蛋白分子通常包括连续氨基酸序列， 其至少包含受体或配体 的结合位点。Fc- 融合蛋白中的免疫球蛋白恒定域序列可获自任何免疫球蛋白， 如 IgG-1， IgG-2， IgG-3， 或 IgG-4 亚型， IgA( 包括 IgA-1 和 IgA-2)， IgE， IgD 或 IgM。例如， 根据本发 明可用的 Fc- 融合蛋白为包含 FGFR3 受体的 FGF 结合部分而没有 FGFR3 受体的跨膜或细胞 质序列的多肽。在一个实施方案中， FGFR3 的细胞外域融合至免疫球蛋白序列的恒定域。
     术语 “抗体” 在本文使用是指机体响应抗原的存在而产生的、 结合至抗原的蛋白 质， 及其抗原 - 结合片段和工程化变体。因此， 术语 “抗体” 和 “抗体” 包括多克隆抗体、 亲 和纯化的多克隆抗体、 单克隆抗体、 和抗原 - 结合抗体片段， 如 F(ab’ )2 和 Fab 片段。遗传 工程完整的抗体和片段， 如嵌合抗体、 人源化抗体、 单链 Fv 片段、 单链抗体、 双抗体、 迷你抗 体、 线性抗体、 多价或多特异性杂合抗体等也包括在内。因此， 术语 “抗体” 可广义地用于包 括任何包含抗体的抗原结合位点且能结合至其抗原的蛋白质。 术语 “遗传工程抗体” 是指以下抗体， 其中氨基酸序列在天然抗体的氨基酸序列的 基础上被改变。因为重组 DNA 技术在抗体产生中的重要性， 不必限制为在天然抗体发现中 的氨基酸序列 ； 可重新设计抗体以得到所需特征。 可能的变化非常多， 可从仅改变一个或一 些氨基酸到例如可变区或恒定区的完全重新设计。通常， 对恒定区进行改变以改善或改变 如补体结合、 与细胞的相互作用和其它效应物作用等特征。 通常， 将对可变区进行变化以改 善抗原结合特征、 改善可变区稳定性、 或减少免疫原性风险。
     “抗体的抗原结合位点” 为抗体的足以结合至其抗原的部分。最小的该区通常 为可变域或其遗传工程变体。单域结合位点可产生自骆驼抗体 ( 参见 Muyldermans 和 Lauwereys， J.Mol.Recog.12 ： 131-140， 1999 ； Nguyen 等 人， EMBO J.19 ： 921-930， 2000) 或 其它物种的 VH 域以产生单域抗体 (“dAbs” ； 参见 Ward 等人， Nature 341 ： 544-546， 1989 ； 美国专利 No.6,248,516 to Winter 等人 )。在某些变化中， 抗原结合位点为仅具有 2 个天 然或非天然 ( 例如， 诱变处理的 ) 存在的重链可变域或轻链可变域， 或其组合的互补决定 区 (CDR) 的多肽区 ( 参见， 例如， Pessi 等人， Nature 362 ： 367-369， 1993 ； Qiu 等人， Nature Biotechnol.25 ： 921-929， 2007)。更一般的， 抗体的抗原结合位点包含结合至相同表位的 重链可变域和轻链可变域两者。在本发明中， “包含抗体的抗原结合位点” 的分子可进一步 包含一个或多个抗体的第二抗原结合位点 ( 其可结合至相同或不同表位或相同或不同抗 原 )， 肽接头， 免疫球蛋白恒定域， 免疫球蛋白铰链， 两亲性螺旋 ( 参见 Pack 和 Pluckthun， Biochem.31 ： 1579-1584， 1992)， 非 肽 接 头， 寡 核 苷 酸 ( 参 见 Chaudri 等 人， FEBSLetters 450 ： 23-26， 1999) 等， 且可为单体或多聚蛋白质。包含抗体的抗原结合位点的分子的实 例是本领域已知的， 包括例如 Fv 片段， 单链 Fv 片段 (scFv)， Fab 片段， 双抗体， 迷你抗体， Fab-scFv 融合物， 双特异性 (scFv)4-IgG， 和双特异性 (scFv)2-Fab。( 参见， 例如， Hu 等人， Cancer Res.56 ： 3055-3061， 1996 ； Atwell 等 人， Molecular Immunology 33 ： 1301-1312，
     1996 ； Carter 和 Merchant， Curr.Opin.Biotechnol.8 ： 449-454， 1997 ； Zuo 等 人， Protein Engineering 13 ： 361-367， 2000 ； and Lu 等人， J.Immunol.Methods 267 ： 213-226， 2002)。
     如本文所述， 术语 “免疫球蛋白” 是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码 的多肽组成的蛋白质。 免疫球蛋白的一种形式构成抗体的基本结构单位。 该形式为四聚物， 且由两个相同的免疫球蛋白链对组成， 每个对具有一个轻链和一个重链。在每个对中， 轻 链和重链可变区一起负责结合至抗原， 且恒定区负责抗体效应物作用。免疫球蛋白通常在 脊椎动物生物中作为抗体起作用。已在高等脊椎动物中鉴定出五种免疫球蛋白 (IgG， IgA， IgM， IgD 和 IgE)。IgG 是主要的种类 ； 它通常作为血浆中第二丰富的蛋白质存在。在人中， IgG 由四个亚类组成， 称为 IgG1， IgG2， IgG3 和 IgG4。IgG 类的重链恒定区用希腊字母 γ 标识。例如， IgG1 亚类的免疫球蛋白包含 γ1 重链恒定区。各个免疫球蛋白重链具有由恒 定区蛋白质域 (CH1， 铰链， CH2， 和 CH3 ； IgG3 也包含 CH4 域 ) 组成的恒定区， 该恒定区蛋白质 域基本上为物种的给定亚类的变体。编码人和非人免疫球蛋白链的 DNA 序列是本领域已知 的。 ( 参见， 例如， Ellison 等人， DNA 1 ： 11-18， 1981 ； Ellison 等人， Nucleic Acids Res.10 ： 4071-4079， 1982 ； Kenten 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79 ： 6661-6665， 1982 ； Seno 等人， Nuc.Acids Res.11 ： 719-726， 1983 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323-327， 1988 ； Amster 等 人， Nuc.Acids Res.8 ： 2055-2065， 1980 ； Rusconi and Kohler， Nature 314 ： 330-334， 1985 ； Boss 等 人， Nuc.Acids Res.12 ： 3791-3806， 1984 ； Bothwell 等 人， Nature 298 ： 380-382， 1982 ； van der Loo 等 人， Immunogenetics 42 ： 333-341， 1995 ； Karlin 等 人， J.Mol. Evol.22 ： 195-208， 1985 ； Kindsvogel 等人， DNA 1 ： 335-343， 1982 ； Breiner 等人， 基因 18 ： 165-174， 1982 ； Kondo 等 人， Eur.J.Immunol.23 ： 245-249， 1993 ； and GenBank Accession No.J00228)。 关于免疫球蛋白结构和功能的综述可参见 Putnam， The Plasma Proteins， Vol V， Academic Press， Inc.， 49-140， 1987 ； 和 Padlan， Mol.Immunol.31 ： 169-217， 1994。术语 “免疫球蛋白” 在此使用为其一般意思， 表示完整抗体， 其组成链， 或链的片段， 依上下文而 定。
     全长免疫球蛋白 “轻链” ( 约 25Kd 或 214 个氨基酸 ) 由 NH2- 端的可变区基因 ( 编码 约 110 个氨基酸 ) 和 COOH- 端的 κ 或 λ 恒定区基因所编码。全长免疫球蛋白 “重链” (约 50Kd 或 446 个氨基酸 ) 由可变区基因 ( 编码约 116 个氨基酸 ) 和 γ， μ， α， δ， 或ε恒 定区基因 ( 编码约 330 个氨基酸 ) 编码， 后者分别定义抗体的同种型为 IgG， IgM， IgA， IgD， 或 IgE。在轻链和重链中， 可变区和恒定区通过约 12 或更多个氨基酸的 “J” 区连接， 且重链 还包括约 10 个或更多氨基酸的 “D” 区。( 通常参见 Fundamental Immunology(Paul， ed.， Raven Press， N.Y.， 2nd ed.1989)， Ch.7)。
     免疫球蛋白 “Fv” 片段包含重链可变域 (VH) 和轻链可变域 (VL)， 二者通过非共价相 互作用保持在一起。因此免疫球蛋白 Fv 片段包含单一抗原结合位点。Fv 片段的二聚结构 可进一步通过突变发生引入二硫键而稳定化。( 参见 Almog 等人， Proteins 31 ： 128-138， 1998.)
     如本文所述， 术语 “单链 Fv” 和 “单链抗体” 是指这样的抗体片段， 其在单一多肽链 中包含重链和轻链两者的可变区， 但缺乏恒定区。通常， 单链抗体进一步包含 VH 和 VL 域之 间的多肽接头， 其使得单链抗体能够形成允许抗原结合的所需结构。 单链抗体详细讨论于， 例如， Pluckthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies， vol.113(Rosenburg 和Moore eds.， Springer-Verlag， New York， 1994)， pp.269-315。( 也参见 WIPO Publication WO 88/01649 ； U.S.Patent Nos.4,946,778 和 5,260,203 ； Bird 等 人， Science 242 ： 423-426， 1988)。单链抗体也可为双特异性的和 / 或人源化的。
     “Fab 片段” 包含一个轻链以及一个重链的 CH1 和可变区。Fab 片段的重链不能与 另一重链分子形成二硫键。
     “Fab’ 片段” 包含一个轻链和一个重链， 所述重链还包含 CH1 和 CH2 域之间的恒定 区部分， 以使两个重链之间能够形成链间的二硫键而形成 F(ab’ )2 分子。
     “F(ab’ )2 片段” 包含两个轻链和含一部分 CH1 和 CH2 域之间的恒定区的两个重链， 以使两个重链之间形成链间二硫键。
     免疫球蛋白 “Fc 片段” ( 或 Fc 域 ) 为抗体中负责结合至细胞上的抗体受体和补体 的 C1q 组分的部分。Fc 代表 “片段结晶” ， 即容易形成蛋白质晶体的抗体的片段。独特的蛋 白质片段 ( 最初基于蛋白水解消化描述 ) 可定义免疫球蛋白的总体一般结构。如文献中最 初定义的， Fc 片段由二硫键连接的重链铰链区、 CH2 和 CH3 域组成。然而， 后来该术语被用于 指由下述部分组成的单链 ： CH3、 CH2、 和至少一部分铰链， 其中所述铰链的至少一部分足以与 另一条这样的链形成二硫键连接的二聚物。免疫球蛋白结构和功能的综述可参见 Putnam， The Plasma Proteins， Vol.V(Academic Press， Inc.， 1987)， pp.49-140 ； and Padlan， Mol. Immunol.31 ： 169-217， 1994。如本文所述， 术语 Fc 包括天然存在的序列的变体。 免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区间断的 “框架” 区组成。因此， 术 语 “高变区” 是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。该高变区包含来自 “互补决定区” 或 “CDR”的氨基酸残基 ( 例如， 在人中， 轻链可变域中的残基 24-34(L1)， 50-56(L2)， 和 89-97(L3)， 和重链可变域中的残基 31-35(H1)， 50-65(H2) 和 95-102(H3)( 氨基酸序列号基 于 EU 索引 ； 参见 Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5th Ed.Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， Md.(1991)) 和 / 或那些来自 “高变环 (loop)” 的残基 ( 在人中， 轻链可变域中的残基 26-32(L1)， 50-52(L2) 和 91-96(L3)， 和重链可变域中的 26-32(H1)， 53-55(H2) 和 96-101(H3) ； Chothia 和 Lesk， J.Mol.Biol.196 ： 901-917， 1987)( 兹将上述文献引入并入本文 )。 “框架区” 或 “FR” 残基 为除在此定义的高变区残基之外的那些的可变域残基。 不同轻链或重链的框架区的序列在 一个物种中相对保守。因此， “人框架区” 为基本上等同于 ( 约 85％或更多， 通常 90-95％ 或更多 ) 天然存在的人免疫球蛋白的框架区的框架区。抗体的框架区 ( 其为组分轻链和重 链的框架区的总体 ) 起到定位和对准 CDR 的作用。该 CDR 主要负责对抗原表位的结合。VL 域的 CDR L1、 L2 和 L3 在这里也分别称为 LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 ； VH 域的 CDR H1、 H2 和 H3 在这里也分别称为 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3。
     “嵌合抗体” 是这样的抗体， 其轻链和重链基因是从属于不同物种的免疫球蛋白可 变区和恒定区基因构建的 ( 典型地通过基因工程 )。 例如， 可以把小鼠单克隆抗体的基因的 可变区段连接于编码人恒定区的区段 ( 例如， 人 γ1 或 γ3 重链基因， 和人 κ 轻链基因 )。 因 此， 治疗嵌合抗体是一种杂合蛋白， 通常由小鼠抗体的可变域或抗原 - 结合域以及人抗体 的恒定域构成， 但也可使用其它哺乳动物物种。具体地， 嵌合抗体通过重组 DNA 技术制备， 其中用免疫球蛋白轻链、 重链或两者的铰链和恒定区的全部或部分代替另一动物的免疫球 蛋白轻链或重链的相应区域。这样， 亲本单克隆抗体的抗原 - 结合部分被嫁接到另一物种
     的抗体的骨架上。任选地可以通过替换暴露的残基来用类人表面 (human-like surface) 来 “遮掩” (cloak) 嵌合抗体， 其结果获得 “表面装饰的抗体” (veneered antibody)。
     如本文所述， 术语 “人抗体” 包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体， 且包括 从人免疫球蛋白库或从这样的动物分离的抗体 ： 该动物转入了一种或多种人免疫球蛋白基 因且不表达内源性免疫球蛋白， 这样的动物描述于例如 Kucherlapati 等人的美国专利号 5,939,598。
     术语 “人源化免疫球蛋白” 是指包含人框架区和源自非人 ( 例如， 小鼠或大鼠 ) 免 疫球蛋白的一个或多个 CDR 的免疫球蛋白。提供 CDR 的非人免疫球蛋白称为 “供者” ， 而提 供框架的人免疫球蛋白称为 “受者” 。 恒定区不需要存在， 但如果存在的话， 它们必须基本上 相同于人免疫球蛋白恒定区， 即， 至少约 85-90％， 优选约 95％或更多的相同。因此， 人源化 免疫球蛋白的所有部分， 除了可能的 CDR， 都基本上相同于天然人免疫球蛋白序列的对应部 分。在一些情况下， 人源化抗体可在人可变区框架域内保持非人残基以增强适当的结合特 征 ( 例如， 当抗体被人源化时可能需要框架中的突变以保留结合亲和力 )。 “人源化抗体” 为 包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如， 人源化抗体不会涵盖如上定义的 典型嵌合抗体， 因为， 例如， 嵌合抗体的整个可变区都是非人的。
     “双特异性抗体” 或 “双功能抗体” 为具有两个不同的重 / 轻链对和两个不同的结合 位点的杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法制备， 包括但不限于杂交瘤的融合或 Fab’ 片段的连接。 参见， 例如， Songsivilai & Lachmann， Clin.Exp.Immunol.79 ： 315-321， 1990 ； Kostelny 等人， J.Immunol.148 ： 1547-1553， 1992。
     “二价抗体” 不同于 “多特异性” 或 “多功能” 抗体， 在某些实施方案中， 为包含两个 具有相同抗原特异性的结合位点的抗体。
     术语 “双抗体” 是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段， 这样的片段在同一多肽 链 (VH-VL) 中包含连接至轻链可变域 (VL) 的重链可变域 (VH)。通过使用太短而不允许在相 同链上的两个域之间配对的接头， 各个域被强迫与另一链的互补域配对， 产生两个抗原结 合位点。双抗体更详细描述于， 例如， EP 404,097 ； WO 93/11161 ； 和 Hollinger 等人， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 6444-6448， 1993。
     术语 “迷你抗体” 在此是指仅编码天然或非天然 ( 例如， 经诱变处理的 ) 存在的 重链可变域或轻链可变域的 2 个互补决定区 (CDR)， 或其组合的多肽。迷你抗体的实例描 述于， 例如， Pessi 等人， Nature 362 ： 367-369， 1993 ； 和 Qiu 等人， Nature Biotechnol.25 ： 921-929， 2007。
     术语 “线性抗体” 是指 Zapata 等人， Protein Eng.8 ： 1057-1062， 1995 描述的抗体。 简言之， 这些抗体包含一对串联 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)， 形成一对抗原结合区。线性抗体可 为双特异性的或单特异性的。
     本文使用的术语 “单克隆抗体” 不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语 “单克 隆抗体” 是指衍生自单一克隆的抗体， 包括任何真核、 原核、 或噬菌体克隆， 而非其制备的方 法。
     本文使用的术语 “亲本抗体” 是指通过用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。 优 选地， 该亲本抗体具有人框架区， 且如果存在的话， 具有人抗体恒定区。 例如， 该亲本抗体可 为人源化的或人抗体。“变体” 抗 VEGF-A 抗体， 在此是指由于在在亲本抗体序列中添加、 缺失和 / 或取代 一个或多个氨基酸残基而与 “亲本” 抗 VEGF-A 抗体氨基酸序列的氨基酸序列不同的分子。 在优选的实施方案中， 该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中包含一个或多个氨基酸取 代。例如， 该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中可包含约 1 至约 10 个， 优选约 2 至约 5 个取代。 通常， 该变体具有这样的氨基酸序列， 其与亲本抗体重链或轻链可变域序列具有至 少 75％的氨基酸序列同一性， 更优选至少 80％， 更优选至少 85％， 更优选至少 90％， 且最优 选至少 95％的氨基酸序列同一性。相对于该序列的同一性或同源性在在此定义为， 在比对 序列并引入缺口 ( 如果必要的话 ) 以达到最大百分比序列同一性后， 候补序列中与亲本抗 体残基相同的氨基酸残基的百分比。N- 端、 C- 端、 或内部延伸、 缺失、 或插入抗体序列中都 不应解释为影响序列同一性或同源性。该变体保持结合人 VEGF-A 的能力， 且优选具有优于 亲本受者或抗体的性质。例如， 该变体可具有更强的结合亲和力、 增强的抑制 VEGF-A- 诱导 的生物活性 ( 例如血管发生或增殖 ) 的能力。为分析这样的性质， 人们应将变体的 Fab 形 式与亲本抗体的 Fab 形式， 或变体的全长形式与亲本抗体的全长形式进行比较， 例如， 因为 已发现在本文公开的生物活性测试中抗 VEGF-A 抗体的形式影响其活性。本文特别感兴趣 的变体抗体为当与亲本抗体相比， 显示约至少 3 倍， 5 倍， 10 倍， 20 倍， 或 50 倍的生物活性增 强的抗体。
     术语 “表位” 包括任何能特异结合至免疫球蛋白或 T- 细胞受体的蛋白质决定簇。 表位决定簇通常由化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链组成， 且通常具有特定的三维结 构特征， 以及特定的电荷特征。更具体地， 本文使用的术语 “VEGF-A 表位” 是指 VEGF-A 多 肽的在动物、 优选哺乳动物、 最优选小鼠或人中具有抗原性或免疫原性活性的部分。 具有免 疫原性活性的表位是 VEGF-A 多肽的可引发动物抗体应答的部分。具有抗原活性的表位是 VEGF-A 多肽中被抗体免疫特异性结合 ( 通过任何本领域众所周知的方法测定的， 例如通过 免疫测试测定的 ) 的部分。抗原性表位不一定是免疫原性的。
     “载体 (vector)” 是这样的核酸分子， 如质粒、 粘粒、 或噬菌体， 其具有在宿主细胞 中自主复制的能力。克隆载体通常包含一个或少数个限制核酸内切酶识别位点 ( 其允许以 可确定的方式插入核酸分子而不丧失载体的必需生物功能 )， 以及编码适用于鉴别和选择 克隆载体转化的细胞的标记基因的核苷酸序列。 标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄 青霉素抗性的基因。
     “表达载体” 是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常， 表达载体包括转 录启动子、 基因和转录终止子。通常将基因表达置于启动子的控制下， 这样的基因被称为 “可操作连接” 于启动子。同样， 如果调节元件调节核心启动子的活性， 则调节元件和核心启 动子是可操作连接的。
     术语 “表达” 是指基因产物的生物合成。例如， 在结构基因的情况下， 表达包括将 结构基因转录为 mRNA 和将 mRNA 翻译为一个或多个多肽。
     关于本文所述的蛋白质， 称 “与 SEQ ID NO 规定的氨基酸残基对应的氨基酸残基” 包括这些残基的翻译后修饰物。
     术语 “新血管形成” 和 “血管发生” 在此可互换使用。新血管形成和血管发生是指 新血管在细胞、 组织或器官中的生成。 血管发生的控制通常在某些疾病状态中改变， 而且在 许多情况下， 与疾病相关的病理损害与血管发生改变的不受调节的相关。 持续性的、 不受调节的血管发生在多种疾病状态 ( 包括那些以内皮细胞的异常生长为特征的疾病 ) 中发生， 且支持在这些症状 ( 包括血管的泄漏和渗透 ) 中观察到的病理损害。
     本文使用的术语 “新生血管疾患” 是指任何具有如下所述的病理的疾病或疾患， 所 述的病理至少部分地由增加的或不受调节的血管发生活性所介导。 这样的疾病或疾患的实 例包括各种癌症， 包括实体瘤 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及某些涉及新血管形成的眼病 (“新生血管性眼病” )。 该疾病或障碍特别适于某些抑制血管发生的治疗方法， 如本文进一步描述的。
     术语 “有效量” ， 在通过向本文所述的受试者给药 FGFR 和 / 或 VEGF-A 拮抗剂治疗 新生血管疾病的背景下， 是指该药物的量， 其足以抑制受试者的血管发生以抑制一种或多 种新生血管疾病的发生或改善所述疾病的症状。有效量的药剂根据本发明方法以 “有效方 案” 给药。术语 “有效方案” 是指足以实现治疗或预防疾病或疾患的给药的量和剂量频率的 组合。
     术语 “患者” 或 “受试者” ， 在治疗本文所述疾病或障碍的背景下， 包括哺乳动物， 例 如， 人和其它灵长类。该术语还包括家养动物， 例如， 牛， 猪， 羊， 马， 狗和猫。
     如果当将两个氨基酸序列以最大对应性比对时， 两个氨基酸序列的氨基酸残基相 同， 则两个氨基酸序列具有 “100％氨基酸序列同一性” 。类似的， 如果当以最大对应性比对 时两个核苷酸序列的核苷酸残基相同， 则两个核苷酸序列具有 “100％核苷酸序列同一性” 。 序列比较可使用标准软件程序 ( 如包括在 LASERGENE 生物信息学计算程序组中的程序， 由 DNASTAR(Madison， Wisconsin) 出品 ) 来进行。 其它用于通过确定最佳比对来比较两种核苷 酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Peruski 和 Peruski， The Internet and the New Biology ： Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press， Inc.1997) ； Wu 等人 (eds.)“ ，Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins， ” Methods in Gene Biotechnology 123-151(CRC Press， Inc.1997) ； Bishop(ed.)， Guide to Human Genome Computing(2nd ed.， Academic Press， Inc.1998))。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对彼此具有至少 80 ％， 至少 90 ％， 或至少 95％序列同一性， 则两个核苷酸或氨基酸序列认为是具有 “基本上类似的序列同一性” 或 “基本上序列同一性” 。
     百分比序列同一性通过常规方法测定。参见， 例如， Altschul 等人， Bull.Math. Bio.48 ： 603， 1986， 和 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1992。 例如， 可比对两个氨基酸序列以优化排列得分， 其使用的缺口形成罚分 (gap opening penalty) 为 10， 缺 口 延 伸 罚 分 (gap extension penalty) 为 1， 和 上 文 的 Henikoff 和 Henikoff 的 “BLOSUM62” 评分矩阵， 如表 1 所示 ( 氨基酸通过标准单字母代码表示 )。然后 百分比同一性如下计算 ： ([ 相同匹配的总数 ]/[ 较长序列的长度加上引入较长序列以比对 该两个序列的缺口数 ])(100)。
     表1： BLOSUM62 评分矩阵
     本领域技术人员理解存在许多已建立的算法以比对两个氨基酸序列。该 Pearson 和 Lipman 的 “FASTA” 相似性搜索算法是用于检测本文公开的氨基酸序列和第二氨基酸 序列所享有的同一性水平的合适的蛋白质比对方法。该 FASTA 算法描述于 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988， 和 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990。简言之， FASTA 首先表征序列相似性， 其方法是鉴别查询序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 2 的残基 25-266) 与测试序列共享的如下所述的区域， 它们或者具有最高的同一性密度 ( 如 果 ktup 变量为 1) 或最高的同一性成对数 ( 如果 ktup ＝ 2))， 不考虑保守氨基酸置换、 插 入、 或缺失。然后对具有最高同一性密度的 10 个区重新评分， 方法是使用氨基酸置换矩阵 比较所有成对的氨基酸的相似性， 再 “修剪” 区的末端以仅包括那些对最高评分有贡献的 残基。如果存在多个分数大于 “截断” 值 ( 基于序列长度和 ktup 值通过预定的公式计算 ) 的区， 则检查被修剪的起始区以确定这些区域能够被连接起来形成近似的带有缺口的比 对。最后， 将两个氨基酸序列的最高的得分区使用修饰的 Needleman-Wunsch-Sellers 算法 对准 (Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 444， 1970 ； Sellers， SIAM J.Appl.Math.26 ： 787， 1974)， 这种算法允许氨基酸插入和缺失。FASTA 分析的例示的参数为 ： ktup ＝ 1， 缺 口形成罚分＝ 10， 缺口延伸罚分＝ 1， 且置换矩阵＝ BLOSUM62。可通过修改评分矩阵文件 (“SMATRIX” ) 将这些参数引入 FASTA 程序， 如 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990 的附 件 2 所述。
     FASTA 也可用于测定核酸分子的序列同一性， 使用以上公开的比例。 对于核苷酸序 列比较， ktup 值范围可为 1 至 6， 优选 3 至 6， 最优选 3， 其它参数如上设定。
     附图简述
     图 1A-1C 描述某些免疫球蛋白 Fc 多肽的氨基酸序列。氨基酸序列数基于 EU 索 引 (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest， US Department of Health and Human Services， NIH， Bethesda， 1991)。阐述的序列包括野生型人序列 (“wt” ； SEQ ID NO ： 75) 和 5 个变体序列， 称为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， Fc4(SEQ ID NO ： 77)， Fc5(SEQ ID NO ： 74)， Fc6(SEQ ID NO ： 78)， 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。通常在与轻链恒 定区 (LC) 和重链恒定区 (HC) 的二硫键键合中涉及的 Cys 残基被标示出来。 “.” 表示与在 该位置的野生型的同一性。*** 表示终止密码子 ； C- 端 Lys 残基已从 Fc6 去除。示出了铰 链、 CH2 和 CH3 域的边界。
     图 2 描述了四价、 双特异性抗体 / 可溶受体组合， 其对两个不同的靶 ( 在此称为 αVEGF-A 和 FGFR 的配体结合域 ) 具有特异性。
     图 3 描 述 显 示 对 FGF-9- 刺 激 的 成 骨 细 胞 增 殖 的 可 变 抑 制 的 FGFR-Fc(R&D Systems)。
     图 4A 描 述 FGFR-Fc 构 建 体 (ZymoGenetics) 抑 制 FGF-9- 刺 激 的 增 殖。 全 长 FGFR3-Fc 野生型和突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50 ； 图 4B 描述截短的 FGFR3-Fc 突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     图 5A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-8b 的直接结合， 图 5B 描述 FGFR-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-8b 的直接结合。
     图 6A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-17 的直接结合， 图 6B 描述 FGFR2-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 7 描述 FGFR3-Fc 构建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 8A 描述 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细胞的生长， 图 8B 描述 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞 的生长。
     图 9 描述 FGF 受体家族的第二和第三 Ig 样域。
     发明描述
     I. 概述
     本发明通过提供新蛋白质， 即多特异性结合蛋白， 特别是双特异性结合蛋白， 解决 了本领域对于提供更多治疗剂以治疗癌症， 特别是实体瘤的需求。所述蛋白质包含与抗体 部分融合的可溶受体部分。如本文所述， 术语 “双特异性结合蛋白” 是指能通过至少两种具 有不同结合特异性的结合部分特异结合至少两种不同的靶分子的蛋白质。 该结合部分可以 是例如蛋白质 ( 例如， 抗体或可溶受体 ) 或小分子。 双特异性结合蛋白的结合部分可以是物 理连接的。如本文所述的本发明提供包含可溶受体部分和抗体部分的双特异性结合蛋白。
     在本发明中， 可溶的受体部分包含可溶的 FGF 受体或其部分， 而抗体部分包含 VEGF-A 抗体或其部分， 如本文所述。在某些实施方案中， 双特异性结合蛋白的两个或多个 不同的部分通过接头连接以形成多聚物 ( 例如， 二聚物 )。例如， 在包含至少两个多肽部分 ( 例如， 可溶 FGF 受体和 VEGF-A 抗体 ) 的融合的双特异性结合蛋白的情况下， 可利用肽接头 序列来分隔， 例如， 多肽组分， 将它们分隔成足以保证各多肽折叠为其二级和三级结构的距 离。
     在某些实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白减少 FGF 和 VEGF-A 两者的生物活 性。具体地， 本发明提供 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂， 特别是中和性抗 VEGF-A 抗体与 FGF 可溶受体的组合， 其减少通过 VEGF-A 受体和 FGF 受体的信号传递。使用这样的拮抗剂减少经由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可用于治疗多种具有至少部分以新血管形成为特征的病 理的疾病。例如， 在肿瘤中和肿瘤周围抑制藉由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可减少 肿瘤形成血管、 生长和转移的能力。
     FGF 受体的活化可活化多种信号转导途径， 包括磷脂酶 C、 磷脂酰肌醇 3- 激酶、 促分裂原活化的蛋白质激酶、 以及转录的信号转导物和活化剂 (STAT) 途径， 这些途径都 在前列腺癌进展中起作用。FGF 信号传导增加的净结果包括增强的增殖、 对细胞死亡的抗 性、 增加的活动力和侵袭力、 增加的血管发生、 增强的转移、 对化疗和放射的抗性和雄激素 非依赖性等， 这些都可增强肿瘤进展和临床侵占性。FGF 受体和 / 或 FGF 信号传导可直 接影响肿瘤细胞， 也可影响肿瘤血管发生 (Kwabi-Addo 等人， Endocrine-Related Cancer 11(4)709-724， 2004)。
     本发明提供减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂。该 FGF- 结合部分为可溶 FGF 受体 (FGFR) 且 VEGF-A- 结合部分为 VEGF-A 抗体。根据本发明， 该 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂为特异结合且减少 VEGF-A 和 FGF 活性的双特异性抗体 / 可溶受体 结合蛋白。本发明的双特异性结合蛋白在此详细描述。
     II.FGF 受体， 抗 VEGF-A 抗体， 和相关双特异性结合组合物
     A.FGF 受体
     该分子的 FGFR 部分为可溶受体。该 FGFR 包含三个 Ig 样域， 称为 D1， D2 和 D3。该 受体可包含 FGF 受体的 D1， D2， D3， 或可包含 D2， D3 而没有 D1。而且， 该受体可为天然受体 或在 D2-D3 区具有突变。该 FGFR 家族和域 D2 和 D3 示于图 1。
     已证实 D1 的截短可增加受体的亲和力和增强受体 / 配体相互作用 (Olsen 等人 PNAS 101 ： 935-940， 2004)。已知 FGFR1-3 由于在 D3 的羧基端的可变剪接而具有多个同种 型。从该知识出发， 本发明者制成了多种具有三个或两个 Ig 样域的变体可溶 FGF 受体， 且 表征了它们对 FGF 配体的结合亲和力。该 FGFR3 和 FGFR2 同种型 IIIc 是特别令人感兴趣 的， 因为它们比相应的 IIb 同种型对 FGF 2， 6， 8b， 9 和 17 具有更高的亲和力。
     FGF 受体可以基于它们对 FGF 配体的结合亲和力来定性。对给定的相互作用， 测 -1 -1 -1 量结合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s ))。结合速率常数是反映配体 - 受体 复合物形成速率的值。解离速率常数是反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常 表示为平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是将解离速率常数除以结合速 率常数 (kd/ka) 而获得， 而 KA 是将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 而获得。具有类似 KD( 或类似 KA) 的分子可具有在广范围内可变的结合和解离速率常数。当在标准体外测试 如 BIACORE 结合分析中测量时， 对本发明双特异性结合蛋白的结合亲和力将在 100nM 或更 少， 优选 10nM 或更少， 且更优选 1nM 或更少的范围。
     在某些实施方案中， FGFR 为 FGFR3IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 2 的第 262 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 9 的第 142 号氨基酸从 S 突变为 W。其它具 体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 15 的第 263 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 22 的第 143 号氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR3IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 10， 19 和 22 所示。
     在其它某些实施方案中， FGFR 为 FGFR2IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 29 的氨基酸数 X 或 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸数 Xa 从 S 突变为 W。其它具体 实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 33 的第 Y 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 42 的第 Ya 号 氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR2IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 37 和 42 所示。
     B.VEGF-A 抗体
     用于本发明的 VEGF-A 拮抗剂包括这样的分子， 它们结合至 VEGF-A 或 VEGF-A 受 体， 从而诱导 VEGF-A 对表达该受体， 例如， VEGFR-1， VEGFR-2， 神经纤毛蛋白 -1， 和 / 或神 经纤毛蛋白 -2 的细胞的活性。特别是， VEGF-A 拮抗剂包括抗 VEGF-A 抗体。其它合适的 VEGF-A 拮抗剂包括包含 VEGFR 细胞外域的可溶 VEGF-A 受体， 以及能抑制 VEGF-A 与其受体 的相互作用或能以其他方式抑制 VEGF-A 诱导的通过 VEGF-A 受体的细胞内信号传导的小分 子拮抗剂。此外， 可使用基于非抗体支架的结合蛋白质。( 参见， 例如， Koide 等人， J.Mol. Biol.284 ： 1141-1151， 1998 ； Hosse 等人蛋白质 Sci.15 ： 14-27， 2006， 以及其中的文献 )。 本 发明使用的优选的 VEGF-A 拮抗剂包括特异结合至 VEGF-A 的抗体， 包括也包含对 FGF 的结 合位点的双特异性抗体。对 VEGF-A 特异的抗体至少结合 VEGF-A 的可溶分泌形式， 且优选 还结合关联于细胞表面的形式。
     抗体在以下情况下被认为是特异结合的， 如果 (1) 它们显示结合活性的阈水平， 和 (2) 它们不显著与对照多肽分子交叉反应。例如， 如果抗 VEGF-A 抗体结合至 VEGF-A 多 肽、 肽或表位的亲和力为与对照 ( 非 VEGF-A) 多肽的结合亲和力的至少 10 倍， 则确定结合 6 -1 阈水平。 优选的是， 本发明中使用的抗体具有的结合亲和力 (Ka) 为 10 M 或更大， 优选 107M-1 或更大， 更优选 108M-1 或更大， 最优选 109M-1 或更大。抗体的结合亲和力可由本领域技术人 员容易地确定， 通常使用自动设备通过表面等离子共振测定。 其它方法是本领域已知的， 例 如 Scatchard 分析 (Scatchard， Ann.NY Acad.Sci.51 ： 660-672， 1949)。
     本发明的抗体包含保持抗原 - 结合特异性的完整抗体的部分或由其组成。合适的 抗体包括， 例如， 完全的人抗体 ； 人源化抗体 ； 嵌合抗体 ； 抗体片段例如 Fab， Fab’ ， F(ab)2， F(ab’ )2 和 Fv 抗体片段 ； 单链抗体 ； 和抗体重链或轻链的单体或二聚物或其混合物。本发 明的优选抗体为单克隆抗体。包含轻链的抗体可包含 κ 或 λ 轻链。
     在某些实施方案中， 本发明的抗体包括任何同种型的完整免疫球蛋白， 包括 IgA， IgG， IgE， IgD， 或 IgM( 包括其亚型 )。根据本发明的完整免疫球蛋白优选包括完整 IgG( 例 如， 完整 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 或 IgA2)。
     制备和分离多克隆抗体、 单克隆抗体和其抗原 - 结合抗体片段的方法是本领域已 知的。参见， 例如， Current Protocols in Immunology， (Cooligan 等人 eds.， John Wiley and Sons， Inc.2006) ； Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor， NY， 2nd ed.1989) ； 和 Monoclonal Hybridoma Antibodies ： Techn iques and Applications(Hurrell ed.， CRC Press， Inc.， Boca Raton， FL， 1982)。抗原结合片 段， 包括 scFv， 可根据本领域已知方法使用噬菌体展示文库制备。噬菌体展示也可用于基 于非抗体支架制备结合蛋白质 (Koide 等人， 上文 .)。制备重组人多克隆抗体的方法公开 于 Wiberg 等 人， Biotechnol Bioeng.94 ： 396-405， 2006 ； Meijer 等 人， J.Mol.Biol.358 ： 764-772， 2006 ； Haurum 等人， 美国专利申请公开 No.2002/0009453 ； 和 Haurum 等人， 美国专 利申请公开 No.2005/0180967。对本领域技术人员显而易见的是， 用于本发明的多克隆抗体可通过用免疫源性多 肽或多肽片段接种多种温血动物如马， 牛， 山羊， 绵羊， 狗， 鸡， 兔， 小鼠， 和大鼠的任一种而 产生。免疫原性多肽的免疫原性可通过使用佐剂， 如明矾 ( 氢氧化铝 ) 或弗氏完全或不完 全佐剂来增加。用于免疫的多肽还包括融合多肽， 如 VEGF-A 或其部分与免疫球蛋白多肽或 与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可为全长分子或其部分。如果多肽部分为半抗原 状， 其可有利地结合或连接至大分子载体 ( 如钥孔虫戚血兰素 (KLH)， 牛血清白蛋白 (BSA) 或破伤风类毒素 ) 以用于免疫。
     此外， 抗体可相对于与抗体靶 ( 例如， 直向同源物， 横向同源物 (paralogs))， 或其 序列变体相关的已知多肽进行筛选， 例如， 以分离对于结合靶蛋白或多肽而言高度特异的 抗体群体。这样的高特异性群体包括， 例如， 结合至人 VEGF-A 但不结合至小鼠 VEGF-A 的抗 体。 这种与相关多肽分子的交叉反应性的缺失通过， 例如， 使用标准蛋白质印迹分析通过检 测 VEGF-A 多肽而不检测已知的相关多肽的抗体显示 (Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人 eds.， Green and Wiley and Sons， NY 1993)) 或 ELISA( 酶免疫 测定 )(Immunoassay， A Practical Guide(Chan ed.， Academic Press， Inc.1987))。在 另一实例中， 针对 VEGF-A 多肽产生的抗体吸附到粘附在不可溶基质上的相关多肽上， 对 VEGF-A 多肽高度特异的抗体将在适当的缓冲条件下流过基质。筛选使得分离与已知的密 切相关的多肽无交叉反应性的多克隆和单克隆抗体成为可能 (Antibody ： A Laboratory Manual(Harlow and Lane eds.， Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988) ； Current Protocols in Immunology(Cooligan 等人 eds.， National Institutes of Health， John Wiley and Sons， Inc.1995)。特异抗体的筛选和分离是本领域已知的。参见 Fundamental Immunology(Paul ed.， Raven Press 1993) ； Getzoff 等 人， Adv.in Immunol.43 ： 1-98， 1988 ； Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice(Goding ed.， Academic Press Ltd.1996) ； Benjamin 等人， Ann.Rev.Immunol.2 ： 67-101， 1984。
     天然单克隆抗体 (“mAbs” ) 可通过， 例如， 用纯化的免疫原性蛋白或其片段免疫 受试者动物 ( 例如， 大鼠或小鼠 ) 而制备。在典型的程序中， 首先分别对动物给予腹腔内 (IP) 注射纯化的蛋白质或其片段， 通常与佐剂 ( 例如， 完全弗氏佐剂或 RIBI 佐剂 ( 获自 Sigma-Aldrich， St.Louis， MO)) 组合， 然后以例如两周的间隔加强 IP 注射纯化蛋白质。给 予第三加强注射后 7-10 天， 对动物放血并收集血清。视需要可以给予更多次的加强接种。 使用常规方法从高效价动物收集脾细胞和淋巴节细胞， 并使其融合至骨髓瘤细胞 ( 例如， 小鼠 SP2/0 或 Ag8 细胞 )。然后将该融合混合物在胸腺细胞的滋养层上培养或用合适的 培养基补充物培养 ( 包括可商购的补充物如杂交瘤融合和克隆补剂 ； Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)。融合后约 10 天， 使用标准测试 ( 例如 ELISA) 鉴别特异的产生抗体的 杂交瘤群。对于阳性池可进一步分析其阻断或减少靶蛋白的活性的能力。通过限制稀释克 隆阳性池。
     在某些方面， 本发明还包括多种单克隆抗体的用途， 所述多种单克隆抗体对单一 靶分子上对不同表位特异。组合使用这样的多种抗体可减少单一抗体所见的载体效应 (carrier effect)， 且还可通过 Fc 受体增加清除率和改善 ADCC。可组合使用两种、 三种或 多种单克隆抗体。
     天然抗体的氨基酸序列可通过使用重组 DNA 技术改变。因此， 抗体可进行重新设计以得到所需特征。相对其非修饰的形式， 修饰的抗体可提供例如改善的稳定性和 / 或治 疗功效。可能的变化有很多， 范围可以从改变仅一个或一些氨基酸到对例如可变区或恒定 区的完全重新设计。 制造恒定区的变化的目的通常是改善或改变特征， 如补体结合、 与膜的 相互作用和其它效应物作用。 通常， 制造可变区的变化以改善抗原结合特征， 改善可变区稳 定性， 或减少免疫原性的风险。噬菌体展示技术也可使用。参见， 例如， Huse 等人， Science 246 ： 1275-1281， 1989 ； Ladner 等人， 美国专利号 5,571,698。
     对 于 用 于 人 体 的 治 疗 用 抗 体， 通常需要根据已知方法将抗体的非人区人源 化。制备人源化抗体的方法公开于， 例如， 美国专利 5,530,101 ； 5,821,337 ； 5,585,089 ； 5,693,762 ； 和 6,180,370。通常， 人源化抗 VEGF-A 抗体包含小鼠供免者疫球蛋白的互补决 定区 (CDR) 和人受者免疫球蛋白的重链和轻链框架。 通常， 人框架区中的框架残基将被 CDR 供者抗体的相应残基取代， 以改变 ( 优选改善 ) 抗原结合。通过本领域众所周知的方法辨 别这些框架取代， 例如， 通过模仿 CDR 和框架残基的相互作用以鉴别对抗原结合重要的框 架残基和序列比较以鉴别在特定位置的一般的框架残基。( 参见， 例如， Queen 等人， 美国专 利号 5,585,089 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323， 1988)。
     非人源化嵌合抗体也可治疗性地使用 ( 例如， 在免疫抑制患者中 )。因此， 在一 些变化中， 根据本发明的抗体是从例如非人抗 VEGF-A 抗体衍生的嵌合抗体。优选地， 嵌合 抗体包含衍生自小鼠或大鼠抗体的可变区和衍生自人的恒定区， 以使该嵌合抗体当给予人 受试者时具有较长的半衰期和较低的免疫原性。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。 ( 参见例如， Morrison， Science 229 ： 1202， 1985 ； Oi 等人， BioTechniques 4 ： 214， 1986 ； Gillies 等人， J.Immunol.Methods 125 ： 191-202， 1989 ； 美国专利 5,807,715 ； 4,816,567 ； 和 4,816,397)。
     本发明还包括完全的人抗体， 如衍生自卵巢， 乳腺， 肾， 结肠直肠， 肺， 子宫内膜， 或 脑癌患者的外周血单核细胞的。该细胞可与骨髓瘤细胞融合， 例如， 以形成产生抗 VEGF-A 的完全的人抗体的杂交瘤细胞。人抗体也可以在转基因非人动物 ( 通常为小鼠 ) 中制备。 参见， 例如， Tomizuka 等人， 美国专利 No.7,041,870。通常， 非人哺乳动物就人重链基因座 和人轻链基因座而言是转基因的， 且相应的内源性免疫球蛋白基因座被失活。
     本发明的抗体可用它们所识别或特异结合的 VEGF-A 多肽的表位或部分来特指。 表位或多肽部分可例如， 用 SEQ ID NO ： 72 所示的 VEGF-A 多肽的表位或其它部分的 N- 端和 C- 端位置来特指。
     本发明的抗体具有这样的结合亲和力， 其包括的小于 5x 10-2M， 小于 10-2M， 小于 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x -10 -10 -11 -11 -12 -12 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10-13M， 小 -13 -14 -14 -15 -15 于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 或小于 10 M 解离常数 (Kd)。
     本发明的抗体进一步包括修饰的衍生物， 修饰的方式例如， 通过对抗体的任何类 型的分子共价连接， 以使共价连接不阻止抗体结合至其表位。合适的修饰包括， 例如， 岩藻 糖基化， 糖基化， 乙酰化， 聚乙二醇化， 磷酸化和酰胺化。 该抗体及其衍生物本身可通过已知 的保护基 / 封闭基、 蛋白酶剪切、 与细胞配体或其它蛋白质的连接等而衍生化。在本发明一 些实施方案中， 抗体的至少一个重链被岩藻糖基化。 在具体的变化形式中， 该岩藻糖基化是N- 连接的。在某些优选的实施方案中， 抗体的至少一个重链包含岩藻糖基化、 N- 连接的寡 糖。
     本发明的抗体可单独使用或作为与细胞毒素剂的免疫缀合物使用。在一些实施 方案中， 该试剂为化学治疗剂。在其它实施方案中， 该试剂为放射性同位素， 例如， 铅 -212， 铋 -212， 砹 -211， 碘 -131， 钪 -47， 铼 -186， 铼 -188， 钇 -90， 碘 -123， 碘 -125， 溴 -77， 铟 -111， 或可裂变核素如硼 -10 或锕系元素。在其它实施方案中， 该试剂为毒素或细胞毒素药物， 例 如蓖麻毒蛋白、 修饰的假单胞菌肠毒素 A、 加利车霉素 (calicheamicin)、 阿霉素、 5- 氟尿嘧 啶、 auristatin( 例如， auristatin E)、 美登木素 (maytansin)、 等。抗体和抗体片段与该试 剂的缀合方法是本领域已知的。
     本发明的抗体包括相对参照抗体 ( 例如， 具有表 2 或表 3 所示 VL 和 / 或 VH 序列 的参照抗体 ) 具有单个或多个氨基酸取代， 缺失， 添加， 或置换的变体， 以使该变体保持参 照抗体的一种或多种生物特性 ( 例如， 阻断 VEGF-A 与其各自的对应结构 (VEGF-A 受体 ) 的 结合， 阻断 VEGF-A 的生物活性， 结合亲和力 )。 本领域技术人员可制备具有单一或多重氨基 酸取代、 缺失、 加成或置换的变体。这些变体可包括， 例如 ： (a) 其中一个或多个氨基酸残基 被保守或非保守氨基酸置换的变体， (b) 其中一个或多个氨基酸被添加至多肽或从多肽被 删除的变体， (c) 其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体， 和 (d) 其中多肽与可赋予多肽 有用的特性的另一肽或多肽融合的变体， 所说的另一肽或多肽如融合配偶体、 蛋白标记物 或其它化学部分， 例如抗体的表位、 多组氨酸序列、 生物素部分等。本发明的抗体可包括以 下变体， 其中一个物种的氨基酸残基代替另一物种中的对应残基， 代替可发生在保守的或 非保守的位置。在另一实施方案中， 非保守的位置的氨基酸残基被保守的或非保守的残基 代替。 获得这些变体的技术， 包括遗传的 ( 抑制、 缺失、 突变等 )、 化学的和酶学的技术， 是本 领域技术人员已知的。
     结合至 VEGF-A 的示例性抗体已通过筛选噬菌体展示文库得以鉴定。通过噬菌 体展示的筛选方法详细描述于标准参考文章， 如 Babas， Phage Display ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab Press ， 2001) 和 Lo ， Benny K.C. ， A. ， Antibody Engineering(2004)。该噬菌体展示文库可用于将表达的蛋白质展示在细胞或其它物质的 表面， 以使互补的结合实体可以被功能性分离 (functionally isolated)。在一种这样的 噬菌体展示文库中， 将抗体轻链可变区和部分重链可变区与编码人抗体序列的合成 DNA 组 合， 然后它们在噬菌体和噬菌粒文库上作为 Fab 抗体片段被展示 (Dyax Human Antibody Libraries， Dyax Corp.， Cambridge， MA.)。因此， 抗体的可变轻链和重链片段可以以 Fab 形式被分离。然后可处理这些可变区以产生抗体， 包括抗原 - 结合片段， 如 scFv， 双特异性 scFv， 以及针对 VEGF-A 的多特异性、 多功能拮抗剂。
     使用该技术， 示例性 Fabs 的可变区已在本文所述得测试中因其结合和 / 或中和 VEGF-A 的特征而被鉴定出来。( 参见下文实施例 )。处理这些可变区以产生多种结合实体， 包括结合和 / 或中和 VEGF-A 的 scFv。下表 2 显示因其结合和中和 VEGF-A 的能力而被鉴定 出的抗 VEGF-A 抗体簇的核苷酸和氨基酸 SEQ ID NO. 标号， 而表 3 列出了对应于表 2 所列 的抗 VEGF-A 抗体的框架和 CDR 区的氨基酸残基位置。
     在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF-A 抗体包含表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的一 个或多个 CDR( 相应 CDR 区的边界分别示于表 3)。 例如， 在某些变化中， 该抗体包含表 2 所列
     的抗体的重链 CDR(HCDR1， HCDR2 和 HCDR3 区中的至少一个 ) 和 / 或相应的轻链 CDR(LCDR1， LCDR2， 和 LCDR3 区中的至少一个 )。在典型实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有表 2 所列的 抗体的两个或三个重链 CDR 和 / 或两个或三个轻链 CDR。在一些变化中， 其中抗 VEGF-A 抗 体具有表 2 所列的抗体的至少一个重链 CDR， 该抗体进一步包含至少一个相应的轻链 CDR。
     在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A 抗体包括重和 / 或轻链可变域， 该重链或轻链可 变域具有 (a) 对应于表 2 所列的抗体所示的重链或轻链 CDR 的一组三个 CDR， 和 (b) 一组四 个框架区。例如， 抗 VEGF-A 抗体可包含重和 / 或轻链可变域， 其中该重链或轻链可变域具 有 (a) 一组三个 CDR， 其中该组 CDR 源自表 2 所列的抗体， 和 (b) 一组四个框架区， 其中该组 框架区与表 2 所列的相同抗体的那组框架区相同或不同。
     在具体实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体包含与表 2 所列的抗体的重和 / 或轻链可变区 基本上相同的重链可变区和 / 或轻链可变区。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， LCDR1 具有 SEQ ID NO ： 66 的 残基 24-34 所示的氨基酸序列 ； LCDR2 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 50-56 所示的氨基酸序 列； LCDR3 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 89-97 所示的氨基酸序列 ； HCDR1 具有抗体 c1039 的 HCDR1 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 31-35) ； HCDR2 具有抗体 c1039 的 HCDR2 氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自 SEQ ID NOs ： 68 的氨基酸序列。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， LCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 23-35) ； LCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR2 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 51-57) ； LCDR3 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR3 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 90-100) ； HCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 31-35) ； HCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR2 氨基酸序 列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 99-102 的氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870， c1039 和 c1094 的抗体的 CDR LCDR1， LCDR2， LCDR3， HCDR1， HCDR2 和 HCDR3。例如， 在 具体实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的抗体的轻链和重链可 变域 (VL 和 VH)。
     在其它实施方案中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体包括含 CDR LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 的 VL 域和含 CDR HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 的 VH 域， 其中该组 VL 和 VH CDR 相对第二组 CDR 具有 3 个或更少个氨基酸取代， 其中所述第二组 CDR 具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的 抗体的 LCDR1、 LCDR2、 LCDR3、 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该 抗体在所述组的 CDR 中包含 0、 1 或 2 个氨基酸取代。
     本发明的抗 VEGF-A 抗体识别的表位通常包含人 VEGF-A165 的 5 个或更多个氨基酸 (SEQ ID NO ： 72 的残基 27-191)。优选的表位包含至少一个包含在一个或多个以下 VEGF-A 的多肽区内的氨基酸 ： HEVVKFMDVYQRSYCHPIETL(SEQ ID NO ： 72 的 氨 基 酸 残 基 38-58)， EYIFKPSCVPLMRCG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84)， EESNITMQIMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 98-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。 在某些实施方案中， 该 表位包含至少 2 个、 至少 3 个、 至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 或至少 7 个源自 SEQ ID NO ： 72 的残基 38-58、 70-84、 98-114、 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的氨基酸。 在一些变化形式中， 该 VEGF-A 表位是通过使用重叠 VEGF-A 肽 )( 例如 13- 聚肽， 其中在每对 依次的肽之间有例如 2 个氨基酸移位 ) 的肽微阵列表位作图而确定的表位。
     在上述抗 VEGF-A 抗体的具体变化形式中， 该抗 VEGF-A 表位包含包括在一个或多 个以下的 VEGF-A 多肽区内的至少一个氨基酸 ： KFMDVYQRSYC(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 42-52)， IFKPSCVPLMR(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 72-82)， IMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的 氨基酸残基 106-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。在某些实施方案中， 该表 位包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 42-52， 72-82， 106-114， 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的至少两个， 至少 3 个， 至少 4 个， 至少 5 个， 至少 6 个， 或至少 7 个氨基酸。
     在一些相关的变化形式中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体结合至如下所述的表位， 该表位包含 (a) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 38-58 或 42-52 所示的第一 VEGF-A 多肽区 内包含的一个或多个氨基酸， 和 (b) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84 或 72-82 所示的 第二 VEGF-A 多肽区内包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的某些实施方案中， 该表位 不包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 90 至 132 所示的 VEGF-A 的多肽区内包含的氨基酸 (EGLECVP TEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRP)。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， 该表位 进一步包含 (c) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 96-114 或 106-114 所示的第三 VEGF-A 多肽区内 包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a)、 (b) 和 (c) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， 该 抗体不以彼此的 10 倍以内的 Kd 值结合人和小鼠 VEGF-A。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它变化形式中， 该表位 进一步包含 (d) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 142-154 所示的第四 VEGF-A 多肽区内包含的一个 或多个氨基酸。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 抗 VEGF-A 抗 体 为 抗 体 片 段， 例 如 Fv、 Fab、 Fab’ 、 F(ab)2、 F(ab’ )2、 scFv、 或双特异性抗体。在一些优选的实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体为 scFv。结合 VEGF-A 的 scFv 实体可具有这样的取向， 其中轻链可变 (VL) 区位于重链可变 (VH) 区的氨基 端或者羧基端。在一些变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 X 所列的抗 VEGF-A 抗体的 CDR。 在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的 VL 和 VH 域。 在某些 实施方案中， 抗 VEGF-A scFv 的 CDR 或 VL 和 VH 域为选自 c870 c1039 和 c1094 的抗 VEGF-A 抗体的 CDR 或 VL 和 VH 域。在抗 VEGF-A scFv 的具体变化形式中， 该 scFv 包含如 SEQ ID NO ： 70(c1039scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 69 所示 ) ； SEQ ID NO ： 44(c870.1e6scFv ； 核 苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) ； 或 SEQ ID NO ： 46(c1094.1scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) 所述的氨基酸序列。此外， scFvs 可以多种双特异性抗体形式的任一种提供， 例如， 串联 scFv(tascFv)、 双 - 单链 Fv(biscFv)、 和具有融合至羧基端的单链 Fv(scFv) 的 完整单克隆抗体 (biAb)( 参见上文 )。
     C. 使用 Fc 蛋白质缀合的双特异性抗体 / 可溶受体组合
     双特异性结合蛋白通过免疫球蛋白重链的 Fc 区结合本发明的结合蛋白， 如图 2 所 例示的。该 Fc- 融合蛋白包含 IgG 分子的 Fc 区。在另一实施方案中， 该 Fc 区来自人 IgG1 分子。在一些实施方案中， 该免疫球蛋白融合物包括 IgG1 分子的铰链、 CH2 和 CH3 区， 或铰链、 CH1、 CH2 和 CH3 区。
     免 疫 球 蛋 白 融 合 物 的 制 备 也 参 见 美 国 专 利 No.5,428,130， 美国专利 No.5,843,725， 美国专利号 6,018,026， 和 Chamow 等人， TIBTECH， 14 ： 52-60(1996)。
     最简单和最直接的 Fc- 融合蛋白设计通常藉由免疫球蛋白重链的 Fc 区联合本发 明的拮抗剂多肽的结合域。在本发明的 Fc- 融合蛋白中， 编码结合组分的核酸融合至编码 免疫球蛋白恒定域序列的 N- 端的核酸的 C 端， 但是 N- 端融合物也是可能的。
     典型地， 这样的融合物中， 编码的嵌合多肽将至少保持免疫球蛋白重链的恒定区 的功能活性铰链、 CH2 和 CH3 域。还在恒定域的 Fc 部分的 C- 端， 或直接在重链的 CH1 或轻 链的对应区域的 N 端进行融合。 进行融合的精确位点不是关键的 ； 具体位点是公知的， 且可 加以选择以优化 Fc- 融合蛋白的生物活性、 分泌或结合特征。
     在一个优选的实施方案中， 该结合域序列融合至免疫球蛋白 G1(IgG1) 的 Fc 区的 N- 端。可以融合整个重链恒定区与结合域序列。然而， 更优选地， 融合中使用这样的序列， 其起始于化学限定 IgG Fc 的木瓜蛋白酶切割位点 ( 即残基 216， 将重链恒定区的第一残基 作为 114) 或其它免疫球蛋白中的类似位点紧邻上游的铰链区。在特别优选的实施方案中， 该结合域氨基酸序列融合至 (a) 铰链区和 CH2 和 CH3 或 (b)IgG 重链的 CH1、 铰链、 CH2 和 CH3 域。
     对于双特异性 Fc- 融合蛋白， Fc- 融合蛋白被组装为多聚体， 特别是异源二聚体或 异源四聚体。通常， 这些组装的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。一种基本的四链结构 单位是存在于 IgG、 IgD 和 IgE 中的形式。四链单位在高分子量免疫球蛋白中重复 ； IgM 通 常以通过二硫键保持在一起的四个基本单位的五聚体存在。IgA 球蛋白， 偶尔还有 IgG 球 蛋白， 也可在血清中以多聚体形式存在。 在多聚体的情况下， 四个单位的每一个可相同或不 同。
     或者， 可将 Fc 序列插入免疫球蛋白的重链和轻链序列之间， 而得到包含嵌合重链 的免疫球蛋白。在该实施方案中， 在免疫球蛋白的每条臂中 Fc 序列融合至免疫球蛋白重 链的 3 ′端， 或是在铰链和 CH2 域之间， 或是在 CH2 和 CH3 域之间。类似构建体已报道于 Hoogenboom 等人， Mol.Immunol.， 28 ： 1027-1037(1991)。
     尽管在本发明的 Fc- 融合蛋白中不需要免疫球蛋白轻链的存在， 但免疫球蛋白轻 链可共价连接于结合域 - 免疫球蛋白重链融合多肽， 或直接融合于结合域。在前者的情况 下， 通常将编码免疫球蛋白轻链的 DNA 与编码结合域免疫球蛋白重链融合蛋白的 DNA 共表 达。 当分泌时， 杂合的重链和轻链将被共价连接， 而提供一种包含两个由二硫键连接的免疫 球蛋白重链 - 轻链对的免疫球蛋白状结构。适合制备该结构的方法例如公开于美国专利 No.4,816,567。
     Fc- 融合蛋白最方便地通过将编码结合域部分的 cDNA 序列合框地融合于免疫球 蛋白 cDNA 序列而构建。 然而， 也可使用与基因组免疫球蛋白片段的融合 ( 参见， 例如 Aruffo 等人， Cell， 61 ： 1303-1313(1990) ； 和 Stamenkovic 等人， Cell， 66 ： 1133-1144(1991))。后 一类型的融合需要存在 Ig 调节序列以用于表达。基于自脾或外周血淋巴细胞衍生的 cDNA 库中公开的序列， 可以通过杂交或聚合酶链反应 (PCR) 技术来分离编码 IgG 重链恒定区的 cDNA。将编码 Fc- 融合蛋白的结合域和免疫球蛋白部分的 cDNA 串联地插入指导在所选的 宿主细胞中的高效表达的质粒载体中。已进行了特殊的修饰以制备用于产生本发明使用的 Fc 融合分子的 Fc 序列。具体 地， 产生 6 个版本的修饰的人 IgG1 Fc 用于生成 Fc 融合蛋白且命名为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， 以及 Fc4(SEQ ID NO ： 77)、 Fc5(SEQ ID NO ： 74)、 Fc6(SEQ ID NO ： 78)、 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。Fc4， Fc5 和 Fc6 包含突变以通过减少 FcγRI 结合和补体 C1q 结合而减少 Fc 介导 的效应物作用。Fc4 包含引入 Fc-488 的相同氨基酸置换。还引入了另外的氨基酸置换以减 少潜在的 Fc 介导的效应物作用。具体地说， 引入三个氨基酸置换以减少 FcγRI 结合。它 们是在 EU 索引位置 234、 235 和 237 的置换。已显示这些位置上的置换可减少与 FcγRI 的 结合 (Duncan 等人， Nature 332 ： 563(1988))。这些氨基酸置换还可减少 FcγRIIa 结合， 以 及 FcγRIII 结合 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000) ； Wines 等人， J.Immunol.164 ： 5313(2000))。
     数 个 研 究 组 描 述 了 EU 索 引 位 置 330 和 331 在 补 体 C1q 结 合 和 后 续 补 体 固 定 (complement fixation) 中的重要性 (Canfield 和 Morrison， J.Exp.Med.173 ： 1483(1991) ； Tao 等人， J.Exp.Med.178 ： 661(1993))。在 Fc4 的这些位置上引入氨基酸置换， 以减少补体 固定。Fc4 的 CH3 域与对应野生型多肽中的 CH3 域相同， 只是终止密码子从 TGA 变为 TAA， 以 便消除克隆的 DNA 在 dam+ 大肠杆菌菌株中生长时潜在的 dam 甲基化位点。 在 Fc5 中， 在 EU 索引位置 218 的精氨酸残基突变回至赖氨酸， 因为在包含该特定 Fc 的融合蛋白中没有使用 BglII 克隆方案。 Fc5 序列的其余部分与上文对 Fc4 的描述相符。
     Fc6 与 Fc5 相同， 只是羧基末端赖氨酸密码子已被消除。成熟免疫球蛋白的 C- 端 赖氨酸经常在翻译后从 B- 细胞分泌之前从成熟免疫球蛋白被去除， 或在血清循环过程中 被去除。因此， 在循环抗体上通常找不到 C- 端赖氨酸残基。像上述 Fc4 和 Fc5 一样， Fc6 序 列中的终止密码子变为 TAA。
     Fc7 与野生型 γ1 Fc 相同， 除了位于 CH2 域中的 EU 索引位置 297 处的氨基酸置换 之外。EU 索引位置 Asn-297 是一个 N- 连接型碳水化合物搭接的位点。由于碳水化合物结 构中可能的批次间差异， N- 连接的碳水化合物向重组表达的蛋白质中导入了潜在的变异性 来源。在一个消除这种潜在的变异性的尝试中， 将 Asn-297 突变为谷氨酰胺残基以防止在 该残基位置上的 N- 连接型碳水化合物的搭接。Fc 对于 FcRIII 的结合也涉及残基 297 处的 碳水化合物 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000))。因此， 去除碳水化合物应该会一 般性地减少包含重组 Fc7 的融合蛋白与 FcγR 的结合。与上面一样， Fc7 序列中的终止密 码子突变为 TAA。
     本发明也考虑这些分子的亮氨酸拉链形式。″亮氨酸拉链″是本领域的术语， 用来表示一种富含亮氨酸的序列， 其增强、 促进、 或驱动其融合配偶体 ( 例如， 亮氨酸拉链 与之融合或连接的序列或分子 ) 的二聚化或三聚化。现有技术已描述了多种亮氨酸拉链 多 肽。 参 见， 例 如， Landschulz 等 人， Science， 240 ： 1759(1988) ； 美 国 专 利 5,716,805 ； WO 94/10308 ； Hoppe 等人， FEBS Letters， 344 ： 1991(1994) ； Maniatis 等人， Nature， 341 ： 24(1989)。本领域技术人员将理解亮氨酸拉链序列可融合于本发明多肽的 5′或 3′端。
     融合蛋白的制备通常可使用标准技术， 包括化学缀合。融合蛋白也可在表达体系 中通过标准技术表达为重组蛋白质。合适的接头进一步在下文描述。
     接头可为天然存在的， 合成的， 或两者的组合。例如， 合成的接头可为随机化的接 头， 例如， 序列和尺寸都随机化。 在一方面， 随机化的接头可包含完全随机化的序列， 或任选
     地， 随机化的接头可基于天然接头序列。接头可包含， 例如， 非多肽部分 ( 例如多核苷酸 )、 多肽、 等。
     接头可为刚性的， 或者柔性的， 或两者的组合。 接头的柔性可以是接头和与接头相 互作用的亚单位两者的组成的函数。接头将两个选定的结合实体 ( 例如， 两个单独的多肽 或蛋白质， 如两个不同的抗体 ) 联接到一起， 并保持各实体为各别且离散的。该接头可允许 单独的、 离散的域的协作， 且保持各别的特性， 如对于多聚物中同一靶标的多个各别的结合 位点， 或者， 例如， 对于多聚物中不同靶标的多个各别的结合位点。 在一些情况下， 在两个连 接的结合实体之间， 或在接头和结合实体之间存在二硫桥。
     对于具体的要连接两个或多个结合实体的情况， 合适的接头的选择可取决于多个 参数， 包括例如结合实体的性质、 双特异性组合物结合的靶标的结构和性质、 和 / 或接头 ( 例如， 肽接头 ) 对蛋白水解和氧化的稳定性。
     特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸 (Gly)、 丝氨酸 (Ser)、 丙氨酸 (Ala) 和 苏氨酸 (Thr) 的氨基酸残基。例如， 肽接头可包含至少 75％ ( 基于肽接头中存在的残基总 数计算 )、 如至少 80％、 至少 85％、 或至少 90％的选自 Gly、 Ser、 Ala 和 Thr 的氨基酸残基。 该肽接头也可仅由 Gly、 Ser， Ala 和 / 或 Thr 残基组成。该接头多肽具有的长度应足以连 接两个结合实体， 使得它们采取相对彼此的正确构象以使它们保持所需的活性， 如结合靶 分子以及可其它能与这样的靶结合相关的活性 ( 例如， 对于给定生物分子的激动或拮抗活 性 )。
     适于该目的的合适长度是例如至少 1 个且通常少于约 50 个氨基酸残基的长度， 如 2-25 个氨基酸残基， 5-20 个氨基酸残基， 5-15 个氨基酸残基， 8-12 个氨基酸残基或 11 个残 基。其它合适的多肽接头尺寸可包括， 例如， 约 2 至约 15 个氨基酸， 约 3 至约 15 个、 约4至 约 12 个、 约 10 个、 约 8 个、 或约 6 个氨基酸。选择纳入接头多肽的氨基酸残基应显示以下 特性， 其不显著干扰多肽多聚物的活性或功能。 因此， 该肽接头从整体上说应不具有与多聚 物的活性或功能不一致的电荷， 不干扰内部折叠， 也不与一个或多个域中的氨基酸残基形 成会严重阻碍多聚物与所关注靶点的结合的键或其它相互作用。
     天然存在的以及人造的肽接头用于连接多肽成为新的连接的融合多肽的用途是 本 领 域 众 所 周 知 的 ( 参 见， 例 如， Hallewell 等 人， J.Biol.Chem.264， 5260-5268， 1989 ； Alfthan 等 人， Protein Eng.8， 725-731， 1995 ； Robinson and Sauer， Biochemistry 35， 109-116， 1996 ； Khandekar 等 人， J.Biol.Chem.272， 32190-32197， 1997 ； Fares 等 人， Endocrinology 139， 2459-2464， 1998 ； Smallshaw 等 人， Protein Eng.12， 623-630， 1999 ； 美国专利号 5,856,456)。
     广泛使用肽接头的一个实例是用于制备单链抗体， 其中轻链 (VL) 和重链 (VH) 的 可变区通过人造接头连接。在这个领域有大量的公开文献。一种广泛使用的肽接头是由 三个重复的 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 氨基酸序列 ((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO ： 73) 组成的 15 聚 物。 也已使用了其它接头， 还使用了噬菌体展示技术， 以及选择性传染噬菌体技术来多样化 和选择合适的接头序列 (Tang 等人， J.Biol.Chem.271， 15682-15686， 1996 ； Hennecke 等人， Protein Eng.11， 405-410， 1998)。肽接头已用于连接异源和同源二聚蛋白质 ( 如 T- 细胞 受体、 λCro 阻抑物、 P22 噬菌体 Arc 阻抑物、 IL-12、 TSH、 FSH、 IL-5 和干扰素 -γ) 中的各 个链。肽接头也已用于产生融合多肽。已使用多种接头， 在 Arc 阻抑物的情况下， 噬菌体展示已用于优化接头长度和组成以增加单链蛋白质的稳定性 ( 参见 Robinson 和 Sauer， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95， 5929-5934， 1998)。
     另 一 种 获 得 合 适 的 接 头 的 途 径 是 通 过 随 机 诱 变 来 优 化 简 单 的 接 头 ( 例 如， (Gly4Ser)n)。
     如上文讨论的， 通常优选肽接头具有至少一些柔性。因此， 在一些变化形式中， 肽 接头包含 1-25 个甘氨酸残基， 5-20 个甘氨酸残基， 5-15 个甘氨酸残基， 或 8-12 个甘氨酸残 基。特别合适的肽接头通常包含至少 50％的甘氨酸残基， 如至少 75％的甘氨酸残基。在一 些实施方案中， 肽接头仅包含甘氨酸残基。 在某些变化中， 该肽接头还包含甘氨酸之外的其 它残基。甘氨酸之外的优选残基包括 Ser， Ala 和 Thr， 特别是 Ser。
     在一些情况下， 向肽接头提供一些刚性是理想的或者是必须的。这可通过在肽接 头的氨基酸序列中包含脯氨酸残基而实现。 因此， 在另一实施方案中， 肽接头在肽接头的氨 基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如， 肽接头可具有这样的氨基酸序列， 其中至少 25％ ( 例如， 至少 50％或至少 75％ ) 的氨基酸残基为脯氨酸残基。在本发明一个具体的实 施方案中， 肽接头仅包含脯氨酸残基。
     在一些实施方案中， 修饰肽接头而引入包含供非多肽部分搭接的基团的氨基酸残 基。此类氨基酸残基的实例可为半胱氨酸或赖氨酸残基 ( 随后非多肽部分搭接于其上 )。 另一种备选方案是包括具有体内 N- 糖基化位点的氨基酸序列 ( 从而将糖部分 ( 体内 ) 连 接于肽接头 )。另一种选择是利用进化的 tRNAs 和 tRNA 合成酶 ( 参见， 例如， 美国专利申请 公开 2003/0082575) 遗传性地将非天然氨基酸掺入多肽结合实体或肽接头。例如， 酮-酪 氨酸的插入允许针对表达的多肽的位点特异性偶联。
     在某些变化形式中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基， 如一个半胱氨酸残基。 例 如， 在一些实施方案中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自 Gly， Ser， Ala 和 Thr 的 氨基酸残基。 在某些此类实施方案中， 肽接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基， 如仅有甘氨 酸残基和半胱氨酸残基。通常， 每个肽接头将仅包含一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残 基的具体肽接头的一个实例包括具有氨基酸序列 Glyn-Cys-Glym 的肽接头， 其中 n 和 m 各为 1-12 的整数， 例如， 3-9、 4-8、 或 4-7。
     如上所述， 本发明包括双特异性结合蛋白， 其包含 FGFR 和抗 VEGF-A 抗体的双特异 性抗体 / 可溶受体组合。在某些此类实施方案中， FGFR 和抗 VEGF-A 抗体共价连接 ( 例如， 通过肽接头 ) 以形成双特异性结合蛋白。在一些变化形式中， 该双特异性结合蛋白包含免 疫球蛋白重链恒定区， 例如， Fc 片段。特别合适的 Fc 片段包括， 例如， 包含修饰的 Fc 区以 减少或消除一种或多种效应物作用的 Fc 片段 ( 例如， Fc5， 具有 SEQ ID NO ： 74 所示的氨基 酸序列 )。
     例如， 在一些实施方案中， 根据本发明的减少 VEGF-A 和 FGF 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白包含如本文所述的抗 VEGF-A 抗体部分的结合区和 如本文所述的 FGFR3 的 FGF 结合部分。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为本文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 尤其是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体部 分和 VEGF-A 抗体部分的组合， 其中 FGF 受体部分为选自下组的 FGFR3 ： 如 SEQ ID NO ： 13 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)， 如 SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ：19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， 如 SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和如 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375) (P250R) ； 所 述 VEGF-A 抗 体 部 分 选 自 下 组 ： 如 SEQ ID NO ： 44 所 示 的 c870.1e6scFV， 如 SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， 如 SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和如 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合 部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 包 括 选 自 下 组 的 FGFR3 部 分 和 VEGF-A 抗 体 部 分 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W) Fc5c870e6pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包含 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分 和 VEGF-A 结 合 部 分， 所 述 FGF 结 合 部 分 为 选 自 下 组 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所 述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其 它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     III. 核酸， 宿主细胞， 和制备 VEGF-A 和 FGF 双特异性抗体 / 可溶受体组合蛋白的 方法
     本发明的可溶 FGFR 多肽可通过表达编码细胞外域或其部分的 DNA 制备。例如， 编 码包含 SEQ ID NO ： 13 的残基 36-388 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 FGFR3IIIc。 N- 端截 短的 FGFR3IIIc 可使用编码 SEQ ID NO ： 19 的残基 36-268 的多核苷酸。为制备 FGFR2IIIc， 可 使用编码 SEQ ID NO ： 24 的残基 36-391 的多核苷酸。在另一实例中， 编码包含 SEQ ID NO ： 37 的残基 36-268 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 N- 端截短的 FGFR2IIIc。优选该细胞外域多肽制备为基本上无跨膜和细胞内多肽区段的形式。为引导受体域从宿主细胞输出， 该 受体 DNA 连接至编码分泌肽的第二 DNA 片段， 如受体的天然信号序列。其它可使用的信号 序列包括 tPA 信号序列 ( 在以下实施例描述 )， CD33 信号序列或人生长激素信号序列。为 促进分泌的受体域的纯化， 可将 C- 端延伸物， 如多组氨酸标签、 物质 P、 FlagTM 肽 (Hopp 等 人， Biotechnology 6 ： 1204-1210， 1988 ； 获自 Eastman Kodak Co.， New Haven， CT) 或另一 有可用的抗体或特异性结合剂的多肽或蛋白质， 融合至受体多肽。
     本发明还包括编码本发明的抗体的重链和 / 或轻链的核酸。本发明的核酸包括这 样的核酸， 其具有与如上表 2 所列的编码 VL 和 / 或 VH 的多核苷酸基本相同的区域。本发明 的核酸还包括互补核酸。 在一些情况下， 当形成比对时， 各序列将是完全互补的 ( 无错配 )。 在其它情况下， 序列中可存在至多约 20％错配。 在本发明一些实施方案中， 提供了编码本发 明抗体的重链和轻链两者的核酸。 本文提供的核酸序列可使用密码子优化、 简并序列、 沉默 突变和其它 DNA 技术优化在特定宿主中表达后加以利用， 本发明涵盖这样的序列修饰。
     因此， 在一些方面， 本发明提供编码本文所述 FGFR 和 / 或 VEGF-A 抗体的一种或多 种多核苷酸 ( 例如， DNA 或 RNA)。在一些变化形式中， 本发明的多核苷酸编码结合并减少 FGF 和 VEGF-A 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白。本领域技术 人员将容易理解， 考虑到遗传密码的简并， 在这些多核苷酸分子中可能有大量的序列变化。
     本发明的核酸可克隆至载体中， 载体例如质粒， 粘粒， 杆粒 (bacmid)， 噬菌体， 人造 染色体 (BAC， YAC) 或病毒， 可向其中插入另一遗传序列或元件 (DNA 或 RNA) 以实现连接的 序列或原件的复制。在一些实施方案中， 该表达载体包含组成型活性启动子区段 ( 例如但 不限于 CMV， SV40， 延伸因子或 LTR 序列 ) 或诱导型启动子序列， 如类固醇可诱导的 pIND 载 体 (Invitrogen)， 在那里核酸的表达可被调节。 本发明的表达载体可进一步包括调节序列， 例如， 内部核糖体进入位点。该表达载体可通过例如转染被引入细胞。
     因此， 用于本发明中的蛋白质可根据常规技术在遗传工程化的宿主细胞中产生。 合适的宿主细胞为可用外源性 DNA 转化或转染且生长在培养物中的细胞类型， 包括细菌， 真菌细胞， 和培养的高等真核细胞 ( 包括培养的多细胞有机体的细胞 )， 特别是培养的哺乳 动物细胞。处理克隆 DNA 分子和向多种宿主细胞引入外源 DNA 的技术公开于 Sambrook 等 人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989)， 和 Ausubel 等人， 上文。
     通常， 在表达载体内， 编码感兴趣蛋白质的 DNA 序列可操作连接于其表达所需的 其它遗传元件， 通常包括转录启动子和终止子。该载体通常还包含一个或多个选择标记和 一个或多个复制起点， 不过， 本领域技术人员知道在某些体系内选择标记可提供在另外的 载体上， 且外源 DNA 的复制可通过整合至宿主细胞基因组中而提供。启动子、 终止子、 选择 标记、 载体和其它元件的选择是本领域常规技术的水平内的常规设计。许多这样的元件描 述于文献中且可获自商业供应者。
     为将重组蛋白质导向至宿主细胞的分泌途径， 在表达载体中提供分泌信号序列 ( 也称为前导序列， 前原序列或前序列 )。该分泌信号序列可为重组蛋白质的天然形式的， 或可衍生自另一分泌的蛋白质 ( 例如， t-PA ； 参见美国专利号 5,641,655) 或从头合成。该 分泌信号序列可操作连接至编码蛋白质的 DNA 序列， 即， 该两个序列在正确的读框中连接 并定位以将新合成的多肽引导至宿主细胞的分泌途径。 分泌信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的 DNA 序列的 5’ ， 但某些信号序列可位于感兴趣的 DNA 序列中的其它位置 ( 参见， 例 如， Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； Holland 等人， 美国专利号 5,143,830)。在具体的 变化形式中， 根据本发明使用的分泌信号序列具有选自下组的氨基酸序列 ： SEQ ID NOS ： 2， 10， 13， 15， 19， 22， 24， 29， 33， 37， 40， 42， 58， 60， 62 和 64 的残基 1-35。
     培养的哺乳动物细胞为制备用于本发明的重组蛋白质的合适的宿主。向哺乳动 物宿主细胞引入外源 DNA 的方法包括磷酸钙 - 介导的转染 (Wigler 等人， Cell 14 ： 725， 1978 ； Corsaro 和 Pearson， Somatic Cell Genetics 7 ： 603， 1981 ： Graham 和 Van der Eb， Virology 52 ： 456， 1973)， 电穿孔 (Neumann 等人， EMBO J.1 ： 841-845， 1982)， DEAE- 葡聚糖 介导的转染 (Ausubel 等人， 上文 )， 和脂质体介导的转染 (Hawley-Nelson 等人， Focus 15 ： 73， 1993 ； Ciccarone 等人， Focus 15 ： 80， 1993)。 重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的制备 公开于， 例如， Levinson 等人， 美国专利号 4,713,339 ； Hagen 等人， 美国专利号 4,784,950 ； Palmiter 等人， 美国专利号 4,579,821 ； 和 Ringold， 美国专利号 4,656,134。合适的哺乳动 物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞 (Vero ； ATCC CRL 1587)， 人胚胎肾细胞 (293-HEK ； ATCC CRL 1573)， 幼仓鼠肾细胞 (BHK-21， BHK-570 ； ATCC CRL 8544， ATCC CRL 10314)， 犬肾细胞 (MDCK ； ATCC CCL 34)， 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-K1 ； ATCC CCL61 ； CHO DG44 ； CHO DXB11(Hyclone， Logan， UT) ； 另参见， 例如， Chasin 等人， Som.Cell.Molec.Genet.12 ： 555， 1986))， 大鼠垂体细胞 (GH1 ； ATCC CCL82)， HeLa S3 细胞 (ATCC CCL2.2)， 大鼠肝癌细胞 (H-4-II-E ； ATCC CRL 1548)SV40- 转化的猴肾细胞 (COS-1 ； ATCC CRL 1650) 和鼠胚胎细胞 (NIH-3T3 ； ATCC CRL 1658)。 其他合适的细胞系是本领域已知的， 并且可以从公共保藏机构 如 American Type Culture Collection， Manassas， Virginia 获得。可使用强的转录启动 子， 如 SV-40 或巨细胞病毒的启动子。参见， 例如， 美国专利号 4,956,288。其它合适的启动 子包括来自金属硫蛋白基因的启动子 ( 美国专利 4,579,821 和 4,601,978) 和腺病毒主要 晚期启动子。
     药物选择通常用于选出已插入外源 DNA 的培养的哺乳动物细胞。这样的细胞通常 称为 “转染子” 。 在选择性试剂的存在下培养且能将感兴趣的的基因传至其后代的细胞称为 “稳定的转染子” 。示例性的选择标记包括编码对抗生素新霉素的抗性的基因， 其允许在新 霉素型药物如 G-418 等的存在下进行选择 ； 黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的 gpt 基因， 其允许宿主细胞在霉酚酸 / 黄嘌呤的存在下生长 ； 和提供对 zeocin， 博来霉素， 杀稻瘟素 (blastocidin)， 和潮霉素的抗性的标记 ( 参见， 例如， Gatignol 等人， Mol.Gen.Genet.207 ： 342， 1987 ； Drocourt 等人， Nucl.Acids Res.18 ： 4009， 1990)。选择系统也可用于增加感兴 。 扩增通过以下方式进行， 在低水平的选择剂的存在 趣基因的表达水平， 该过程称为 “扩增” 下培养转染子， 然后增加选择剂的量以选择出产生高水平的引入的基因的产物的细胞。可 扩增的选择标记的实例为二氢叶酸还原酶， 其赋予对甲氨蝶呤的抗性。其它药物抗性基因 ( 例如， 潮霉素抗性， 多药抗性， 嘌呤霉素乙酰基转移酶 ) 也可使用。
     其它高等真核细胞也可用作宿主， 包括昆虫细胞、 植物细胞和禽类细胞。 毛根土壤 杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 在植物细胞中作为用于表达基因的载体的用途已描述 于 Sinkar 等人， J.Biosci.(Bangalore)11 ： 47-58， 1987。昆虫细胞的转化和其中外源多肽 的产生公开于 Guarino 等人， 美国专利号 5,162,222 和 WIpO 公开 WO 94/06463。
     昆 虫 细 胞 可 被 通 常 衍 生 自 苜 蓿 丫 纹 夜 蛾 (Autographa californica) 核 型多 角 体 病 毒 (AcNPV) 的 重 组 杆 状 病 毒 感 染。 参 见 King 和 Possee， The Baculovirus Expression System ： A Laboratory Guide(Chapman & Hall， London) ； O’ Reilly 等 人， Baculovirus Expression Vectors ： A Laboratory Manual(Oxford University Press.， New York 1994) ； 和 Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology(Richardson ed.， Humana Press， Totowa， NJ， 1995)。重组杆状病毒也可通过使 用描述于 Luckow 等人 (J.Virol.67 ： 4566-4579， 1993) 的基于转座子的体系制备。这种 系统使用转移载体， 可以试剂盒的形式商购 (BAC-TO-BAC 试剂盒 ； Life Technologies， Gaithersburg， MD)。转移载体 ( 例如， PFASTBAC1 ； Life Technologies) 包含 Tn7 转座子， 以将编码感兴趣蛋白质的 DNA 移至作为大质粒 ( 称为 “杆粒” ) 保持在大肠杆菌中的杆状 病毒基因组中。参见 Hill-Perkins 和 Possee， J.Gen.Virol.71 ： 971-976， 1990 ； Bonning 等人， J.Gen.Virol.75 ： 1551-1556， 1994 ； 和 Chazenbalk 和 Rapoport， J.Biol.Chem.270 ： 1543-1549， 1995。此外， 转移载体可包括与上述编码多肽延伸物或亲和标签的 DNA 的合框 融合。使用本领域已知的技术， 将包含编码蛋白质的 DNA 序列的转移载体转化到大肠杆菌 宿主细胞中， 并从细胞中筛选包含断裂的 lacZ 基因 ( 其是重组杆状病毒的指示 ) 的杆粒。 使用一般技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒 DNA， 并用其转染草地贪夜蛾细胞， 如 Sf9 细胞。随后制备表达感兴趣蛋白质的重组病毒。重组病毒株通过本领域通常使用的方 法制备。 对 于 蛋 白 质 制 备， 重 组 病 毒 用 于 感 染 宿 主 细 胞， 通常为衍生自草地贪夜蛾 (Spodoptera fugiperda) 的 细 胞 系 ( 例 如， Sf9 或 Sf21 细 胞 ) 或 衍 生 自 粉 纹 夜 蛾 (Trichoplusia ni) 的细胞系 ( 例如， HIGH FIVE 细胞 ； Invitrogen， Carlsbad， CA)。一般 参 见 Glick 和 Pasternak， Molecular Biotechnology， Principles & Applications of Recombinant DNA(ASM Press， Washington， D.C.， 1994)。 也参见美国专利号 5,300,435。 无 血清培养基用于培养和保持细胞。合适的培养基制剂是本领域已知的且可获自供应商。细 胞从约 2-5x 105 细胞的接种密度生长至 1-2x 106 细胞的密度， 此时添加重组病毒株， 其感 染复数 (MOI) 为 0.1 至 10， 更典型接近 3。使用的步骤通常描述于可用的实验室手册 ( 参 见， 例如， King 和 Possee， 上文 ； O’ Reilly 等人， 上文 ； Richardson， 上文 )。
     真菌细胞， 包括酵母细胞， 也可用于本发明。 在这方面感兴趣的酵母物种包括酿酒 酵母， 毕赤酵母 (Pichia pastoris)， 和甲醇毕赤酵母。用外源 DNA 转化酿酒酵母细胞和由 此制备重组多肽的方法公开于， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kawasaki 等人， 美 国专利号 4,931,373 ； Brake， 美国专利号 4,870,008 ； Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； 通常是药物抗 和 Murray 等人， 美国专利号 4,845,075。依据由选择标记所确定的表型， 性、 或在特定营养素 ( 例如， 亮氨酸 ) 不存在的情况下生长的能力， 来选择转化的细胞。用 于酿酒酵母的载体系统的实例为 Kawasaki 等人 ( 美国专利号 4,931,373) 公开的 POT1 载体系统， 其允许通过含葡萄糖的培养基中培养来选择转化的细胞。用于酵母的合适的 启动子和终止子包括源自糖酵解酶基因 ( 参见， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kingsman 等人， 美国专利号 4,615,974 ； 和 Bitter， 美国专利号 4,977,092) 和醇脱氢酶基 因的那些。另参见美国专利号 4,990,446 ； 5,063,154 ； 5,139,936 ； 和 4,661,454。其它酵 母的转化体系， 包括多形汉逊酵母， 粟酒裂殖酵母， 乳酸克鲁维酵母， 脆壁克鲁维酵母， 玉米 黑粉菌 (Ustilago maydis)， 巴斯德毕赤酵母， 甲醇毕赤酵母， 季也蒙毕赤酵母， 和麦芽糖
     假丝酵母是本领域已知的。参见， 例如， Gleeson 等人， J.Gen.Microbiol.132 ： 3459-3465， 1986 ； Cregg， 美国专利号 4,882,279 ； 和 Raymond 等人， Yeast 14 ： 11-23， 1998。曲霉细胞 可根据 McKnight 等人， 美国专利号 4,935,349 的方法使用。转化产黄顶孢霉 (Acremonium chrysogenum) 的方法公开于 Sumino 等人， 美国专利号 5,162,228。转化链孢霉的方法公开 于 Lambowitz， 美国专利号 4,486,533。在甲醇毕赤酵母中制备重组蛋白质公开于美国专利 5,716,808 ； 5,736,383 ； 5,854,039 ； 和 5,888,768。
     原核宿主细胞， 包括细菌大肠杆菌、 芽孢杆菌属、 和其它属也是本发明中可用的宿 主细胞。转化这些宿主和表达其中克隆的外源 DNA 序列的技术是本领域已知的 ( 参见， 例 如， Sambrook 等人， 上文 )。当在细菌如大肠杆菌中表达重组蛋白质时， 该蛋白质可保持在 细胞质中， 通常作为不可溶颗粒， 或可通过细菌分泌序列导至周质空间。在前一情形， 将细 胞溶解， 回收颗粒并使用例如胍异硫氰酸酯或脲使其变性。然后变性的蛋白质可通过稀释 变性剂 ( 例如， 通过对脲与还原型和氧化型的谷胱甘肽的组合的溶液透析， 然后对缓冲盐 水溶液透析 ) 而重折叠和二聚化。或者， 该蛋白质可以可溶形式从细胞质回收， 并在不使 用变性剂的情况下分离。蛋白质作为水提取物 ( 例如磷酸盐缓冲盐水中的水提取物 ) 从 细胞回收。为了捕捉感兴趣的蛋白质， 将提取物直接施加至色谱介质， 如固定的抗体或肝 素 -Sepharose 柱。分泌的蛋白质可以以可溶的、 有功能的形式从周质空间回收， 方法是破 裂细胞 ( 通过， 例如， 超声处理或渗透压冲击 ) 以释放周质空间的内含物和回收蛋白质， 从 而无需变性和重折叠。 抗体， 包括单链抗体， 可在细菌宿主细胞中根据已知方法制备。 参见， 例如， Bird 等人， Science 242 ： 423-426， 1988 ； Huston 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5879-5883， 1988 ； 和 Pantoliano 等人， Biochem.30 ： 10117-10125， 1991。
     转化或转染的宿主细胞根据常规步骤在含营养素和所选宿主细胞的生长所需的 其它组分培养基中培养。 多种合适的培养基， 包括确定成分培养基和复合培养基， 是本领域 已知的， 且通常包括碳源、 氮源， 必需氨基酸， 维生素和矿物质。 培养基可按需要包含生长因 子或血清之类的成分。生长培养基通常会选择包含外源添加的 DNA 的细胞， 例如通过药物 选择或必须营养素的缺乏， 该必须营养素通过表达载体携带的或者共转染到宿主细胞中的 选择标记补充。
     包 含 VEGF-A 抗 体 / 可 溶 FGF 受 体 双 特 异 性 结 合 蛋 白 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 通 过 常 规 蛋 白 质 纯 化 方 法 纯 化， 通 常 通 过 色 谱 技 术 的 组 合 纯 化。 一 般 参 见 Affinity Chromatography ： Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology， Uppsala ，Sweden ， 1988) ； Scopes ，Protein Purification ： Principles and Practice(Springer-Verlag， New York 1994)。包含免疫球蛋白重链多肽的蛋白质可通过 亲和色谱法在固定的蛋白质 A 上纯化。可采用进一步的纯化步骤， 如凝胶过滤， 来获得所需 水平的纯度或提供脱盐， 缓冲液交换等。
     抗体可从细胞培养基通过已知方法， 如亲和色谱法使用常规柱和其它设备纯化。 在典型的程序中， 收集条件化培养基， 且可将其在 4℃储存至多 5 天。 为避免污染， 通常添加 抑菌剂 ( 例如， 叠氮化钠 )。降低培养基的 pH( 通常至 Ph ～ 5.5)， 如通过滴加冰醋酸。较 低的 pH 提供通过蛋白 G 树脂的最佳的 IgG 俘获。该蛋白质 G 柱的尺寸基于条件化培养基 的体积确定。用合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2 中和填充好的柱子。然 后使培养基通过中和的蛋白质 g 树脂， 流速由培养基体积和柱尺寸确定。保留穿透液以备可能的再次过柱。然后将具有俘获的抗体的树脂冲洗成中和缓冲液。使用酸性洗脱缓冲 液， 如 0.1M 甘氨酸， pH 2.7 或等价物将柱子洗脱为级分。中和各级分， 例如使用 2M tris， pH 8.0， 以 tris ∶甘氨酸的 1 ∶ 20 比例。汇集包含蛋白质的级分 ( 例如， 基于 A280)。汇集 的级分使用脱盐柱缓冲液交换至合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2。通过 A280 使用消光系数 1.44 测定浓度。内毒素水平可通过 LAL 测定法确定。纯化蛋白质可冷冻 储存， 通常在 -80℃。
     表达功能性 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的细胞在筛选测定中 使用。多种合适的测定是本领域已知的。这些测定基于对靶细胞中生物响应的检测。一 种这样的测试为细胞增殖测试。在存在或不存在测试化合物的情况下培养细胞， 且通过， 例如， 测量氚化的胸苷的掺入或通过基于 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四唑 鎓溴化物 (MTT) 的代谢分解的比色测定细胞增殖 (Mosman， J.Immunol.Meth.65 ： 55-63， 1983) 检测。一种备选的测定法形式使用进一步工程化以表达报道基因的细胞。该报道基 因连接于对受体连接的途径响应的启动子元件， 该测定法检测该报道基因的转录的活化。 在此方面， 优选的启动子元件为血清响应元件， 或称 SRE。( 参见， 例如， Shaw 等人， Cell 56 ： 563-572， 1989)。优选的该报道基因是荧光素酶基因。( 参见 de Wet 等人， Mol.Cell. Biol.7 ： 725， 1987.)。使用本领域已知方法通过发光检测荧光素酶基因的表达。( 参见， 例 如， Baumgartner 等 人， J.Biol.Chem.269 ： 29094-29101， 1994 ； Schenborn 和 Goiffin， Promega Notes 41 ： 11， 1993.)。荧光素酶活性测定试剂盒可购自， 例如， Promega Corp.， Madison， WI。该类型的靶细胞系可用于筛选化学物质库， 细胞条件化的培养基， 真菌培养 液， 土壤样， 水样， 等。 例如， 可在靶细胞上测定细胞条件化的培养基样品的库以鉴别产生配 体的细胞。 然后用阳性细胞在哺乳动物表达载体中产生 cDNA 文库， 将文库分池 (pools)， 转 染到宿主细胞中， 表达。 然后测定转染的细胞的培养基样品， 随后进一步分池， 再转染， 传代 培养， 且重新测定阳性细胞以分离编码配体的克隆 cDNA。
     IV. 治疗方法
     A. 概述
     在另一方面， 本发明提供抑制血管发生的方法， 特别是治疗与血管发生相关的疾 病或疾患的方法。一般而言， 该方法包括向受试者施用可有效抑制血管发生的量的包含双 特异性抗体 / 可溶受体组合的双特异性结合蛋白。更具体地， 对于治疗用途， 将该双特异性 结合蛋白施用于患有， 或有升高的风险患上以血管发生增加为特征的疾病或疾患 (“新生 血管疾病” ) 的患者。适合根据本发明治疗的新生血管疾病包括， 例如， 以实体瘤生长为特 征的癌症 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC)， 成胶质细 胞瘤， 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及多种新生血管眼病 ( 例如， 年龄相关的黄斑变性， 糖尿 病性视网膜病， 虹膜新生血管形成， 和新生血管性青光眼 )。其它适合根据本发明治疗的新 生血管疾病包括， 例如， 类风湿性关节炎， 银屑病， 动脉粥样硬化， 慢性炎症， 肺炎症， 先兆子 痫， 心包渗漏 ( 如与心包炎相关的 )， 和胸腔积液。
     在本文所述治疗方法的每一实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的递送方式符合与寻求治疗的疾病 或疾患的管理相关的常规方法学。根据本文的公开， 在足以预防或治疗疾病或疾患的条件 下、 以足以预防或治疗疾病或疾患的时间向需要该治疗的受试者施用有效量的拮抗剂。施用本文描述的双特异性结合蛋白的受试者包括有较高的风险发生特定的与血 管发生相关的疾病或疾患的患者， 也包括表现出现有的新生血管疾病的患者。在某些实施 方案中， 该受试者已诊断为患有寻求治疗的疾病或疾患。 而且， 可在治疗过程中监测受试者 任何疾病或疾患的变化 ( 例如， 监测疾病或疾患的临床症状的增加或减少 )。
     在预防性的应用中， 将药物组合物或药物施用于对特定疾病易感或具有其他风险 的患者， 施用的量足以消除或减少疾病的风险或延迟疾病的发生。 在治疗性的应用中， 将组 合物或药物施用于疑似患有， 或已患有该疾病的患者， 施用的量足以治愈， 或至少部分阻止 该疾病症状及其并发症。足以实现该目的的量称为治疗有效量或药物有效量。在预防和治 疗方案两者中， 药物通常施用多个剂量直到达到充分的响应 ( 例如， 抑制不合适的血管发 生活性 )。通常， 监测该响应， 如果期望响应开始消退则给予重复的剂量。
     为鉴别用于根据本发明的方法治疗的受试患者， 可使用公认的筛选方法来确定 与特定的新生血管疾病相关的风险因素或确定受试者中确认的已有疾病的状态。这样的 方法可包括， 例如， 确定个体是否有亲属被诊断有特定疾病。筛选方法还可包括， 例如， 对 已知具有可遗传的成分的具体疾病进行常规病情检查以确定家族状态。例如， 多种癌症 还已知具有某些可遗传的成分。癌症的可遗传的成分包括， 例如， 多种转化中的基因 ( 例 如， Ras， Raf， EGFR， cMet， 及其他 ) 内的突变， 某些 HLA 和杀伤抑制性受体 (KIR) 分子的有 无， 或癌细胞能直接或间接调节细胞如 NK 细胞和 T 细胞的免疫抑制的机理 ( 参见， 例如， Ljunggren 和 Malmberg， Nature Rev.Immunol.7 ： 329-339， 2007 ； Boyton 和 Altmann， Clin. Exp.Immunol.149 ： 1-8， 2007)。 为此目的， 可常规性地使用核苷酸探针鉴定携带与感兴趣的 具体疾病相关的遗传标记的个体。 此外， 很多种免疫方法是本领域已知的， 可用于鉴别特定 疾病的标记。例如， 有多种 ELISA 免疫测定方法可以使用， 且为本领域公知， 这些方法使用 单克隆抗体探针检测与特定肿瘤相关的抗原。 可按照已知的患者症状， 年龄因素， 相关风险 因素等的指示来实施筛选。 这些方法允许临床医师常规地选择需要本文所述治疗方法的患 者。根据这些方法， 血管发生的抑制可作为独立治疗过程进行， 或作为其它治疗的后续的、 辅助的、 或协同的治疗方案。
     对于施用， 该包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白配制为药物组合物。 包含双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合的药物组合物可根 据已知方法配制以制备可药用组合物， 其中将治疗分子与可药用的载体组合为混合物。如 果组合物的施用可被接受的患者耐受， 则其称为 “可药用的载体” 。无菌磷酸盐缓冲盐水为 可药用的载体的一个实例。其它合适的载体是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995))。制剂可进一步包括一种或多种赋形剂， 防腐剂， 增溶剂， 缓冲剂， 用于防止小瓶 表面上蛋白质损失的白蛋白等。单特异性拮抗剂可单独配制或以组合制剂提供。
     包含含有 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的 药物组合物以有效量施用于受试者。根据本发明的方法， 拮抗剂可通过多种施用方式施用 于受试者， 包括例如， 肌内， 皮下， 静脉内， 心房内， 关节内， 肠胃外， 鼻内， 肺内， 经皮， 胸膜 内， 鞘内， 和口腔施用途径。对于治疗新生血管眼病的药物用途， 该双特异性结合蛋白通常 根据常规方法配制为用于玻璃体内注射。对于治疗和预防目的， 拮抗剂可以以下方式施用 于受试者 ： 单次推注递送、 长时间连续递送 ( 例如， 连续经皮递送 )， 或以重复的施用方案( 例如， 基于每小时， 每日， 或每周 )。
     组合物的 “治疗有效量” 是产生统计学显著效果的量， 如疾病进展的统计学显著减 少或器官功能的统计学显著改善。精确剂量将通过临床医师根据公认的标准确定， 其中考 虑治疗症状的性质和严重性、 患者特征等。剂量的确定在本领域技术人员水平范围内。
     此语境中有效剂量的确定通常基于动物模型研究， 然后是人体临床试验， 并通过 确定可显著减少模型受试者中受试者疾病或疾患的发生或严重性的有效剂量和施用方案 来指导。本发明的组合物的有效剂量根据多种不同的因素改变， 包括施用手段， 靶位点， 患 者生理状态， 患者为人还是动物， 施用的其它药物， 该治疗为预防性还是治疗性， 以及组合 物本身具体活性及其在个体中引起所需响应的能力。通常， 该患者是人， 但在一些疾病中， 该患者可为非人哺乳动物。通常， 对剂量方案进行调节以提供最佳治疗响应， 即， 优化安全 性和功效。 因此， 治疗性或预防性有效量也是这样的量， 其中抑制血管发生的有利作用大于 任何不想要的副作用。 对于施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白， 剂量通常为约 0.1μg 至 100mg/kg 或 1μg/kg 至约 50mg/kg， 更通常为 10μg 至 5mg/kg 受试者体重。 在更具体的实施方案中， 药物的有效量为约 1μg/kg 至约 20mg/kg， 约 10μg/kg 至约 10mg/kg， 或约 0.1mg/kg 至约 5mg/kg。该范围的剂量可通过单一或多次 施用实现， 包括， 例如， 每日施用多次或每日、 每周、 每两周或每月施用一次。 例如， 在某些变 化形式中， 施用方案由初始施用和之后的间隔一周或两周的多次施用组成。另一方案由初 始施用和之后的间隔一月或两月的多次施用组成。 或者， 施用可以是不规则的， 通过监测 NK 细胞活性和 / 或疾病或疾患的临床症状来指示。
     药物组合物的剂量可由主治医师加以改变以保持靶位处所需的浓度。例如， 如果 选择静脉内递送模式， 靶组织处血流中药物的局部浓度可为约 1-50 纳摩尔组合物 / 升， 有 时为约 1.0 纳摩尔 / 升至 10， 15， 或 25 纳摩尔 / 升， 取决于受试者的状态和预计的测量响 应。可基于递送方式 ( 例如是经表皮递送还是递送至粘膜的表面 ) 选择较高或较低浓度。 剂量也应基于施用的制剂 ( 例如， 鼻喷雾剂对粉末， 缓释口服或注射颗粒， 经皮制剂等 ) 的 释放速率而调节。为达到相同的血清浓度水平， 例如， 释放速率为 5 纳摩尔 ( 标准条件下 ) 的缓慢释放颗粒的施用剂量为释放速率为 10 纳摩尔的颗粒的剂量的约两倍。
     包括含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的药物 组合物可以以液体形式、 喷雾剂或固体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液、 气雾剂、 滴液、 表面用溶液和口服悬液。示例性的固体形式包括胶囊、 片剂和控释形式。后一形式的 示例有微渗透压泵和植入物。 ( 参见， 例如， Bremer 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 239， 1997 ； Ranade， Drug Delivery Systems 95-123 中的 “Implants in Drug Delivery， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Bremer 等人， Protein Delivery ： Physical Systems 239-254 中的 “Protein Delivery with Infusion Pumps， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Yewey 等 人， Protein Delivery ： Physical Systems 93-117 中 的 “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997))。其它固体形式包括乳膏， 糊剂， 其它表面敷剂等。
     脂质体提供了一种手段来向受试者递送治疗多肽， 例如， 静脉内递送， 向腹膜 内递送， 鞘内递送， 肌内递送， 皮下递送， 或通过口服施用、 吸入、 或鼻内施用递送。脂 质体为微囊泡， 其由围绕着水性隔室的一个或多个脂质双层组成。( 参见， 一般性的，Bakker-Woudenberg 等 人， Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1) ： S61， 1993 ； Kim， Drugs 46 ： 618， 1993 ； Ranade， Drug Delivery Systems 3-24 中 的 “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995))。脂质体的组成与细胞膜相似， 因此， 脂质体可安全施用且生物可降解。取决于制备 方法， 脂质体可为单层的或多层的， 且脂质体的尺寸可变化， 直径从 0.02μm 至大于 10μm 不等。 多种试剂可包囊在脂质体中 ： 疏水试剂分配在双层中， 而亲水性试剂分配在内部水性 空间中。( 参见， 例如， Machy 等人， Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987) ； Ostro 等人， American J.Hosp.Pharm.46 ： 1576， 1989)。 而且， 可通过改变脂 质体尺寸、 双层的数量、 脂质组成、 以及脂质体的电荷和表面特征来控制包囊的试剂的治疗 可利用度 (therapeutic availability)。
     脂质体可吸附至几乎任何类型的细胞， 然后缓慢释放包囊的试剂。 或者， 吸附的脂 质体可被吞噬性的细胞内吞。 内吞作用之后发生脂质体脂质的溶酶体内降解和包囊的试剂 的释放 ( 参见 Scherphof 等人， Ann.N.Y.Acad.Sci.446 ： 368， 1985)。静脉内施用后， 小的脂 质体 (0.1 至 1.0μm) 通常被主要位于肝和脾中网状内皮系统的细胞所摄取， 而大于 3.0μm 的脂质体沉积在肺中。 网状内皮系统的细胞对较小脂质体的这种优先吸收作用已经被利用 来将化学治疗剂递送至巨噬细胞和肝的肿瘤。 可通过多种方法避开网状内皮系统， 包括用大剂量的脂质体颗粒饱和， 或通过药 理手段选择性地对巨噬细胞灭活 ( 参见 Claassen 等人， Biochim.Biophys.Acta 802 ： 428， 1984)。 此外， 已显示将用糖脂或聚乙二醇衍生化的磷脂掺入脂质体膜可导致网状内皮系统 的吸收显著减少 ( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1068 ： 133， 1991 ； Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     也可在制备脂质体时通过改变磷脂组成或向脂质体插入受体或反受体 (counter-receptors) 以靶向特定细胞或器官。例如， 制备为带有高含量非离子表面活性 剂的脂质体已被用于靶向肝。( 参见， 例如， Hayakawa 等人的日本专利 04-244,018 ； Kato 等人， Biol.Pharm.Bull.16 ： 960， 1993)。这些制剂通过以下方式制备 ： 在甲醇中混合大豆 磷脂酰胆碱、 α- 生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油 (HCO-60)， 真空浓缩该混合物， 然后用水复 原该混合物。二棕榈酰基磷脂酰胆碱 (DPPC) 和大豆衍生的甾酰基葡糖苷混合物 (SG) 和胆 固醇 (Ch) 的脂质体制剂已显示靶向肝。( 参见 Shimizu 等人， Biol.Pharm.Bull.20 ： 881， 1997)。
     或者， 可将多种靶向性反受体连接于脂质体的表面， 如抗体， 抗体片段， 碳水化合 物， 维生素， 和转运蛋白。例如， 为了靶向肝脏， 可用支链型的半乳糖基脂质衍生物修饰脂 质体以靶向脱唾液酸糖蛋白 ( 半乳糖 ) 受体， 此类受体仅在肝细胞表面表达。( 参见 Kato 和 Sugiyama， Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14 ： 287， 1997 ； Murahashi 等 人， Biol. Pharm.Bull.20 ： 259， 1997)。根据一种更通用的组织靶向方法， 用对靶细胞表达的反受体 特异的生物素化抗体预先标记靶细胞。( 参见 Harasym 等人， Adv.Drug Deliv.Rev.32 ： 99， 1998)。血浆清除游离抗体后， 施用链亲和素缀合的脂质体。在另一方法中， 将靶向性抗体 直接连接至脂质体。( 参见 Harasym 等人， 上文 )。
     多 肽 和 抗 体 可 使 用 蛋 白 质 微 囊 化 的 标 准 技 术 包 封 在 脂 质 体 中。( 参 见， 例 如， Anderson 等 人， Infect.Immun.31 ： 1099， 1981 ； Anderson 等 人， Cancer Res.50 ：
     1853， 1990 ； Cohen 等 人， Biochim.Biophys.Acta 1063 ： 95， 1991 ； Alving 等 人 Liposome Technology(Vol.III)317 中的 “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies， ” (Gregoriadis， ed.， CRC Press， 2nd ed.1993) ； Wassef 等人， Meth.Enzymol.149 ： 124， 1987.)。如上所述， 治疗上有用的脂质体可包含多种组分。例如， 脂质体可包含聚 ( 乙 二醇 ) 的脂质衍生物。( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     已设计了可降解聚合物微球以保持治疗蛋白质的高全身水平。 微球从可降解聚合 物制备， 如丙交酯乙交酯共聚物 (PLG)， 聚酸酐， 聚 ( 原酸酯 )， 非生物可降解的乙基乙酸乙 烯酯聚合物， 其中蛋白质圈闭在聚合物中。( 参见， 例如， Gombotz 和 Pettit， Bioconjugate Chem.6 ： 332， 1995 ； Ranade， “Role of Polymers in Drug Delivery， ” in Drug Delivery Systems 51-93(Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Roskos and Maskiewicz， “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery， ” in Protein Delivery ： PhysicalSystems 45-92(Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Bartus 等人， Science 281 ： 1161， 1998 ； Putney and Burke， Nature Biotechnology 16 ： 153， 1998 ； Putney， Curr..Opin.Chem.Biol.2 ： 548， 1998)。聚乙二醇 (PEG) 包被的纳米球 也可提供静脉内施用治疗蛋白质的载体。( 参见， 例如， Gref 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 167， 1997)。
     本领域技术人员可设计其它剂型， 例如可见， Ansel 和 Popovich， Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lea & Febiger ， 5th ed.1990) ； Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995)， 和 Ranade 和 Hollinger， Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)。
     本文所述的药物组合物也可在联合治疗的背景下使用。术语 “联合治疗” 在本文 使用时， 是指对受试者施用至少一个治疗有效剂量的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特 异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和另一治疗剂。 例如， 在癌症免疫治疗的背景下， 包含含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组合物可用作血管发 生抑制剂与化疗或放射联合。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白可与常规类型的化疗或放射协同作用。 该双特异性结合蛋白可进一步减少肿 瘤负担并可使得化疗剂的杀灭作用更有效。
     显示血管发生抑制活性的本发明的组合物也可与免疫调节化合物 ( 包括多种细 胞因子和共刺激 / 抑制分子 ) 联合使用。它们可包括， 但不限于， 使用刺激抗癌免疫应答 的细胞因子。例如， 组合使用 IL-2 和 IL-12 在 T- 细胞淋巴瘤， 鳞状上皮细胞癌， 和肺癌中 显示有益作用。( 参见 Zaki 等人， J.Invest.Dermatol.118 ： 366-71， 2002 ； Li 等人， Arch. Otolaryngol.Head Neck Surg.127 ： 1319-24， 2001 ； Hiraki 等人， Lung Cancer 35 ： 329-33， 2002)。 此外， VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白可与共刺激基于免疫的效应细 胞上发现的多种细胞表面分子的试剂组合， 如 CD137 的活化。( 参见 Wilcox 等人， J.Clin. Invest.109 ： 651-9， 2002) 或 CTLA4 的抑制 (Chambers 等人， Ann.Rev.Immunol.19 ： 565-94， 2001)。或者， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可 与通过与 TRAIL- 相关的受体的相互作用诱导肿瘤细胞凋亡的试剂一起使用。 ( 参见， 例如， Takeda 等人， J.Exp.Med.195 ： 161-9， 2002 ； Srivastava， Neoplasia 3 ： 535-46， 2001)。这 样的试剂包括 TRAIL 配体， TRAIL 配体 -Ig 融合物， 抗 TRAIL 抗体， 等。在其它变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与不特异靶向血管发生的单克隆抗体治疗联合使用。 该联合治疗特别用于治疗 癌症， 其中使用单克隆抗体， 特别是针对肿瘤表达的抗原的抗体， 正在成为对许多肿瘤 ( 包 括乳腺细胞癌 ( 曲妥单抗或 HERCEPTIN ) 和结肠癌 ( 西妥昔单抗或 ERBITUX )) 的标准做 法。
     药物组合物可作为试剂盒提供， 该试剂盒包含含本文所述的治疗组合物的容器。 治疗组合物可提供为， 例如， 单剂或多剂施用的可注射溶液形式， 或作为在注射前复原的无 菌粉末。或者， 该试剂盒可包括用于施用治疗组合物的干粉分散器， 液体气雾剂发生器， 或 喷雾器。该试剂盒可进一步包含关于适应症和药物组合物的用途的书面信息。
     B. 癌症治疗
     1. 癌症类型
     根据本发明可治疗的癌症包括以实体瘤的存在为特征的癌症。如前人讨论的， 肿 瘤组织中血管的量是涉及实体瘤形成的癌症的强的负面预后指标 ( 参见， 例如， Weidner 等 人， (1992)， 上文 ； Weidner 等人， (1993)， 上文 ； Li 等人， 上文 ； Foss 等人， 上文 )， 且 VEGF 和 FGF 信号分子家族都显示出在实体瘤相关的新血管形成中起关键作用。下表 4 列出一些特 征为实体瘤形成的癌症， 主要通过靶组织分类。
     表4： 涉及实体瘤形成的示例性癌症
     因此， 在某些实施方案中， 本文所述的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白用于治疗特征为存在实体瘤的癌症， 例如， 表 4 所列的任一 种癌症。 例如， 在一些实施方案中， 要根据本发明治疗的癌症选自下列 ： 头颈部癌症 ( 例如， 口腔， 口咽， 鼻咽， 下咽， 鼻腔或鼻旁窦， 喉， 唇， 或唾液腺的癌症 ) ； 肺癌 ( 例如， 非小细胞肺
     癌， 小细胞癌， 或间皮瘤 ) ； 胃肠道癌 ( 例如， 结肠直肠癌， 胃癌， 食管癌， 或肛门癌 ) ； 胃肠 道间质瘤 (GIST) ； 胰腺癌 ； 胰腺腺泡细胞癌 ； 小肠的癌症 ； 肝癌或胆系癌 ( 例如， 肝细胞腺 瘤， 肝细胞癌， 血管肉瘤， 肝外或肝内胆管肉瘤， 法特壶腹癌， 或胆囊癌 ) ； 乳腺癌 ( 例如， 转 移性乳腺癌或炎性乳腺癌 ) ； 妇科癌症 ( 例如， 子宫颈癌， 卵巢癌， 输卵管癌症， 腹膜癌， 阴道 癌， 外阴癌症， 妊娠性滋养层细胞瘤形成， 或子宫癌， 包括子宫内膜癌或子宫肉瘤 ) ； 泌尿道 癌症 ( 例如， 前列腺癌 ； 膀胱癌 ； 阴茎癌 ； 尿道癌， 或肾癌， 例如， 肾细胞癌或移行细胞癌， 包 括肾盂和输尿管 ) ； 睾丸癌 ； 中枢神经系统 (CNS) 癌症如颅内肿瘤 ( 例如， 星形细胞瘤， 间 变性星形细胞瘤， 成胶质细胞瘤， 少突胶质细胞瘤， 间变性少突胶质细胞瘤， 室管膜瘤， 原发 性 CNS 淋巴瘤， 成神经管细胞瘤， 生殖细胞瘤， 松果腺瘤， 脑膜瘤， 垂体肿瘤， 神经鞘肿瘤 ( 例 如， 神经鞘瘤 )， 脊索瘤， 颅咽管瘤， 脉络丛肿瘤 ( 例如， 脉络丛癌 ) ； 或其它神经元或神经胶 质起源的颅内肿瘤 ) 或脊髓肿瘤 ( 例如， 神经鞘瘤， 脑膜瘤 ) ； 内分泌瘤 ( 例如， 甲状腺癌， 例如， 甲状腺癌， 髓样癌症， 或甲状腺淋巴瘤 ； 胰腺内分泌肿瘤， 例如， 胰岛素瘤或胰高血糖 素瘤 ； 肾上腺癌， 例如， 嗜铬细胞瘤 ； 类癌瘤 ； 或甲状旁腺癌 ) ； 皮肤癌 ( 例如， 鳞状上皮细胞 癌； 基底细胞癌 ； 卡波西肉瘤 ； 或恶性黑素瘤， 例如， 眼内黑素瘤 ) ； 骨癌 ( 例如， 骨肉瘤， 例 如， 骨肉瘤， 骨软骨瘤， 或尤因氏肉瘤 ) ； 多发性骨髓瘤 ； 绿色瘤 ； 软组织肉瘤 ( 例如， 纤维性 肿瘤或纤维组织细胞瘤 ) ； 平滑肌或骨骼肌肿瘤 ； 血液或淋巴管血管周围肿瘤 ( 例如， 卡波 西肉瘤 ) ； 滑膜肿瘤 ； 间皮瘤 ； 神经肿瘤 ； 副神经节肿瘤 ； 骨骼外软骨或骨肿瘤 ； 和多能间质 瘤。
     在一些变化形式中， 待治疗的癌症是儿童期癌症， 例如， 脑癌， 神经母细胞瘤， 维尔 姆斯瘤 ( 肾胚细胞瘤 )， 横纹肌肉瘤， 视网膜母细胞瘤， 或肝母细胞瘤。
     在其它变化形式中， 癌症为免疫治疗敏感性癌症， 例如， 黑素瘤， 肾癌， 乳腺癌， 前 列腺癌， 结肠直肠癌， 子宫颈癌， 卵巢癌， 或肺癌。
     在以下进一步详细描述上述癌症中的一些， 包括一些评价 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用的相关动物模型。
     a. 前列腺癌
     前列腺癌是男性生殖系统中发现于膀胱下侧、 直肠之前的一个腺体中的异常生 长。几乎所有前列腺癌都产生自前列腺中的分泌性腺细胞， 因此都是前列腺腺癌。在美国， 前列腺癌症是男性中的普通恶性癌症， 仅次于肺癌。 前列腺癌主要为老年男性的肿瘤， 当扩 散时其经常响应于治疗， 且当局部化时可被治愈。估计 17％的男性将在一生中被诊断出前 列腺癌。该肿瘤通常作为小的、 界限清楚的病变发生， 且可经常作为多发性原发肿瘤存在 (Villers 等人 .1992)。进展在局部和远端都发生， 通常达到精囊、 射精管和骨盆淋巴结， 在 更晚期达到骨、 肝和肺。一旦转移发生， 癌细胞增殖的速率加快。
     包含可溶 FGF 受体和抗 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物对肿瘤响应的作用可 在小鼠模型中评估， 有可用的前列腺癌小鼠模型 (Ahmad 等人综述， Expert Rev Mol Med， 10 ： e16(2008))， 在实施例 12 中有提供。
     b. 黑素瘤
     浅表性播散性黑素瘤是最普通类型的黑素瘤。约十分之七 (70％ ) 为该类型。它 们最经常发生于中年人。 最通常的位置为女性的腿上， 而男性中其更通常在躯干上， 特别是 背部。它们开始时往往穿过皮肤表面扩散， 这被称为放射生长期。如果在该阶段去除黑素瘤， 治愈的几率非常高。如果不去除黑素瘤， 其将开始向下更深地生长进入皮肤层。然后它 就有在血流或淋巴系统中扩散至身体其它部分的风险。 结节性黑素瘤最通常在胸或背上发 生。其最通常发现于中年人。如果不去除， 其容易很快地生长进入皮肤深处。该类型的黑 素瘤经常从皮肤表面凸起， 触觉像肿块。可为极深褐 - 黑色或黑色。恶性雀斑样黑素瘤最 经常存在于脸上， 特别是老年人。其生长缓慢， 发展可历时数年。肢端黑素瘤通常存在于 手掌， 足底或趾甲周围。其它的极少见类型的皮肤黑素瘤包括无黑色素性黑素瘤 ( 其中黑 素瘤失去其色素且呈现白色区域 ) 和结缔组织增生性黑素瘤 ( 其包括纤维疤组织 )。恶性 黑素瘤可从皮肤之外的身体部分发生， 但这非常少见。可能受影响的身体部分为眼、 口、 指 ( 趾 ) 甲下 ( 称为甲下黑素瘤 )、 外阴或阴道组织， 或身体内部。
     大多数黑素瘤首先是正常皮肤外观的变化。这可看起来像异常的新痣。少于三分 之一在现有的痣中发生。可能难以认出痣和黑素瘤的差异， 但可使用以下清单辅助。其已 知为 ABCD 清单。不对称性 - 普通的痣通常形状对称。黑素瘤很可能为不规则的或不对称 的。 边界 - 痣通常具有界限清晰的规则边界。 黑素瘤更可能具有锯齿状边缘的不规则边界。 颜色 - 痣通常为均匀棕色的。黑素瘤倾向于具有多于一种颜色。它们可以有不同的色调， 棕色混合有黑、 红、 粉、 白色或淡蓝色。直径 - 痣通常不大于铅笔的平端 ( 径向约 6mm)。黑 素瘤通常直径大于 7mm。通常痣可从皮肤凸起和 / 或可有毛。搔痒、 结痂或出血也可发生 于黑素瘤 - 这些是较少出现的迹象但不应忽视 (cancerbacup 互联网网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于 下列文献中所述的的鼠黑素瘤模型中评估 Hermans 等人， Cancer Res.63 ： 8408-13， 2003 ； Ramont 等 人， Exp.Cell.Res.29 ： 1-10， 2003 ； Safwat 等 人， J.Exp.Ther.Oncol.3 ： 161-8， 2003 ； 和 Fidler， Nat New Biol.242 ： 148-9， 1973。
     c. 肾细胞癌
     肾细胞癌为涉及肾小管细胞中的癌性变化的肾癌形式， 其为成人肾癌的最普遍形 式。细胞为什么会变为癌性还未知。吸烟史极大增加发生肾细胞癌的风险。一些人也可 能自遗传获得了发生肾细胞癌的增加的风险， 且家族肾癌病史增加该风险。患有希普尔病 ( 一种影响脑毛细血管的遗传疾病 ) 的人， 通常也发生肾细胞癌。 需要透析治疗的肾疾病也 增加发生肾细胞癌的风险。最初症状通常为尿血。有时两个肾都受累。该癌症容易转移或 扩散， 最经常转移或扩散至肺和其它器官， 且约三分之一的患者在诊断时已转移 (Medline Plus Medical Encyclopedia 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白 的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠肾细胞癌模型中 评估 ： Sayers 等人， Cancer Res.50 ： 5414-20， 1990 ； Salup 等人， Immunol.138 ： 641-7， 1987 ； 和 Luan 等人， Transplatation 73 ： 1565-72， 2002。
     d. 子宫颈癌
     子宫颈为通向阴道的子宫的颈部。 子宫颈癌， 也称为宫颈癌， 发生自子宫颈表面的 异常细胞。 子宫颈癌是影响女性的最常见癌症之一。 在子宫颈癌发生之前通常有发育异常， 子宫颈表面细胞的癌前变化。 这些异常细胞可发展为浸润性癌症。 一旦该癌症出现， 其可经 由四个阶段进展。这些阶段是根据癌症扩散的程度定义的。癌症扩散得越多， 治疗可能约 深切。 子宫颈癌有两种主要类型 ： (1) 鳞状类型 ( 表皮样癌 ) ： 这是最常见的类型， 占子宫颈 癌的约 80％至 85％。该癌症可由性传播疾病引起。一种这样的性病为人乳头状瘤病毒， 其引起尖锐湿疣。该癌症肿瘤在子宫颈上生长并进入子宫颈。该癌症通常起始于子宫颈表面 且可在早期通过巴氏涂片诊断。(2) 腺癌 ： 该类型的子宫颈癌发生于子宫颈管中的宫颈腺 的组织。早期子宫颈癌通常不引起症状。该癌症通常通过巴氏涂片和骨盆检查检测。这就 是为什么你一旦有性活动就应开始进行巴氏涂片和骨盆检查的原因。 从未有性活动的健康 年轻女性应在 18 岁之前进行首次每年的骨盆检查。晚期子宫颈癌引起异常阴道出血或在 预期外的时间 ( 如月经期之间， 性交后， 或绝经后 ) 排出血污。异常阴道排放可为混浊的或 带血的或可包含具有恶味的粘液。 癌症晚期可引起疼痛 (University of Michigan Health System 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠子宫颈癌模型中评估 ： Ahn 等人， Hum. Gene.Ther.14 ： 1389-99， 2003 ； Hussain 等人， Oncology 49 ： 237-40， 1992 ； 和 Sengupta 等 人， Oncology 48 ： 258-61， 1991。
     e. 头颈部肿瘤
     大多数头颈部癌症是称为 “癌” (carcinoma) 的类型 ( 特别是鳞状上皮细胞癌 )。 头颈部的癌起源于构成口、 鼻、 喉或耳的内层， 或覆盖舌的表面层的细胞。 然而， 头颈部癌症 可发生于其它类型的细胞。淋巴瘤发生于淋巴系统细胞。肉瘤发生于构成肌肉、 软骨或血 管的支持性细胞。黑素瘤起始于称为黑素细胞的细胞， 这类细胞给予眼和皮肤颜色。头颈 部的癌症的症状将取决于其位置 - 例如， 舌癌可引起一些语言迟钝。最通常的症状为发生 的头或颈的、 几周内不痊愈的溃疡或损伤区域 ； 吞咽困难， 或咀嚼或吞咽时疼痛 ； 呼吸或讲 话困难， 如持续性呼吸杂音， 语言迟钝或嘶哑 ； 口中麻木感觉 ； 持续鼻塞， 或鼻出血 ； 持续耳 痛， 耳鸣， 或听力困难 ； 口或颈肿胀或肿块 ； 面部或上颌疼痛 ； 在吸烟或咀嚼烟草的人群中， 癌前变化可发生于口的衬里， 或在舌上。 这些可显现为持续白斑 ( 粘膜白斑病 ) 或红斑 ( 粘 膜红斑病 )。它们通常不疼但有时会溃疡且可出血 (Cancerbacup 网站 )。包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下 列文献中所述的鼠头颈肿瘤模型中评估 ： Kuriakose 等人， Head Neck 22 ： 57-63， 2000 ； Cao 等人， Clin.Cancer Res.5 ： 1925-34， 1999 ； Hier 等人， Laryngoscope 105 ： 1077-80， 1995 ； Braakhuis 等人， Cancer Res.51 ： 211-4， 1991 ； Baker， Laryngoscope 95 ： 43-56， 1985 ； 和 Dong 等人， Cancer Gene.Ther.10 ： 96-104， 2003。
     f. 脑癌
     已知脑组织中产生的肿瘤称为脑的原发性肿瘤。 原发性脑肿瘤根据其发源的细胞 类型或其产生的脑的部位命名。最常见的原发性脑肿瘤为神经胶质瘤。它们产生于胶质细 胞。神经胶质瘤有许多类型。(1) 星形细胞瘤 - 该肿瘤产生自呈星形的胶质细胞， 称为星形 细胞。在成人中， 星形细胞瘤最经常产生自大脑。在儿童中， 它们发生于脑干、 大脑和小脑。 III 级星形细胞瘤有时称为间变性星形细胞瘤。IV 级星形细胞瘤通常称为多形性星形细胞 瘤。 (2) 脑干神经胶质瘤 - 该肿瘤发生于脑最下方的部分。 脑干神经胶质瘤最经常在幼儿和 中年成人中诊断出。 (3) 室管膜瘤 - 该肿瘤产生自脑室或脊髓中心管的衬底细胞。 它们最常 见于儿童和年轻成人。(4) 少突胶质细胞瘤 - 这种罕见的肿瘤是由生成覆盖和保护神经的 脂肪物质的细胞发生的。这些肿瘤通常发生于大脑中。它们生长缓慢且通常不扩散进入周 围脑组织。 它们在中年成人中最普遍。 脑肿瘤的症状取决于肿瘤尺寸、 类型和位置。 当肿瘤 压迫神经或损伤某一区域的脑时可引起症状。 当脑肿胀或液体在颅骨中累积时也可产生症状。这些是最常见的脑肿瘤症状 ： 头痛 ( 通常在早晨更严重 ) ； 恶心或呕吐 ； 语言、 视觉、 或 听觉的改变 ； 平衡或行走问题 ； 情绪、 个性、 或集中能力的改变 ； 记忆问题 ； 肌肉跳动或颤搐 ( 癫痫发作或惊厥 ) ； 和手臂或腿的麻木或麻刺感 (National Cancer Institute’ s 网站 )。 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作 用可在类似于下列文献中所述的神经胶质瘤动物模型中评估 ： Schueneman 等人， Cancer Res.63 ： 4009-16， 2003 ； Martinet 等 人， Eur.J.Surg.Oncol.29 ： 351-7， 2003 ； Bello 等 人， Clin.CancerRes.8 ： 3539-48， 2002 ； Ishikawa 等 人， Cancer Sci.95 ： 98-103， 2004 ； Degen 等 人， J.Neurosurg.99 ： 893-8， 2003 ； Engelhard 等 人， Neurosurgery 48 ： 616-24， 2001 ； Watanabe 等人， Neurol.Res.24 ： 485-90， 2002 ； 和 Lumniczky 等人， Cancer Gene Ther.9 ： 44-52， 2002。
     g. 甲状腺癌
     乳头状和滤泡状甲状腺癌占所有甲状腺癌的 80 至 90％。这两种类型都起始于甲 状腺的滤泡细胞。大多数乳头状和滤泡状甲状腺癌倾向于生长缓慢。如果早期检出， 大多 数可成功治疗。髓样甲状腺癌占甲状腺癌病例的 5 至 10％。它在 C 细胞而非滤泡细胞中 产生。如果在甲状腺髓样癌扩散至身体其它部分之前被发现和治疗， 其易于控制。甲状腺 未分化癌为最少见的一类甲状腺癌 ( 仅占病例的 1 至 2％ )。其在滤泡细胞中发生。该癌 细胞高度异常且难以识别。该类型的癌症通常非常难以控制， 因为癌细胞倾向于非常快速 生长和扩散。早期甲状腺癌经常不产生症状。但随着癌症生长， 症状可包括 ： 出现在颈前 部接近喉结的团块或结节 ； 声嘶或正常声音讲话困难 ； 淋巴结肿胀， 尤其在颈部 ； 吞咽或呼 吸困难 ； 或咽喉或颈疼痛 (National Cancer Institute 的网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可 溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下述文 献的小鼠或大鼠甲状腺肿瘤模型中评估 ： Quidville 等人， Endocrinology 145 ： 2561-71， 2004( 小鼠模型 ) ； Cranston 等人， Cancer Res.63 ： 4777-80， 2003( 小鼠模型 ) ； Zhang 等 人， Clin Endocrinol(Oxf).52 ： 687-94， 2000( 大鼠模型 ) ； 和 Zhang 等人， Endocrinology 140 ： 2152-8， 1999( 大鼠模型 )。
     h. 肝癌
     有两种不同类型的原发性肝癌。最通常的种类称为肝癌或肝细胞癌 (HCC)， 源 自肝的主要细胞 ( 肝细胞 )。该类型通常限于肝， 尽管偶尔其延伸至其它器官。其经常 发生于患有一种称为肝硬化的肝病的人中。还有一种稀有的肝癌亚型， 称为纤维板层 (Fibrolamellar) 肝癌， 其可发生于年轻人中且与之前的肝疾病不相关。 另一类型的原发性 肝癌称为胆管癌或胆管癌症， 因为其起始于胆管衬底的细胞。大多数患有肝癌的人还通常 具有称为肝硬化的肝病。 肝硬化是由于多种原因， 包括感染和长期大量饮酒， 而在整个肝中 发生的细小的瘢痕形成。然而， 仅有小比例的肝硬化的人产生原发性肝癌。感染乙型肝炎 或丙型肝炎病毒可导致肝癌， 且也可为肝硬化的原因， 这增加产生肝癌的风险。 患有稀有症 状称为血色病 ( 其引起体内铁的过量沉积 ) 的人， 具有更高的发生肝癌的几率。因此， 本发 明的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可用于治疗 肝细胞癌、 预防肝细胞癌、 抑制肝细胞癌进展， 延迟肝细胞癌发生， 和 / 或减少与肝细胞癌 相关的至少一种症候或症状严重性或抑制与肝细胞癌相关的至少一种症候或症状。 肝细胞 癌可与肝炎 ( 例如， 甲型肝炎， 乙型肝炎， 丙型肝炎和丁型肝炎 ) 感染相关或不相关。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响 应的作用可在肝细胞癌转基因小鼠模型中评估， 其包括单独的转化生长因子 -α(TFG-α) 的过表达 (Jhappan 等人， Cell， 61 ： 1137-1146， 1990 ； Sandgren 等人， Mol.Cell.Biol.， 13 ： 320-330， 1993 ； Sandgren 等 人， Oncogene 4 ： 715-724， 1989 ； 和 Lee 等 人， CancerRes.52 ： 5162 ： 5170， 1992) 或 其 与 c-myc(Murakami 等 人， Cancer Res.， 53 ： 1719-1723， 1993)， 突 变 的 H-ras(Saitoh 等 人， Oncogene 5 ： 1195-2000， 1990)， 编 码 HbsAg 和 HBx 的 乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 (Toshkov 等 人， Hepatology 20 ： 1162-1172， 1994 ； Koike 等 人， Hepatology 19 ： 810-819， 1994)， SV40 大 T 抗 原 (Sepulveda 等 人， Cancer Res.49 ： 6108-6117， 1989 ； Schirmacher 等人， Am.J.Pathol.， 139 ： 231-241， 1991) 和 FGF19(Nicholes 等人， American Journal of Pathology， 160 ： 2295-2307， 2002) 的组合的过表达。
     i. 肺癌
     包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤 响应的作用可在人小细胞肺癌 / 非小细胞肺癌异种移植模型中评估。简言之， 将人肿瘤 移植至免疫缺陷小鼠， 然后用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白单独治疗或与其它可用于通过评估肿瘤生长证实治疗的功效的药物组合治 疗这些小鼠 (Nemati 等人， Clin Cancer Res.6 ： 2075-86， 2000 ； 和 Hu 等人， Clin.Cancer Res.10 ： 7662-70， 2004)。
     2. 实体瘤的终点和抗肿瘤活性
     尽管各种规程对肿瘤响应评估可能有不同的定义， 但 RECIST( 实体瘤的响应评 价标准 ) 标准目前被认为是国立癌症研究所用于评估肿瘤响应的推荐的指导方针 ( 参见 Therasse 等人， J.Natl.Cancer Inst.92 ： 205-216， 2000)。根据 RECIST 标准， 肿瘤响应是 指减少或消除所有可测的病变或转移。 在以下条件下， 疾病通常认为是可测量的 ： 疾病包含 可在至少一个维度上可以被准确测量为≥ 20mm( 用常规技术 ) 或≥ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的损伤， 且通过医学照相或 X- 射线、 计算机轴断层摄影术 (CT)、 磁共振成像 (MRI) 或临床检 测 ( 如果损伤是表面的 ) 可见具有清楚限定的边界。不可测量的疾病是指以下疾病， 其由 ＜ 20mm( 用常规技术 ) 或＜ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的病变， 和确实不可测的病变 ( 太小而 不能准确测量 ) 构成。不可测量的疾病包括胸腔积液， 腹水， 和间接证据证明的疾病。
     规程需要目标状态的标准以评估实体瘤响应。代表性的标准包括以下 ： (1) 完全 响应 (CR)， 定义为所有可测量的疾病的完全消失 ； 无新的病变 ； 无疾病相关的症状 ； 无不可 测量的疾病的证据 ； (2) 部分响应 (PR)， 定义为靶病变的最长直径的总和降低 30％ ； (3) 进 行性疾病 (PD)， 定义为靶病变的最长直径的总和增加 20％或出现任何新病变 ； (4) 稳定或 无响应， 定义为未达到 CR、 PR、 或进行性疾病的标准者。( 参见 Therasse 等人， 上文 )。
     其他在肿瘤学领域中公认的终点包括总存活 (OS)， 无疾病存活 (D6FS)， 目标应答 率 (ORR)， 进展前时间 (TTP)， 和无进展存活 (PFS)( 参见 Guidance for Industry ： Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics， 2005 年 4 月， Center for Drug Evaluation and Research， FDA， Rockville， MD)。
     3. 组合癌症疗法
     如上讨论的， 在某些实施方案中， 将双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合与 治疗新生血管疾病的第二药剂组合使用。当用于治疗癌症时， 本发明的拮抗剂可用于与常规癌症治疗组合使用， 常规癌症治疗例如， 外科手术， 放疗， 化疗， 或其组合。 在某些方面， 其 它可用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行 组合癌症治疗的治疗剂包括其它抗血管发生剂。在一些其它方面， 其它用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行组合治疗的治疗剂包括针 对肿瘤生长中涉及的其它因素的拮抗剂， 所述的其它因素例如， EGFR， ErbB2(Her2)， ErbB3， ErbB4， 或 TNF。在一些方面， 将包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白与细胞因子 ( 例如， 刺激对肿瘤的免疫应答的细胞因子 ) 共同施用。特别适 合用于治疗癌症的示例性组合治疗在以下更详细描述。
     a. 靶向肿瘤相关的抗原的抗体与包含双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白的双特 异性结合蛋白的组合
     抗体疗法在癌症治疗中已获得了特别的成功， 因为某些肿瘤显示唯一的抗原、 种 系特异性抗原、 或相对于正常细胞而言过量存在的抗原。与单克隆抗体治疗的抗肿瘤活性 相关的一种机理是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)。 在 ADCC 中， 单克隆抗体结合至靶细胞 ( 例 如， 癌细胞 )， 而表达所述单克隆抗体的受体的特异性效应细胞 ( 例如， NK 细胞， 单核细胞， 粒细胞 ) 结合至该单克隆抗体 / 靶细胞复合物， 导致靶细胞死亡。在本发明的某些变化形 式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白与针对肿瘤 相关的抗原的单克隆抗体共同施用。 单抗的剂量和时程基于所共同施用的特定抗体的药代 动力学和毒物代谢动力学特性， 且应优化这些效果， 同时最小化可与施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白相关的任何毒性。
     当第一线治疗 (first line treatment) 失败时， 可指示需要与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和对肿瘤 - 相关的抗原的单克隆抗体 的组合治疗， 并可考虑将该组合治疗作为第二线治疗。本发明还提供， 对于新确诊的、 先前 未用抗癌剂治疗的患者群体 (“新患者” )， 和先前未接受任何单克隆抗体治疗的患者 (“首 次治疗患者” )， 使用该组合作为第一线治疗。
     双特异性结合蛋白也可用于在不存在任何直接的抗体介导的肿瘤细胞的 ADCC 情 况下与针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体组合治疗。例如， 在免疫系统中阻断抑制信号的抗 体可导致增强的免疫应答。实例包括 (1) 抗具有抑制功能的 B7R 家族的分子， 如， 细胞毒性 T 淋巴细胞 - 相关的抗原 4(CTLA-4)， 程序死亡 -1(PD-1)， B 和 T 淋巴细胞弱化子 (BTLA) 的 抗体 ； (2) 抗抑制性细胞因子如 IL-10、 TGFβ 的抗体 ； 和 (3) 消减或抑制遏制性细胞的功能 的抗体如抗 CD25 或 CTLA-4。 例如， 认为抗 CTLA4 单抗在小鼠和人中都抑制免疫抑制调节性 T 细胞 (Tregs) 的功能或抑制通过 T 细胞上 CTLA-4 与 APC 或肿瘤细胞上的 B7-1 或 B7-2 分 子的结合传递的抑制信号。
     表 8 是一些已经得到批准或正在接受测试的单克隆抗体的非排他性列表， 这些单 克隆抗体与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组 合治疗是可能的。
     表8： 用于与 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白组合使用的单克隆抗 体疗法
     49102448984 A CN 102449007 靶 TRAIL-R1 TRAIL-R2 CD40 HER2
     靶 EGF-R EGF-R EGF-R EGF-R α5β3 整联蛋白 CD152 CD49e MUC18(TIM- 状 ) TAG-72 粘蛋白 CD3 CD64(FcGR1) CEA EpCAM Lewis-Y-Ag
     药物名称 ABX-EGF EMD72000 MDX-214 爱必妥 (Erbitux) Vitaxin CTLA-4 整联蛋白 α5 ABX-MA1 Anatumomab Ecromeximab AntiCD64 CEA-Cide Panorex SGN15 药物名称 HGS-ETR1 HGS-ETR2 SGN40 赫赛汀说明书公司 HGS HGS46/82 页临床适应证 癌症 实体瘤 MM 乳腺癌Seattle Genetics Genentech临床适应证 CRC， NSCLC， RCC 实体瘤 EGF-R- 阳性肿瘤 CRC 银屑病， 前列腺癌 癌症 癌症 黑素瘤 癌症 黑素瘤 癌症 癌症 结肠直肠癌 癌症公司 Abgenix Merck Medarex Imclone AME/Lilly Medarex Protein Design LabsKyowa Hakko Medarex Immunomedics Centocor Seattle Geneticsb. 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白
     在一些实施方案中， 包含如本文所述的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合 蛋白的双特异性结合蛋白与酪氨酸激酶抑制剂组合使用。酪氨酸激酶是催化 γ 磷酸基团 从三磷酸腺苷转移至靶蛋白的酶。 酪氨酸激酶可分类为受体蛋白酪氨酸激酶和非受体蛋白 酪氨酸激酶。 它们在多种正常细胞过程中起关键作用， 包括通过生长受体的活化， 且影响多种细胞类型的增殖、 存活和生长。此外， 认为它们促进肿瘤细胞增殖， 诱导抗凋亡作用且促 进血管发生和转移。除了通过生长因子的活化， 通过体细胞突变的蛋白质激酶活化是肿瘤 发生的一种普遍机理。一些已鉴定的突变在 B-Raf 激酶， FLt3 激酶， BCR-ABL 激酶， c-KIT 激酶， 表皮生长因子 (EGFR) 和 PDGFR 途径中发生。Her2、 VEGFR 和 c-Met 是其他在癌症进 展和肿瘤发生涉及的重要的受体酪氨酸激酶 (RTK) 途径。因为大量细胞进程是由酪氨酸激 酶引发的， 它们已被确认为抑制剂的关键靶标。
     酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 是在细胞中起作用的小分子， 与三磷酸腺苷 (ATP) 竞争 对受体和非受体酪氨酸激酶两者的催化性酪氨酸激酶域的结合。 该竞争性结合阻断下游信 号传递的引发， 所述下游信号传递导致与这些信号事件相关的效应作用如生长、 存活和血 管发生。使用结构和计算手段， 从众多医药化学组合库鉴定出了大量抑制酪氨酸激酶的化 合物。
     认为大多数 TKI 通过直接抑制肿瘤细胞或通过抑制血管发生而抑制肿瘤生长。而 且， 某些 TKI， 包括索拉非尼和舒尼替尼， 通过 VEGF 家族受体影响信号传导。 在一些情况下， 已显示 TKI 可活化树突状细胞和其它天然免疫细胞， 如 NK 细胞的功能。这最近在动物模型 中对于伊马替尼进行了报道。伊马替尼是一种已被证明通过树突状细胞和 NK 细胞而增强 杀伤活性的 TKI( 综述参见 Smyth 等人， NEJM 354 ： 2282， 2006)。
     BAY 43-9006( 索 拉 非 尼， Nexavar ) 和 SU11248( 舒 尼 替 尼， Sutent ) 是 两 种 这 样 的 TKI， 它 们 最 近 获 准 用 于 转 移 性 肾 细 胞 癌 (RCC)。 许 多 其 它 TKI 处 于 晚 期 和 早 期 开 发 之 中， 用 于 治 疗 不 同 类 型 的 癌 症。 其 它 TKIs 包 括， 但不限于 ： 甲磺酸 伊 马 替 尼 (Gleevec Novartis) ； 吉 非 替 尼 (Iressa AstraZeneca) ； 埃罗替尼 盐 酸 盐 (Tarceva Genentech) ； 凡 德 他 尼 (Zactima AstraZeneca)，替 吡 法 尼 (Zarnestra Janssen-Cilag) ； 达 沙 替 尼 (Sprycel Bristol Myers Squibb) ； 洛那 法尼 (Sarasar Schering Plough) ； 瓦他拉尼琥珀酸盐 (Novartis， Schering AG) ； 拉 帕替尼 (Tykerb GlaxoSmithKline) ； 尼洛替尼 (Novartis) ； 来他替尼 (Cephalon) ； 帕 唑帕尼盐酸盐 (GlaxoSmithKline) ； 阿西替尼 (Pfizer) ； 卡奈替尼二盐酸盐 (Pfizer) ； 培 利 替 尼 (National Cancer Institute， Wyeth) ； 坦 度 替 尼 (Millennium) ； 博舒替 尼 (Wyeth) ； 司 马 沙 尼 (Sugen， Taiho) ； AZD-2171(AstraZeneca) ； VX-680(Merck， Vertex) ； EXEL-0999(Exelixis) ； ARRY-142886(Array BioPharma ，AstraZeneca) ； PD-0325901(Pfizer) ； AMG-706(Amgen) ； BIBF-1120(Boehringer Ingelheim) ； SU-6668(Taiho) ； CP-547632(OSI) ； (AEE-788(Novartis) ； BMS-582664(Bristol-Myers Squibb) ； JNK-401(Celgene) ； R-788(Rigel) ； AZD-1152HQPA(AstraZeneca) ； NM-3(Genzyme Oncology) ； CP-868596(Pfizer) ； BMS-599626(Bristol-Myers Squibb) ； PTC-299(PTC Therapeutics) ； ABT-869(Abbott) ； EXEL-2880(Exelixis) ； AG-024322(Pfizer) ； XL-820(Exelixis) ； OSI-930(OSI) ； XL-184(Exelixis) ； KRN-951(Kirin Brewery) ； CP-724714(OSI) ； E-7080(Eisai) ； HKI-272(Wyeth) ； CHIR-258(Chiron) ； ZK-304709(Schering A G) ； EXEL-7647(Exelixis) ； BAY-57-9352(Bayer) ； BIBW-2992(Boehringer Ingelheim) ； AV-412(AVEO) ； YN-968D1(Advenchen Laboratories) ；米 哚 妥 林 (Novartis) ；哌 立 福 辛 (AEterna Zentaris， Keryx， National Cancer Institute) ； AG-024322(Pfizer) ； AZD-1152(AstraZeneca) ；ON-01910Na(Onconova) ； 和 AZD-0530(AstraZeneca)。
     c. 化学治疗组合
     在某些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体的双特异性结合蛋白与一种 或多种化学治疗剂组合施用。化疗剂具有不同的作用方式， 例如， 通过影响 DNA 或 RNA 和 干扰细胞周期复制。以 DNA 水平或 RNA 水平作用化学治疗剂的实例为抗代谢物 ( 如硫唑 嘌呤， 阿糖胞苷， 磷酸氟达拉滨， 氟达拉滨， 吉西他滨， 阿糖胞苷， 克拉屈滨， 卡培他滨 6- 疏 基嘌呤， 6- 硫鸟嘌呤， 甲氨蝶呤， 5- 氟尿嘧啶和羟基脲 ) ； 烷化剂 ( 如美法仑， 白消安， 顺铂， 卡铂， 环磷酰胺， 异环磷酰胺， 达卡巴嗪， 丙卡巴肼， 苯丁酸氮芥， 塞替派， 洛莫司汀， 替莫唑 胺)； 抗有丝分裂剂 ( 如长春瑞滨， 长春新碱， 长春碱， 多西紫杉醇， 紫杉醇 ) ； 拓扑异构酶 抑制剂 ( 如多柔比星， 安吖啶， 伊立替康， 柔红霉素， 表柔比星， 丝裂霉素， 米托蒽醌， 伊达比 星， 替尼泊苷， 依托泊苷， 拓扑替康 ) ； 抗生素 ( 如放线菌素和博来霉素 ) ； 门冬酰胺酶 ； 蒽环 类抗生素或紫杉烷。
     d. 放射治疗组合
     在一些变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与放射治疗组合施用。某些肿瘤可用放射或放射性药物治疗。放射治疗通常用 于治疗不能切除的或不能手术的肿瘤和 / 或肿瘤转移物。放射治疗通常以三种方式递送。 外束放射在人体一定的距离之外给予， 包括 γ 射线 (60Co) 和 X- 射线。近程放疗使用与靶 137 192 组织一起或与靶组织接触的放射源， 例如 60Co， Cs， Ir， 或 125I。
     e. 激素药组合
     在一些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与激素或抗激素组合施用。 某些癌症与激素依赖相关， 包括， 例如， 卵巢癌， 乳腺 癌和前列腺癌。激素依赖性癌症的治疗可包括使用抗雄激素或抗雌激素化合物。用于癌症 治疗的激素和抗激素包括磷酸雌莫司汀， 磷酸聚雌二醇， 雌二醇， 阿那曲唑， 依西美坦， 来曲 唑， 他莫昔芬， 乙酸甲地孕酮， 醋酸甲羟孕酮， 奥曲肽， 乙酸环丙孕酮， 比卡鲁胺， 氟他胺， 曲 普瑞林， 亮丙瑞林， 布舍瑞林和戈舍瑞林。
     本发明进一步通过以下非限制性实例阐述。
     实施例 1 ： 筛选结合 VEGF-A 的抗体
     通 过 筛 选 Dyax Fab 310 噬 菌 体 文 库 (Dyax Corp.， Cambridge， MA) 来 鉴 别 结 合 VEGF-A 的抗体。选定的噬菌体 - 抗体文库选择和筛选方法使用抗原 (VEGF-A165， R&D Systems) 包被的聚苯乙烯免疫管 (NUNC， Denmark)。通过在少数轮的选择后增加严格性而 分离抗体。第一代抗体为 Fab 形式。通过 MluI(#R0198S， New England Biolabs， Beverly， MA) 酶消化产生可溶 Fab 抗体以去除 M13 噬菌体中的 geneIII 残株 (stump)。对 scFv 形式 的抗体使用了相同的选择、 筛选和裂解策略。
     实施例 2 ： 鉴别 VEGF-A 结合性 Fab 克隆
     通过基于平板的结合测定 (plate based binding assay) 来鉴别结合 VEGF-A 的 Fab 克隆。Costar(#9018)96- 孔板用 50μl VEGF-A(R&D Systems) 或 PDGF-D(SEQ ID NO ： 80) 同二聚体 (0.6μg/ml 在 0.1M NaHCO3， pH 9.6 中 )4 ℃包被过夜。第二天， 用 0.1 ％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。 各孔加入 100μl 2％牛乳 (#170-6404， Bio-Rad)/PBST， 室温封闭 1 小时。然后用 PBST 洗涤测试板三次。各孔加入 25ul 2％牛乳 /PBST， 然后添加25ul Fab 上清液。然后混合各孔， 在室温孵育 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。对于 Fab 检 测， 将 2％牛乳 /PBST 中的 50ul(1 ∶ 4000) 抗人 Fab 特异的 pAb-HRP(#31482， Pierce) 添 加至各孔， 室温保持 1 小时。然后用 PBST 洗涤板三次。将 50ul TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔， 显色 15 分钟， 然后添加 50ul 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以终止该反应。然后将平板在板读数器上以 450nm 读数。
     实施例 3 ： 将 VEGF-A 结合性 sFab 转化为 scFv
     对于一个第 2 轮， A 臂和 B 臂 VEGF-A 筛选的 Fab Dyax 噬菌体 DNA 池， 通过一套 3 步骤程序使用对各亚型的框架序列的引物扩增 λ、 κ 和重链可变区。第一轮 PCR 扩增各可 变框架区且添加合适的突出端以促进第 2 轮 PCR 反应。 第 2 轮 PCR 反应向正确的第 1 轮 PCR 产物的末端添加合适的 gly/ser 接头序列， 第 3 轮 PCR 反应将可变轻链 λ、 可变轻链 κ、 和 可变重链产物重叠以产生 LH 和 HL 两种取向的 scFv 产物， 然后其克隆至经 ApaLI/NotI- 消 化的 PIMD21 噬菌体展示载体。
     实施例 4 ： 抑制 VEGF 与 sVEGFR2 的结合的 sFab 和 scFv 的鉴别
     通过基于平板的中和测定筛选 VEGF-A Fab 和 scFv 克隆。 将 Costar(#9018)96- 孔 板用 100μl 抗人 IgG Fcγ- 特异抗体 (#109-005-098， Jackson Immunology)(1μg/ml， 在 0.1M NaHCO3 中， pH 9.6) 在 4℃包被过夜。第二天， 用 400ul 0.1％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。各孔加入 100μl 1％ BSA(#A3059-100G， ∑ )/PBST， 在室温 (RT) 阻断 1 小时。 用 PBST 洗涤板三次。将 100μl VEGFR2-Fc(SEQ ID NO ： 81)( 以 0.2μg/ml， 在 1 ％ BSA/ PBST 中 ) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。同时， 在一块单独的 96 孔板 (Costar 3357) 中， 将 65μl Fab 或 scFv 上清液添加至 65μl 生物素化 VEGF-A( 在 1％ BSA/PBST 中， 20ng/ml) 中， 在室温保持 1 小时。将经封闭的测定平板用 PBST 洗涤三次。各孔加入 100μl 上清液 / 生物素化 VEGF-A 复合物， 在室温保持 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。将 100μl 1％ BSA/ PBST 中的 (1 ∶ 4000) 链亲和素 -HRP(#21124， Pierce) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。然 后用 PBST 洗涤板三次。将 100μl TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔 以显色 20 分钟， 然后添加 100μl 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以停 止反应。然后将板以 450nm 在板读数器上读数。
     实施例 5 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的 相互作用的解离速率常数
     对人 VEGF-A 拮抗剂评估其与人 VEGF-A 的结合亲和力。
     VEGF-A 根据其解离速率常数使用表面等离子共振。通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的解离速率常数。解离速率常数 (kd(s-1)) 是反映该 复合物稳定性的值。其与浓度不相关， 因此适合用于筛选和评定未知浓度的样品。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结合亲和力。在 TM Biacore T-100 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合动力学和亲和力研究。 使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程方法。使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 将人 VEGF-A 共价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到约 200RU 的密度。将 VEGF-A 仅固定至活性流动 室 (active flow cell)。固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室上的剩余活性位点。用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。活化参照室， 然后用乙醇胺封闭。
     将 VEGF-A 拮抗剂上清液 ( 选自 Dyax 噬菌体文库筛选 ) 在流动缓冲液中 1 ∶ 3 稀释， 注射在表面上， 容许其特异结合至传感器芯片上的 VEGF-A， 结合时间为 5 分钟， 离解时 间为 5 分钟。双重注射 100nM VEGFR-2-Fc5 和 100nM 抗 VEGF-A 单克隆抗体 (AvastinTM， Genentech) 用作阳性对照。使用 30ul/min 的流速进行动力结合研究。所有结合实验在 25℃于 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的流动缓冲液中进行。还进行缓冲液注射以允许减少仪器干扰和误差。在循环之 间， 流动室用 10mM 甘氨酸， pH 1.5 洗涤以从表面去除结合的 VEGF-A 拮抗剂。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射进行处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个系列的注射中提供了一 致的结合表面。因为 VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 所得结合曲线与计算解离速率常数 (kd(s-1)) 的 1 ∶ 1 解离结合模型完全拟合。
     结果 ： 测定 VEGF-A 拮抗剂对人 VEGF-A 的解离速率分析。 所得结合曲线与 1 ∶ 1 解 离模型良好吻合。VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 因此仅报道解离速率常数 (kd(s-1))， 因 为 kd 与浓度不相关。计算的解离速率常数从最慢至最快排列。在这些测试条件下， VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用显示大范围的解离速率常数 (1.E-5-2.E-2(s-1))( 参见表 5)。为了比较， VEGFR-2-Fc5-VEGF-A 相互作用的 kd 为约 2.E-4s-1， 抗 VEGF-A 单克隆抗体 AvastinTM Fab-VEGF-A 相互作用为约 8.E-5s-1。
     表5： VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A scFvs 和对照物的相互作用的解离速率常数
     实施例 6 ： 衍生自大肠杆菌周质级分的蛋白质的纯化
     在大肠杆菌细胞的周质空间中表达了 scFv、 串联 scFv 和 sFab 蛋白质。 发酵规模从 25mL 摇瓶培养到 2L 分批补料的系统不等。 大肠杆菌细胞使用离心机旋转沉降为离心沉淀。 以每克湿细胞重量 2mL 的比例将湿细胞离心沉淀完全重悬浮于周质缓冲液 [0.2M Tris， 20％ (w/v) 蔗糖， 完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 (Roche)pH 7.5]。 过程中可包括或不包 括溶菌酶 ( 促进细胞壁降解的酶 )。 为确定是否使用溶菌酶， 将 500uL 重悬浮的离心沉淀转 移至 Eppendorf 管， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将 悬浮液在室温孵育 5 分钟。孵育后， 通过翻转来检测溶液的粘度增加。如果溶液粘在管壁 上， 那么可能发生了过早的细胞裂解， 则在准备的溶液中不包含溶菌酶。 如果溶液不粘在管
     壁上， 则将溶菌酶包含在准备的溶液中。 如果使用溶菌酶， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将悬浮液在室温孵育 4-6 分钟。 以每克初始湿细胞离心沉 淀重量 3mL 的比例添加冰冷的水， 并将溶液孵育至少 10 分钟但不长于 30 分钟。将剩余原 生质球在室温通过离心分离以 15,000xg( 或 10,000-20,000RPM， 以更快者为准 ) 离心沉淀 至少 15 分钟， 但不长于 45 分钟。将包含周质级分的上清液倒入新容器且使用称出的固体 调节至 25mM 咪唑， 500mMNaCl。 该溶液通过 0.22um 滤器过滤， 然后使用瓶顶滤器 (Nalgene) 纯化。
     固定的金属亲和色谱 (IMAC) 捕获
     常规上， 将 5mL HisTrap HP 柱 (GE Healthcare) 用于 IMAC 步骤， 然而， 柱的尺 寸可以按比例放大或缩小， 取决于通过分析 IMAC-SEC 测定法测得的周质部分中的 scFv 靶物的量。已显示该 IMAC 树脂的结合能力至少为 20mg/mL 填充床。如果使用尺寸大于 10mL 的柱， 优选内径为 2 和 5cm 的 Waters 玻璃柱 (Millipore)。使用合适的色谱工作站 (Akta Explorer， 使用 UNICORN 软件 4.1 和更高版本 [GE Healthcare]， 或 BioCAD Sprint， 700E， 或 Vision， 使用 Perfusion Chromatography 软件， 版本 3.00 或更高版本 [Applied Biosystems])， 将 IMAC 柱在 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 25mM 咪唑 pH 7.5 中平衡， 且周质级分 以不快于 190cm/hr 上柱直到耗尽。用平衡缓冲液洗涤柱子直到在不超过 190cm/hr 的流速 下在 UV A254nm 和 UV A280nm 的监测基线稳定至少 2 个 CV。使用 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 400mM 咪唑， pH 7.5 以不快于 190cm/hr 竞争性洗脱结合的蛋白。 洗脱级分通过 UV@A280nm、 分析型大小排阻色谱、 和 SDS-PAGE 评估蛋白质含量。
     其它色谱技术
     通过 SDS-PAGE 凝胶和分析型大小排阻色谱 (SEC) 评估 IMAC 池 (pool) 的纯度。 如 果该池不适合通过 SEC 最终提纯， 则使用其它色谱技术以进一步纯化靶 scFv 蛋白质以去除 残余宿主细胞污染物和聚集体。这些常规技术包括阴离子交换、 阳离子交换和疏水相互作 用。也使用其它基于亲和力的方法， 包括， 但不限于使用 c- 端 myc 标签， 借助抗 myc 树脂或 使用共价偶合至刚性珠子的合适的配体的配体亲和力方法。 这些其它技术的用处依具体的 蛋白质而定。
     大小排阻色谱法 (SEC)
     通过 UV@A280nm 和分析型 SEC 方法评估的蛋白质的量确定了所用的凝胶过滤柱 的尺寸 ： ＜ 1mg ＝ 10/300Superdex 200GL 柱， 1-10mg ＝ 16/60Superdex 200， ＞ 10mg ＝ 26/60Superdex 200( 均获自 GE Healthcare)。 IMAC 洗脱池使用 10kD MWCO Ultracel 离心 浓缩机 (Millipore) 浓缩， 且最终浓缩物体积不大于使用的凝胶过滤柱的体积的 3％。将 浓缩物注射入柱， 等度洗脱蛋白质， 流速不超过 76cm/hr 且不慢于 34cm/hr。通过 SDS-PAGE 分析洗脱级分， 制成合适的池。
     内毒素去除
     关于内毒素水平的最终产物规格依据一个特定群集的状态来确定。使用 10kD MWCO Ultracel 离心浓缩机 (Millipore) 将 SEC 池浓缩至＞ 0.25mg/mL( 通过 UV@A280nm 测定 )。Mustang E 0.22um 滤器 (PALL) 用 SEC 流动相缓冲液预润湿， 通过手动注射递送系 统将 SEC 浓缩物通过该滤器过滤， 流速为～ 1mL/min。使用 PTS EndoSafe 系统 (Charles River) 测试最终过滤产物的内毒素， UV@A280nm 浓度， 等分储存。实施例 7 ： 利用 293/KDR/KZ136/c22VEGF-A- 诱导的基于细胞的荧光素酶测定法鉴 别中和性抗人 VEGF scFv
     为筛选候选分子 (scFv) 中和人 VEGF-A 的活性的能力， 进行基于细胞的荧光素酶 测定法。293/KDR/KZ136/c22 细胞于 100μl 完全培养基 (DMEM， 10 ％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中以 10,000 细胞 / 孔的接种密度铺板于 96 孔不 透明白色组织培养处理板 (Costar#3917)， 在 37℃湿润的 5％ CO2 培养箱中孵育 48 小时。 48 小时后， 通过真空抽吸去除完全培养基， 用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 替换， 孵育过夜。
     第二天， 将候选 VEGF-A 中和性分子 (scFv， Fab)， 阳性对照 ( 贝伐单抗 ( 抗 VEGF-A 单克隆抗体， Genentech)， ranibizumab( 抗 VEGF-A 亲和力成熟 Fab， Genentech) 和内部制 备的贝伐单抗 Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一起在无血清培养基中以 1 ∶ 5 稀释从 200nM 连续稀释至 12pM。向这些之中， 添加等体积的 0.54nM VEGF-A165， 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 地中和分子或阳性对照。将这些在 37℃培养 60 分钟。培养后， 将培养基从 血清饥饿细胞吸出， 添加 100μl 上述复合物， 并在 37℃培养 4 小时。
     4 小时孵育后， 使用荧光素酶测定系统 (Promega， E1501) 根据制造商的说明进行 荧光素酶测定。简言之， 吸出培养基且将 25μl 1X is 缓冲液 (Promega， E153A) 添加至各 孔。将平板在室温孵育 20-30 分钟以平衡。使用微板发光计 (Berthold Technologies)、 以 40μl 的底物注射量、 1 秒的积分时间测量荧光素酶活性。使用分析软件 (Spotfire) 分析 数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     VEGF-A165 与其受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱发一个信号级联， 使驱使 荧光素酶报道基因转录的 STAT( 转录的信号转导物和活化剂 ) 和 / 或 SRE( 血清 - 响应元 素 ) 活化。荧光素酶活性的降低表明该 VEGF-A 介导的信号传递被中和。
     结果 ： 针对下表 6 所列的 scFv 在荧光素酶测试中筛选中和 VEGF- 诱导的活性。若 干被筛选的 scFvs 显示了显著抑制 ( 在表 6 中报道为 IC50 值 )。 IC50 值表示为中和 VEGF- 活 性 达 50 ％ 所 需 的 scFv 的 nM 浓 度。 贝 伐 单 抗 (AvastinTM)， LucentisTM， 和 AvastinTM Fab( 内部制备 ) 用作活性的对照。
     表6： scFvs 和对照在基于细胞的荧光素酶测定中的活性
     IC50(nM)
     AvastinTM LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 0.1-0.4 0.1-0.5 2.9-6.45 0.95 0.16-0.3 0.07实施例 8 ： 用于测定 VEGFA scFv 对人 VEGF-A- 刺激的 HUVEC 细胞的中和活性的增殖测定 为筛选对 VEGF-A 具有适中亲和力的中和 VEGF-A scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组 人 VEGF-A165 以 2.6nM 用作阳性对照。含有 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。将人 VEGF-A scFv 在 SFM 中连续稀释为 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内 皮细胞 (HUVEC) 铺板于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 该 HUVEC 细胞在 37℃， 5％ CO2 下在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中铺板 2 天。细 胞用 SFM 血清饥饿培养 24h， 用 2.6nM 在有或没有连续稀释的 VEGF-A scFv 的情况下刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H- 胸苷 ( 其掺入增殖中的细胞 ) 冲激 24h( 均在 37℃， 5％ CO2)。收 集细胞且使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 如表 7 所示的低 nM IC50 值可见， 大量在该测定中筛选的 scFvs 显示人 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖的有效中和。
     表7： HUVEC 增殖测试中的抗 VEGF-A scFv 中和活性
     scFvs 和对照 AvastinTM
     LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 c870e6
     0.3-0.8 14-17 1.00 0.8-2 0.7 1.6-4 IC50(nM) 0.3-0.6实施例 9 ： VEGF-A 拮抗剂的表位分拣 (Epitope Binning)
     进行表位分拣实验以测定哪种 VEGF-A 拮抗剂能同时结合至人 VEGF-A。竞争抗原 上的相同或重叠的结合位点 ( 表位 ) 的 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合， 在功能上分组到同一 家族或 “表位仓” (Epitope Bin) 中。不竞争抗原上的相同结合位点的 VEGF-A 拮抗剂能同 时结合， 被分组到不同的家族或表位仓中。 实验使用 Biacore T100TM 仪器进行。 Biacore 仅 仅是通常用于将抗体片段和单克隆抗体组 (panels) 分配至表位仓的多种测试形式中的一 种。许多文献 ( 例如， The Epitope Mapping Protocols， Methods in Molecular Biology， Volume 6， 6 Glenn E.Morris ed.) 描述了备选方法， 其可用于 “储藏” 抗体片段且预期能提 供关于 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合特征的参照数据。表位分拣实验使用可溶的天然 人 VEGF-A 作为抗原进行。材料和方法 ： 在 BIACORE T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行两 个单独的表位分拣实验。在两个实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 共 价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到密度约 800-1000RU。 固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室 上的剩余活性位点。通过用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。参照室也被活化， 然后用乙醇胺在没有 VEGF-A 拮抗剂的条件下封闭。
     在第一组实验中， 将第二 VEGF-A 拮抗剂和 VEGF-A 抗原稀释至 100nM。 注射 VEGF-A 抗原且使其特异结合于固定在传感器芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。VEGF-A 是二聚物， 因此对 每个 VEGF-A 拮抗剂而言存在两个潜在的结合位点。为保证所有结合位点被占据， 将先前固 定的第一 VEGF-A 拮抗剂注射在 VEGF-A 上。该步骤后， 注射第二 VEGF-A 拮抗剂以观察与 VEGF-A 的同时结合。
     在第二组分拣实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂再次共价固定至 BIACORECM5 传感器芯 片的单独的流动细胞。 然而， 在该实验中， 将 10nM VEGF-A 抗原与 1mM 第二 VEGF-A 拮抗剂预 混合， 然后以竞争形式注射在固定的第一 VEGF-A 拮抗剂上。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的缓 冲液中进行。还进行了缓冲液注射以减少仪器干扰和误差。在循环之间， 在每次注射循环 后通过注射 60 秒 10mM 甘氨酸 (pH 1.5， 50ul/min) 来再生俘获表面。这样做从该表面上去 除了结合的 VEGF-A。数据使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑。
     两组实验结果都由如下解释。如果第二 VEGF-A 拮抗剂不能与第一拮抗剂同时结 合至 VEGF-A 抗原， 则将其功能性归类到单一的家族或表位仓中。然而， 如果第二 VEGF-A 拮 抗剂能与第一拮抗剂同时结合至抗原 ( 通过显示芯片表面的质量增加 )， 则其归类到不同 的家族或表位仓中。 将各 VEGF-A 拮抗剂本身作为阴性对照进行测试以建立背景 ( 无结合 ) 信号水平。
     结果 ： 使用上述两组实验的结合数据， 将纯化的 VEGF-A 拮抗剂分配至表位仓中。 TM BIACORE 报道的信号 (RU， 应答单元 ) 与传感器芯片表面上的质量直接相关。一旦建立了 阴性对照相关的本底信号 (RU) 的水平 ( 相同 VEGF-A 拮抗剂用作第一和第二拮抗剂 )， 则 分拣结果报道为阳性或阴性结合。阳性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂能同时结合抗原。 阴性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合抗原。
     利用这些实验中阳性响应值和阴性响应值之间的差异将 VEGF-A 拮抗剂指配到三 个家族或表位仓中 ( 参见表 8)。第一表位仓以克隆 c636 产生的 VEGF-A 拮抗剂代表。第二 表位仓以 VEGF-A 拮抗剂 c868、 c1039 和 c1081 代表。值得注意的是， 当 c636 先与 VEGF-A 相互作用时， c868 和 c1039 都显示同时结合。当 c868 或 c1039 先与 VEGF-A 相互作用时， c636 不显示任何结合， 因此 c868 和 c1039 重叠了 c636 的表位。此外， VEGF-A 拮抗剂 c870 重叠了仓 #1 和仓 #2。第三表位仓由 VEGF-A 拮抗剂 c820 和阳性对照 VEGF-A 抗体 ( 小鼠抗 VEGF-A 单克隆抗体， R&D Systems) 代表。这些 VEGF-A 拮抗剂在所有其它 VEGF-A 拮抗剂的 存在下都显示同时结合。所有分拣实验中测试的拮抗剂都显示一定程度地中和 VEGF-A 促 分裂原活性。
     表8： 中和性 VEGF-A 拮抗剂的表位仓指配
     58102448984 A CN 102449007 表位仓 # 仓 #1 ： 仓 #2 ： 仓 #1/2 ： 仓 #3 ：
     说明书VEGF-A 拮抗剂 c636 c868， c1039， c1081 c870 c82055/82 页实施例 10 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结 合亲和力
     使用表面等离子共振评估克隆 c870 和 c1039 产生的一价人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合亲和力。 通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的亲 和力决定动力学速率常数和平衡解离常数用。 结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 是反映抗原 - 拮抗 剂复合物形成的速率的值。解离速率常数 (kd(s-1)) 为反映复合物稳定性的值。将结合速 率常数除以解离速率常数 (ka/kd) 得到平衡结合常数 (KA(M-1))。用解离速率常数除以结 合速率常数 (kd/ka) 得到平衡解离常数 (KD(M))。该值描述了相互作用的结合亲和力。KD 相同的相互作用可具有广泛变化的结合和解离速率常数。因此， 同时测量 ka 和 kd 有助于更 独特地描述相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量克隆 c870 和 c1039 产生的纯化的 VEGF-A 拮 抗剂的结合亲和力。在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合 动力学和亲和力研究。方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程。制备带有 His6/Myc 表位标签的 VEGF-A 拮抗剂。亲和力分析通过使用固定在 CM5 芯片上的抗 His6/ Myc 抗体俘获 VEGF-A 拮抗剂而进行。以 1 ∶ 1 摩尔比混合抗 His6 和抗 Myc 抗体， 并利用胺 偶联化学将它们共价固定至 CM5 传感器芯片， 达到为约 7500RU 的密度。 以 10ul/min 将 10nM VEGF-A 拮抗剂注射到单独的流动室上， 保持 1 分钟， 然后是 1 分钟稳定化时间。将 VEGF-A 连续的 1 ∶ 3 稀释物 (33.3nM-0.14nM) 注射在该表面上， 使之特异结合于被俘获在传感器 芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。进行每个浓度的 VEGF-A 的双重注射， 结合时间为 5 分钟， 离解 时间为 10 分钟。以 30μL/min 的流速进行动力学结合研究。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 500mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 0.1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的 缓冲液中进行。在循环之间， 用 50mM H3PO4 洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤将被俘获 的 VEGF-A 拮抗剂从固定化的抗体表面上去除， 且容许之后下一样品的结合。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个注射的顺序中提供一致的结 合表面。检查重复注射曲线的再现性。由于 VEGF-A 抗原形成二聚物， 将所得结合曲线整体 拟合于二价分析物相互作用模型。
     结果 ： 表征了两种 VEGFA 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力 ( 结果示于表 9)。 测量这 些人 VEGF-A 拮抗剂的结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 和解离速率常数 (kd(s-1))。由 ka 和 kd 值计 算 KD 和 KA。该数据与二价分析物模型良好拟合。该模型测量 ka(ka1 和 ka2) 和 kd(kd1 和 kd2) 的两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的单价动力学， 其报道于表 9。这些样品报道的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1。由 ka 和 kd 值计算出 KD 和 KA。所有三种 VEGF-A 拮抗剂显示对 VEGF-A 抗原类似的亲和力 (KD ＝ 0.7-1.0E-9M)， 且这些结果在两次独立运行 中一致。
     表9： VEGF-A 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力的表征
     实施例 11 ： 抗 VEGF-A 抗体的表位作图
     使 用 JPT VEGF-A RepliTopeTM 载 玻 片 对 克 隆 c870 和 c1039 产 生 的 单 克 隆 人 VEGF-A 抗体评价其与人 VEGF-A 的肽结合。
     材料和方法 ： 各 JPT 载玻片由一式三份如下所述的阵列组成。每个阵列的组成如 下： 连续的、 重叠的 VEGF-A 的 13aa 片段 ( 点 1-78)， 接着是连续、 重叠的 VEGF-A 的 20aa 片段 ( 点 85-115)。 此外， 各种测试抗体和小鼠和人 IgG 的对照点分布于各阵列的顶侧、 底侧和侧 面。 进行了一系列实验以测定 scFv c870 和 c1039 相对于人 VEGF-A 蛋白质的合成的直链肽 的结合能力。用 His/Myc 表位标签标记抗人 VEGF-A scFv。将 10-100μg/ml 的抗体溶液施 加至肽载玻片。然后将抗 His 和 / 或抗 Myc 抗体施加至载玻片。根据试剂盒描述的方法用 生物素化酪胺 (Tyramide) 扩增信号 (Renaissance TSATM Biotin System， PerkinElmer， #NEL700A)。结合的抗体使用链亲和素碱性磷酸酶和 DAKO Permanent Red 染料显色。
     数据使用自制显微镜载玻片扫描仪编辑， 其由 Nikon Eclipse TE2000U 倒置显微 镜， ASI MS-2000 电动台， Photometrics Cascade II 512 相机和 X-cite 120 荧光照明系统 组成。信号强度使用 MetaMorph v7.1 成像软件分析。
     结果 ： 结合肽的位置和序列示于下表 10。数字代表相对总体信号强度的肽的百分 比信号强度。
     表 10
     “β7 后” 区域是 VEGF 分子的肝素结合域。
     所有抗体均显示在 α2-β2 区周围有特异性结合位点。该数据表明被测抗体可分 为两类 ： 抗体 c870 优选 VEGF 的 c- 端侧， 而抗体 c1039 对蛋白质的 n- 端侧具有更强的结 合。抗体 c870 具有最少的结合肽而抗体 c1039 具有最分散的结合模式。各抗体的前两个 结合位点列于下表。
     结合等级 A2131/c1039 A2128/c870*表 1161102448984 A CN 102449007 1 2
     说明书α2-β2 α158/82 页β7 后 α2-β2实施例 12 ： 使用 VEGFR2 磷酸化测定法测试 VEGF-A 结合性 scFv 与抗鼠 VEGF-A 的 双特异性抗体的交叉反应性
     为筛选候选分子 (scFv， Fab 和双特异物 ) 中和鼠 VEGF-A 的活性的能力， 进行了 一项基于细胞的发光测定， 其测量 VEGFR2(KDR/Flk-1) 磷酸化。因为 mVEGF-A164 将与人 VEGFR2 交叉反应， 可使用基于人 VEGFR2 的报道物体系。将 293/KDR/KZ136/c22 细胞以 20,000 细胞 / 孔的密度在 100μl 完全培养基 (DMEM， 10％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠、 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中铺板于透明 96- 孔组织培养板， 且使之贴壁过夜。第二天， 通过 真空抽吸去除完全培养基， 并用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax) 替 换。将细胞温育过夜。
     第二天， 将候选的 VEGF-A 中和分子 (scFv， Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一道在 无血清培养基中以 1 ∶ 5 的稀释度从 200nM 连续稀释至 12pM。VEGFR2-Fc 用作中和的阳性 对照。向这些中添加等体积的 0.54nM 的 mVEGF-A164(493-MV-005， R&D Systems)， 以达到 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 的中和分子或阳性对照。将这些在 37℃孵育 60 分钟。
     孵育后， 通过真空抽吸从血清饥饿细胞去除培养基， 并用 100μl 上述复合物替 换。将细胞在 37℃孵育 10 分钟。孵育后， 通过真空抽吸去除培养基， 并轻柔地用 100μl 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS， Invitrogen) 洗涤细胞。通过真空抽吸去除 PBS， 将细胞在 25μl NP-40 溶解缓冲液 (Invitrogen Cat.#FNN0021) 中溶解， 该溶解缓冲液每 10mL 包含 1mM PMSF(Sigma， P-2714， 溶于 DMSO) 和 1 片 Complete Mini 片剂 (Roche， 11836153001)。 将溶解产物在 4℃在平台振荡器上孵育 20 分钟， 然后 4℃ 3000rpm 离心 10 分钟以使溶解产 物澄清。将溶解产物转移至新的 96- 孔微量滴定板上， -20℃放置直到测定。
     对于 VEGFR2 磷酸化发光测定， 根据制造商的说明使用细胞内蛋白质缓冲液试剂 盒 (Invitrogen LHB0002) 和 VEGFR2[pY1059] 抗体珠子试剂盒 (Invitrogen LHO0601)。 将 溶解产物解冻， 以 1 ∶ 5 与 80μl 测定稀释剂混合。将发光真空过滤板的孔用 200μl 工 作洗涤溶液预先润湿。以每孔 25μl 添加经稀释的珠子， 并用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 2 次。 洗涤后， 将 50μl 稀释的溶解产物和 50μl 稀释的检测抗体添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 室温 (RT) 孵育 3 小时。孵育后， 用 200μl 工作洗涤溶液洗涤珠 子 2X， 然后将 100μl 稀释的抗兔 IgG-RPE 添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 在室温孵育 30 分钟。孵育后， 将珠子用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 3X， 且重悬浮于 125μl 工作洗涤溶液。将珠子在平台振荡器上以 500rpm 重悬浮 30 秒， 用发光 -100 仪器 (BioRad) 读数。使用分析软件 (Spotfire) 分析数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     结果 ： mVEGF-A164 对人受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱导该受体的磷酸 化。该基于发光的测定将总 VEGF-R2 结合于与抗 VEGFR2 抗体缀合的、 荧光标记的珠子。利 用检测 [pY1059] 的磷酸化的第二抗体来检测有多少 VEGFR2 已被磷酸化。如下表 12 所示， 许多中和了人 VEGF-A 活性的 scFv 也在该测定抑制了小鼠 VEGF 活性。包含相同这些 scFv 的双特异性抗体也中和了小鼠 VEGF-A 活性。表 12 ： VEGF-A 特异 scFv 和双特异性抗体中和小鼠 VEGF-A 活性scFv c870 c1039 c1094 IC50(nM) 0.16 无活性 0.55实施例 13 ： 用于测定 scFvs 对小鼠 VEGFA(VEGF-A164) 刺激的 HUVEC 细胞的中和 活性的增殖测定
     为筛选中和小鼠 VEGF-A 的 scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组小鼠 VEGF-A164 以 2.6nM 用作阳性对照。含 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清 培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。scFv 分子在 SFM 中连续稀释至 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 铺板 于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 将 HUVEC 细胞在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中在 37℃， 5％ CO2 下铺板 2 天。将细胞用血清饥饿培养
     24h， 在或有或没有连续稀释的 VEGF-AscFv 的条件下用 2.6nM 刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H 胸苷脉冲 24h， 该胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 从如下表 13 所示低 nM IC50 值可见， 该测定中被筛选的多种 scFv 显示有效 地中和小鼠 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖。
     表 13 ： 通过 VEGF-A- 特异性 scFv 中和小鼠 VEGF-A 诱导的 HUVEC 增殖
     scFv c870 c1094 c1039
     IC50(nM) 0.36 2.84 无活性实施例 14 ： 构建可溶 FGFR3IIIc C-term Fc5 表达质粒以表达第一、 第二和第三细 胞外 Ig 样域或包括第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式
     生成了包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式的一系列表达构建体。这些人 FGFR3IIIc 序列 段与下游 C- 端 Fc5 序列融合。该系列中的构建体包括上述的序列区和一个点突变， 该点突 变分别在 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 262 处和 SEQ ID NO ： 10 的残基 142 处产生色氨酸残 基 ( 突变的 249 位以天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列为参照 ) 代替该位置上的丝氨酸。该突变 记录为 S249W。这些构建体通过 PCR 和同源重组使用编码上述 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段、 Fc5 片段和表达载体 pZMP31 产生。为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体指定的 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)， 产生了三个 PCR 片段且将它们一起通过酵母重组引入 pZMP31 载体。第一 片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列的 5’ 重叠， 后面是编码 S249W 点突变 的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列的 3’ 重叠。对于该片段， PCR 扩增反应 使用 5’ 寡核苷酸 zc62552((SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 起始于 SEQ ID NO ： 2 的 E36))。片段将克隆为 pZMP31， 使用 opTPA 前 导序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 1-35)。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反 向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与在 5’ 端 嵌套 Rec 序列的正向引物一起使用 )， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。
     第二片段呈现 ： 与上游人 FGFR3IIIc 序列的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的 人 FGFR3IIIc 的序列和与 Fc5 序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 389-620) 的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62556(SEQ ID NO ： 82)( 正向引物， 用于以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 sol.Rec 序列的 3’ 端的反向引 物一起使用 )。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62553(SEQ ID NO ： 6) ： ( 反向引物， 以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375。片段将具有重叠的 Fc5 序列 ) 进行， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模板。
     第三片段包含 Fc5 序列且呈现与人 FGFR3IIIc 的 5’ 重叠和与 pZMP31 载体序列的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62554(SEQ ID NO ： 7)。( 正向引物， 用 于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375)。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62555(SEQ ID NO ： 8)( 反向引物， 用于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 pZMP31 的序列 ) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1699， IL17REFc5 作 为模板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应条件如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 1 分 30 秒 ； 1 个循环， 72℃， 7 分钟。PCR 反应混合 物 1％琼脂糖凝胶上运行， 并使用 QIAquickTM 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从 凝胶提取对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 pZMP31 为哺乳动物表达载体， 其包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表 达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动 物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启动子， 增强子和复制起点， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及在酿酒酵母中的选择和复制所需的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     之前， 用 BglII 消化该质粒 pZMP31， 然后与下列上文提到过的凝胶提取的 PCR 片段 在酵母中重组。将 50μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 3μl 各个 PCR 片段插入 DNA 和约 50ng BglII 消化的 pZMP31 载体混合。将该混合物转移至 0.2cm 电穿孔小杯。使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF， 对酵母 / DNA 混合物进行电脉冲。 将 300μl 1.2M 山梨醇添加至小杯， 将酵母以 75μl 和 200μl 的等 分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。约 72 小时后， 将来自一块板的 Ura+ 酵母转化体 重悬于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062MTris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymo 裂合酶 /100ul 的 100ul Qiagen小提试剂盒缓冲液 P1。然后将该混合物在 37℃孵育约 15 分钟， 小提试剂盒的余下操作根 据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 酵母 DNA 制备物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。细胞以 1.75kV， 25μF、 400 欧姆电脉冲。电穿孔后， 添加 .5ml LB， 然后 将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼 脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择包含正确序列的一个克隆。使用可商购的试 剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明分离大规模质粒 DNA。
     使用相同的方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 其称为 MPET 构 建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)。 第一片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序 列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560((SEQ ID NO ： 11) ( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 Ig D2D3 形式。截 短的 FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 2 的 D156， Ig D2 的上游。将利用 opTPA 前导序 列克隆至 pZMP31 中的片段 ))。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 Rec 序列 的 5’ 端的正向引物一起使用 )) 进行， 且使用 clonetrackID #102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。片段使用如前文所述的相同 PCR 热循环制备， 并将该片段与上述第二和第三片段一起 引入 BglII 消化的 pzMP31 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。
     使用 Qiagen 大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。对于全 长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5， 和截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 分别称为 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2) 和 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)， 将 200μg 的每种 表达构建体大提质粒用约 240 单位的 BstB1 限制酶在 37℃消化 2 小时， 用苯酚 / 氯仿 / 异 戊醇洗涤， 然后用氯仿 / 异戊醇洗涤， 然后用乙醇沉淀过夜， 且在 1.5mL 微量离心机管离心。 倾出上清液， 用 1mL 70％乙醇洗涤离心沉淀， 在室温孵育 5 分钟。将管在微量离心机中以 14,000RPM 旋转 10 分钟， 且倾去离心沉淀的上清液。 在组织培养罩的无菌环境中， 将离心沉 淀在空气中干燥约 5 分钟， 然后重悬浮于 0.4ml 37℃预热的 CHO 细胞组织培养基中， 且使之 在 37℃孵育 10 分钟。 对 DNA 离心沉淀被溶解时， 对各个待电穿孔的载体， 将约 9x 106CHO 细 胞离心沉淀后重悬于 4ml CHO 细胞组织培养基中， 并与重悬的质粒 DNA 混合， 达到最终体积 为 800ul。将 DNA/ 细胞混合物置于 0.4cm 缝隙小杯中， 使用以下参数电穿孔 ； 950μF， 高电 容， 300V。然后， 对于每个质粒电穿孔组， 移出试管的内含物， 汇总， 用 CHO 细胞组织培养基 稀释至 25mL， 置于 125mL 摇瓶中。将瓶置于培养箱中振荡器上， 37℃， 5％ CO2120RPM 摇动。
     CHO 细胞用 500nM 甲氨蝶呤 (MTX) 进行营养物选择和扩增。选出的 CHO 细胞系称 为 MECL 1334(solFGFR3IIIc(23375)(S249W)Fc5) 和 MECL 1337(solFGFR3IIIc(143_375) (S249W)Fc5)。
     为测试表达， 使用电穿孔后汇集物第 3 代建立培养。将细胞离心后 .5e6c/ml 重悬 浮于 50ml 体积新鲜培养基 ( 无选择 )， 且使之如上所述进行 96 小时。通过蛋白质印迹证实 蛋白质表达。启动大型转瓶以产生用于纯化的蛋白质。利用第 6 代的转染后 CHO 细胞池 MECL 1334 和 MECL 1337， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 且添加 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来 自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070) 和 500nM 甲氨蝶呤， 开始生成 200ml 接种培 养物。将瓶在 37℃ 120rpm 和 6％ CO2 下培养。6 天后， 将每个 CHO 池瓶接种至一个 3L 转 瓶中， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 加有 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070)， 无选择， 达到 1L 工作体积， .5e6c/ml。将旋转瓶在 37℃， 95rpm 和 6％ CO2 培养。接种后约 24 小时后， 将另外 .5L 培养基添加至各个转瓶中以达到最终体 积为 1.5L， 继续培养。接种后约 8 天， 收集条件化培养基， 0.2μM 过滤后， 用于蛋白质纯化。
     用类似方法产生 FGFR3 Fc5 区的另外的构建体， 包括可溶全长和截短的形式， 没有 点突变， 或在序列中具有使得 SEQ ID NO ： 15 的 263 位和 SEQ ID NO ： 22 的 143 位的脯氨酸 残基改变为精氨酸 ( 标注为 P250R) 的突变 ( 突变的 250 位是参照天然 FGFR3IIIc 氨基酸 序列 )。该寡核苷酸和所得的构建体用相应的序列标识符标示于下。
     表 14
     pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)
     表 15 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)
     表 16 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)Fc5， 构建体 #1916(SEQ ID NOS ： 12 和 13)
     表 17 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1918(SEQ ID NOS ： 14 和 15)
     表 18 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)Fc5， 构建体 #1919(SEQ ID NOS ： 18 和 19)
     表 19 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1921(SEQ ID NOS ： 21 和 22)使用了类似方法产生 FGFR2αIIIc Fc5 的可溶形式的构建体区域， 包括可溶全长 和截短的形式， 没有点突变或在序列中具有使 SEQ ID NO ： 29 的 266 位和 SEQ ID NO ： 40 的 143 位的丝氨酸残基改变为标注为 S252W 的色氨酸， 或 SEQ ID NO ： 33 的 267 位和 SEQ ID NO ： 42 的 144 位的脯氨酸残基改变为精氨酸 ( 标注为 P253R) 的突变 ( 突变的位置是参照 天然 FGFR2αIIIc 氨基酸序列 )。
     表 20
     pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)Fc5， 构建体 #1945(SEQ ID NOS ： 23 和 24)
     表 21 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(S252W)Fc5， 构 建 体 #1946(SEQ ID NOS ： 28 和29)
     表 22 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(P253R)Fc5， 构 建 体 #1947(SEQ ID NOS ： 32 和33)
     表 23 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)Fc5， 构建体 #1948(SEQ ID NOS ： 36 和 37)
     表 24 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(S252W)Fc5， 构建体 #1949(SEQ ID NOS ： 39 和40
     表 25 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(P253R)Fc5， 构建体 #1950(SEQ ID NOS ： 41 和42)
     实施例 15 ： 多特异性、 可溶 FGFR3IIIc Fc5 VEGFA scFv 表达质粒的构建
     生成一系列表达构建体， 其包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或 具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式。这些人 FGFR3IIIc 序列区段 与下游 C- 端 Fc5、 接头、 下游 c- 端用于特异结合至 VEGF-A 的 scFv 序列融合。该系列中的 构建体包括上述的人 FGFR3IIIc 序列段和一个点突变 ( 其在 SEQ ID NO ： 64 的氨基酸 162 位 和 SEQ ID NO ： 62 的 142 位产生色氨酸残基以代替丝氨酸 )。该突变记录为 S249W。( 突变 的位置参考天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列 )。这些构建体通过使用 PCR 和同源重组 ( 利用编码 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段与 Fc5 序列和包含 VEGF-A scFv 序列 870e6 和 1094.1 的表达载体 pZMP31 进行 ) 而产生。
     为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5c870e6 和全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W) Fc5c1094.1 构建体， 产生 PCR 片段且通过酵母重组将其引入基于 pZMP31 的载体， 其中基 于 pZMP31 的载体包含接头和下游 VEGFAscFv 序列 870e6 或 1094.1( 称为 MVC 709-SEQ ID NO ： 43 和 44 ； 以及 MVC 710-SEQ ID NO ： 45 和 46)。该 PCR 片段包含 ： 与基于 pZMP31 的载体 序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序 列， Fc5 序列、 以及与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62552(SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 序列起始于 Ig D1 上游的 E23。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 使用 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NO ： 1) 作为模 板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 2 分钟 ； 1 循环， 72℃， 7 分钟。在 1％琼脂糖凝胶上运行 TM PCR 反应混合物， 且使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从凝胶提取 对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 MVC 709 和 MVC 710 是基于 pZMP31 的哺乳动物表达载体， 其包含鼠 Fc2、 接 头、 和 870e6(SEQ ID NO ： 43) 或 1094.1scFv(SEQ ID NO ： 45) 的下游序列、 VEGF-A 结合序列。 这些载体包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启 动子， 增强子和复制起始区， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及酿酒酵母中的选择和复制所需 的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     将质粒 MVC 709 和 MVC 710 用 BglII 限制酶消化， 然后与下列上文提到的凝胶提
     取的 PCR 片段在酵母中重组。将 60μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 5μl 的各个 PCR 片段插入的 DNA 和约 50ng BglII 消化的 MVC 709 和 MVC 710 载体混合。将该混合物转移 至 0.2cm 电穿孔小杯。对酵母 /DNA 混合物电冲激， 使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF。 将 400μl 1.2M 山梨醇添加至小 杯， 然后将酵母以 75μl 和 200μl 等分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。 约 72 小时后， + 将来自一块板的 Ura 酵母转化体重悬浮于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062M Tris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymolyase/100ul 的 100ul Qiagen MiniPrep 试剂盒缓冲液 P1。 然后将该混合物在 37℃孵 育约 15 分钟， Qiagen 小提试剂盒方案的其余步骤根据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 提取的酵母质粒 DNA 制备 物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。以 1.75kV、 25μF、 400 欧姆对细胞电冲激。电穿孔后， 添 加 .5ml LB， 然后将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板上 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择一个包含正确序列的克隆。大规模质粒 DNA 使用可商购的试剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明 分离。
     利用相同方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。一个片段包含 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列， Fc5 序列和与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560(SEQ ID NO ： 20)。( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片 段。片段将产生 Ig D2D3 形式。FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 60 的 D156， Ig D2 的上 游。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1920 作为模板 (SEQ ID NO ： 9)。
     使用与上述相同的 PCR 热循环产生该片段， 并引入 BglII 消化的 MVC709 和 MVC 710 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接头和下游 c- 端对 VEGFA 构建体结 合特异的 scFv 序列， 如上所述。
     编 码 全 长 的 或 截 短 的 可 溶 人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接 头 和 下 游 c- 端 对 结 合 VEGF-A 特异的 scFv 序列的质粒命名为 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 781)， 如 SEQ ID NOS ： 57 和 58 所示， FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 782)， 如 SEQ ID NOS ： 59 和 60 所 示， FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 783)， 如 SEQ ID NOS ： 61 和 62 所示， 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 784)， 如 SEQ ID NOS ： 63 和 64 所示。将这些质粒在 293F 细胞中瞬时表达 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#R790-07)。使用 QIAGEN 质粒大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。 将 293F 悬浮细胞在 293Freestyle 培养基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#12338-018) 中在 37 ℃， 6 ％ CO2 下在 3L 转瓶中 95RPM 培养。在即将转染之前添加新鲜培养基以得 到 1.5 升工作体积， 最终密度为 1x10E6 细胞 /mL。对于每个转瓶， 将 2mLLipofectAMINE 2000(Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#11668-019) 添 加 至 20mL Opti-MEM 培 养 基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#31985-070) 中， 且在另一试管中将 1.5mg 总质粒 DNA 在 20mL Opti-MEM 中稀释。各试管单独在在室温孵育 5 分钟， 然后混合 (combined) 且一起在室温下再孵育 30 分钟， 不时轻微混合。将脂质 -DNA 混合物添加至 293F 细胞的各转瓶， 然 后恢复至 37℃， 6％ CO2、 75RPM。 约 96 小时后， 收集该条件化培养基， 0.2μM 过滤， 用于蛋白 质纯化。
     实施例 16 ： 纯化方法
     将条件化培养基作为包含 0.02％叠氮化钠的 0.2μ 无菌过滤可输送物输送至纯 化。在将该培养基装载至亲和力俘获柱之前不进行其他调节。
     对于大规模纯化， ～ 10 升可输送物， 采用 POROS A50( 蛋白 A 亲和树脂 ) 的 87mL 柱床 2 厘米直径的柱子用于俘获过程的目的。对于小规模纯化 ( ～ 1-1.5 升可输送物 )， 使 用 4mL 柱床的 POROS Mab MabCapture 灌注色谱树脂。
     加载样品之前， 该柱用 20 柱体积的缓冲液 A(10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬 酸， 250mM[NH4]2S04， pH 7.3， 包含 0.02％叠氮化钠 (W/v)) 平衡。一旦平衡后， 以 20mL/ 分 钟 ( 对于大规模方法 )， 或 10mL/ 分钟 ( 对于小规模方法 ) 加载条件化培养基。当方法的装 载阶段完成时， 用 10-20 柱体积的平衡缓冲液从柱洗出未结合的蛋白质级分。结合的蛋白 质的洗脱通过下降的 pH 梯度完成， 该梯度是在平衡缓冲液 A 和具有以下组成的洗脱缓冲液 B 之间形成的 ： 10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬酸， 250mM[NH4]2S04， pH 3.0， 包含 0.02％ 叠氮化钠 (w/v)。大规模方法的洗脱流速为 30mL/ 分钟， 同时在缓冲液 A 和缓冲液 B 之间形 成 3 个柱体积的梯度。用 0.5mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (10mL)， 立即混合内含 物。小规模方法的洗脱使用相同缓冲液和 4 柱体积的梯度 ( 从缓冲液 A 至缓冲液 B)， 且流 速为 5mL/ 分钟。用 0.25mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (4mL)。立即混合所有洗脱液 级分以保证快速 pH 中和。
     将所有在 280 纳米波长具有正吸收的级分汇集， 进一步进行大小排阻色谱法步 骤。将汇集的蛋白质浓缩至 7ml( 大规模方法 ) 或 1.5mL( 小规模方法 ) 用于大小排阻色谱 法 (SEC)。 采用 SEC 色谱法的目的是缓冲液交换， 以及将少量多聚体或聚集物质与最终产物 区分开来。用于 SEC 和最终蛋白制剂的流动相为 35mM 磷酸钠， 120mM 氯化钠， pH 7.3。大规 模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (26/60 规格， 具有 321mL 柱床体积 ) 上 进行。小规模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (16/60 规格， 具有 120mL 柱 床体积 ) 上进行。根据方法规模， SEC 步骤的流速对大规模或小规模分别为 2.5mL/ 分钟或 1.5mL/ 分钟。汇集在主要对称的峰下的级分， 重点是从最终产物中排除任何少量的高分子 量材料。最终汇集物以 0.2μ 无菌过滤， 制备等分试样且储存于 -80℃。该相同方法用于处 理所有 FGFR 受体和可溶 FGF 受体 (FGFR) 和 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物。 3
     实施例 17 ： H- 胸苷增殖测定以测定可溶 FGF 受体对 FGF- 刺激的 HUVEC 细胞的中 和活性
     为筛选抑制多种 FGF 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人脐带内皮细胞 (HUVEC) 进行 3H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF1， 2， 4 和 6(R&D Systems， Inc.) 以 10ng/ml 在测定介质 (RPMI-1640， 1％ FBS， 1 单位 /ml 肝素和丙酮酸盐 ) 中使用。然后从 0.5-4ug/ ml( 取决于受体 ) 滴定的可溶人 FGFR(R&D Systems 和 ZymoGenetics)， 并在测定介质中 连续稀释至 32-4ng/ml。即 HUVEC 铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2000 细胞 / 孔。HUVEC 增殖测定体系在 37℃， 5％ CO2 培养 2 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸 苷 (Amersham， TRK120) 冲激 HUVEC18 小时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％CO2)。收集细胞， 在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结果 ： 所 有 测 定 的 FGFR 均 如 预 期 的 那 样 以 类 似 的 活 性 中 和 FGF1。FGFR1 和 FGFR2(R&D Systems) 强 力 地 中 和 所 有 FGF。 而 FGFR3 和 FGFR4(R&D Systems) 对 FGF2， 4 和 6 活 性 的 抑 制 弱 一 些。FGFR3A2258F(143_375， S249W)(SEQ ID NO ： 10) 和 FGFR3 A2256F(22_375， S249W)(SEQ ID NO ： 2) 强力地中和 FGF1， 2， 4 和 6， 且 IC50 值与 FGFR1 相 似。
     表 26
     实施例 18 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 LNCap 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 LNCap 细胞进行 3 了 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 以 200 至 1000ng/ml 在测定介 质 (RPMI-1640， 1％ BSA， ITS[ 胰岛素 - 转铁蛋白和硒 ]， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 [ 均获自 Invitrogen]) 中使用。然后从 1-2ug/ml 滴定 R&D Systems 的可溶人 FGFR(R1-R4)、 以及 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 31-15ng/ml。将 LNCap 细胞铺板 于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2500 细胞 / 孔。将该 LNCap 增殖测定在 3 37℃， 5％ CO2 培养 3 天。然后每孔用 1μCi H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将 LNCap 冲激 8 小
     时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结 果： R&D System 的 FGFRs R2-R4 中 和 FGF8b， 但 R1 则 否。 全 长 FGFR2A2556F(22_377)SEQ ID NO ： 24 ， A2557F(22_377)(S252W)SEQ ID NO ： 29 ， 和 A2558F(22_377)(P253R)SEQ ID NO ： 33 不中和 FGF8b。而截短的 FGFR2A2559F(145_377)SEQ ID NO ： 37， A2560F(145_377)(S252W)SEQ ID NO ： 40， 和 A2561F(145_377)(P253F)SEQ ID NO ： 42 确实中和 FGF8b， 类似于 R&D Systems FGFR2。FGFR3A2519F(143_375)(P250R) SEQ ID NO ： 22， A2256F(23_375)(S249W)SEQ ID NO ： 2 和 A2258F(143_375)(S249W)SEQ ID NO ： 10 中和 FGF8b， 但 A2518F(143_375)SEQ ID NO ： 19， A2257F(23_375)SEQ ID NO ： 13， 和 A2259F(23_375)(P250R)SEQ ID NO ： 15 则否。
     表 27
     ND， 未测定。
     实施例 19 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 MCF-7 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 MCF-7 细胞进行 3 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 在测定介质 (RPMI-1640， 5％ FBS， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 ) 中为 100ng/ml。从 10ug/ml 滴定来自 R&D Systems 的可溶人 FGFR-Fc(R1-R4) 和 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 78ng/ml。 将 MCF-7 细胞铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 1250 细胞 / 孔。将该
     MCF-7 增殖测定系统在 37℃， 5％ CO2 下培养 4 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将细胞冲激 8 小时， 该 3H- 胸苷掺入中的增殖细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细 胞且在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     实施例 20 ： 用于测定 sFGFR-Fc 对 FGF-9 刺激的 HCO 成骨细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为测定 sFGFR-Fc 构建体对 FGF-9- 刺激的成骨细胞增殖的中和作用， 进行 3H- 胸 苷测定。用人 FGF-9 刺激人成骨细胞生长。以 0.02nM 至 6nM 的浓度将 FGFR-Fc 蛋白质添 加至测定介质。观察到成骨细胞增殖的显著抑制， 并对各蛋白质计算 IC50。
     研究设计 ： 以 1.2nM 人 FGF-9(R&D Systems， Minneapolis， MN) 刺 激 人 颅 盖 成 骨 细 胞 (HCO ； ScienCell， Carlsbad， CA)。ObM 测 定 介 质 [ 成 骨 细 胞 基 础 培 养 基 (ObM， ScienCell)， 含有 0.5 ％胎牛血清 (FBS)， 2mM GlutaMax(Invitrogen， Carlsbad， CA)， 1mM 丙酮酸钠， 和 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 (Invitrogen)] 用作阴性对照。将人 FGFR1-Fc， FGFR2-Fc， FGFR3-Fc， 和 FGFR4-Fc(R&D Systems) 在 ObM 测定介质中连续稀释到 6nM， 2nM， 0.67nM， 0.22nM， 0.07nM， 和 0.02nM。对 FGFR3-Fc 突变体 (ZymoGenetics， Seattle， WA) 也 类似进行稀释。将 HCO 细胞在补充有 5％ FBS 和成骨细胞生长补充剂 (ObGS， ScienCell) 的 ObM 中铺板于在 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 1000 细胞 / 孔。将各板在 37℃， 5％ CO2 孵育过夜。细胞用 ObM 测定介质血清饥饿 24h， 在有或无连续稀释的 FGFR-Fc 的条件下 3 用 1.2nM FGF-9 刺激 24h， 用 1μCi 每孔的 H- 胸苷冲激 24h(GE Healthcare Biosciences， 3 Piscataway， NJ)， 该 H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37 ℃， 5 ％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果证实该突变体 FGFR3-Fc 构建体显著抑制人成骨细胞增殖， 且其 IC50 在 R&D Systems 的 FGFR3-Fc 的 3 倍范围内， 如图 3 所示， 图 2 显示全长 FGFR3-Fc 野生型和突变体 构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     表 28 ： 成骨细胞增殖测定中的 FGFR-Fc IC50.
     实施例 21 ： FGFR-Fc 野生型和突变体构建体与 FGF-8b 和 FGF-17 的结合
     为测定 FGFR-Fc 与其各自配体的结合能力， 进行 ELISA。 在室温在摇动下将重组人 FGF-8b 或 FGF-17(R&D Systems) 以 100nM 铺板于 Nunc Maxisorp 96- 孔板上保持 1h。各 板在室温用 BLOTTO(Thermo Fisher Scientific， Rockford， IL) 封闭 1h， 然后用 ELISA C 缓冲液 (137mM NaCl， 2.7mM KCl， 7.2mM Na2HPO4， 1.5mM KH2PO4， 0.05％ (v/w) 聚山梨酯 20， pH 7.2) 洗涤 5 次。FGFR-Fcs 用 PBS/0.1x BLOTTO/10ug/ml 猪肝素 (Sigma， St.Louis， MO) 稀释至 100nM， 然后制备 1 ∶ 2 连续稀释物， 到 0.10nM 为止。将 100μL FGFR-Fc 铺板且在 4℃培养过夜。 次日， 将各板用 ELISA C 洗涤 5 次， 然后在室温在摇动下用 2.5μg/mL 辣根过 氧化物酶缀合的抗人 Fc 抗体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories， West Grove， PA) 孵育 1h。用 ELISAC 洗涤 5 次后， 添加柠檬酸盐缓冲液中的 100μL OPD(5mg 邻苯二胺， 于 63mM 柠檬酸钠， 37mM 柠檬酸， pH 5.0， 0.03％ H2O2 中 ) 以进行检测。2-5 分钟后， 用 1N H2SO4 停止反应。各板使用 SoftMaxPro 软件在 490nm 读数。
     结果 ： 尽管野生型和突变体 FGFR2-Fcs 不显著结合至 FGF-8b 或 -17， 但有一些突 变体 FGFR3-Fc 构建体以大于野生型 FGFR3-Fc 的程度结合至 FGF-8b 和 FGF-17 两者， 如图 5A， 5B， 6A， 6B 和 7 所示。
     表 29 ： 野生型和突变体 FGFR3-Fc 构建体结合 FGF-8b 和 FGF-17.
     实施例 22 ： 通过表面等离子体共振测量 FGF 受体对 FGF 配体的结合亲和力
     通过表面等离子体共振测量可溶 FGF 受体 (FGFR) 与 FGF 配体的相互作用的动力 学速率常数、 平衡结合常数和平衡解离常数。 在该研究中检查多种形式的 FGFR3。 制备了有 两个或三个 Ig 样域， 且具有两个可能的点突变 (S249W 或 P250R) 的 FGFR3。FGFR3 都制备 为二聚体 Fc- 融合蛋白。对于这些研究， 利用 Fc 标签将 FGFR 分子俘获在先前用蛋白 A 固 定的 Biacore 芯片上。使 FGF 配体在含肝素的缓冲液中在该表面上流过。尽管 FGF 配体为 单体， 但认为它们在肝素的存在下结合为二聚物。 因此确定， 二价分析物模型是适合用于这
     些相互作用的。
     亲和力测定 ： 表征了 FGF 受体的对 FGF 配体的结合亲和力。对各相互作用测量结 -1 -1 合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s-1))。结合速率常数为反映配体 - 受体复合 物形成速率的值。解离速率常数为反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常表示为 平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是通过将解离速率常数除以结合速率 常数 (kd/ka) 获得的， 而 KA 是通过将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 获得的。具有类 似的 KD( 或类似的 KA) 的分子可能具有可广泛变化的结合和解离速率常数。 因此， 测量 ka 和 kd 以及 KA 或 KD 有助于更加独特地描述配体 - 受体相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 结合动力学和亲和力研究在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行。 Biacore T100TM 的方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 2.0 编程。因为各 FGF 受体分子包含人 Fc 域， 将生物素化蛋白 A(Thermo Fisher Scientific Inc， Rockford， IL) 用作俘获试剂用于这些研究。 将生物素化蛋白 A 在 HBS-EP 缓冲液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA， 0.05％表面活性剂 P20 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中 稀释至 50μg/mL 浓度， 然后俘获至 SA( 链亲和素 ) 传感器芯片的所有四个流动室上。每个 流动室获得约 1100RU 的密度。随后通过蛋白质 -A 以 150-250RU 的近似密度将各 FGF 受体 分子俘获至 SA 芯片的单独的流动室上。 Biacore 仪器测量结合于传感器芯片表面的蛋白质 的质量， 因此， 验证了各循环中受体的俘获。
     对于动力结合研究， 制备了 FGF 配体的从 200nM-0.06nM 的连续 1 ∶ 5 稀释物。将 这些样品注射在表面上， 并允许它们特异结合至传感器芯片俘获的 FGF 受体。以结合时间 为 7 分钟， 离解时间为 15 分钟进行各配体浓度的注射。以 50μL/min 的流速进行动力结合 研究。所有结合实验在 25℃在含 50μg/mL 肝素 (Calbiochem， La Jolla， Ca) 的 HBS-P 缓冲 液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 0.05％表面活性剂 P20， pH 7.4 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中进行。
     在循环之间， 用 20mM 盐酸洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤从蛋白 A 表面去 除俘获的 FGF 受体和任何结合的 FGF 配体， 便于接下来后一个测定样品的结合。数据使用 TM Biacore T100 评价软件 ( 版本 2.0) 编辑。数据通过减去参照流动室和空白注射处理。评 价基线稳定性以保证在整个注射顺序过程中再生步骤提供了一致的结合表面。 检查重复注 射曲线的再现性。将结合曲线整体拟合于二价分析物模型。
     结果 ： 确定了该二价分析物模型对这些相互作用而言是最适合的。 该模型对 ka(ka1 和 ka2) 以及 kd(kd1 和 kd2) 两者都测量两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的一价动 力学。这些样品报告的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1 和 KA1。第二组值 (ka2 和 kd2) 是指相互作用的亲合力， 没有报告。 尽管在残差中有一些趋向性 (trending)， 但与模型的拟 合对评估结合亲和力而言是令人满意的。表 30 详细列出了多种 FGFR3 分子与 FGF6 的结合 相互作用的动力学。全长 FGFR 分子 (23_375) 的亲和力类似于二域 FGFR 分子 (143_375) 的亲和力。该点突变增加对 FGF6 的亲和力， 且 S249W 的亲和力＞ P250R 的亲和力＞野生型 的亲和力。通常， 该亲和力的增加主要是由于较慢的解离速率常数导致的。
     表 30 ： FGF6 的结合亲和力
     实施例 23 ： 用于测定 FGFR-Fc 对肿瘤细胞的增殖的抑制的 3H- 胸苷增殖测定
     为测定 FGFR-Fc 抑制肿瘤细胞增殖的能力， 进行 3H- 胸苷测定。 将 Caki-1 和 DU145 肿瘤细胞以 2000 细胞 / 孔的密度铺板于 96- 孔平底板， 并在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。次 日， 将 FGFR-Fc 构建体在 RPMI 1640( 具有 0.5％ FBS， 1mM 丙酮酸钠， 和 2mM GlutaMAX) 中 以 20， 10， 和 5μg/mL 连续稀释， 并在 37 ℃， 5 ％ CO2 下铺板于孔保持 3 天。将细胞用每孔 3 1μCi H- 胸苷 (GE Healthcare Biosciences， Piscataway， NJ) 冲激 24h， 该 3H- 胸苷掺入 增殖中的细胞。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果 ： 在 20μg/mL， 截短的 FGFR3-FC S249W 突变体抑制 Caki-1 和 DU145 细胞二 者， 其抑制程度稍微大于野生型 FGFR2-Fc 或 FGFR3-Fc。图 8A 演示 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细 胞生长， 图 8B 演示 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞生长。
     表 31 ： 增殖的百分比抑制
     实施例 24 ： sFGFR-VEGF scFv 蛋白质抑制内皮细胞萌芽
     为测定包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 的功效， 如 (Darland et al， Dev Biol 264(2003)， 275) 所述建立内皮细胞和周皮细胞的体 外共培养系统。 在该共培养中， 将包被在 Cytodex 珠上的 HUVEC 与人间充质干细胞 (Lonzo) 在 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞条件化培养基的存在下在纤维蛋白凝胶中共培养。 在实验开始时或在实验第 7 天， 将 0.04-50nM 对照拮抗剂、 VEGF-A 拮抗剂或包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白添加至培养物。在添加拮抗剂后 的第 8 天使用 PFA 固定细胞。然后使用抗平滑肌细胞肌动蛋白 (aSMA) 或抗 PECAM 抗体通 过 IHC 染色细胞以分别识别周皮细胞和内皮细胞。在使用对照拮抗剂处理的孔中， 这些细
     胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。在用抗 VEGF-A、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受 体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明 拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     研究设计 ： 在第 1 天， Cytodex-3 珠用 HUVECs 包被， 在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。在 第 2 天， 在 24 孔板的孔中将 HUVEC 珠 (200 珠 / 孔 ) 与人间充质干细胞 (hMSC)(40,000 细 胞 / 孔 ) 一起包埋到纤维蛋白凝胶中。将 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞培养基的 1 ∶ 1 混合物与 2ng/mL HGF 一起添加至这些细胞。每两天替换培养基直到实验结束。在第 2 天 ( 从共培养开始起 ) 或第 7 天 ( 共培养形成后 ) 将拮抗剂添加至培养物。添加拮抗剂 后将细胞在 4％ PFA 中固定过夜。用抗 PECAM 或抗 SMA 抗体染色细胞， 然后用第二抗体 ( 缀 合有荧光剂 ) 染色。然后通过显微镜观察细胞， 对 10 珠 / 孔的代表组手动计数芽的数量和 长度。然后计算孔的平均值。
     结果 ： 在用对照拮抗剂处理的孔中， 细胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。 在用抗 VEGF-A 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     实施例 25 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白质预防性处理在 Nu/Nu 小鼠中抑制 A549 肺癌细胞生 长
     为测定 sFGFR 蛋白质是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 在第 0 天对多组小鼠皮下 注射 A549 肺癌肿瘤。然后多组小鼠 (n ＝ 10/gp) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周历时 4 周， 起始于肿瘤接种 1 天后。3X/ 周监测肿瘤体积 4 周。与 注射对照试剂的小鼠相比， 注射 sFGFR 蛋白质的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生 长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 6 用 2x 10 个 A549 细胞在右胁腹皮下注射。从第 1 天开始， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内 注射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周， 注射 4 周。使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。 肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤并用于组织学。 将将肿瘤固 定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密 度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 26 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白治疗处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞生长
     为测定是否 sFGFR 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 几组小鼠在第 0 天皮下注射 3 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm ， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试 剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹 膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。使用测径 器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 保持 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且肿瘤称重。肿瘤也交付进行组织学分析 用于微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 27 ： 使用 sFGFR-Fc 蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测试 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。然后对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试 剂， sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 自肿瘤接种 1 天后开始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历 时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿 瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤 固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管 密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 28 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌细 胞的生长
     为测定 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 3 DU145 前列腺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/ Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比 注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑 制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析 以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 29 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。对多组小鼠(n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂， sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后起。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂 的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小 鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射浓 度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-VEGFscFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿 瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血 管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白的小鼠肿瘤显 著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 30 ： 以双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到 3 尺寸 200mm ， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿 瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106 个 A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用 后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 31 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。对多 组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后开 始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对 肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历 时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内 皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 32 ： 使用双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 DU145 前列腺癌细胞在 Nu/ Nu 小鼠中的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。 当肿瘤 3 达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双 特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的 功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     生理或病理条件下新血管的生长需要血管发生的活化剂和抑制剂的协调作用。 血 管发生的活化剂包括血管内皮生长因子 -A(VEGF-A)， 成纤维细胞生长因子 (FGFs)， 胎盘生 长因子 (PlGF)， 和肝细胞生长因子 (HGF) 和一些细胞因子如白介素 -8(IL-8)。血管发生的 内源性抑制剂包括血小板反应蛋白、 内皮他丁、 血管他丁和白介素 -12。血管发生的活化剂 和抑制剂之间的平衡生理和病理血管发生过程中向活化剂倾斜。
     VEGF-A 为生理和病理血管发生的关键调节剂。其通过调节内皮细胞的增殖、 迁移 和存活在血管的规格、 形态形成、 分化和体内稳态方面起到重要作用。 ( 参见， 例如， Ferrara 等人， Nat Med 9 ： 669， 2003.)。研究表明 VEGF-A 在多种人肿瘤中高度表达。( 参见， 例如， Ellis 和 Hicklin， Nat.Rev.Cancer 8 ： 579， 2008)。 VEGF-A 表达通过低氧诱导因子 1(HIF-1) 转录因子调节。 ( 参见， 例如， Wang 和 Semenza， J.Biol.Chem.270 ： 1230， 1995)。 肿瘤细胞的 快速增殖和差的血液流动导致肿瘤中的低氧 - 传导性环境， 导致 VEGF-A 的快速上调。( 参 见， 例如， Brahimi-Horn 和 Pouyssegur， Bull.Cancer 93 ： E73， 2006)。
     已描述了由不同的 mRNA 剪接变体编码的 121， 145， 165， 189 或 206 个氨基酸长度 的 5 种人 VEGF-A 亚型 (VEGF-A121-206)， 它们都能刺激内皮细胞的有丝分裂发生。 这些亚型在 生物活性、 受体特异性、 以及对细胞表面及细胞外基质关联的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 ( 该 蛋白聚糖作为 VEGF-A 的低亲和力受体起作用 ) 的亲和力方面不同 ： VEGF-A121 不结合至肝 素或硫酸乙酰肝素 ； VEGF-A145 和 VEGF-A165(GenBank Acc.No.M32977) 都能结合至肝素 ； 而 VEGF-A189 和 VEGF-A206 对肝素和硫酸乙酰肝素显示最强的亲和力。VEGF-A121、 VEGF-A145 和 VEGF-A165 以可溶形式分泌， 尽管大多数 VEGF-A165 仅限制于细胞表面和细胞外基质蛋白聚 糖， 而 VEGF-A189 和 VEGF-A206 保持与细胞外基质相关联。VEGF-A189 和 VEGF-A206 都可通过 被肝素或肝素酶处理释放， 这表明这些亚型是通过蛋白聚糖连接于细胞外基质的。细胞结 合的 VEGF-A189 也可被蛋白酶如纤维蛋白溶酶所裂解， 导致活性可溶的 VEGF-A110 的释放。 人 VEGF-A165 是丰度最高而且是有生物活性的形式， 它的 Asn74 被糖基化， 并且典型地作为 46kDa 的 23kDa 亚单位同型二聚体表达。
     已 鉴 定 出 了 与 VEGF-A 相 互 作 用 的 4 种 细 胞 表 面 受 体。 这 些 包 括 VEGFR-1/ Flt-1(fins 状 酪 氨 酸 激 酶 -1 ； GenBank Acc.No.X51602 ； De Vries 等 人， Science 255 ： 989-991， 1992) ； VEGFR-2/KDR/Flk-1( 包 含 受 体 / 胎 肝 激 酶 -1 的 激 酶 插 入 域 ； GenBank Acc.Nos.X59397(Flk-1) 和 L04947(KDR) ； Terman 等人， Biochem.Biophys.Res.Comm.187 ： 1579-1586， 1992 ； Matthews 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 9026-9030， 1991) ；
     神 经 纤 毛 蛋 白 -1(Gen Bank Acc.No.NM003873)， 和 神 经 纤 毛 蛋 白 -2(Gen Bank Acc. No.NM003872)。VEGF121 和 VEGF165 结 合 VEGFR-1 ； VEGF121、 VEGF145 和 VEGF165 结 合 VEGFR-2 ； VEGF165 结合神经纤毛蛋白 -1 ； 而 VEGF165 和 VEGF145 结合神经纤毛蛋白 -2。( 参见， 例如， Neufeld 等人， FASEB J.13 ： 9-22， 1999 ； Stacker 和 Achen， Growth Factors 17 ： 1-11， 1999 ； Ortega 等 人， Fron.Biosci.4 ： 141-152， 1999 ； Zachary， Intl.J.Biochem.Cell Bio.30 ： 1169-1174， 1998 ； Petrova 等人， Exp.Cell Res.253 ： 117-130， 1999)。
     人们对 VEGF-A 对于几类重要癌症的发生的重要性的认识终于导致了一种人源 化 VEGF-A 单克隆抗体 AVASTINTM 在最近被批准用于与化学治疗联合治疗转移性结肠直 肠癌、 非小细胞肺癌和转移性乳腺癌。( 参见， 例如， Hervitz 等人， N.Engl.J.Med.350 ： 2335-2342， 2004 ； Sandler 等人， N.Engl.J.Med.355 ： 2542-2550， 2006 ； Miller 等人， 2008)。 TM 类似的， LUCENTIS ( 一种人源化单克隆抗体片段 ) 最近被批准用于治疗新生血管 ( 湿型 ) 年龄相关的黄斑变性 (AMD)， 这反映了 VEGF-A 在新生血管性眼病的发病机理中的重要性。
     成纤维细胞生长因子 (FGFs) 为一个肝素结合性生长因子的家族， 在哺乳动物中 具有 22 个家族成员 (FGF1-14， 16-23)。FGF 在多种生物功能如细胞增殖、 分化、 迁移、 血管 发生和肿瘤发生中起重要作用。它们通过结合、 二聚化、 并且活化细胞表面 FGF 受体而发挥 它们的多效生物作用。( 参见， 例如， Eswarakumar 等人 Cytokine Growth Factor Rev.16 ： 139-149， 2005)。哺乳动物中有四种 FGF 受体基因， fgfR1-fgfR4。FGFRs 的细胞外域包含 三个免疫球蛋白状域。FgfR1-FgfR3 的膜近端 Ig 环处的可变剪接产生更多的变体。该环 N- 端的一半由不变的外显子 (IIIa) 编码， 且另外一半由选自称为 IIIb 或 IIIc 的外显子编 码。 FGF 配体和受体的过表达和 FGF 受体中的突变体与许多类型的癌症相关， 所说的 癌症包括前列腺、 乳腺、 卵巢、 膀胱、 结肠直肠、 胰腺、 肝、 肺、 成胶质细胞瘤癌症， 多发性骨髓 瘤和白血病。( 参见例如， Grose 等人， Cytokine Growth Factor Rev.16 ： 179-186， 2005)。 FGF1， 2， 6， 8b， 9 和 17 在前列腺肿瘤组织中过表达， 且 FGF8b 和 17 的表达水平与肿瘤阶段、 级别和预后不良相关 (Dorkin 等人， Oncogene 18 ： 2755-2761， 1999 ； Gnanapragasam 等人， Oncogene 21 ： 5069-5080， 2002 ； Heer 等人， J Pathol.204 ： 578-586.2004)。FGF9 促使前列 腺癌 - 诱导的新骨形成且可参与雄激素受体 - 阴性的前列腺癌在骨中成骨细胞的进展 (Li 等人， J Clin Invest.118 ： 2697-2710， 2008)。FGFR1 和 FGFR4 在前列腺肿瘤组织中过表 达， 且 FGFR2IIIb 至 IIIc 的亚型转换促进前列腺癌起始和进展 (Giri 等人， Clin Cancer Res.5 ： 1063-1071， 1999 ； Wang 等人， Clin.Cancer Res.10 ： 6169-6178， 2004 ； Kwabi-Addo 等 人， Prostate 46 ： 163-172， 2001)。FGF1， 2， 8 在乳腺肿瘤组织中过表达。所有乳腺癌中高 达 8.7％具有 FGFR1 基因扩增， 且该扩增为整体存活率的独立预测因素。FGFR4 过表达与 复发性乳腺癌患者的他莫昔芬治疗失败相关 ( 参见， 例如， Elsheikh 等人， Breast Cancer Res.9， 2007 ； Meijer 等人， Endocrine-Related Cancer 15 ： 101-111， 2008)。FGF1， 8， 9， 18 和 FGFR1IIIc， FGFR2IIIc， FGFR4 在卵巢肿瘤组织中过表达。FGFR3 过表达和激活突变在膀胱 癌的膀胱上皮细胞癌中有报道。在非侵入性、 低等级和阶段的膀胱肿瘤中的 FGFR3 突变与 较高的复发率显著相关。 ( 参见， 例如， Knowles， World J.Urol.25 ： 581-593， 2007)。 FGF-2， FGFR1 和 FGFR2 经常在肺的腺癌和鳞状细胞癌中过表达。FGF-2 信号途径活化可能是鳞状 细胞癌发病的早期现象 (Behrens， 等人， Clin Cancer Res.14 ： 6014-6022， 2008)。
     许多 FGF 家族成员， 包括 FGF1， FGF2， FGF4 和 FGF6， 也具有强的体外和体内促血 管生成活性， 且可通过调节肿瘤血管化而促进肿瘤进展 (Presta 等人， Cytokine Growth Factor Rev.16 ： 159-178， 2005)。在血管发生过程中在 FGF 家族和 VEGF 家族成员之间存 在密切的相互沟通 (cross-talk)。在产生自发性胰腺肿瘤的 Rip1-Tag2 转基因小鼠肿瘤 组织中， 用抗 VEGFR2 单克隆抗体阻断 VEGF 促进缺氧， 并且诱导 FGF1， FGF2 和 FGF7 的表达 (Casanovas 等人， Cancer Cell 8 ： 299-309， 2005)。 FGF 的上调与血管发生的再诱导和逃避 VEGF 阻断同时发生。 该模型中联合抑制 VEGF 和 FGF 信号传递导致进一步的肿瘤抑制， 表明 FGF 信号途径的上调对于 VEGF 靶向性治疗后的逃避机理至少部分有帮助。而且， 在多种小 鼠肿瘤模型 ( 包括 T3M4， Panc1 和 QG56 异种移植模型 ) 中阻断 VEGF 和 FGF 信号显示加和 性的或协同性的抗肿瘤作用 (Ogawa 等人， Cancer Gene Ther.9 ： 633-640， 2002)。最近， 用 泛 VEGFR 酪氨酸激酶抑制剂治疗的成胶质细胞瘤患者的临床研究显示 FGF2 的血清水平在 复发患者中比在响应阶段中的相同患者的水平高， 表明一种类似的涉及 FGF2 上调的补偿 机理 (Batchelor 等人， Cancer Cell 11 ： 83-95， 2007)。
     总之， 上述临床前数据和临床数据支持以下观点， 即阻止 VEGF 和 FGF 信号传递 途径二者的联合治疗在许多实体瘤中比单独的 VEGF 阻断可产生更好的抗肿瘤作用。这 些数据为肿瘤学中靶向这两种途径提供了强有力的概念证明性论据 (proof-of-concept rationale)。阻断这两种途径也可在其它血管发生疾病， 包括 AMD 中提供更好的功效。本 发明提供用于所述这些和其它用途的多特异性蛋白， 在本文的教导下， 其对本领域技术人 员将是显而易见的。 发明内容
     本发明提供双特异性结合蛋白， 其包含减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的抗 体 / 可溶受体双特异性结合蛋白。根据本发明， 该双特异性结合蛋白包含抗 VEGF-A 抗体 (VEGF-A 抗体 ) 部分的 VEGF-A 结合区和 FGF 受体的 FGF 结合部分， 如本文所述。本文所述 的 FGF 结合部分通常为可溶 FGF 受体 (FGFR)。本发明在某些实施方案中提供， 该双特异性 结合蛋白的可溶 FGF 受体部分包含本文所述的 FGFR3 或 FGFR2 的 FGF 受体部分。在其它实 施方案中， Fc 多肽融合至 FGFR 的 C- 端。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分和 VEGF-A 结 合部分为使用肽或多肽接头序列融合的多肽， 并且在这些情况下， 编码所述实施方案的多 核苷酸可表达为单一双特异性结合蛋白。
     本发明还提供， 双特异性结合蛋白的某些实施方案包含本文所述的 VEGF-A 抗体 部分。该 VEGF-A 抗体部分可进一步由本文所述的 scFV 多肽或 VL 和 VH 多肽构成。
     在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 特别是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体 部分， 其为选自以下的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 以及选自以下的 VEGF-A 抗体部分 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6 scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1 scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其为选自以下的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 和选 自以下的 VEGF-A 结合部分 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在其它实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白包括 FGFR3 部分和 VEGF-A 抗体 部分， 其选自 FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375) (S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包括 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其 为 选 自 以 下 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 和 选 自 以 下 的 VEGF-A 结 合 部 分 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6 scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性 抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其为选自以下的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示 的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 和选 自以下的 VEGF-A 结合部分 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在其它方面， 本发明提供使用本文所述的双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白的方 法。在某些实施方案中， 该双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白可给予受试者以治疗以实体 瘤生长为特征的癌症， 如前列腺癌， 乳腺癌， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 成胶质细 胞瘤， 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和胃肠道间质瘤 (GIST)。
     本发明的这些和其它方面在参考以下发明详述和附图后将会是明显的。
     定义
     除非另有定义， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解 的所述方法和组合物的意思相同的意思。如本文所述， 以下术语和短语具有属于它们的意 思， 除非另有所述。
     “多肽” 为通过肽键结合的氨基酸残基的聚合物， 无论天然或合成产生的。少于约 10 个氨基酸残基的多肽通常称为 “肽” 。
     “蛋白质” 为包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可包含非肽组分， 如碳水 化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可通过产生蛋白质的细胞添加至蛋白质， 且将随着细胞的类型而改变。蛋白质在此根据它们的氨基酸主链结构定义 ； 取代基如碳水化合 物基团通常没有规定， 但仍然可存在。
     术语 “氨基 - 端” 和 “羧基 - 端” 在本文使用以表示多肽中的位置。当上下文允许 时， 这些术语用于以具体的多肽序列或的部分为参考表示近似或相关的位置。 例如， 位于多 肽中相关序列的羧基 - 端的某一序列是与该相关序列的羧基端相邻， 而不一定位于完整多 肽的羧基端。
     如本文所述， “核酸” 或 “核酸分子” 是指多核苷酸， 如脱氧核糖核酸 (DNA) 或核糖 核酸 (RNA)， 寡核苷酸， 聚合酶链反应 (PCR) 产生的片段， 和连接、 分裂、 核酸内切酶作用， 和 核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可由单体构成， 该单体为天然存在的核 苷酸 ( 如 DNA 和 RNA)， 或天然存在的核苷酸的类似物 ( 例如， 天然存在的核苷酸的 α- 对 映体形式 )， 或两者的组合。修饰的核苷酸可在糖部分和 / 或嘧啶或嘌呤碱基部分具有 变化。糖修饰包括， 例如， 用卤素、 烃基、 胺和叠氮基代替一个或多个羟基， 或糖可官能化 为醚或酯。而且， 整个糖部分可用立体上和电子上类似的结构， 如氮杂 - 糖和碳环的糖类 似物代替。碱基部分的修饰的实例包括烃基化嘌呤和嘧啶、 酰基化嘌呤或嘧啶， 或其它众 所周知的杂环的代替物。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯 键的类似物包括硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 硒代磷酸酯， 硒代磷酸酯， 苯胺基硫代磷酸酯 (phosphoroanilothioate)， 苯胺基磷酸酯 (phosphoranilidate)， 氨基磷酸酯， 等。 术语 “核 酸分子” 也包括所谓的 “肽核酸” ， 其包括连接至聚酰胺主链的天然存在的或修饰的核酸碱 基。核酸可为单链或双链。
     如本文所述， 术语 “拮抗剂” 表示在某个生物环境中减少另一化合物的活性的化合 物。例如， VEGF-A 拮抗剂为减少 VEGF-A 的生物活性的化合物， 且 FGFR 拮抗剂为减少 FGF 的生物活性的化合物。因为 VEGF-A 和 FGF 两者的活性取决于多种分子 ( 包括配体、 受体和 信号转导物 ) 的相互作用， 拮抗剂可通过直接作用于 VEGF-A 或 FGF， 或通过作用于同源生 物途径中的另一分子来减少活性。例如， FGF 拮抗剂可通过以下方式减少 FGF 活性， 例如， 通过结合至受体本身， 通过结合至其配体之一， 通过干扰受体二聚体化， 或通过干扰受体磷 酸化。拮抗剂包括但不限于抗体、 可溶受体、 和结合至配体或其受体， 或以其他方式干扰配 体 - 受体相互作用和 / 或其它受体功能的非蛋白质化合物。
     术语″受体″表示细胞相关的蛋白质， 其结合至生物活性分子 ( 即， 配体 ) 且介导 配体对细胞的作用。膜结合的受体以多域或多肽结构为特征， 其包含细胞外配体 - 结合域 和通常在信号转导中涉及的细胞内效应物结构域。配体与受体的结合导致受体中构象变 化， 导致效应物结构域和细胞中其它分子的相互作用。该相互作用进而导致细胞中代谢变 化。 与受体 - 配体相互作用相关的代谢事件包括基因转录、 磷酸化、 脱磷酸化、 环状 AMP 产生 的增加、 细胞钙动员、 膜脂质动员、 细胞粘附、 肌醇脂质的水解和磷脂的水解。通常， 受体可 为膜结合的、 可溶的或核内的 ； 单体的 ( 例如， 甲状腺刺激激素受体， β- 肾上腺素能受体 ) 或多聚体的 ( 例如， PDGF 受体、 生长激素受体、 IL-3 受体、 GM-CSF 受体、 G-CSF 受体、 红细胞 生成素受体和 IL-6 受体 )。
     “可溶受体” 是不结合于细胞膜的受体多肽。最常见的情况下， 可溶受体是缺乏跨 膜和胞浆域的配体 - 结合受体多肽。可溶受体可包括另外的氨基酸残基， 如提供多肽的纯 化或提供用于多肽连接至底物的位点的亲和标签。 许多细胞表面受体具有天然存在的可溶对应物， 它们是通过蛋白水解产生或从可变剪接的 mRNAs 翻译的。当受体多肽分别缺少跨 膜和细胞内多肽区段的足够部分以提供膜锚定或信号转导时， 称该受体多肽基本上没有跨 膜和细胞内多肽区段。
     如本文所述， 术语″ Fc- 融合蛋白″表示兼具异源蛋白质的结合特异性与免疫球 蛋白恒定域的效应物作用的抗体状分子。结构上， Fc- 融合蛋白包含具有所需结合特异性 的氨基酸序列 ( 其不同于抗体的抗原识别和结合位点 ( 即， 为″异源的″ ))， 和免疫球蛋白 恒定域序列的融合。Fc- 融合蛋白分子通常包括连续氨基酸序列， 其至少包含受体或配体 的结合位点。Fc- 融合蛋白中的免疫球蛋白恒定域序列可获自任何免疫球蛋白， 如 IgG-1， IgG-2， IgG-3， 或 IgG-4 亚型， IgA( 包括 IgA-1 和 IgA-2)， IgE， IgD 或 IgM。例如， 根据本发 明可用的 Fc- 融合蛋白为包含 FGFR3 受体的 FGF 结合部分而没有 FGFR3 受体的跨膜或细胞 质序列的多肽。在一个实施方案中， FGFR3 的细胞外域融合至免疫球蛋白序列的恒定域。
     术语 “抗体” 在本文使用是指机体响应抗原的存在而产生的、 结合至抗原的蛋白 质， 及其抗原 - 结合片段和工程化变体。因此， 术语 “抗体” 和 “抗体” 包括多克隆抗体、 亲 和纯化的多克隆抗体、 单克隆抗体、 和抗原 - 结合抗体片段， 如 F(ab’ )2 和 Fab 片段。遗传 工程完整的抗体和片段， 如嵌合抗体、 人源化抗体、 单链 Fv 片段、 单链抗体、 双抗体、 迷你抗 体、 线性抗体、 多价或多特异性杂合抗体等也包括在内。因此， 术语 “抗体” 可广义地用于包 括任何包含抗体的抗原结合位点且能结合至其抗原的蛋白质。 术语 “遗传工程抗体” 是指以下抗体， 其中氨基酸序列在天然抗体的氨基酸序列的 基础上被改变。因为重组 DNA 技术在抗体产生中的重要性， 不必限制为在天然抗体发现中 的氨基酸序列 ； 可重新设计抗体以得到所需特征。 可能的变化非常多， 可从仅改变一个或一 些氨基酸到例如可变区或恒定区的完全重新设计。通常， 对恒定区进行改变以改善或改变 如补体结合、 与细胞的相互作用和其它效应物作用等特征。 通常， 将对可变区进行变化以改 善抗原结合特征、 改善可变区稳定性、 或减少免疫原性风险。
     “抗体的抗原结合位点” 为抗体的足以结合至其抗原的部分。最小的该区通常 为可变域或其遗传工程变体。单域结合位点可产生自骆驼抗体 ( 参见 Muyldermans 和 Lauwereys， J.Mol.Recog.12 ： 131-140， 1999 ； Nguyen 等 人， EMBO J.19 ： 921-930， 2000) 或 其它物种的 VH 域以产生单域抗体 (“dAbs” ； 参见 Ward 等人， Nature 341 ： 544-546， 1989 ； 美国专利 No.6,248,516 to Winter 等人 )。在某些变化中， 抗原结合位点为仅具有 2 个天 然或非天然 ( 例如， 诱变处理的 ) 存在的重链可变域或轻链可变域， 或其组合的互补决定 区 (CDR) 的多肽区 ( 参见， 例如， Pessi 等人， Nature 362 ： 367-369， 1993 ； Qiu 等人， Nature Biotechnol.25 ： 921-929， 2007)。更一般的， 抗体的抗原结合位点包含结合至相同表位的 重链可变域和轻链可变域两者。在本发明中， “包含抗体的抗原结合位点” 的分子可进一步 包含一个或多个抗体的第二抗原结合位点 ( 其可结合至相同或不同表位或相同或不同抗 原 )， 肽接头， 免疫球蛋白恒定域， 免疫球蛋白铰链， 两亲性螺旋 ( 参见 Pack 和 Pluckthun， Biochem.31 ： 1579-1584， 1992)， 非 肽 接 头， 寡 核 苷 酸 ( 参 见 Chaudri 等 人， FEBSLetters 450 ： 23-26， 1999) 等， 且可为单体或多聚蛋白质。包含抗体的抗原结合位点的分子的实 例是本领域已知的， 包括例如 Fv 片段， 单链 Fv 片段 (scFv)， Fab 片段， 双抗体， 迷你抗体， Fab-scFv 融合物， 双特异性 (scFv)4-IgG， 和双特异性 (scFv)2-Fab。( 参见， 例如， Hu 等人， Cancer Res.56 ： 3055-3061， 1996 ； Atwell 等 人， Molecular Immunology 33 ： 1301-1312，
     1996 ； Carter 和 Merchant， Curr.Opin.Biotechnol.8 ： 449-454， 1997 ； Zuo 等 人， Protein Engineering 13 ： 361-367， 2000 ； and Lu 等人， J.Immunol.Methods 267 ： 213-226， 2002)。
     如本文所述， 术语 “免疫球蛋白” 是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码 的多肽组成的蛋白质。 免疫球蛋白的一种形式构成抗体的基本结构单位。 该形式为四聚物， 且由两个相同的免疫球蛋白链对组成， 每个对具有一个轻链和一个重链。在每个对中， 轻 链和重链可变区一起负责结合至抗原， 且恒定区负责抗体效应物作用。免疫球蛋白通常在 脊椎动物生物中作为抗体起作用。已在高等脊椎动物中鉴定出五种免疫球蛋白 (IgG， IgA， IgM， IgD 和 IgE)。IgG 是主要的种类 ； 它通常作为血浆中第二丰富的蛋白质存在。在人中， IgG 由四个亚类组成， 称为 IgG1， IgG2， IgG3 和 IgG4。IgG 类的重链恒定区用希腊字母 γ 标识。例如， IgG1 亚类的免疫球蛋白包含 γ1 重链恒定区。各个免疫球蛋白重链具有由恒 定区蛋白质域 (CH1， 铰链， CH2， 和 CH3 ； IgG3 也包含 CH4 域 ) 组成的恒定区， 该恒定区蛋白质 域基本上为物种的给定亚类的变体。编码人和非人免疫球蛋白链的 DNA 序列是本领域已知 的。 ( 参见， 例如， Ellison 等人， DNA 1 ： 11-18， 1981 ； Ellison 等人， Nucleic Acids Res.10 ： 4071-4079， 1982 ； Kenten 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79 ： 6661-6665， 1982 ； Seno 等人， Nuc.Acids Res.11 ： 719-726， 1983 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323-327， 1988 ； Amster 等 人， Nuc.Acids Res.8 ： 2055-2065， 1980 ； Rusconi and Kohler， Nature 314 ： 330-334， 1985 ； Boss 等 人， Nuc.Acids Res.12 ： 3791-3806， 1984 ； Bothwell 等 人， Nature 298 ： 380-382， 1982 ； van der Loo 等 人， Immunogenetics 42 ： 333-341， 1995 ； Karlin 等 人， J.Mol. Evol.22 ： 195-208， 1985 ； Kindsvogel 等人， DNA 1 ： 335-343， 1982 ； Breiner 等人， 基因 18 ： 165-174， 1982 ； Kondo 等 人， Eur.J.Immunol.23 ： 245-249， 1993 ； and GenBank Accession No.J00228)。 关于免疫球蛋白结构和功能的综述可参见 Putnam， The Plasma Proteins， Vol V， Academic Press， Inc.， 49-140， 1987 ； 和 Padlan， Mol.Immunol.31 ： 169-217， 1994。术语 “免疫球蛋白” 在此使用为其一般意思， 表示完整抗体， 其组成链， 或链的片段， 依上下文而 定。
     全长免疫球蛋白 “轻链” ( 约 25Kd 或 214 个氨基酸 ) 由 NH2- 端的可变区基因 ( 编码 约 110 个氨基酸 ) 和 COOH- 端的 κ 或 λ 恒定区基因所编码。全长免疫球蛋白 “重链” (约 50Kd 或 446 个氨基酸 ) 由可变区基因 ( 编码约 116 个氨基酸 ) 和 γ， μ， α， δ， 或ε恒 定区基因 ( 编码约 330 个氨基酸 ) 编码， 后者分别定义抗体的同种型为 IgG， IgM， IgA， IgD， 或 IgE。在轻链和重链中， 可变区和恒定区通过约 12 或更多个氨基酸的 “J” 区连接， 且重链 还包括约 10 个或更多氨基酸的 “D” 区。( 通常参见 Fundamental Immunology(Paul， ed.， Raven Press， N.Y.， 2nd ed.1989)， Ch.7)。
     免疫球蛋白 “Fv” 片段包含重链可变域 (VH) 和轻链可变域 (VL)， 二者通过非共价相 互作用保持在一起。因此免疫球蛋白 Fv 片段包含单一抗原结合位点。Fv 片段的二聚结构 可进一步通过突变发生引入二硫键而稳定化。( 参见 Almog 等人， Proteins 31 ： 128-138， 1998.)
     如本文所述， 术语 “单链 Fv” 和 “单链抗体” 是指这样的抗体片段， 其在单一多肽链 中包含重链和轻链两者的可变区， 但缺乏恒定区。通常， 单链抗体进一步包含 VH 和 VL 域之 间的多肽接头， 其使得单链抗体能够形成允许抗原结合的所需结构。 单链抗体详细讨论于， 例如， Pluckthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies， vol.113(Rosenburg 和Moore eds.， Springer-Verlag， New York， 1994)， pp.269-315。( 也参见 WIPO Publication WO 88/01649 ； U.S.Patent Nos.4,946,778 和 5,260,203 ； Bird 等 人， Science 242 ： 423-426， 1988)。单链抗体也可为双特异性的和 / 或人源化的。
     “Fab 片段” 包含一个轻链以及一个重链的 CH1 和可变区。Fab 片段的重链不能与 另一重链分子形成二硫键。
     “Fab’ 片段” 包含一个轻链和一个重链， 所述重链还包含 CH1 和 CH2 域之间的恒定 区部分， 以使两个重链之间能够形成链间的二硫键而形成 F(ab’ )2 分子。
     “F(ab’ )2 片段” 包含两个轻链和含一部分 CH1 和 CH2 域之间的恒定区的两个重链， 以使两个重链之间形成链间二硫键。
     免疫球蛋白 “Fc 片段” ( 或 Fc 域 ) 为抗体中负责结合至细胞上的抗体受体和补体 的 C1q 组分的部分。Fc 代表 “片段结晶” ， 即容易形成蛋白质晶体的抗体的片段。独特的蛋 白质片段 ( 最初基于蛋白水解消化描述 ) 可定义免疫球蛋白的总体一般结构。如文献中最 初定义的， Fc 片段由二硫键连接的重链铰链区、 CH2 和 CH3 域组成。然而， 后来该术语被用于 指由下述部分组成的单链 ： CH3、 CH2、 和至少一部分铰链， 其中所述铰链的至少一部分足以与 另一条这样的链形成二硫键连接的二聚物。免疫球蛋白结构和功能的综述可参见 Putnam， The Plasma Proteins， Vol.V(Academic Press， Inc.， 1987)， pp.49-140 ； and Padlan， Mol. Immunol.31 ： 169-217， 1994。如本文所述， 术语 Fc 包括天然存在的序列的变体。 免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区间断的 “框架” 区组成。因此， 术 语 “高变区” 是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。该高变区包含来自 “互补决定区” 或 “CDR”的氨基酸残基 ( 例如， 在人中， 轻链可变域中的残基 24-34(L1)， 50-56(L2)， 和 89-97(L3)， 和重链可变域中的残基 31-35(H1)， 50-65(H2) 和 95-102(H3)( 氨基酸序列号基 于 EU 索引 ； 参见 Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5th Ed.Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， Md.(1991)) 和 / 或那些来自 “高变环 (loop)” 的残基 ( 在人中， 轻链可变域中的残基 26-32(L1)， 50-52(L2) 和 91-96(L3)， 和重链可变域中的 26-32(H1)， 53-55(H2) 和 96-101(H3) ； Chothia 和 Lesk， J.Mol.Biol.196 ： 901-917， 1987)( 兹将上述文献引入并入本文 )。 “框架区” 或 “FR” 残基 为除在此定义的高变区残基之外的那些的可变域残基。 不同轻链或重链的框架区的序列在 一个物种中相对保守。因此， “人框架区” 为基本上等同于 ( 约 85％或更多， 通常 90-95％ 或更多 ) 天然存在的人免疫球蛋白的框架区的框架区。抗体的框架区 ( 其为组分轻链和重 链的框架区的总体 ) 起到定位和对准 CDR 的作用。该 CDR 主要负责对抗原表位的结合。VL 域的 CDR L1、 L2 和 L3 在这里也分别称为 LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 ； VH 域的 CDR H1、 H2 和 H3 在这里也分别称为 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3。
     “嵌合抗体” 是这样的抗体， 其轻链和重链基因是从属于不同物种的免疫球蛋白可 变区和恒定区基因构建的 ( 典型地通过基因工程 )。 例如， 可以把小鼠单克隆抗体的基因的 可变区段连接于编码人恒定区的区段 ( 例如， 人 γ1 或 γ3 重链基因， 和人 κ 轻链基因 )。 因 此， 治疗嵌合抗体是一种杂合蛋白， 通常由小鼠抗体的可变域或抗原 - 结合域以及人抗体 的恒定域构成， 但也可使用其它哺乳动物物种。具体地， 嵌合抗体通过重组 DNA 技术制备， 其中用免疫球蛋白轻链、 重链或两者的铰链和恒定区的全部或部分代替另一动物的免疫球 蛋白轻链或重链的相应区域。这样， 亲本单克隆抗体的抗原 - 结合部分被嫁接到另一物种
     的抗体的骨架上。任选地可以通过替换暴露的残基来用类人表面 (human-like surface) 来 “遮掩” (cloak) 嵌合抗体， 其结果获得 “表面装饰的抗体” (veneered antibody)。
     如本文所述， 术语 “人抗体” 包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体， 且包括 从人免疫球蛋白库或从这样的动物分离的抗体 ： 该动物转入了一种或多种人免疫球蛋白基 因且不表达内源性免疫球蛋白， 这样的动物描述于例如 Kucherlapati 等人的美国专利号 5,939,598。
     术语 “人源化免疫球蛋白” 是指包含人框架区和源自非人 ( 例如， 小鼠或大鼠 ) 免 疫球蛋白的一个或多个 CDR 的免疫球蛋白。提供 CDR 的非人免疫球蛋白称为 “供者” ， 而提 供框架的人免疫球蛋白称为 “受者” 。 恒定区不需要存在， 但如果存在的话， 它们必须基本上 相同于人免疫球蛋白恒定区， 即， 至少约 85-90％， 优选约 95％或更多的相同。因此， 人源化 免疫球蛋白的所有部分， 除了可能的 CDR， 都基本上相同于天然人免疫球蛋白序列的对应部 分。在一些情况下， 人源化抗体可在人可变区框架域内保持非人残基以增强适当的结合特 征 ( 例如， 当抗体被人源化时可能需要框架中的突变以保留结合亲和力 )。 “人源化抗体” 为 包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如， 人源化抗体不会涵盖如上定义的 典型嵌合抗体， 因为， 例如， 嵌合抗体的整个可变区都是非人的。
     “双特异性抗体” 或 “双功能抗体” 为具有两个不同的重 / 轻链对和两个不同的结合 位点的杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法制备， 包括但不限于杂交瘤的融合或 Fab’ 片段的连接。 参见， 例如， Songsivilai & Lachmann， Clin.Exp.Immunol.79 ： 315-321， 1990 ； Kostelny 等人， J.Immunol.148 ： 1547-1553， 1992。
     “二价抗体” 不同于 “多特异性” 或 “多功能” 抗体， 在某些实施方案中， 为包含两个 具有相同抗原特异性的结合位点的抗体。
     术语 “双抗体” 是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段， 这样的片段在同一多肽 链 (VH-VL) 中包含连接至轻链可变域 (VL) 的重链可变域 (VH)。通过使用太短而不允许在相 同链上的两个域之间配对的接头， 各个域被强迫与另一链的互补域配对， 产生两个抗原结 合位点。双抗体更详细描述于， 例如， EP 404,097 ； WO 93/11161 ； 和 Hollinger 等人， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 6444-6448， 1993。
     术语 “迷你抗体” 在此是指仅编码天然或非天然 ( 例如， 经诱变处理的 ) 存在的 重链可变域或轻链可变域的 2 个互补决定区 (CDR)， 或其组合的多肽。迷你抗体的实例描 述于， 例如， Pessi 等人， Nature 362 ： 367-369， 1993 ； 和 Qiu 等人， Nature Biotechnol.25 ： 921-929， 2007。
     术语 “线性抗体” 是指 Zapata 等人， Protein Eng.8 ： 1057-1062， 1995 描述的抗体。 简言之， 这些抗体包含一对串联 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)， 形成一对抗原结合区。线性抗体可 为双特异性的或单特异性的。
     本文使用的术语 “单克隆抗体” 不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语 “单克 隆抗体” 是指衍生自单一克隆的抗体， 包括任何真核、 原核、 或噬菌体克隆， 而非其制备的方 法。
     本文使用的术语 “亲本抗体” 是指通过用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。 优 选地， 该亲本抗体具有人框架区， 且如果存在的话， 具有人抗体恒定区。 例如， 该亲本抗体可 为人源化的或人抗体。“变体” 抗 VEGF-A 抗体， 在此是指由于在在亲本抗体序列中添加、 缺失和 / 或取代 一个或多个氨基酸残基而与 “亲本” 抗 VEGF-A 抗体氨基酸序列的氨基酸序列不同的分子。 在优选的实施方案中， 该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中包含一个或多个氨基酸取 代。例如， 该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中可包含约 1 至约 10 个， 优选约 2 至约 5 个取代。 通常， 该变体具有这样的氨基酸序列， 其与亲本抗体重链或轻链可变域序列具有至 少 75％的氨基酸序列同一性， 更优选至少 80％， 更优选至少 85％， 更优选至少 90％， 且最优 选至少 95％的氨基酸序列同一性。相对于该序列的同一性或同源性在在此定义为， 在比对 序列并引入缺口 ( 如果必要的话 ) 以达到最大百分比序列同一性后， 候补序列中与亲本抗 体残基相同的氨基酸残基的百分比。N- 端、 C- 端、 或内部延伸、 缺失、 或插入抗体序列中都 不应解释为影响序列同一性或同源性。该变体保持结合人 VEGF-A 的能力， 且优选具有优于 亲本受者或抗体的性质。例如， 该变体可具有更强的结合亲和力、 增强的抑制 VEGF-A- 诱导 的生物活性 ( 例如血管发生或增殖 ) 的能力。为分析这样的性质， 人们应将变体的 Fab 形 式与亲本抗体的 Fab 形式， 或变体的全长形式与亲本抗体的全长形式进行比较， 例如， 因为 已发现在本文公开的生物活性测试中抗 VEGF-A 抗体的形式影响其活性。本文特别感兴趣 的变体抗体为当与亲本抗体相比， 显示约至少 3 倍， 5 倍， 10 倍， 20 倍， 或 50 倍的生物活性增 强的抗体。
     术语 “表位” 包括任何能特异结合至免疫球蛋白或 T- 细胞受体的蛋白质决定簇。 表位决定簇通常由化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链组成， 且通常具有特定的三维结 构特征， 以及特定的电荷特征。更具体地， 本文使用的术语 “VEGF-A 表位” 是指 VEGF-A 多 肽的在动物、 优选哺乳动物、 最优选小鼠或人中具有抗原性或免疫原性活性的部分。 具有免 疫原性活性的表位是 VEGF-A 多肽的可引发动物抗体应答的部分。具有抗原活性的表位是 VEGF-A 多肽中被抗体免疫特异性结合 ( 通过任何本领域众所周知的方法测定的， 例如通过 免疫测试测定的 ) 的部分。抗原性表位不一定是免疫原性的。
     “载体 (vector)” 是这样的核酸分子， 如质粒、 粘粒、 或噬菌体， 其具有在宿主细胞 中自主复制的能力。克隆载体通常包含一个或少数个限制核酸内切酶识别位点 ( 其允许以 可确定的方式插入核酸分子而不丧失载体的必需生物功能 )， 以及编码适用于鉴别和选择 克隆载体转化的细胞的标记基因的核苷酸序列。 标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄 青霉素抗性的基因。
     “表达载体” 是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常， 表达载体包括转 录启动子、 基因和转录终止子。通常将基因表达置于启动子的控制下， 这样的基因被称为 “可操作连接” 于启动子。同样， 如果调节元件调节核心启动子的活性， 则调节元件和核心启 动子是可操作连接的。
     术语 “表达” 是指基因产物的生物合成。例如， 在结构基因的情况下， 表达包括将 结构基因转录为 mRNA 和将 mRNA 翻译为一个或多个多肽。
     关于本文所述的蛋白质， 称 “与 SEQ ID NO 规定的氨基酸残基对应的氨基酸残基” 包括这些残基的翻译后修饰物。
     术语 “新血管形成” 和 “血管发生” 在此可互换使用。新血管形成和血管发生是指 新血管在细胞、 组织或器官中的生成。 血管发生的控制通常在某些疾病状态中改变， 而且在 许多情况下， 与疾病相关的病理损害与血管发生改变的不受调节的相关。 持续性的、 不受调节的血管发生在多种疾病状态 ( 包括那些以内皮细胞的异常生长为特征的疾病 ) 中发生， 且支持在这些症状 ( 包括血管的泄漏和渗透 ) 中观察到的病理损害。
     本文使用的术语 “新生血管疾患” 是指任何具有如下所述的病理的疾病或疾患， 所 述的病理至少部分地由增加的或不受调节的血管发生活性所介导。 这样的疾病或疾患的实 例包括各种癌症， 包括实体瘤 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及某些涉及新血管形成的眼病 (“新生血管性眼病” )。 该疾病或障碍特别适于某些抑制血管发生的治疗方法， 如本文进一步描述的。
     术语 “有效量” ， 在通过向本文所述的受试者给药 FGFR 和 / 或 VEGF-A 拮抗剂治疗 新生血管疾病的背景下， 是指该药物的量， 其足以抑制受试者的血管发生以抑制一种或多 种新生血管疾病的发生或改善所述疾病的症状。有效量的药剂根据本发明方法以 “有效方 案” 给药。术语 “有效方案” 是指足以实现治疗或预防疾病或疾患的给药的量和剂量频率的 组合。
     术语 “患者” 或 “受试者” ， 在治疗本文所述疾病或障碍的背景下， 包括哺乳动物， 例 如， 人和其它灵长类。该术语还包括家养动物， 例如， 牛， 猪， 羊， 马， 狗和猫。
     如果当将两个氨基酸序列以最大对应性比对时， 两个氨基酸序列的氨基酸残基相 同， 则两个氨基酸序列具有 “100％氨基酸序列同一性” 。类似的， 如果当以最大对应性比对 时两个核苷酸序列的核苷酸残基相同， 则两个核苷酸序列具有 “100％核苷酸序列同一性” 。 序列比较可使用标准软件程序 ( 如包括在 LASERGENE 生物信息学计算程序组中的程序， 由 DNASTAR(Madison， Wisconsin) 出品 ) 来进行。 其它用于通过确定最佳比对来比较两种核苷 酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Peruski 和 Peruski， The Internet and the New Biology ： Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press， Inc.1997) ； Wu 等人 (eds.)“ ，Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins， ” Methods in Gene Biotechnology 123-151(CRC Press， Inc.1997) ； Bishop(ed.)， Guide to Human Genome Computing(2nd ed.， Academic Press， Inc.1998))。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对彼此具有至少 80 ％， 至少 90 ％， 或至少 95％序列同一性， 则两个核苷酸或氨基酸序列认为是具有 “基本上类似的序列同一性” 或 “基本上序列同一性” 。
     百分比序列同一性通过常规方法测定。参见， 例如， Altschul 等人， Bull.Math. Bio.48 ： 603， 1986， 和 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1992。 例如， 可比对两个氨基酸序列以优化排列得分， 其使用的缺口形成罚分 (gap opening penalty) 为 10， 缺 口 延 伸 罚 分 (gap extension penalty) 为 1， 和 上 文 的 Henikoff 和 Henikoff 的 “BLOSUM62” 评分矩阵， 如表 1 所示 ( 氨基酸通过标准单字母代码表示 )。然后 百分比同一性如下计算 ： ([ 相同匹配的总数 ]/[ 较长序列的长度加上引入较长序列以比对 该两个序列的缺口数 ])(100)。
     表1： BLOSUM62 评分矩阵
    本领域技术人员理解存在许多已建立的算法以比对两个氨基酸序列。该 Pearson 和 Lipman 的 “FASTA” 相似性搜索算法是用于检测本文公开的氨基酸序列和第二氨基酸 序列所享有的同一性水平的合适的蛋白质比对方法。该 FASTA 算法描述于 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988， 和 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990。简言之， FASTA 首先表征序列相似性， 其方法是鉴别查询序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 2 的残基 25-266) 与测试序列共享的如下所述的区域， 它们或者具有最高的同一性密度 ( 如 果 ktup 变量为 1) 或最高的同一性成对数 ( 如果 ktup ＝ 2))， 不考虑保守氨基酸置换、 插 入、 或缺失。然后对具有最高同一性密度的 10 个区重新评分， 方法是使用氨基酸置换矩阵 比较所有成对的氨基酸的相似性， 再 “修剪” 区的末端以仅包括那些对最高评分有贡献的 残基。如果存在多个分数大于 “截断” 值 ( 基于序列长度和 ktup 值通过预定的公式计算 ) 的区， 则检查被修剪的起始区以确定这些区域能够被连接起来形成近似的带有缺口的比 对。最后， 将两个氨基酸序列的最高的得分区使用修饰的 Needleman-Wunsch-Sellers 算法 对准 (Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 444， 1970 ； Sellers， SIAM J.Appl.Math.26 ： 787， 1974)， 这种算法允许氨基酸插入和缺失。FASTA 分析的例示的参数为 ： ktup ＝ 1， 缺 口形成罚分＝ 10， 缺口延伸罚分＝ 1， 且置换矩阵＝ BLOSUM62。可通过修改评分矩阵文件 (“SMATRIX” ) 将这些参数引入 FASTA 程序， 如 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990 的附 件 2 所述。
     FASTA 也可用于测定核酸分子的序列同一性， 使用以上公开的比例。 对于核苷酸序 列比较， ktup 值范围可为 1 至 6， 优选 3 至 6， 最优选 3， 其它参数如上设定。
     附图简述
     图 1A-1C 描述某些免疫球蛋白 Fc 多肽的氨基酸序列。氨基酸序列数基于 EU 索 引 (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest， US Department of Health and Human Services， NIH， Bethesda， 1991)。阐述的序列包括野生型人序列 (“wt” ； SEQ ID NO ： 75) 和 5 个变体序列， 称为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， Fc4(SEQ ID NO ： 77)， Fc5(SEQ ID NO ： 74)， Fc6(SEQ ID NO ： 78)， 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。通常在与轻链恒 定区 (LC) 和重链恒定区 (HC) 的二硫键键合中涉及的 Cys 残基被标示出来。 “.” 表示与在 该位置的野生型的同一性。*** 表示终止密码子 ； C- 端 Lys 残基已从 Fc6 去除。示出了铰 链、 CH2 和 CH3 域的边界。
     图 2 描述了四价、 双特异性抗体 / 可溶受体组合， 其对两个不同的靶 ( 在此称为 αVEGF-A 和 FGFR 的配体结合域 ) 具有特异性。
     图 3 描 述 显 示 对 FGF-9- 刺 激 的 成 骨 细 胞 增 殖 的 可 变 抑 制 的 FGFR-Fc(R&D Systems)。
     图 4A 描 述 FGFR-Fc 构 建 体 (ZymoGenetics) 抑 制 FGF-9- 刺 激 的 增 殖。 全 长 FGFR3-Fc 野生型和突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50 ； 图 4B 描述截短的 FGFR3-Fc 突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     图 5A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-8b 的直接结合， 图 5B 描述 FGFR-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-8b 的直接结合。
     图 6A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-17 的直接结合， 图 6B 描述 FGFR2-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 7 描述 FGFR3-Fc 构建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 8A 描述 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细胞的生长， 图 8B 描述 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞 的生长。
     图 9 描述 FGF 受体家族的第二和第三 Ig 样域。
     发明描述
     I. 概述
     本发明通过提供新蛋白质， 即多特异性结合蛋白， 特别是双特异性结合蛋白， 解决 了本领域对于提供更多治疗剂以治疗癌症， 特别是实体瘤的需求。所述蛋白质包含与抗体 部分融合的可溶受体部分。如本文所述， 术语 “双特异性结合蛋白” 是指能通过至少两种具 有不同结合特异性的结合部分特异结合至少两种不同的靶分子的蛋白质。 该结合部分可以 是例如蛋白质 ( 例如， 抗体或可溶受体 ) 或小分子。 双特异性结合蛋白的结合部分可以是物 理连接的。如本文所述的本发明提供包含可溶受体部分和抗体部分的双特异性结合蛋白。
     在本发明中， 可溶的受体部分包含可溶的 FGF 受体或其部分， 而抗体部分包含 VEGF-A 抗体或其部分， 如本文所述。在某些实施方案中， 双特异性结合蛋白的两个或多个 不同的部分通过接头连接以形成多聚物 ( 例如， 二聚物 )。例如， 在包含至少两个多肽部分 ( 例如， 可溶 FGF 受体和 VEGF-A 抗体 ) 的融合的双特异性结合蛋白的情况下， 可利用肽接头 序列来分隔， 例如， 多肽组分， 将它们分隔成足以保证各多肽折叠为其二级和三级结构的距 离。
     在某些实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白减少 FGF 和 VEGF-A 两者的生物活 性。具体地， 本发明提供 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂， 特别是中和性抗 VEGF-A 抗体与 FGF 可溶受体的组合， 其减少通过 VEGF-A 受体和 FGF 受体的信号传递。使用这样的拮抗剂减少经由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可用于治疗多种具有至少部分以新血管形成为特征的病 理的疾病。例如， 在肿瘤中和肿瘤周围抑制藉由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可减少 肿瘤形成血管、 生长和转移的能力。
     FGF 受体的活化可活化多种信号转导途径， 包括磷脂酶 C、 磷脂酰肌醇 3- 激酶、 促分裂原活化的蛋白质激酶、 以及转录的信号转导物和活化剂 (STAT) 途径， 这些途径都 在前列腺癌进展中起作用。FGF 信号传导增加的净结果包括增强的增殖、 对细胞死亡的抗 性、 增加的活动力和侵袭力、 增加的血管发生、 增强的转移、 对化疗和放射的抗性和雄激素 非依赖性等， 这些都可增强肿瘤进展和临床侵占性。FGF 受体和 / 或 FGF 信号传导可直 接影响肿瘤细胞， 也可影响肿瘤血管发生 (Kwabi-Addo 等人， Endocrine-Related Cancer 11(4)709-724， 2004)。
     本发明提供减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂。该 FGF- 结合部分为可溶 FGF 受体 (FGFR) 且 VEGF-A- 结合部分为 VEGF-A 抗体。根据本发明， 该 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂为特异结合且减少 VEGF-A 和 FGF 活性的双特异性抗体 / 可溶受体 结合蛋白。本发明的双特异性结合蛋白在此详细描述。
     II.FGF 受体， 抗 VEGF-A 抗体， 和相关双特异性结合组合物
     A.FGF 受体
     该分子的 FGFR 部分为可溶受体。该 FGFR 包含三个 Ig 样域， 称为 D1， D2 和 D3。该 受体可包含 FGF 受体的 D1， D2， D3， 或可包含 D2， D3 而没有 D1。而且， 该受体可为天然受体 或在 D2-D3 区具有突变。该 FGFR 家族和域 D2 和 D3 示于图 1。
     已证实 D1 的截短可增加受体的亲和力和增强受体 / 配体相互作用 (Olsen 等人 PNAS 101 ： 935-940， 2004)。已知 FGFR1-3 由于在 D3 的羧基端的可变剪接而具有多个同种 型。从该知识出发， 本发明者制成了多种具有三个或两个 Ig 样域的变体可溶 FGF 受体， 且 表征了它们对 FGF 配体的结合亲和力。该 FGFR3 和 FGFR2 同种型 IIIc 是特别令人感兴趣 的， 因为它们比相应的 IIb 同种型对 FGF 2， 6， 8b， 9 和 17 具有更高的亲和力。
     FGF 受体可以基于它们对 FGF 配体的结合亲和力来定性。对给定的相互作用， 测 -1 -1 -1 量结合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s ))。结合速率常数是反映配体 - 受体 复合物形成速率的值。解离速率常数是反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常 表示为平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是将解离速率常数除以结合速 率常数 (kd/ka) 而获得， 而 KA 是将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 而获得。具有类似 KD( 或类似 KA) 的分子可具有在广范围内可变的结合和解离速率常数。当在标准体外测试 如 BIACORE 结合分析中测量时， 对本发明双特异性结合蛋白的结合亲和力将在 100nM 或更 少， 优选 10nM 或更少， 且更优选 1nM 或更少的范围。
     在某些实施方案中， FGFR 为 FGFR3IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 2 的第 262 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 9 的第 142 号氨基酸从 S 突变为 W。其它具 体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 15 的第 263 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 22 的第 143 号氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR3IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 10， 19 和 22 所示。
     在其它某些实施方案中， FGFR 为 FGFR2IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 29 的氨基酸数 X 或 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸数 Xa 从 S 突变为 W。其它具体 实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 33 的第 Y 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 42 的第 Ya 号 氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR2IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 37 和 42 所示。
     B.VEGF-A 抗体
     用于本发明的 VEGF-A 拮抗剂包括这样的分子， 它们结合至 VEGF-A 或 VEGF-A 受 体， 从而诱导 VEGF-A 对表达该受体， 例如， VEGFR-1， VEGFR-2， 神经纤毛蛋白 -1， 和 / 或神 经纤毛蛋白 -2 的细胞的活性。特别是， VEGF-A 拮抗剂包括抗 VEGF-A 抗体。其它合适的 VEGF-A 拮抗剂包括包含 VEGFR 细胞外域的可溶 VEGF-A 受体， 以及能抑制 VEGF-A 与其受体 的相互作用或能以其他方式抑制 VEGF-A 诱导的通过 VEGF-A 受体的细胞内信号传导的小分 子拮抗剂。此外， 可使用基于非抗体支架的结合蛋白质。( 参见， 例如， Koide 等人， J.Mol. Biol.284 ： 1141-1151， 1998 ； Hosse 等人蛋白质 Sci.15 ： 14-27， 2006， 以及其中的文献 )。 本 发明使用的优选的 VEGF-A 拮抗剂包括特异结合至 VEGF-A 的抗体， 包括也包含对 FGF 的结 合位点的双特异性抗体。对 VEGF-A 特异的抗体至少结合 VEGF-A 的可溶分泌形式， 且优选 还结合关联于细胞表面的形式。
     抗体在以下情况下被认为是特异结合的， 如果 (1) 它们显示结合活性的阈水平， 和 (2) 它们不显著与对照多肽分子交叉反应。例如， 如果抗 VEGF-A 抗体结合至 VEGF-A 多 肽、 肽或表位的亲和力为与对照 ( 非 VEGF-A) 多肽的结合亲和力的至少 10 倍， 则确定结合 6 -1 阈水平。 优选的是， 本发明中使用的抗体具有的结合亲和力 (Ka) 为 10 M 或更大， 优选 107M-1 或更大， 更优选 108M-1 或更大， 最优选 109M-1 或更大。抗体的结合亲和力可由本领域技术人 员容易地确定， 通常使用自动设备通过表面等离子共振测定。 其它方法是本领域已知的， 例 如 Scatchard 分析 (Scatchard， Ann.NY Acad.Sci.51 ： 660-672， 1949)。
     本发明的抗体包含保持抗原 - 结合特异性的完整抗体的部分或由其组成。合适的 抗体包括， 例如， 完全的人抗体 ； 人源化抗体 ； 嵌合抗体 ； 抗体片段例如 Fab， Fab’ ， F(ab)2， F(ab’ )2 和 Fv 抗体片段 ； 单链抗体 ； 和抗体重链或轻链的单体或二聚物或其混合物。本发 明的优选抗体为单克隆抗体。包含轻链的抗体可包含 κ 或 λ 轻链。
     在某些实施方案中， 本发明的抗体包括任何同种型的完整免疫球蛋白， 包括 IgA， IgG， IgE， IgD， 或 IgM( 包括其亚型 )。根据本发明的完整免疫球蛋白优选包括完整 IgG( 例 如， 完整 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 或 IgA2)。
     制备和分离多克隆抗体、 单克隆抗体和其抗原 - 结合抗体片段的方法是本领域已 知的。参见， 例如， Current Protocols in Immunology， (Cooligan 等人 eds.， John Wiley and Sons， Inc.2006) ； Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor， NY， 2nd ed.1989) ； 和 Monoclonal Hybridoma Antibodies ： Techn iques and Applications(Hurrell ed.， CRC Press， Inc.， Boca Raton， FL， 1982)。抗原结合片 段， 包括 scFv， 可根据本领域已知方法使用噬菌体展示文库制备。噬菌体展示也可用于基 于非抗体支架制备结合蛋白质 (Koide 等人， 上文 .)。制备重组人多克隆抗体的方法公开 于 Wiberg 等 人， Biotechnol Bioeng.94 ： 396-405， 2006 ； Meijer 等 人， J.Mol.Biol.358 ： 764-772， 2006 ； Haurum 等人， 美国专利申请公开 No.2002/0009453 ； 和 Haurum 等人， 美国专 利申请公开 No.2005/0180967。对本领域技术人员显而易见的是， 用于本发明的多克隆抗体可通过用免疫源性多 肽或多肽片段接种多种温血动物如马， 牛， 山羊， 绵羊， 狗， 鸡， 兔， 小鼠， 和大鼠的任一种而 产生。免疫原性多肽的免疫原性可通过使用佐剂， 如明矾 ( 氢氧化铝 ) 或弗氏完全或不完 全佐剂来增加。用于免疫的多肽还包括融合多肽， 如 VEGF-A 或其部分与免疫球蛋白多肽或 与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可为全长分子或其部分。如果多肽部分为半抗原 状， 其可有利地结合或连接至大分子载体 ( 如钥孔虫戚血兰素 (KLH)， 牛血清白蛋白 (BSA) 或破伤风类毒素 ) 以用于免疫。
     此外， 抗体可相对于与抗体靶 ( 例如， 直向同源物， 横向同源物 (paralogs))， 或其 序列变体相关的已知多肽进行筛选， 例如， 以分离对于结合靶蛋白或多肽而言高度特异的 抗体群体。这样的高特异性群体包括， 例如， 结合至人 VEGF-A 但不结合至小鼠 VEGF-A 的抗 体。 这种与相关多肽分子的交叉反应性的缺失通过， 例如， 使用标准蛋白质印迹分析通过检 测 VEGF-A 多肽而不检测已知的相关多肽的抗体显示 (Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人 eds.， Green and Wiley and Sons， NY 1993)) 或 ELISA( 酶免疫 测定 )(Immunoassay， A Practical Guide(Chan ed.， Academic Press， Inc.1987))。在 另一实例中， 针对 VEGF-A 多肽产生的抗体吸附到粘附在不可溶基质上的相关多肽上， 对 VEGF-A 多肽高度特异的抗体将在适当的缓冲条件下流过基质。筛选使得分离与已知的密 切相关的多肽无交叉反应性的多克隆和单克隆抗体成为可能 (Antibody ： A Laboratory Manual(Harlow and Lane eds.， Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988) ； Current Protocols in Immunology(Cooligan 等人 eds.， National Institutes of Health， John Wiley and Sons， Inc.1995)。特异抗体的筛选和分离是本领域已知的。参见 Fundamental Immunology(Paul ed.， Raven Press 1993) ； Getzoff 等 人， Adv.in Immunol.43 ： 1-98， 1988 ； Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice(Goding ed.， Academic Press Ltd.1996) ； Benjamin 等人， Ann.Rev.Immunol.2 ： 67-101， 1984。
     天然单克隆抗体 (“mAbs” ) 可通过， 例如， 用纯化的免疫原性蛋白或其片段免疫 受试者动物 ( 例如， 大鼠或小鼠 ) 而制备。在典型的程序中， 首先分别对动物给予腹腔内 (IP) 注射纯化的蛋白质或其片段， 通常与佐剂 ( 例如， 完全弗氏佐剂或 RIBI 佐剂 ( 获自 Sigma-Aldrich， St.Louis， MO)) 组合， 然后以例如两周的间隔加强 IP 注射纯化蛋白质。给 予第三加强注射后 7-10 天， 对动物放血并收集血清。视需要可以给予更多次的加强接种。 使用常规方法从高效价动物收集脾细胞和淋巴节细胞， 并使其融合至骨髓瘤细胞 ( 例如， 小鼠 SP2/0 或 Ag8 细胞 )。然后将该融合混合物在胸腺细胞的滋养层上培养或用合适的 培养基补充物培养 ( 包括可商购的补充物如杂交瘤融合和克隆补剂 ； Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)。融合后约 10 天， 使用标准测试 ( 例如 ELISA) 鉴别特异的产生抗体的 杂交瘤群。对于阳性池可进一步分析其阻断或减少靶蛋白的活性的能力。通过限制稀释克 隆阳性池。
     在某些方面， 本发明还包括多种单克隆抗体的用途， 所述多种单克隆抗体对单一 靶分子上对不同表位特异。组合使用这样的多种抗体可减少单一抗体所见的载体效应 (carrier effect)， 且还可通过 Fc 受体增加清除率和改善 ADCC。可组合使用两种、 三种或 多种单克隆抗体。
     天然抗体的氨基酸序列可通过使用重组 DNA 技术改变。因此， 抗体可进行重新设计以得到所需特征。相对其非修饰的形式， 修饰的抗体可提供例如改善的稳定性和 / 或治 疗功效。可能的变化有很多， 范围可以从改变仅一个或一些氨基酸到对例如可变区或恒定 区的完全重新设计。 制造恒定区的变化的目的通常是改善或改变特征， 如补体结合、 与膜的 相互作用和其它效应物作用。 通常， 制造可变区的变化以改善抗原结合特征， 改善可变区稳 定性， 或减少免疫原性的风险。噬菌体展示技术也可使用。参见， 例如， Huse 等人， Science 246 ： 1275-1281， 1989 ； Ladner 等人， 美国专利号 5,571,698。
     对 于 用 于 人 体 的 治 疗 用 抗 体， 通常需要根据已知方法将抗体的非人区人源 化。制备人源化抗体的方法公开于， 例如， 美国专利 5,530,101 ； 5,821,337 ； 5,585,089 ； 5,693,762 ； 和 6,180,370。通常， 人源化抗 VEGF-A 抗体包含小鼠供免者疫球蛋白的互补决 定区 (CDR) 和人受者免疫球蛋白的重链和轻链框架。 通常， 人框架区中的框架残基将被 CDR 供者抗体的相应残基取代， 以改变 ( 优选改善 ) 抗原结合。通过本领域众所周知的方法辨 别这些框架取代， 例如， 通过模仿 CDR 和框架残基的相互作用以鉴别对抗原结合重要的框 架残基和序列比较以鉴别在特定位置的一般的框架残基。( 参见， 例如， Queen 等人， 美国专 利号 5,585,089 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323， 1988)。
     非人源化嵌合抗体也可治疗性地使用 ( 例如， 在免疫抑制患者中 )。因此， 在一 些变化中， 根据本发明的抗体是从例如非人抗 VEGF-A 抗体衍生的嵌合抗体。优选地， 嵌合 抗体包含衍生自小鼠或大鼠抗体的可变区和衍生自人的恒定区， 以使该嵌合抗体当给予人 受试者时具有较长的半衰期和较低的免疫原性。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。 ( 参见例如， Morrison， Science 229 ： 1202， 1985 ； Oi 等人， BioTechniques 4 ： 214， 1986 ； Gillies 等人， J.Immunol.Methods 125 ： 191-202， 1989 ； 美国专利 5,807,715 ； 4,816,567 ； 和 4,816,397)。
     本发明还包括完全的人抗体， 如衍生自卵巢， 乳腺， 肾， 结肠直肠， 肺， 子宫内膜， 或 脑癌患者的外周血单核细胞的。该细胞可与骨髓瘤细胞融合， 例如， 以形成产生抗 VEGF-A 的完全的人抗体的杂交瘤细胞。人抗体也可以在转基因非人动物 ( 通常为小鼠 ) 中制备。 参见， 例如， Tomizuka 等人， 美国专利 No.7,041,870。通常， 非人哺乳动物就人重链基因座 和人轻链基因座而言是转基因的， 且相应的内源性免疫球蛋白基因座被失活。
     本发明的抗体可用它们所识别或特异结合的 VEGF-A 多肽的表位或部分来特指。 表位或多肽部分可例如， 用 SEQ ID NO ： 72 所示的 VEGF-A 多肽的表位或其它部分的 N- 端和 C- 端位置来特指。
     本发明的抗体具有这样的结合亲和力， 其包括的小于 5x 10-2M， 小于 10-2M， 小于 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x -10 -10 -11 -11 -12 -12 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10-13M， 小 -13 -14 -14 -15 -15 于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 或小于 10 M 解离常数 (Kd)。
     本发明的抗体进一步包括修饰的衍生物， 修饰的方式例如， 通过对抗体的任何类 型的分子共价连接， 以使共价连接不阻止抗体结合至其表位。合适的修饰包括， 例如， 岩藻 糖基化， 糖基化， 乙酰化， 聚乙二醇化， 磷酸化和酰胺化。 该抗体及其衍生物本身可通过已知 的保护基 / 封闭基、 蛋白酶剪切、 与细胞配体或其它蛋白质的连接等而衍生化。在本发明一 些实施方案中， 抗体的至少一个重链被岩藻糖基化。 在具体的变化形式中， 该岩藻糖基化是N- 连接的。在某些优选的实施方案中， 抗体的至少一个重链包含岩藻糖基化、 N- 连接的寡 糖。
     本发明的抗体可单独使用或作为与细胞毒素剂的免疫缀合物使用。在一些实施 方案中， 该试剂为化学治疗剂。在其它实施方案中， 该试剂为放射性同位素， 例如， 铅 -212， 铋 -212， 砹 -211， 碘 -131， 钪 -47， 铼 -186， 铼 -188， 钇 -90， 碘 -123， 碘 -125， 溴 -77， 铟 -111， 或可裂变核素如硼 -10 或锕系元素。在其它实施方案中， 该试剂为毒素或细胞毒素药物， 例 如蓖麻毒蛋白、 修饰的假单胞菌肠毒素 A、 加利车霉素 (calicheamicin)、 阿霉素、 5- 氟尿嘧 啶、 auristatin( 例如， auristatin E)、 美登木素 (maytansin)、 等。抗体和抗体片段与该试 剂的缀合方法是本领域已知的。
     本发明的抗体包括相对参照抗体 ( 例如， 具有表 2 或表 3 所示 VL 和 / 或 VH 序列 的参照抗体 ) 具有单个或多个氨基酸取代， 缺失， 添加， 或置换的变体， 以使该变体保持参 照抗体的一种或多种生物特性 ( 例如， 阻断 VEGF-A 与其各自的对应结构 (VEGF-A 受体 ) 的 结合， 阻断 VEGF-A 的生物活性， 结合亲和力 )。 本领域技术人员可制备具有单一或多重氨基 酸取代、 缺失、 加成或置换的变体。这些变体可包括， 例如 ： (a) 其中一个或多个氨基酸残基 被保守或非保守氨基酸置换的变体， (b) 其中一个或多个氨基酸被添加至多肽或从多肽被 删除的变体， (c) 其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体， 和 (d) 其中多肽与可赋予多肽 有用的特性的另一肽或多肽融合的变体， 所说的另一肽或多肽如融合配偶体、 蛋白标记物 或其它化学部分， 例如抗体的表位、 多组氨酸序列、 生物素部分等。本发明的抗体可包括以 下变体， 其中一个物种的氨基酸残基代替另一物种中的对应残基， 代替可发生在保守的或 非保守的位置。在另一实施方案中， 非保守的位置的氨基酸残基被保守的或非保守的残基 代替。 获得这些变体的技术， 包括遗传的 ( 抑制、 缺失、 突变等 )、 化学的和酶学的技术， 是本 领域技术人员已知的。
     结合至 VEGF-A 的示例性抗体已通过筛选噬菌体展示文库得以鉴定。通过噬菌 体展示的筛选方法详细描述于标准参考文章， 如 Babas， Phage Display ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab Press ， 2001) 和 Lo ， Benny K.C. ， A. ， Antibody Engineering(2004)。该噬菌体展示文库可用于将表达的蛋白质展示在细胞或其它物质的 表面， 以使互补的结合实体可以被功能性分离 (functionally isolated)。在一种这样的 噬菌体展示文库中， 将抗体轻链可变区和部分重链可变区与编码人抗体序列的合成 DNA 组 合， 然后它们在噬菌体和噬菌粒文库上作为 Fab 抗体片段被展示 (Dyax Human Antibody Libraries， Dyax Corp.， Cambridge， MA.)。因此， 抗体的可变轻链和重链片段可以以 Fab 形式被分离。然后可处理这些可变区以产生抗体， 包括抗原 - 结合片段， 如 scFv， 双特异性 scFv， 以及针对 VEGF-A 的多特异性、 多功能拮抗剂。
     使用该技术， 示例性 Fabs 的可变区已在本文所述得测试中因其结合和 / 或中和 VEGF-A 的特征而被鉴定出来。( 参见下文实施例 )。处理这些可变区以产生多种结合实体， 包括结合和 / 或中和 VEGF-A 的 scFv。下表 2 显示因其结合和中和 VEGF-A 的能力而被鉴定 出的抗 VEGF-A 抗体簇的核苷酸和氨基酸 SEQ ID NO. 标号， 而表 3 列出了对应于表 2 所列 的抗 VEGF-A 抗体的框架和 CDR 区的氨基酸残基位置。
    在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF-A 抗体包含表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的一 个或多个 CDR( 相应 CDR 区的边界分别示于表 3)。 例如， 在某些变化中， 该抗体包含表 2 所列
     的抗体的重链 CDR(HCDR1， HCDR2 和 HCDR3 区中的至少一个 ) 和 / 或相应的轻链 CDR(LCDR1， LCDR2， 和 LCDR3 区中的至少一个 )。在典型实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有表 2 所列的 抗体的两个或三个重链 CDR 和 / 或两个或三个轻链 CDR。在一些变化中， 其中抗 VEGF-A 抗 体具有表 2 所列的抗体的至少一个重链 CDR， 该抗体进一步包含至少一个相应的轻链 CDR。
     在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A 抗体包括重和 / 或轻链可变域， 该重链或轻链可 变域具有 (a) 对应于表 2 所列的抗体所示的重链或轻链 CDR 的一组三个 CDR， 和 (b) 一组四 个框架区。例如， 抗 VEGF-A 抗体可包含重和 / 或轻链可变域， 其中该重链或轻链可变域具 有 (a) 一组三个 CDR， 其中该组 CDR 源自表 2 所列的抗体， 和 (b) 一组四个框架区， 其中该组 框架区与表 2 所列的相同抗体的那组框架区相同或不同。
     在具体实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体包含与表 2 所列的抗体的重和 / 或轻链可变区 基本上相同的重链可变区和 / 或轻链可变区。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， LCDR1 具有 SEQ ID NO ： 66 的 残基 24-34 所示的氨基酸序列 ； LCDR2 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 50-56 所示的氨基酸序 列； LCDR3 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 89-97 所示的氨基酸序列 ； HCDR1 具有抗体 c1039 的 HCDR1 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 31-35) ； HCDR2 具有抗体 c1039 的 HCDR2 氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自 SEQ ID NOs ： 68 的氨基酸序列。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， LCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 23-35) ； LCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR2 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 51-57) ； LCDR3 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR3 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 90-100) ； HCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 31-35) ； HCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR2 氨基酸序 列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 99-102 的氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870， c1039 和 c1094 的抗体的 CDR LCDR1， LCDR2， LCDR3， HCDR1， HCDR2 和 HCDR3。例如， 在 具体实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的抗体的轻链和重链可 变域 (VL 和 VH)。
     在其它实施方案中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体包括含 CDR LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 的 VL 域和含 CDR HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 的 VH 域， 其中该组 VL 和 VH CDR 相对第二组 CDR 具有 3 个或更少个氨基酸取代， 其中所述第二组 CDR 具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的 抗体的 LCDR1、 LCDR2、 LCDR3、 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该 抗体在所述组的 CDR 中包含 0、 1 或 2 个氨基酸取代。
     本发明的抗 VEGF-A 抗体识别的表位通常包含人 VEGF-A165 的 5 个或更多个氨基酸 (SEQ ID NO ： 72 的残基 27-191)。优选的表位包含至少一个包含在一个或多个以下 VEGF-A 的多肽区内的氨基酸 ： HEVVKFMDVYQRSYCHPIETL(SEQ ID NO ： 72 的 氨 基 酸 残 基 38-58)， EYIFKPSCVPLMRCG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84)， EESNITMQIMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 98-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。 在某些实施方案中， 该 表位包含至少 2 个、 至少 3 个、 至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 或至少 7 个源自 SEQ ID NO ： 72 的残基 38-58、 70-84、 98-114、 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的氨基酸。 在一些变化形式中， 该 VEGF-A 表位是通过使用重叠 VEGF-A 肽 )( 例如 13- 聚肽， 其中在每对 依次的肽之间有例如 2 个氨基酸移位 ) 的肽微阵列表位作图而确定的表位。
     在上述抗 VEGF-A 抗体的具体变化形式中， 该抗 VEGF-A 表位包含包括在一个或多 个以下的 VEGF-A 多肽区内的至少一个氨基酸 ： KFMDVYQRSYC(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 42-52)， IFKPSCVPLMR(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 72-82)， IMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的 氨基酸残基 106-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。在某些实施方案中， 该表 位包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 42-52， 72-82， 106-114， 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的至少两个， 至少 3 个， 至少 4 个， 至少 5 个， 至少 6 个， 或至少 7 个氨基酸。
     在一些相关的变化形式中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体结合至如下所述的表位， 该表位包含 (a) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 38-58 或 42-52 所示的第一 VEGF-A 多肽区 内包含的一个或多个氨基酸， 和 (b) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84 或 72-82 所示的 第二 VEGF-A 多肽区内包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的某些实施方案中， 该表位 不包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 90 至 132 所示的 VEGF-A 的多肽区内包含的氨基酸 (EGLECVP TEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRP)。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， 该表位 进一步包含 (c) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 96-114 或 106-114 所示的第三 VEGF-A 多肽区内 包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a)、 (b) 和 (c) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， 该 抗体不以彼此的 10 倍以内的 Kd 值结合人和小鼠 VEGF-A。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它变化形式中， 该表位 进一步包含 (d) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 142-154 所示的第四 VEGF-A 多肽区内包含的一个 或多个氨基酸。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 抗 VEGF-A 抗 体 为 抗 体 片 段， 例 如 Fv、 Fab、 Fab’ 、 F(ab)2、 F(ab’ )2、 scFv、 或双特异性抗体。在一些优选的实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体为 scFv。结合 VEGF-A 的 scFv 实体可具有这样的取向， 其中轻链可变 (VL) 区位于重链可变 (VH) 区的氨基 端或者羧基端。在一些变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 X 所列的抗 VEGF-A 抗体的 CDR。 在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的 VL 和 VH 域。 在某些 实施方案中， 抗 VEGF-A scFv 的 CDR 或 VL 和 VH 域为选自 c870 c1039 和 c1094 的抗 VEGF-A 抗体的 CDR 或 VL 和 VH 域。在抗 VEGF-A scFv 的具体变化形式中， 该 scFv 包含如 SEQ ID NO ： 70(c1039scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 69 所示 ) ； SEQ ID NO ： 44(c870.1e6scFv ； 核 苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) ； 或 SEQ ID NO ： 46(c1094.1scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) 所述的氨基酸序列。此外， scFvs 可以多种双特异性抗体形式的任一种提供， 例如， 串联 scFv(tascFv)、 双 - 单链 Fv(biscFv)、 和具有融合至羧基端的单链 Fv(scFv) 的 完整单克隆抗体 (biAb)( 参见上文 )。
     C. 使用 Fc 蛋白质缀合的双特异性抗体 / 可溶受体组合
     双特异性结合蛋白通过免疫球蛋白重链的 Fc 区结合本发明的结合蛋白， 如图 2 所 例示的。该 Fc- 融合蛋白包含 IgG 分子的 Fc 区。在另一实施方案中， 该 Fc 区来自人 IgG1 分子。在一些实施方案中， 该免疫球蛋白融合物包括 IgG1 分子的铰链、 CH2 和 CH3 区， 或铰链、 CH1、 CH2 和 CH3 区。
     免 疫 球 蛋 白 融 合 物 的 制 备 也 参 见 美 国 专 利 No.5,428,130， 美国专利 No.5,843,725， 美国专利号 6,018,026， 和 Chamow 等人， TIBTECH， 14 ： 52-60(1996)。
     最简单和最直接的 Fc- 融合蛋白设计通常藉由免疫球蛋白重链的 Fc 区联合本发 明的拮抗剂多肽的结合域。在本发明的 Fc- 融合蛋白中， 编码结合组分的核酸融合至编码 免疫球蛋白恒定域序列的 N- 端的核酸的 C 端， 但是 N- 端融合物也是可能的。
     典型地， 这样的融合物中， 编码的嵌合多肽将至少保持免疫球蛋白重链的恒定区 的功能活性铰链、 CH2 和 CH3 域。还在恒定域的 Fc 部分的 C- 端， 或直接在重链的 CH1 或轻 链的对应区域的 N 端进行融合。 进行融合的精确位点不是关键的 ； 具体位点是公知的， 且可 加以选择以优化 Fc- 融合蛋白的生物活性、 分泌或结合特征。
     在一个优选的实施方案中， 该结合域序列融合至免疫球蛋白 G1(IgG1) 的 Fc 区的 N- 端。可以融合整个重链恒定区与结合域序列。然而， 更优选地， 融合中使用这样的序列， 其起始于化学限定 IgG Fc 的木瓜蛋白酶切割位点 ( 即残基 216， 将重链恒定区的第一残基 作为 114) 或其它免疫球蛋白中的类似位点紧邻上游的铰链区。在特别优选的实施方案中， 该结合域氨基酸序列融合至 (a) 铰链区和 CH2 和 CH3 或 (b)IgG 重链的 CH1、 铰链、 CH2 和 CH3 域。
     对于双特异性 Fc- 融合蛋白， Fc- 融合蛋白被组装为多聚体， 特别是异源二聚体或 异源四聚体。通常， 这些组装的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。一种基本的四链结构 单位是存在于 IgG、 IgD 和 IgE 中的形式。四链单位在高分子量免疫球蛋白中重复 ； IgM 通 常以通过二硫键保持在一起的四个基本单位的五聚体存在。IgA 球蛋白， 偶尔还有 IgG 球 蛋白， 也可在血清中以多聚体形式存在。 在多聚体的情况下， 四个单位的每一个可相同或不 同。
     或者， 可将 Fc 序列插入免疫球蛋白的重链和轻链序列之间， 而得到包含嵌合重链 的免疫球蛋白。在该实施方案中， 在免疫球蛋白的每条臂中 Fc 序列融合至免疫球蛋白重 链的 3 ′端， 或是在铰链和 CH2 域之间， 或是在 CH2 和 CH3 域之间。类似构建体已报道于 Hoogenboom 等人， Mol.Immunol.， 28 ： 1027-1037(1991)。
     尽管在本发明的 Fc- 融合蛋白中不需要免疫球蛋白轻链的存在， 但免疫球蛋白轻 链可共价连接于结合域 - 免疫球蛋白重链融合多肽， 或直接融合于结合域。在前者的情况 下， 通常将编码免疫球蛋白轻链的 DNA 与编码结合域免疫球蛋白重链融合蛋白的 DNA 共表 达。 当分泌时， 杂合的重链和轻链将被共价连接， 而提供一种包含两个由二硫键连接的免疫 球蛋白重链 - 轻链对的免疫球蛋白状结构。适合制备该结构的方法例如公开于美国专利 No.4,816,567。
     Fc- 融合蛋白最方便地通过将编码结合域部分的 cDNA 序列合框地融合于免疫球 蛋白 cDNA 序列而构建。 然而， 也可使用与基因组免疫球蛋白片段的融合 ( 参见， 例如 Aruffo 等人， Cell， 61 ： 1303-1313(1990) ； 和 Stamenkovic 等人， Cell， 66 ： 1133-1144(1991))。后 一类型的融合需要存在 Ig 调节序列以用于表达。基于自脾或外周血淋巴细胞衍生的 cDNA 库中公开的序列， 可以通过杂交或聚合酶链反应 (PCR) 技术来分离编码 IgG 重链恒定区的 cDNA。将编码 Fc- 融合蛋白的结合域和免疫球蛋白部分的 cDNA 串联地插入指导在所选的 宿主细胞中的高效表达的质粒载体中。已进行了特殊的修饰以制备用于产生本发明使用的 Fc 融合分子的 Fc 序列。具体 地， 产生 6 个版本的修饰的人 IgG1 Fc 用于生成 Fc 融合蛋白且命名为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， 以及 Fc4(SEQ ID NO ： 77)、 Fc5(SEQ ID NO ： 74)、 Fc6(SEQ ID NO ： 78)、 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。Fc4， Fc5 和 Fc6 包含突变以通过减少 FcγRI 结合和补体 C1q 结合而减少 Fc 介导 的效应物作用。Fc4 包含引入 Fc-488 的相同氨基酸置换。还引入了另外的氨基酸置换以减 少潜在的 Fc 介导的效应物作用。具体地说， 引入三个氨基酸置换以减少 FcγRI 结合。它 们是在 EU 索引位置 234、 235 和 237 的置换。已显示这些位置上的置换可减少与 FcγRI 的 结合 (Duncan 等人， Nature 332 ： 563(1988))。这些氨基酸置换还可减少 FcγRIIa 结合， 以 及 FcγRIII 结合 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000) ； Wines 等人， J.Immunol.164 ： 5313(2000))。
     数 个 研 究 组 描 述 了 EU 索 引 位 置 330 和 331 在 补 体 C1q 结 合 和 后 续 补 体 固 定 (complement fixation) 中的重要性 (Canfield 和 Morrison， J.Exp.Med.173 ： 1483(1991) ； Tao 等人， J.Exp.Med.178 ： 661(1993))。在 Fc4 的这些位置上引入氨基酸置换， 以减少补体 固定。Fc4 的 CH3 域与对应野生型多肽中的 CH3 域相同， 只是终止密码子从 TGA 变为 TAA， 以 便消除克隆的 DNA 在 dam+ 大肠杆菌菌株中生长时潜在的 dam 甲基化位点。 在 Fc5 中， 在 EU 索引位置 218 的精氨酸残基突变回至赖氨酸， 因为在包含该特定 Fc 的融合蛋白中没有使用 BglII 克隆方案。 Fc5 序列的其余部分与上文对 Fc4 的描述相符。
     Fc6 与 Fc5 相同， 只是羧基末端赖氨酸密码子已被消除。成熟免疫球蛋白的 C- 端 赖氨酸经常在翻译后从 B- 细胞分泌之前从成熟免疫球蛋白被去除， 或在血清循环过程中 被去除。因此， 在循环抗体上通常找不到 C- 端赖氨酸残基。像上述 Fc4 和 Fc5 一样， Fc6 序 列中的终止密码子变为 TAA。
     Fc7 与野生型 γ1 Fc 相同， 除了位于 CH2 域中的 EU 索引位置 297 处的氨基酸置换 之外。EU 索引位置 Asn-297 是一个 N- 连接型碳水化合物搭接的位点。由于碳水化合物结 构中可能的批次间差异， N- 连接的碳水化合物向重组表达的蛋白质中导入了潜在的变异性 来源。在一个消除这种潜在的变异性的尝试中， 将 Asn-297 突变为谷氨酰胺残基以防止在 该残基位置上的 N- 连接型碳水化合物的搭接。Fc 对于 FcRIII 的结合也涉及残基 297 处的 碳水化合物 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000))。因此， 去除碳水化合物应该会一 般性地减少包含重组 Fc7 的融合蛋白与 FcγR 的结合。与上面一样， Fc7 序列中的终止密 码子突变为 TAA。
     本发明也考虑这些分子的亮氨酸拉链形式。″亮氨酸拉链″是本领域的术语， 用来表示一种富含亮氨酸的序列， 其增强、 促进、 或驱动其融合配偶体 ( 例如， 亮氨酸拉链 与之融合或连接的序列或分子 ) 的二聚化或三聚化。现有技术已描述了多种亮氨酸拉链 多 肽。 参 见， 例 如， Landschulz 等 人， Science， 240 ： 1759(1988) ； 美 国 专 利 5,716,805 ； WO 94/10308 ； Hoppe 等人， FEBS Letters， 344 ： 1991(1994) ； Maniatis 等人， Nature， 341 ： 24(1989)。本领域技术人员将理解亮氨酸拉链序列可融合于本发明多肽的 5′或 3′端。
     融合蛋白的制备通常可使用标准技术， 包括化学缀合。融合蛋白也可在表达体系 中通过标准技术表达为重组蛋白质。合适的接头进一步在下文描述。
     接头可为天然存在的， 合成的， 或两者的组合。例如， 合成的接头可为随机化的接 头， 例如， 序列和尺寸都随机化。 在一方面， 随机化的接头可包含完全随机化的序列， 或任选
     地， 随机化的接头可基于天然接头序列。接头可包含， 例如， 非多肽部分 ( 例如多核苷酸 )、 多肽、 等。
     接头可为刚性的， 或者柔性的， 或两者的组合。 接头的柔性可以是接头和与接头相 互作用的亚单位两者的组成的函数。接头将两个选定的结合实体 ( 例如， 两个单独的多肽 或蛋白质， 如两个不同的抗体 ) 联接到一起， 并保持各实体为各别且离散的。该接头可允许 单独的、 离散的域的协作， 且保持各别的特性， 如对于多聚物中同一靶标的多个各别的结合 位点， 或者， 例如， 对于多聚物中不同靶标的多个各别的结合位点。 在一些情况下， 在两个连 接的结合实体之间， 或在接头和结合实体之间存在二硫桥。
     对于具体的要连接两个或多个结合实体的情况， 合适的接头的选择可取决于多个 参数， 包括例如结合实体的性质、 双特异性组合物结合的靶标的结构和性质、 和 / 或接头 ( 例如， 肽接头 ) 对蛋白水解和氧化的稳定性。
     特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸 (Gly)、 丝氨酸 (Ser)、 丙氨酸 (Ala) 和 苏氨酸 (Thr) 的氨基酸残基。例如， 肽接头可包含至少 75％ ( 基于肽接头中存在的残基总 数计算 )、 如至少 80％、 至少 85％、 或至少 90％的选自 Gly、 Ser、 Ala 和 Thr 的氨基酸残基。 该肽接头也可仅由 Gly、 Ser， Ala 和 / 或 Thr 残基组成。该接头多肽具有的长度应足以连 接两个结合实体， 使得它们采取相对彼此的正确构象以使它们保持所需的活性， 如结合靶 分子以及可其它能与这样的靶结合相关的活性 ( 例如， 对于给定生物分子的激动或拮抗活 性 )。
     适于该目的的合适长度是例如至少 1 个且通常少于约 50 个氨基酸残基的长度， 如 2-25 个氨基酸残基， 5-20 个氨基酸残基， 5-15 个氨基酸残基， 8-12 个氨基酸残基或 11 个残 基。其它合适的多肽接头尺寸可包括， 例如， 约 2 至约 15 个氨基酸， 约 3 至约 15 个、 约4至 约 12 个、 约 10 个、 约 8 个、 或约 6 个氨基酸。选择纳入接头多肽的氨基酸残基应显示以下 特性， 其不显著干扰多肽多聚物的活性或功能。 因此， 该肽接头从整体上说应不具有与多聚 物的活性或功能不一致的电荷， 不干扰内部折叠， 也不与一个或多个域中的氨基酸残基形 成会严重阻碍多聚物与所关注靶点的结合的键或其它相互作用。
     天然存在的以及人造的肽接头用于连接多肽成为新的连接的融合多肽的用途是 本 领 域 众 所 周 知 的 ( 参 见， 例 如， Hallewell 等 人， J.Biol.Chem.264， 5260-5268， 1989 ； Alfthan 等 人， Protein Eng.8， 725-731， 1995 ； Robinson and Sauer， Biochemistry 35， 109-116， 1996 ； Khandekar 等 人， J.Biol.Chem.272， 32190-32197， 1997 ； Fares 等 人， Endocrinology 139， 2459-2464， 1998 ； Smallshaw 等 人， Protein Eng.12， 623-630， 1999 ； 美国专利号 5,856,456)。
     广泛使用肽接头的一个实例是用于制备单链抗体， 其中轻链 (VL) 和重链 (VH) 的 可变区通过人造接头连接。在这个领域有大量的公开文献。一种广泛使用的肽接头是由 三个重复的 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 氨基酸序列 ((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO ： 73) 组成的 15 聚 物。 也已使用了其它接头， 还使用了噬菌体展示技术， 以及选择性传染噬菌体技术来多样化 和选择合适的接头序列 (Tang 等人， J.Biol.Chem.271， 15682-15686， 1996 ； Hennecke 等人， Protein Eng.11， 405-410， 1998)。肽接头已用于连接异源和同源二聚蛋白质 ( 如 T- 细胞 受体、 λCro 阻抑物、 P22 噬菌体 Arc 阻抑物、 IL-12、 TSH、 FSH、 IL-5 和干扰素 -γ) 中的各 个链。肽接头也已用于产生融合多肽。已使用多种接头， 在 Arc 阻抑物的情况下， 噬菌体展示已用于优化接头长度和组成以增加单链蛋白质的稳定性 ( 参见 Robinson 和 Sauer， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95， 5929-5934， 1998)。
     另 一 种 获 得 合 适 的 接 头 的 途 径 是 通 过 随 机 诱 变 来 优 化 简 单 的 接 头 ( 例 如， (Gly4Ser)n)。
     如上文讨论的， 通常优选肽接头具有至少一些柔性。因此， 在一些变化形式中， 肽 接头包含 1-25 个甘氨酸残基， 5-20 个甘氨酸残基， 5-15 个甘氨酸残基， 或 8-12 个甘氨酸残 基。特别合适的肽接头通常包含至少 50％的甘氨酸残基， 如至少 75％的甘氨酸残基。在一 些实施方案中， 肽接头仅包含甘氨酸残基。 在某些变化中， 该肽接头还包含甘氨酸之外的其 它残基。甘氨酸之外的优选残基包括 Ser， Ala 和 Thr， 特别是 Ser。
     在一些情况下， 向肽接头提供一些刚性是理想的或者是必须的。这可通过在肽接 头的氨基酸序列中包含脯氨酸残基而实现。 因此， 在另一实施方案中， 肽接头在肽接头的氨 基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如， 肽接头可具有这样的氨基酸序列， 其中至少 25％ ( 例如， 至少 50％或至少 75％ ) 的氨基酸残基为脯氨酸残基。在本发明一个具体的实 施方案中， 肽接头仅包含脯氨酸残基。
     在一些实施方案中， 修饰肽接头而引入包含供非多肽部分搭接的基团的氨基酸残 基。此类氨基酸残基的实例可为半胱氨酸或赖氨酸残基 ( 随后非多肽部分搭接于其上 )。 另一种备选方案是包括具有体内 N- 糖基化位点的氨基酸序列 ( 从而将糖部分 ( 体内 ) 连 接于肽接头 )。另一种选择是利用进化的 tRNAs 和 tRNA 合成酶 ( 参见， 例如， 美国专利申请 公开 2003/0082575) 遗传性地将非天然氨基酸掺入多肽结合实体或肽接头。例如， 酮-酪 氨酸的插入允许针对表达的多肽的位点特异性偶联。
     在某些变化形式中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基， 如一个半胱氨酸残基。 例 如， 在一些实施方案中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自 Gly， Ser， Ala 和 Thr 的 氨基酸残基。 在某些此类实施方案中， 肽接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基， 如仅有甘氨 酸残基和半胱氨酸残基。通常， 每个肽接头将仅包含一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残 基的具体肽接头的一个实例包括具有氨基酸序列 Glyn-Cys-Glym 的肽接头， 其中 n 和 m 各为 1-12 的整数， 例如， 3-9、 4-8、 或 4-7。
     如上所述， 本发明包括双特异性结合蛋白， 其包含 FGFR 和抗 VEGF-A 抗体的双特异 性抗体 / 可溶受体组合。在某些此类实施方案中， FGFR 和抗 VEGF-A 抗体共价连接 ( 例如， 通过肽接头 ) 以形成双特异性结合蛋白。在一些变化形式中， 该双特异性结合蛋白包含免 疫球蛋白重链恒定区， 例如， Fc 片段。特别合适的 Fc 片段包括， 例如， 包含修饰的 Fc 区以 减少或消除一种或多种效应物作用的 Fc 片段 ( 例如， Fc5， 具有 SEQ ID NO ： 74 所示的氨基 酸序列 )。
     例如， 在一些实施方案中， 根据本发明的减少 VEGF-A 和 FGF 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白包含如本文所述的抗 VEGF-A 抗体部分的结合区和 如本文所述的 FGFR3 的 FGF 结合部分。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为本文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 尤其是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体部 分和 VEGF-A 抗体部分的组合， 其中 FGF 受体部分为选自下组的 FGFR3 ： 如 SEQ ID NO ： 13 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)， 如 SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ：19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， 如 SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和如 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375) (P250R) ； 所 述 VEGF-A 抗 体 部 分 选 自 下 组 ： 如 SEQ ID NO ： 44 所 示 的 c870.1e6scFV， 如 SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， 如 SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和如 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合 部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 包 括 选 自 下 组 的 FGFR3 部 分 和 VEGF-A 抗 体 部 分 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W) Fc5c870e6pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包含 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分 和 VEGF-A 结 合 部 分， 所 述 FGF 结 合 部 分 为 选 自 下 组 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所 述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其 它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     III. 核酸， 宿主细胞， 和制备 VEGF-A 和 FGF 双特异性抗体 / 可溶受体组合蛋白的 方法
     本发明的可溶 FGFR 多肽可通过表达编码细胞外域或其部分的 DNA 制备。例如， 编 码包含 SEQ ID NO ： 13 的残基 36-388 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 FGFR3IIIc。 N- 端截 短的 FGFR3IIIc 可使用编码 SEQ ID NO ： 19 的残基 36-268 的多核苷酸。为制备 FGFR2IIIc， 可 使用编码 SEQ ID NO ： 24 的残基 36-391 的多核苷酸。在另一实例中， 编码包含 SEQ ID NO ： 37 的残基 36-268 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 N- 端截短的 FGFR2IIIc。优选该细胞外域多肽制备为基本上无跨膜和细胞内多肽区段的形式。为引导受体域从宿主细胞输出， 该 受体 DNA 连接至编码分泌肽的第二 DNA 片段， 如受体的天然信号序列。其它可使用的信号 序列包括 tPA 信号序列 ( 在以下实施例描述 )， CD33 信号序列或人生长激素信号序列。为 促进分泌的受体域的纯化， 可将 C- 端延伸物， 如多组氨酸标签、 物质 P、 FlagTM 肽 (Hopp 等 人， Biotechnology 6 ： 1204-1210， 1988 ； 获自 Eastman Kodak Co.， New Haven， CT) 或另一 有可用的抗体或特异性结合剂的多肽或蛋白质， 融合至受体多肽。
     本发明还包括编码本发明的抗体的重链和 / 或轻链的核酸。本发明的核酸包括这 样的核酸， 其具有与如上表 2 所列的编码 VL 和 / 或 VH 的多核苷酸基本相同的区域。本发明 的核酸还包括互补核酸。 在一些情况下， 当形成比对时， 各序列将是完全互补的 ( 无错配 )。 在其它情况下， 序列中可存在至多约 20％错配。 在本发明一些实施方案中， 提供了编码本发 明抗体的重链和轻链两者的核酸。 本文提供的核酸序列可使用密码子优化、 简并序列、 沉默 突变和其它 DNA 技术优化在特定宿主中表达后加以利用， 本发明涵盖这样的序列修饰。
     因此， 在一些方面， 本发明提供编码本文所述 FGFR 和 / 或 VEGF-A 抗体的一种或多 种多核苷酸 ( 例如， DNA 或 RNA)。在一些变化形式中， 本发明的多核苷酸编码结合并减少 FGF 和 VEGF-A 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白。本领域技术 人员将容易理解， 考虑到遗传密码的简并， 在这些多核苷酸分子中可能有大量的序列变化。
     本发明的核酸可克隆至载体中， 载体例如质粒， 粘粒， 杆粒 (bacmid)， 噬菌体， 人造 染色体 (BAC， YAC) 或病毒， 可向其中插入另一遗传序列或元件 (DNA 或 RNA) 以实现连接的 序列或原件的复制。在一些实施方案中， 该表达载体包含组成型活性启动子区段 ( 例如但 不限于 CMV， SV40， 延伸因子或 LTR 序列 ) 或诱导型启动子序列， 如类固醇可诱导的 pIND 载 体 (Invitrogen)， 在那里核酸的表达可被调节。 本发明的表达载体可进一步包括调节序列， 例如， 内部核糖体进入位点。该表达载体可通过例如转染被引入细胞。
     因此， 用于本发明中的蛋白质可根据常规技术在遗传工程化的宿主细胞中产生。 合适的宿主细胞为可用外源性 DNA 转化或转染且生长在培养物中的细胞类型， 包括细菌， 真菌细胞， 和培养的高等真核细胞 ( 包括培养的多细胞有机体的细胞 )， 特别是培养的哺乳 动物细胞。处理克隆 DNA 分子和向多种宿主细胞引入外源 DNA 的技术公开于 Sambrook 等 人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989)， 和 Ausubel 等人， 上文。
     通常， 在表达载体内， 编码感兴趣蛋白质的 DNA 序列可操作连接于其表达所需的 其它遗传元件， 通常包括转录启动子和终止子。该载体通常还包含一个或多个选择标记和 一个或多个复制起点， 不过， 本领域技术人员知道在某些体系内选择标记可提供在另外的 载体上， 且外源 DNA 的复制可通过整合至宿主细胞基因组中而提供。启动子、 终止子、 选择 标记、 载体和其它元件的选择是本领域常规技术的水平内的常规设计。许多这样的元件描 述于文献中且可获自商业供应者。
     为将重组蛋白质导向至宿主细胞的分泌途径， 在表达载体中提供分泌信号序列 ( 也称为前导序列， 前原序列或前序列 )。该分泌信号序列可为重组蛋白质的天然形式的， 或可衍生自另一分泌的蛋白质 ( 例如， t-PA ； 参见美国专利号 5,641,655) 或从头合成。该 分泌信号序列可操作连接至编码蛋白质的 DNA 序列， 即， 该两个序列在正确的读框中连接 并定位以将新合成的多肽引导至宿主细胞的分泌途径。 分泌信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的 DNA 序列的 5’ ， 但某些信号序列可位于感兴趣的 DNA 序列中的其它位置 ( 参见， 例 如， Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； Holland 等人， 美国专利号 5,143,830)。在具体的 变化形式中， 根据本发明使用的分泌信号序列具有选自下组的氨基酸序列 ： SEQ ID NOS ： 2， 10， 13， 15， 19， 22， 24， 29， 33， 37， 40， 42， 58， 60， 62 和 64 的残基 1-35。
     培养的哺乳动物细胞为制备用于本发明的重组蛋白质的合适的宿主。向哺乳动 物宿主细胞引入外源 DNA 的方法包括磷酸钙 - 介导的转染 (Wigler 等人， Cell 14 ： 725， 1978 ； Corsaro 和 Pearson， Somatic Cell Genetics 7 ： 603， 1981 ： Graham 和 Van der Eb， Virology 52 ： 456， 1973)， 电穿孔 (Neumann 等人， EMBO J.1 ： 841-845， 1982)， DEAE- 葡聚糖 介导的转染 (Ausubel 等人， 上文 )， 和脂质体介导的转染 (Hawley-Nelson 等人， Focus 15 ： 73， 1993 ； Ciccarone 等人， Focus 15 ： 80， 1993)。 重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的制备 公开于， 例如， Levinson 等人， 美国专利号 4,713,339 ； Hagen 等人， 美国专利号 4,784,950 ； Palmiter 等人， 美国专利号 4,579,821 ； 和 Ringold， 美国专利号 4,656,134。合适的哺乳动 物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞 (Vero ； ATCC CRL 1587)， 人胚胎肾细胞 (293-HEK ； ATCC CRL 1573)， 幼仓鼠肾细胞 (BHK-21， BHK-570 ； ATCC CRL 8544， ATCC CRL 10314)， 犬肾细胞 (MDCK ； ATCC CCL 34)， 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-K1 ； ATCC CCL61 ； CHO DG44 ； CHO DXB11(Hyclone， Logan， UT) ； 另参见， 例如， Chasin 等人， Som.Cell.Molec.Genet.12 ： 555， 1986))， 大鼠垂体细胞 (GH1 ； ATCC CCL82)， HeLa S3 细胞 (ATCC CCL2.2)， 大鼠肝癌细胞 (H-4-II-E ； ATCC CRL 1548)SV40- 转化的猴肾细胞 (COS-1 ； ATCC CRL 1650) 和鼠胚胎细胞 (NIH-3T3 ； ATCC CRL 1658)。 其他合适的细胞系是本领域已知的， 并且可以从公共保藏机构 如 American Type Culture Collection， Manassas， Virginia 获得。可使用强的转录启动 子， 如 SV-40 或巨细胞病毒的启动子。参见， 例如， 美国专利号 4,956,288。其它合适的启动 子包括来自金属硫蛋白基因的启动子 ( 美国专利 4,579,821 和 4,601,978) 和腺病毒主要 晚期启动子。
     药物选择通常用于选出已插入外源 DNA 的培养的哺乳动物细胞。这样的细胞通常 称为 “转染子” 。 在选择性试剂的存在下培养且能将感兴趣的的基因传至其后代的细胞称为 “稳定的转染子” 。示例性的选择标记包括编码对抗生素新霉素的抗性的基因， 其允许在新 霉素型药物如 G-418 等的存在下进行选择 ； 黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的 gpt 基因， 其允许宿主细胞在霉酚酸 / 黄嘌呤的存在下生长 ； 和提供对 zeocin， 博来霉素， 杀稻瘟素 (blastocidin)， 和潮霉素的抗性的标记 ( 参见， 例如， Gatignol 等人， Mol.Gen.Genet.207 ： 342， 1987 ； Drocourt 等人， Nucl.Acids Res.18 ： 4009， 1990)。选择系统也可用于增加感兴 。 扩增通过以下方式进行， 在低水平的选择剂的存在 趣基因的表达水平， 该过程称为 “扩增” 下培养转染子， 然后增加选择剂的量以选择出产生高水平的引入的基因的产物的细胞。可 扩增的选择标记的实例为二氢叶酸还原酶， 其赋予对甲氨蝶呤的抗性。其它药物抗性基因 ( 例如， 潮霉素抗性， 多药抗性， 嘌呤霉素乙酰基转移酶 ) 也可使用。
     其它高等真核细胞也可用作宿主， 包括昆虫细胞、 植物细胞和禽类细胞。 毛根土壤 杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 在植物细胞中作为用于表达基因的载体的用途已描述 于 Sinkar 等人， J.Biosci.(Bangalore)11 ： 47-58， 1987。昆虫细胞的转化和其中外源多肽 的产生公开于 Guarino 等人， 美国专利号 5,162,222 和 WIpO 公开 WO 94/06463。
     昆 虫 细 胞 可 被 通 常 衍 生 自 苜 蓿 丫 纹 夜 蛾 (Autographa californica) 核 型多 角 体 病 毒 (AcNPV) 的 重 组 杆 状 病 毒 感 染。 参 见 King 和 Possee， The Baculovirus Expression System ： A Laboratory Guide(Chapman & Hall， London) ； O’ Reilly 等 人， Baculovirus Expression Vectors ： A Laboratory Manual(Oxford University Press.， New York 1994) ； 和 Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology(Richardson ed.， Humana Press， Totowa， NJ， 1995)。重组杆状病毒也可通过使 用描述于 Luckow 等人 (J.Virol.67 ： 4566-4579， 1993) 的基于转座子的体系制备。这种 系统使用转移载体， 可以试剂盒的形式商购 (BAC-TO-BAC 试剂盒 ； Life Technologies， Gaithersburg， MD)。转移载体 ( 例如， PFASTBAC1 ； Life Technologies) 包含 Tn7 转座子， 以将编码感兴趣蛋白质的 DNA 移至作为大质粒 ( 称为 “杆粒” ) 保持在大肠杆菌中的杆状 病毒基因组中。参见 Hill-Perkins 和 Possee， J.Gen.Virol.71 ： 971-976， 1990 ； Bonning 等人， J.Gen.Virol.75 ： 1551-1556， 1994 ； 和 Chazenbalk 和 Rapoport， J.Biol.Chem.270 ： 1543-1549， 1995。此外， 转移载体可包括与上述编码多肽延伸物或亲和标签的 DNA 的合框 融合。使用本领域已知的技术， 将包含编码蛋白质的 DNA 序列的转移载体转化到大肠杆菌 宿主细胞中， 并从细胞中筛选包含断裂的 lacZ 基因 ( 其是重组杆状病毒的指示 ) 的杆粒。 使用一般技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒 DNA， 并用其转染草地贪夜蛾细胞， 如 Sf9 细胞。随后制备表达感兴趣蛋白质的重组病毒。重组病毒株通过本领域通常使用的方 法制备。 对 于 蛋 白 质 制 备， 重 组 病 毒 用 于 感 染 宿 主 细 胞， 通常为衍生自草地贪夜蛾 (Spodoptera fugiperda) 的 细 胞 系 ( 例 如， Sf9 或 Sf21 细 胞 ) 或 衍 生 自 粉 纹 夜 蛾 (Trichoplusia ni) 的细胞系 ( 例如， HIGH FIVE 细胞 ； Invitrogen， Carlsbad， CA)。一般 参 见 Glick 和 Pasternak， Molecular Biotechnology， Principles & Applications of Recombinant DNA(ASM Press， Washington， D.C.， 1994)。 也参见美国专利号 5,300,435。 无 血清培养基用于培养和保持细胞。合适的培养基制剂是本领域已知的且可获自供应商。细 胞从约 2-5x 105 细胞的接种密度生长至 1-2x 106 细胞的密度， 此时添加重组病毒株， 其感 染复数 (MOI) 为 0.1 至 10， 更典型接近 3。使用的步骤通常描述于可用的实验室手册 ( 参 见， 例如， King 和 Possee， 上文 ； O’ Reilly 等人， 上文 ； Richardson， 上文 )。
     真菌细胞， 包括酵母细胞， 也可用于本发明。 在这方面感兴趣的酵母物种包括酿酒 酵母， 毕赤酵母 (Pichia pastoris)， 和甲醇毕赤酵母。用外源 DNA 转化酿酒酵母细胞和由 此制备重组多肽的方法公开于， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kawasaki 等人， 美 国专利号 4,931,373 ； Brake， 美国专利号 4,870,008 ； Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； 通常是药物抗 和 Murray 等人， 美国专利号 4,845,075。依据由选择标记所确定的表型， 性、 或在特定营养素 ( 例如， 亮氨酸 ) 不存在的情况下生长的能力， 来选择转化的细胞。用 于酿酒酵母的载体系统的实例为 Kawasaki 等人 ( 美国专利号 4,931,373) 公开的 POT1 载体系统， 其允许通过含葡萄糖的培养基中培养来选择转化的细胞。用于酵母的合适的 启动子和终止子包括源自糖酵解酶基因 ( 参见， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kingsman 等人， 美国专利号 4,615,974 ； 和 Bitter， 美国专利号 4,977,092) 和醇脱氢酶基 因的那些。另参见美国专利号 4,990,446 ； 5,063,154 ； 5,139,936 ； 和 4,661,454。其它酵 母的转化体系， 包括多形汉逊酵母， 粟酒裂殖酵母， 乳酸克鲁维酵母， 脆壁克鲁维酵母， 玉米 黑粉菌 (Ustilago maydis)， 巴斯德毕赤酵母， 甲醇毕赤酵母， 季也蒙毕赤酵母， 和麦芽糖
     假丝酵母是本领域已知的。参见， 例如， Gleeson 等人， J.Gen.Microbiol.132 ： 3459-3465， 1986 ； Cregg， 美国专利号 4,882,279 ； 和 Raymond 等人， Yeast 14 ： 11-23， 1998。曲霉细胞 可根据 McKnight 等人， 美国专利号 4,935,349 的方法使用。转化产黄顶孢霉 (Acremonium chrysogenum) 的方法公开于 Sumino 等人， 美国专利号 5,162,228。转化链孢霉的方法公开 于 Lambowitz， 美国专利号 4,486,533。在甲醇毕赤酵母中制备重组蛋白质公开于美国专利 5,716,808 ； 5,736,383 ； 5,854,039 ； 和 5,888,768。
     原核宿主细胞， 包括细菌大肠杆菌、 芽孢杆菌属、 和其它属也是本发明中可用的宿 主细胞。转化这些宿主和表达其中克隆的外源 DNA 序列的技术是本领域已知的 ( 参见， 例 如， Sambrook 等人， 上文 )。当在细菌如大肠杆菌中表达重组蛋白质时， 该蛋白质可保持在 细胞质中， 通常作为不可溶颗粒， 或可通过细菌分泌序列导至周质空间。在前一情形， 将细 胞溶解， 回收颗粒并使用例如胍异硫氰酸酯或脲使其变性。然后变性的蛋白质可通过稀释 变性剂 ( 例如， 通过对脲与还原型和氧化型的谷胱甘肽的组合的溶液透析， 然后对缓冲盐 水溶液透析 ) 而重折叠和二聚化。或者， 该蛋白质可以可溶形式从细胞质回收， 并在不使 用变性剂的情况下分离。蛋白质作为水提取物 ( 例如磷酸盐缓冲盐水中的水提取物 ) 从 细胞回收。为了捕捉感兴趣的蛋白质， 将提取物直接施加至色谱介质， 如固定的抗体或肝 素 -Sepharose 柱。分泌的蛋白质可以以可溶的、 有功能的形式从周质空间回收， 方法是破 裂细胞 ( 通过， 例如， 超声处理或渗透压冲击 ) 以释放周质空间的内含物和回收蛋白质， 从 而无需变性和重折叠。 抗体， 包括单链抗体， 可在细菌宿主细胞中根据已知方法制备。 参见， 例如， Bird 等人， Science 242 ： 423-426， 1988 ； Huston 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5879-5883， 1988 ； 和 Pantoliano 等人， Biochem.30 ： 10117-10125， 1991。
     转化或转染的宿主细胞根据常规步骤在含营养素和所选宿主细胞的生长所需的 其它组分培养基中培养。 多种合适的培养基， 包括确定成分培养基和复合培养基， 是本领域 已知的， 且通常包括碳源、 氮源， 必需氨基酸， 维生素和矿物质。 培养基可按需要包含生长因 子或血清之类的成分。生长培养基通常会选择包含外源添加的 DNA 的细胞， 例如通过药物 选择或必须营养素的缺乏， 该必须营养素通过表达载体携带的或者共转染到宿主细胞中的 选择标记补充。
     包 含 VEGF-A 抗 体 / 可 溶 FGF 受 体 双 特 异 性 结 合 蛋 白 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 通 过 常 规 蛋 白 质 纯 化 方 法 纯 化， 通 常 通 过 色 谱 技 术 的 组 合 纯 化。 一 般 参 见 Affinity Chromatography ： Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology， Uppsala ，Sweden ， 1988) ； Scopes ，Protein Purification ： Principles and Practice(Springer-Verlag， New York 1994)。包含免疫球蛋白重链多肽的蛋白质可通过 亲和色谱法在固定的蛋白质 A 上纯化。可采用进一步的纯化步骤， 如凝胶过滤， 来获得所需 水平的纯度或提供脱盐， 缓冲液交换等。
     抗体可从细胞培养基通过已知方法， 如亲和色谱法使用常规柱和其它设备纯化。 在典型的程序中， 收集条件化培养基， 且可将其在 4℃储存至多 5 天。 为避免污染， 通常添加 抑菌剂 ( 例如， 叠氮化钠 )。降低培养基的 pH( 通常至 Ph ～ 5.5)， 如通过滴加冰醋酸。较 低的 pH 提供通过蛋白 G 树脂的最佳的 IgG 俘获。该蛋白质 G 柱的尺寸基于条件化培养基 的体积确定。用合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2 中和填充好的柱子。然 后使培养基通过中和的蛋白质 g 树脂， 流速由培养基体积和柱尺寸确定。保留穿透液以备可能的再次过柱。然后将具有俘获的抗体的树脂冲洗成中和缓冲液。使用酸性洗脱缓冲 液， 如 0.1M 甘氨酸， pH 2.7 或等价物将柱子洗脱为级分。中和各级分， 例如使用 2M tris， pH 8.0， 以 tris ∶甘氨酸的 1 ∶ 20 比例。汇集包含蛋白质的级分 ( 例如， 基于 A280)。汇集 的级分使用脱盐柱缓冲液交换至合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2。通过 A280 使用消光系数 1.44 测定浓度。内毒素水平可通过 LAL 测定法确定。纯化蛋白质可冷冻 储存， 通常在 -80℃。
     表达功能性 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的细胞在筛选测定中 使用。多种合适的测定是本领域已知的。这些测定基于对靶细胞中生物响应的检测。一 种这样的测试为细胞增殖测试。在存在或不存在测试化合物的情况下培养细胞， 且通过， 例如， 测量氚化的胸苷的掺入或通过基于 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四唑 鎓溴化物 (MTT) 的代谢分解的比色测定细胞增殖 (Mosman， J.Immunol.Meth.65 ： 55-63， 1983) 检测。一种备选的测定法形式使用进一步工程化以表达报道基因的细胞。该报道基 因连接于对受体连接的途径响应的启动子元件， 该测定法检测该报道基因的转录的活化。 在此方面， 优选的启动子元件为血清响应元件， 或称 SRE。( 参见， 例如， Shaw 等人， Cell 56 ： 563-572， 1989)。优选的该报道基因是荧光素酶基因。( 参见 de Wet 等人， Mol.Cell. Biol.7 ： 725， 1987.)。使用本领域已知方法通过发光检测荧光素酶基因的表达。( 参见， 例 如， Baumgartner 等 人， J.Biol.Chem.269 ： 29094-29101， 1994 ； Schenborn 和 Goiffin， Promega Notes 41 ： 11， 1993.)。荧光素酶活性测定试剂盒可购自， 例如， Promega Corp.， Madison， WI。该类型的靶细胞系可用于筛选化学物质库， 细胞条件化的培养基， 真菌培养 液， 土壤样， 水样， 等。 例如， 可在靶细胞上测定细胞条件化的培养基样品的库以鉴别产生配 体的细胞。 然后用阳性细胞在哺乳动物表达载体中产生 cDNA 文库， 将文库分池 (pools)， 转 染到宿主细胞中， 表达。 然后测定转染的细胞的培养基样品， 随后进一步分池， 再转染， 传代 培养， 且重新测定阳性细胞以分离编码配体的克隆 cDNA。
     IV. 治疗方法
     A. 概述
     在另一方面， 本发明提供抑制血管发生的方法， 特别是治疗与血管发生相关的疾 病或疾患的方法。一般而言， 该方法包括向受试者施用可有效抑制血管发生的量的包含双 特异性抗体 / 可溶受体组合的双特异性结合蛋白。更具体地， 对于治疗用途， 将该双特异性 结合蛋白施用于患有， 或有升高的风险患上以血管发生增加为特征的疾病或疾患 (“新生 血管疾病” ) 的患者。适合根据本发明治疗的新生血管疾病包括， 例如， 以实体瘤生长为特 征的癌症 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC)， 成胶质细 胞瘤， 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及多种新生血管眼病 ( 例如， 年龄相关的黄斑变性， 糖尿 病性视网膜病， 虹膜新生血管形成， 和新生血管性青光眼 )。其它适合根据本发明治疗的新 生血管疾病包括， 例如， 类风湿性关节炎， 银屑病， 动脉粥样硬化， 慢性炎症， 肺炎症， 先兆子 痫， 心包渗漏 ( 如与心包炎相关的 )， 和胸腔积液。
     在本文所述治疗方法的每一实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的递送方式符合与寻求治疗的疾病 或疾患的管理相关的常规方法学。根据本文的公开， 在足以预防或治疗疾病或疾患的条件 下、 以足以预防或治疗疾病或疾患的时间向需要该治疗的受试者施用有效量的拮抗剂。施用本文描述的双特异性结合蛋白的受试者包括有较高的风险发生特定的与血 管发生相关的疾病或疾患的患者， 也包括表现出现有的新生血管疾病的患者。在某些实施 方案中， 该受试者已诊断为患有寻求治疗的疾病或疾患。 而且， 可在治疗过程中监测受试者 任何疾病或疾患的变化 ( 例如， 监测疾病或疾患的临床症状的增加或减少 )。
     在预防性的应用中， 将药物组合物或药物施用于对特定疾病易感或具有其他风险 的患者， 施用的量足以消除或减少疾病的风险或延迟疾病的发生。 在治疗性的应用中， 将组 合物或药物施用于疑似患有， 或已患有该疾病的患者， 施用的量足以治愈， 或至少部分阻止 该疾病症状及其并发症。足以实现该目的的量称为治疗有效量或药物有效量。在预防和治 疗方案两者中， 药物通常施用多个剂量直到达到充分的响应 ( 例如， 抑制不合适的血管发 生活性 )。通常， 监测该响应， 如果期望响应开始消退则给予重复的剂量。
     为鉴别用于根据本发明的方法治疗的受试患者， 可使用公认的筛选方法来确定 与特定的新生血管疾病相关的风险因素或确定受试者中确认的已有疾病的状态。这样的 方法可包括， 例如， 确定个体是否有亲属被诊断有特定疾病。筛选方法还可包括， 例如， 对 已知具有可遗传的成分的具体疾病进行常规病情检查以确定家族状态。例如， 多种癌症 还已知具有某些可遗传的成分。癌症的可遗传的成分包括， 例如， 多种转化中的基因 ( 例 如， Ras， Raf， EGFR， cMet， 及其他 ) 内的突变， 某些 HLA 和杀伤抑制性受体 (KIR) 分子的有 无， 或癌细胞能直接或间接调节细胞如 NK 细胞和 T 细胞的免疫抑制的机理 ( 参见， 例如， Ljunggren 和 Malmberg， Nature Rev.Immunol.7 ： 329-339， 2007 ； Boyton 和 Altmann， Clin. Exp.Immunol.149 ： 1-8， 2007)。 为此目的， 可常规性地使用核苷酸探针鉴定携带与感兴趣的 具体疾病相关的遗传标记的个体。 此外， 很多种免疫方法是本领域已知的， 可用于鉴别特定 疾病的标记。例如， 有多种 ELISA 免疫测定方法可以使用， 且为本领域公知， 这些方法使用 单克隆抗体探针检测与特定肿瘤相关的抗原。 可按照已知的患者症状， 年龄因素， 相关风险 因素等的指示来实施筛选。 这些方法允许临床医师常规地选择需要本文所述治疗方法的患 者。根据这些方法， 血管发生的抑制可作为独立治疗过程进行， 或作为其它治疗的后续的、 辅助的、 或协同的治疗方案。
     对于施用， 该包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白配制为药物组合物。 包含双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合的药物组合物可根 据已知方法配制以制备可药用组合物， 其中将治疗分子与可药用的载体组合为混合物。如 果组合物的施用可被接受的患者耐受， 则其称为 “可药用的载体” 。无菌磷酸盐缓冲盐水为 可药用的载体的一个实例。其它合适的载体是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995))。制剂可进一步包括一种或多种赋形剂， 防腐剂， 增溶剂， 缓冲剂， 用于防止小瓶 表面上蛋白质损失的白蛋白等。单特异性拮抗剂可单独配制或以组合制剂提供。
     包含含有 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的 药物组合物以有效量施用于受试者。根据本发明的方法， 拮抗剂可通过多种施用方式施用 于受试者， 包括例如， 肌内， 皮下， 静脉内， 心房内， 关节内， 肠胃外， 鼻内， 肺内， 经皮， 胸膜 内， 鞘内， 和口腔施用途径。对于治疗新生血管眼病的药物用途， 该双特异性结合蛋白通常 根据常规方法配制为用于玻璃体内注射。对于治疗和预防目的， 拮抗剂可以以下方式施用 于受试者 ： 单次推注递送、 长时间连续递送 ( 例如， 连续经皮递送 )， 或以重复的施用方案( 例如， 基于每小时， 每日， 或每周 )。
     组合物的 “治疗有效量” 是产生统计学显著效果的量， 如疾病进展的统计学显著减 少或器官功能的统计学显著改善。精确剂量将通过临床医师根据公认的标准确定， 其中考 虑治疗症状的性质和严重性、 患者特征等。剂量的确定在本领域技术人员水平范围内。
     此语境中有效剂量的确定通常基于动物模型研究， 然后是人体临床试验， 并通过 确定可显著减少模型受试者中受试者疾病或疾患的发生或严重性的有效剂量和施用方案 来指导。本发明的组合物的有效剂量根据多种不同的因素改变， 包括施用手段， 靶位点， 患 者生理状态， 患者为人还是动物， 施用的其它药物， 该治疗为预防性还是治疗性， 以及组合 物本身具体活性及其在个体中引起所需响应的能力。通常， 该患者是人， 但在一些疾病中， 该患者可为非人哺乳动物。通常， 对剂量方案进行调节以提供最佳治疗响应， 即， 优化安全 性和功效。 因此， 治疗性或预防性有效量也是这样的量， 其中抑制血管发生的有利作用大于 任何不想要的副作用。 对于施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白， 剂量通常为约 0.1μg 至 100mg/kg 或 1μg/kg 至约 50mg/kg， 更通常为 10μg 至 5mg/kg 受试者体重。 在更具体的实施方案中， 药物的有效量为约 1μg/kg 至约 20mg/kg， 约 10μg/kg 至约 10mg/kg， 或约 0.1mg/kg 至约 5mg/kg。该范围的剂量可通过单一或多次 施用实现， 包括， 例如， 每日施用多次或每日、 每周、 每两周或每月施用一次。 例如， 在某些变 化形式中， 施用方案由初始施用和之后的间隔一周或两周的多次施用组成。另一方案由初 始施用和之后的间隔一月或两月的多次施用组成。 或者， 施用可以是不规则的， 通过监测 NK 细胞活性和 / 或疾病或疾患的临床症状来指示。
     药物组合物的剂量可由主治医师加以改变以保持靶位处所需的浓度。例如， 如果 选择静脉内递送模式， 靶组织处血流中药物的局部浓度可为约 1-50 纳摩尔组合物 / 升， 有 时为约 1.0 纳摩尔 / 升至 10， 15， 或 25 纳摩尔 / 升， 取决于受试者的状态和预计的测量响 应。可基于递送方式 ( 例如是经表皮递送还是递送至粘膜的表面 ) 选择较高或较低浓度。 剂量也应基于施用的制剂 ( 例如， 鼻喷雾剂对粉末， 缓释口服或注射颗粒， 经皮制剂等 ) 的 释放速率而调节。为达到相同的血清浓度水平， 例如， 释放速率为 5 纳摩尔 ( 标准条件下 ) 的缓慢释放颗粒的施用剂量为释放速率为 10 纳摩尔的颗粒的剂量的约两倍。
     包括含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的药物 组合物可以以液体形式、 喷雾剂或固体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液、 气雾剂、 滴液、 表面用溶液和口服悬液。示例性的固体形式包括胶囊、 片剂和控释形式。后一形式的 示例有微渗透压泵和植入物。 ( 参见， 例如， Bremer 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 239， 1997 ； Ranade， Drug Delivery Systems 95-123 中的 “Implants in Drug Delivery， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Bremer 等人， Protein Delivery ： Physical Systems 239-254 中的 “Protein Delivery with Infusion Pumps， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Yewey 等 人， Protein Delivery ： Physical Systems 93-117 中 的 “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997))。其它固体形式包括乳膏， 糊剂， 其它表面敷剂等。
     脂质体提供了一种手段来向受试者递送治疗多肽， 例如， 静脉内递送， 向腹膜 内递送， 鞘内递送， 肌内递送， 皮下递送， 或通过口服施用、 吸入、 或鼻内施用递送。脂 质体为微囊泡， 其由围绕着水性隔室的一个或多个脂质双层组成。( 参见， 一般性的，Bakker-Woudenberg 等 人， Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1) ： S61， 1993 ； Kim， Drugs 46 ： 618， 1993 ； Ranade， Drug Delivery Systems 3-24 中 的 “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995))。脂质体的组成与细胞膜相似， 因此， 脂质体可安全施用且生物可降解。取决于制备 方法， 脂质体可为单层的或多层的， 且脂质体的尺寸可变化， 直径从 0.02μm 至大于 10μm 不等。 多种试剂可包囊在脂质体中 ： 疏水试剂分配在双层中， 而亲水性试剂分配在内部水性 空间中。( 参见， 例如， Machy 等人， Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987) ； Ostro 等人， American J.Hosp.Pharm.46 ： 1576， 1989)。 而且， 可通过改变脂 质体尺寸、 双层的数量、 脂质组成、 以及脂质体的电荷和表面特征来控制包囊的试剂的治疗 可利用度 (therapeutic availability)。
     脂质体可吸附至几乎任何类型的细胞， 然后缓慢释放包囊的试剂。 或者， 吸附的脂 质体可被吞噬性的细胞内吞。 内吞作用之后发生脂质体脂质的溶酶体内降解和包囊的试剂 的释放 ( 参见 Scherphof 等人， Ann.N.Y.Acad.Sci.446 ： 368， 1985)。静脉内施用后， 小的脂 质体 (0.1 至 1.0μm) 通常被主要位于肝和脾中网状内皮系统的细胞所摄取， 而大于 3.0μm 的脂质体沉积在肺中。 网状内皮系统的细胞对较小脂质体的这种优先吸收作用已经被利用 来将化学治疗剂递送至巨噬细胞和肝的肿瘤。 可通过多种方法避开网状内皮系统， 包括用大剂量的脂质体颗粒饱和， 或通过药 理手段选择性地对巨噬细胞灭活 ( 参见 Claassen 等人， Biochim.Biophys.Acta 802 ： 428， 1984)。 此外， 已显示将用糖脂或聚乙二醇衍生化的磷脂掺入脂质体膜可导致网状内皮系统 的吸收显著减少 ( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1068 ： 133， 1991 ； Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     也可在制备脂质体时通过改变磷脂组成或向脂质体插入受体或反受体 (counter-receptors) 以靶向特定细胞或器官。例如， 制备为带有高含量非离子表面活性 剂的脂质体已被用于靶向肝。( 参见， 例如， Hayakawa 等人的日本专利 04-244,018 ； Kato 等人， Biol.Pharm.Bull.16 ： 960， 1993)。这些制剂通过以下方式制备 ： 在甲醇中混合大豆 磷脂酰胆碱、 α- 生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油 (HCO-60)， 真空浓缩该混合物， 然后用水复 原该混合物。二棕榈酰基磷脂酰胆碱 (DPPC) 和大豆衍生的甾酰基葡糖苷混合物 (SG) 和胆 固醇 (Ch) 的脂质体制剂已显示靶向肝。( 参见 Shimizu 等人， Biol.Pharm.Bull.20 ： 881， 1997)。
     或者， 可将多种靶向性反受体连接于脂质体的表面， 如抗体， 抗体片段， 碳水化合 物， 维生素， 和转运蛋白。例如， 为了靶向肝脏， 可用支链型的半乳糖基脂质衍生物修饰脂 质体以靶向脱唾液酸糖蛋白 ( 半乳糖 ) 受体， 此类受体仅在肝细胞表面表达。( 参见 Kato 和 Sugiyama， Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14 ： 287， 1997 ； Murahashi 等 人， Biol. Pharm.Bull.20 ： 259， 1997)。根据一种更通用的组织靶向方法， 用对靶细胞表达的反受体 特异的生物素化抗体预先标记靶细胞。( 参见 Harasym 等人， Adv.Drug Deliv.Rev.32 ： 99， 1998)。血浆清除游离抗体后， 施用链亲和素缀合的脂质体。在另一方法中， 将靶向性抗体 直接连接至脂质体。( 参见 Harasym 等人， 上文 )。
    多 肽 和 抗 体 可 使 用 蛋 白 质 微 囊 化 的 标 准 技 术 包 封 在 脂 质 体 中。( 参 见， 例 如， Anderson 等 人， Infect.Immun.31 ： 1099， 1981 ； Anderson 等 人， Cancer Res.50 ：
     1853， 1990 ； Cohen 等 人， Biochim.Biophys.Acta 1063 ： 95， 1991 ； Alving 等 人 Liposome Technology(Vol.III)317 中的 “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies， ” (Gregoriadis， ed.， CRC Press， 2nd ed.1993) ； Wassef 等人， Meth.Enzymol.149 ： 124， 1987.)。如上所述， 治疗上有用的脂质体可包含多种组分。例如， 脂质体可包含聚 ( 乙 二醇 ) 的脂质衍生物。( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     已设计了可降解聚合物微球以保持治疗蛋白质的高全身水平。 微球从可降解聚合 物制备， 如丙交酯乙交酯共聚物 (PLG)， 聚酸酐， 聚 ( 原酸酯 )， 非生物可降解的乙基乙酸乙 烯酯聚合物， 其中蛋白质圈闭在聚合物中。( 参见， 例如， Gombotz 和 Pettit， Bioconjugate Chem.6 ： 332， 1995 ； Ranade， “Role of Polymers in Drug Delivery， ” in Drug Delivery Systems 51-93(Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Roskos and Maskiewicz， “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery， ” in Protein Delivery ： PhysicalSystems 45-92(Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Bartus 等人， Science 281 ： 1161， 1998 ； Putney and Burke， Nature Biotechnology 16 ： 153， 1998 ； Putney， Curr..Opin.Chem.Biol.2 ： 548， 1998)。聚乙二醇 (PEG) 包被的纳米球 也可提供静脉内施用治疗蛋白质的载体。( 参见， 例如， Gref 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 167， 1997)。
     本领域技术人员可设计其它剂型， 例如可见， Ansel 和 Popovich， Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lea & Febiger ， 5th ed.1990) ； Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995)， 和 Ranade 和 Hollinger， Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)。
     本文所述的药物组合物也可在联合治疗的背景下使用。术语 “联合治疗” 在本文 使用时， 是指对受试者施用至少一个治疗有效剂量的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特 异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和另一治疗剂。 例如， 在癌症免疫治疗的背景下， 包含含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组合物可用作血管发 生抑制剂与化疗或放射联合。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白可与常规类型的化疗或放射协同作用。 该双特异性结合蛋白可进一步减少肿 瘤负担并可使得化疗剂的杀灭作用更有效。
     显示血管发生抑制活性的本发明的组合物也可与免疫调节化合物 ( 包括多种细 胞因子和共刺激 / 抑制分子 ) 联合使用。它们可包括， 但不限于， 使用刺激抗癌免疫应答 的细胞因子。例如， 组合使用 IL-2 和 IL-12 在 T- 细胞淋巴瘤， 鳞状上皮细胞癌， 和肺癌中 显示有益作用。( 参见 Zaki 等人， J.Invest.Dermatol.118 ： 366-71， 2002 ； Li 等人， Arch. Otolaryngol.Head Neck Surg.127 ： 1319-24， 2001 ； Hiraki 等人， Lung Cancer 35 ： 329-33， 2002)。 此外， VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白可与共刺激基于免疫的效应细 胞上发现的多种细胞表面分子的试剂组合， 如 CD137 的活化。( 参见 Wilcox 等人， J.Clin. Invest.109 ： 651-9， 2002) 或 CTLA4 的抑制 (Chambers 等人， Ann.Rev.Immunol.19 ： 565-94， 2001)。或者， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可 与通过与 TRAIL- 相关的受体的相互作用诱导肿瘤细胞凋亡的试剂一起使用。 ( 参见， 例如， Takeda 等人， J.Exp.Med.195 ： 161-9， 2002 ； Srivastava， Neoplasia 3 ： 535-46， 2001)。这 样的试剂包括 TRAIL 配体， TRAIL 配体 -Ig 融合物， 抗 TRAIL 抗体， 等。在其它变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与不特异靶向血管发生的单克隆抗体治疗联合使用。 该联合治疗特别用于治疗 癌症， 其中使用单克隆抗体， 特别是针对肿瘤表达的抗原的抗体， 正在成为对许多肿瘤 ( 包 括乳腺细胞癌 ( 曲妥单抗或 HERCEPTIN ) 和结肠癌 ( 西妥昔单抗或 ERBITUX )) 的标准做 法。
     药物组合物可作为试剂盒提供， 该试剂盒包含含本文所述的治疗组合物的容器。 治疗组合物可提供为， 例如， 单剂或多剂施用的可注射溶液形式， 或作为在注射前复原的无 菌粉末。或者， 该试剂盒可包括用于施用治疗组合物的干粉分散器， 液体气雾剂发生器， 或 喷雾器。该试剂盒可进一步包含关于适应症和药物组合物的用途的书面信息。
     B. 癌症治疗
     1. 癌症类型
     根据本发明可治疗的癌症包括以实体瘤的存在为特征的癌症。如前人讨论的， 肿 瘤组织中血管的量是涉及实体瘤形成的癌症的强的负面预后指标 ( 参见， 例如， Weidner 等 人， (1992)， 上文 ； Weidner 等人， (1993)， 上文 ； Li 等人， 上文 ； Foss 等人， 上文 )， 且 VEGF 和 FGF 信号分子家族都显示出在实体瘤相关的新血管形成中起关键作用。下表 4 列出一些特 征为实体瘤形成的癌症， 主要通过靶组织分类。
     表4： 涉及实体瘤形成的示例性癌症
    
    因此， 在某些实施方案中， 本文所述的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白用于治疗特征为存在实体瘤的癌症， 例如， 表 4 所列的任一 种癌症。 例如， 在一些实施方案中， 要根据本发明治疗的癌症选自下列 ： 头颈部癌症 ( 例如， 口腔， 口咽， 鼻咽， 下咽， 鼻腔或鼻旁窦， 喉， 唇， 或唾液腺的癌症 ) ； 肺癌 ( 例如， 非小细胞肺
     癌， 小细胞癌， 或间皮瘤 ) ； 胃肠道癌 ( 例如， 结肠直肠癌， 胃癌， 食管癌， 或肛门癌 ) ； 胃肠 道间质瘤 (GIST) ； 胰腺癌 ； 胰腺腺泡细胞癌 ； 小肠的癌症 ； 肝癌或胆系癌 ( 例如， 肝细胞腺 瘤， 肝细胞癌， 血管肉瘤， 肝外或肝内胆管肉瘤， 法特壶腹癌， 或胆囊癌 ) ； 乳腺癌 ( 例如， 转 移性乳腺癌或炎性乳腺癌 ) ； 妇科癌症 ( 例如， 子宫颈癌， 卵巢癌， 输卵管癌症， 腹膜癌， 阴道 癌， 外阴癌症， 妊娠性滋养层细胞瘤形成， 或子宫癌， 包括子宫内膜癌或子宫肉瘤 ) ； 泌尿道 癌症 ( 例如， 前列腺癌 ； 膀胱癌 ； 阴茎癌 ； 尿道癌， 或肾癌， 例如， 肾细胞癌或移行细胞癌， 包 括肾盂和输尿管 ) ； 睾丸癌 ； 中枢神经系统 (CNS) 癌症如颅内肿瘤 ( 例如， 星形细胞瘤， 间 变性星形细胞瘤， 成胶质细胞瘤， 少突胶质细胞瘤， 间变性少突胶质细胞瘤， 室管膜瘤， 原发 性 CNS 淋巴瘤， 成神经管细胞瘤， 生殖细胞瘤， 松果腺瘤， 脑膜瘤， 垂体肿瘤， 神经鞘肿瘤 ( 例 如， 神经鞘瘤 )， 脊索瘤， 颅咽管瘤， 脉络丛肿瘤 ( 例如， 脉络丛癌 ) ； 或其它神经元或神经胶 质起源的颅内肿瘤 ) 或脊髓肿瘤 ( 例如， 神经鞘瘤， 脑膜瘤 ) ； 内分泌瘤 ( 例如， 甲状腺癌， 例如， 甲状腺癌， 髓样癌症， 或甲状腺淋巴瘤 ； 胰腺内分泌肿瘤， 例如， 胰岛素瘤或胰高血糖 素瘤 ； 肾上腺癌， 例如， 嗜铬细胞瘤 ； 类癌瘤 ； 或甲状旁腺癌 ) ； 皮肤癌 ( 例如， 鳞状上皮细胞 癌； 基底细胞癌 ； 卡波西肉瘤 ； 或恶性黑素瘤， 例如， 眼内黑素瘤 ) ； 骨癌 ( 例如， 骨肉瘤， 例 如， 骨肉瘤， 骨软骨瘤， 或尤因氏肉瘤 ) ； 多发性骨髓瘤 ； 绿色瘤 ； 软组织肉瘤 ( 例如， 纤维性 肿瘤或纤维组织细胞瘤 ) ； 平滑肌或骨骼肌肿瘤 ； 血液或淋巴管血管周围肿瘤 ( 例如， 卡波 西肉瘤 ) ； 滑膜肿瘤 ； 间皮瘤 ； 神经肿瘤 ； 副神经节肿瘤 ； 骨骼外软骨或骨肿瘤 ； 和多能间质 瘤。
     在一些变化形式中， 待治疗的癌症是儿童期癌症， 例如， 脑癌， 神经母细胞瘤， 维尔 姆斯瘤 ( 肾胚细胞瘤 )， 横纹肌肉瘤， 视网膜母细胞瘤， 或肝母细胞瘤。
     在其它变化形式中， 癌症为免疫治疗敏感性癌症， 例如， 黑素瘤， 肾癌， 乳腺癌， 前 列腺癌， 结肠直肠癌， 子宫颈癌， 卵巢癌， 或肺癌。
     在以下进一步详细描述上述癌症中的一些， 包括一些评价 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用的相关动物模型。
     a. 前列腺癌
     前列腺癌是男性生殖系统中发现于膀胱下侧、 直肠之前的一个腺体中的异常生 长。几乎所有前列腺癌都产生自前列腺中的分泌性腺细胞， 因此都是前列腺腺癌。在美国， 前列腺癌症是男性中的普通恶性癌症， 仅次于肺癌。 前列腺癌主要为老年男性的肿瘤， 当扩 散时其经常响应于治疗， 且当局部化时可被治愈。估计 17％的男性将在一生中被诊断出前 列腺癌。该肿瘤通常作为小的、 界限清楚的病变发生， 且可经常作为多发性原发肿瘤存在 (Villers 等人 .1992)。进展在局部和远端都发生， 通常达到精囊、 射精管和骨盆淋巴结， 在 更晚期达到骨、 肝和肺。一旦转移发生， 癌细胞增殖的速率加快。
     包含可溶 FGF 受体和抗 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物对肿瘤响应的作用可 在小鼠模型中评估， 有可用的前列腺癌小鼠模型 (Ahmad 等人综述， Expert Rev Mol Med， 10 ： e16(2008))， 在实施例 12 中有提供。
     b. 黑素瘤
     浅表性播散性黑素瘤是最普通类型的黑素瘤。约十分之七 (70％ ) 为该类型。它 们最经常发生于中年人。 最通常的位置为女性的腿上， 而男性中其更通常在躯干上， 特别是 背部。它们开始时往往穿过皮肤表面扩散， 这被称为放射生长期。如果在该阶段去除黑素瘤， 治愈的几率非常高。如果不去除黑素瘤， 其将开始向下更深地生长进入皮肤层。然后它 就有在血流或淋巴系统中扩散至身体其它部分的风险。 结节性黑素瘤最通常在胸或背上发 生。其最通常发现于中年人。如果不去除， 其容易很快地生长进入皮肤深处。该类型的黑 素瘤经常从皮肤表面凸起， 触觉像肿块。可为极深褐 - 黑色或黑色。恶性雀斑样黑素瘤最 经常存在于脸上， 特别是老年人。其生长缓慢， 发展可历时数年。肢端黑素瘤通常存在于 手掌， 足底或趾甲周围。其它的极少见类型的皮肤黑素瘤包括无黑色素性黑素瘤 ( 其中黑 素瘤失去其色素且呈现白色区域 ) 和结缔组织增生性黑素瘤 ( 其包括纤维疤组织 )。恶性 黑素瘤可从皮肤之外的身体部分发生， 但这非常少见。可能受影响的身体部分为眼、 口、 指 ( 趾 ) 甲下 ( 称为甲下黑素瘤 )、 外阴或阴道组织， 或身体内部。
     大多数黑素瘤首先是正常皮肤外观的变化。这可看起来像异常的新痣。少于三分 之一在现有的痣中发生。可能难以认出痣和黑素瘤的差异， 但可使用以下清单辅助。其已 知为 ABCD 清单。不对称性 - 普通的痣通常形状对称。黑素瘤很可能为不规则的或不对称 的。 边界 - 痣通常具有界限清晰的规则边界。 黑素瘤更可能具有锯齿状边缘的不规则边界。 颜色 - 痣通常为均匀棕色的。黑素瘤倾向于具有多于一种颜色。它们可以有不同的色调， 棕色混合有黑、 红、 粉、 白色或淡蓝色。直径 - 痣通常不大于铅笔的平端 ( 径向约 6mm)。黑 素瘤通常直径大于 7mm。通常痣可从皮肤凸起和 / 或可有毛。搔痒、 结痂或出血也可发生 于黑素瘤 - 这些是较少出现的迹象但不应忽视 (cancerbacup 互联网网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于 下列文献中所述的的鼠黑素瘤模型中评估 Hermans 等人， Cancer Res.63 ： 8408-13， 2003 ； Ramont 等 人， Exp.Cell.Res.29 ： 1-10， 2003 ； Safwat 等 人， J.Exp.Ther.Oncol.3 ： 161-8， 2003 ； 和 Fidler， Nat New Biol.242 ： 148-9， 1973。
     c. 肾细胞癌
     肾细胞癌为涉及肾小管细胞中的癌性变化的肾癌形式， 其为成人肾癌的最普遍形 式。细胞为什么会变为癌性还未知。吸烟史极大增加发生肾细胞癌的风险。一些人也可 能自遗传获得了发生肾细胞癌的增加的风险， 且家族肾癌病史增加该风险。患有希普尔病 ( 一种影响脑毛细血管的遗传疾病 ) 的人， 通常也发生肾细胞癌。 需要透析治疗的肾疾病也 增加发生肾细胞癌的风险。最初症状通常为尿血。有时两个肾都受累。该癌症容易转移或 扩散， 最经常转移或扩散至肺和其它器官， 且约三分之一的患者在诊断时已转移 (Medline Plus Medical Encyclopedia 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白 的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠肾细胞癌模型中 评估 ： Sayers 等人， Cancer Res.50 ： 5414-20， 1990 ； Salup 等人， Immunol.138 ： 641-7， 1987 ； 和 Luan 等人， Transplatation 73 ： 1565-72， 2002。
     d. 子宫颈癌
     子宫颈为通向阴道的子宫的颈部。 子宫颈癌， 也称为宫颈癌， 发生自子宫颈表面的 异常细胞。 子宫颈癌是影响女性的最常见癌症之一。 在子宫颈癌发生之前通常有发育异常， 子宫颈表面细胞的癌前变化。 这些异常细胞可发展为浸润性癌症。 一旦该癌症出现， 其可经 由四个阶段进展。这些阶段是根据癌症扩散的程度定义的。癌症扩散得越多， 治疗可能约 深切。 子宫颈癌有两种主要类型 ： (1) 鳞状类型 ( 表皮样癌 ) ： 这是最常见的类型， 占子宫颈 癌的约 80％至 85％。该癌症可由性传播疾病引起。一种这样的性病为人乳头状瘤病毒， 其引起尖锐湿疣。该癌症肿瘤在子宫颈上生长并进入子宫颈。该癌症通常起始于子宫颈表面 且可在早期通过巴氏涂片诊断。(2) 腺癌 ： 该类型的子宫颈癌发生于子宫颈管中的宫颈腺 的组织。早期子宫颈癌通常不引起症状。该癌症通常通过巴氏涂片和骨盆检查检测。这就 是为什么你一旦有性活动就应开始进行巴氏涂片和骨盆检查的原因。 从未有性活动的健康 年轻女性应在 18 岁之前进行首次每年的骨盆检查。晚期子宫颈癌引起异常阴道出血或在 预期外的时间 ( 如月经期之间， 性交后， 或绝经后 ) 排出血污。异常阴道排放可为混浊的或 带血的或可包含具有恶味的粘液。 癌症晚期可引起疼痛 (University of Michigan Health System 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠子宫颈癌模型中评估 ： Ahn 等人， Hum. Gene.Ther.14 ： 1389-99， 2003 ； Hussain 等人， Oncology 49 ： 237-40， 1992 ； 和 Sengupta 等 人， Oncology 48 ： 258-61， 1991。
     e. 头颈部肿瘤
     大多数头颈部癌症是称为 “癌” (carcinoma) 的类型 ( 特别是鳞状上皮细胞癌 )。 头颈部的癌起源于构成口、 鼻、 喉或耳的内层， 或覆盖舌的表面层的细胞。 然而， 头颈部癌症 可发生于其它类型的细胞。淋巴瘤发生于淋巴系统细胞。肉瘤发生于构成肌肉、 软骨或血 管的支持性细胞。黑素瘤起始于称为黑素细胞的细胞， 这类细胞给予眼和皮肤颜色。头颈 部的癌症的症状将取决于其位置 - 例如， 舌癌可引起一些语言迟钝。最通常的症状为发生 的头或颈的、 几周内不痊愈的溃疡或损伤区域 ； 吞咽困难， 或咀嚼或吞咽时疼痛 ； 呼吸或讲 话困难， 如持续性呼吸杂音， 语言迟钝或嘶哑 ； 口中麻木感觉 ； 持续鼻塞， 或鼻出血 ； 持续耳 痛， 耳鸣， 或听力困难 ； 口或颈肿胀或肿块 ； 面部或上颌疼痛 ； 在吸烟或咀嚼烟草的人群中， 癌前变化可发生于口的衬里， 或在舌上。 这些可显现为持续白斑 ( 粘膜白斑病 ) 或红斑 ( 粘 膜红斑病 )。它们通常不疼但有时会溃疡且可出血 (Cancerbacup 网站 )。包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下 列文献中所述的鼠头颈肿瘤模型中评估 ： Kuriakose 等人， Head Neck 22 ： 57-63， 2000 ； Cao 等人， Clin.Cancer Res.5 ： 1925-34， 1999 ； Hier 等人， Laryngoscope 105 ： 1077-80， 1995 ； Braakhuis 等人， Cancer Res.51 ： 211-4， 1991 ； Baker， Laryngoscope 95 ： 43-56， 1985 ； 和 Dong 等人， Cancer Gene.Ther.10 ： 96-104， 2003。
     f. 脑癌
     已知脑组织中产生的肿瘤称为脑的原发性肿瘤。 原发性脑肿瘤根据其发源的细胞 类型或其产生的脑的部位命名。最常见的原发性脑肿瘤为神经胶质瘤。它们产生于胶质细 胞。神经胶质瘤有许多类型。(1) 星形细胞瘤 - 该肿瘤产生自呈星形的胶质细胞， 称为星形 细胞。在成人中， 星形细胞瘤最经常产生自大脑。在儿童中， 它们发生于脑干、 大脑和小脑。 III 级星形细胞瘤有时称为间变性星形细胞瘤。IV 级星形细胞瘤通常称为多形性星形细胞 瘤。 (2) 脑干神经胶质瘤 - 该肿瘤发生于脑最下方的部分。 脑干神经胶质瘤最经常在幼儿和 中年成人中诊断出。 (3) 室管膜瘤 - 该肿瘤产生自脑室或脊髓中心管的衬底细胞。 它们最常 见于儿童和年轻成人。(4) 少突胶质细胞瘤 - 这种罕见的肿瘤是由生成覆盖和保护神经的 脂肪物质的细胞发生的。这些肿瘤通常发生于大脑中。它们生长缓慢且通常不扩散进入周 围脑组织。 它们在中年成人中最普遍。 脑肿瘤的症状取决于肿瘤尺寸、 类型和位置。 当肿瘤 压迫神经或损伤某一区域的脑时可引起症状。 当脑肿胀或液体在颅骨中累积时也可产生症状。这些是最常见的脑肿瘤症状 ： 头痛 ( 通常在早晨更严重 ) ； 恶心或呕吐 ； 语言、 视觉、 或 听觉的改变 ； 平衡或行走问题 ； 情绪、 个性、 或集中能力的改变 ； 记忆问题 ； 肌肉跳动或颤搐 ( 癫痫发作或惊厥 ) ； 和手臂或腿的麻木或麻刺感 (National Cancer Institute’ s 网站 )。 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作 用可在类似于下列文献中所述的神经胶质瘤动物模型中评估 ： Schueneman 等人， Cancer Res.63 ： 4009-16， 2003 ； Martinet 等 人， Eur.J.Surg.Oncol.29 ： 351-7， 2003 ； Bello 等 人， Clin.CancerRes.8 ： 3539-48， 2002 ； Ishikawa 等 人， Cancer Sci.95 ： 98-103， 2004 ； Degen 等 人， J.Neurosurg.99 ： 893-8， 2003 ； Engelhard 等 人， Neurosurgery 48 ： 616-24， 2001 ； Watanabe 等人， Neurol.Res.24 ： 485-90， 2002 ； 和 Lumniczky 等人， Cancer Gene Ther.9 ： 44-52， 2002。
     g. 甲状腺癌
     乳头状和滤泡状甲状腺癌占所有甲状腺癌的 80 至 90％。这两种类型都起始于甲 状腺的滤泡细胞。大多数乳头状和滤泡状甲状腺癌倾向于生长缓慢。如果早期检出， 大多 数可成功治疗。髓样甲状腺癌占甲状腺癌病例的 5 至 10％。它在 C 细胞而非滤泡细胞中 产生。如果在甲状腺髓样癌扩散至身体其它部分之前被发现和治疗， 其易于控制。甲状腺 未分化癌为最少见的一类甲状腺癌 ( 仅占病例的 1 至 2％ )。其在滤泡细胞中发生。该癌 细胞高度异常且难以识别。该类型的癌症通常非常难以控制， 因为癌细胞倾向于非常快速 生长和扩散。早期甲状腺癌经常不产生症状。但随着癌症生长， 症状可包括 ： 出现在颈前 部接近喉结的团块或结节 ； 声嘶或正常声音讲话困难 ； 淋巴结肿胀， 尤其在颈部 ； 吞咽或呼 吸困难 ； 或咽喉或颈疼痛 (National Cancer Institute 的网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可 溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下述文 献的小鼠或大鼠甲状腺肿瘤模型中评估 ： Quidville 等人， Endocrinology 145 ： 2561-71， 2004( 小鼠模型 ) ； Cranston 等人， Cancer Res.63 ： 4777-80， 2003( 小鼠模型 ) ； Zhang 等 人， Clin Endocrinol(Oxf).52 ： 687-94， 2000( 大鼠模型 ) ； 和 Zhang 等人， Endocrinology 140 ： 2152-8， 1999( 大鼠模型 )。
     h. 肝癌
     有两种不同类型的原发性肝癌。最通常的种类称为肝癌或肝细胞癌 (HCC)， 源 自肝的主要细胞 ( 肝细胞 )。该类型通常限于肝， 尽管偶尔其延伸至其它器官。其经常 发生于患有一种称为肝硬化的肝病的人中。还有一种稀有的肝癌亚型， 称为纤维板层 (Fibrolamellar) 肝癌， 其可发生于年轻人中且与之前的肝疾病不相关。 另一类型的原发性 肝癌称为胆管癌或胆管癌症， 因为其起始于胆管衬底的细胞。大多数患有肝癌的人还通常 具有称为肝硬化的肝病。 肝硬化是由于多种原因， 包括感染和长期大量饮酒， 而在整个肝中 发生的细小的瘢痕形成。然而， 仅有小比例的肝硬化的人产生原发性肝癌。感染乙型肝炎 或丙型肝炎病毒可导致肝癌， 且也可为肝硬化的原因， 这增加产生肝癌的风险。 患有稀有症 状称为血色病 ( 其引起体内铁的过量沉积 ) 的人， 具有更高的发生肝癌的几率。因此， 本发 明的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可用于治疗 肝细胞癌、 预防肝细胞癌、 抑制肝细胞癌进展， 延迟肝细胞癌发生， 和 / 或减少与肝细胞癌 相关的至少一种症候或症状严重性或抑制与肝细胞癌相关的至少一种症候或症状。 肝细胞 癌可与肝炎 ( 例如， 甲型肝炎， 乙型肝炎， 丙型肝炎和丁型肝炎 ) 感染相关或不相关。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响 应的作用可在肝细胞癌转基因小鼠模型中评估， 其包括单独的转化生长因子 -α(TFG-α) 的过表达 (Jhappan 等人， Cell， 61 ： 1137-1146， 1990 ； Sandgren 等人， Mol.Cell.Biol.， 13 ： 320-330， 1993 ； Sandgren 等 人， Oncogene 4 ： 715-724， 1989 ； 和 Lee 等 人， CancerRes.52 ： 5162 ： 5170， 1992) 或 其 与 c-myc(Murakami 等 人， Cancer Res.， 53 ： 1719-1723， 1993)， 突 变 的 H-ras(Saitoh 等 人， Oncogene 5 ： 1195-2000， 1990)， 编 码 HbsAg 和 HBx 的 乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 (Toshkov 等 人， Hepatology 20 ： 1162-1172， 1994 ； Koike 等 人， Hepatology 19 ： 810-819， 1994)， SV40 大 T 抗 原 (Sepulveda 等 人， Cancer Res.49 ： 6108-6117， 1989 ； Schirmacher 等人， Am.J.Pathol.， 139 ： 231-241， 1991) 和 FGF19(Nicholes 等人， American Journal of Pathology， 160 ： 2295-2307， 2002) 的组合的过表达。
     i. 肺癌
     包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤 响应的作用可在人小细胞肺癌 / 非小细胞肺癌异种移植模型中评估。简言之， 将人肿瘤 移植至免疫缺陷小鼠， 然后用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白单独治疗或与其它可用于通过评估肿瘤生长证实治疗的功效的药物组合治 疗这些小鼠 (Nemati 等人， Clin Cancer Res.6 ： 2075-86， 2000 ； 和 Hu 等人， Clin.Cancer Res.10 ： 7662-70， 2004)。
     2. 实体瘤的终点和抗肿瘤活性
     尽管各种规程对肿瘤响应评估可能有不同的定义， 但 RECIST( 实体瘤的响应评 价标准 ) 标准目前被认为是国立癌症研究所用于评估肿瘤响应的推荐的指导方针 ( 参见 Therasse 等人， J.Natl.Cancer Inst.92 ： 205-216， 2000)。根据 RECIST 标准， 肿瘤响应是 指减少或消除所有可测的病变或转移。 在以下条件下， 疾病通常认为是可测量的 ： 疾病包含 可在至少一个维度上可以被准确测量为≥ 20mm( 用常规技术 ) 或≥ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的损伤， 且通过医学照相或 X- 射线、 计算机轴断层摄影术 (CT)、 磁共振成像 (MRI) 或临床检 测 ( 如果损伤是表面的 ) 可见具有清楚限定的边界。不可测量的疾病是指以下疾病， 其由 ＜ 20mm( 用常规技术 ) 或＜ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的病变， 和确实不可测的病变 ( 太小而 不能准确测量 ) 构成。不可测量的疾病包括胸腔积液， 腹水， 和间接证据证明的疾病。
     规程需要目标状态的标准以评估实体瘤响应。代表性的标准包括以下 ： (1) 完全 响应 (CR)， 定义为所有可测量的疾病的完全消失 ； 无新的病变 ； 无疾病相关的症状 ； 无不可 测量的疾病的证据 ； (2) 部分响应 (PR)， 定义为靶病变的最长直径的总和降低 30％ ； (3) 进 行性疾病 (PD)， 定义为靶病变的最长直径的总和增加 20％或出现任何新病变 ； (4) 稳定或 无响应， 定义为未达到 CR、 PR、 或进行性疾病的标准者。( 参见 Therasse 等人， 上文 )。
     其他在肿瘤学领域中公认的终点包括总存活 (OS)， 无疾病存活 (D6FS)， 目标应答 率 (ORR)， 进展前时间 (TTP)， 和无进展存活 (PFS)( 参见 Guidance for Industry ： Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics， 2005 年 4 月， Center for Drug Evaluation and Research， FDA， Rockville， MD)。
     3. 组合癌症疗法
     如上讨论的， 在某些实施方案中， 将双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合与 治疗新生血管疾病的第二药剂组合使用。当用于治疗癌症时， 本发明的拮抗剂可用于与常规癌症治疗组合使用， 常规癌症治疗例如， 外科手术， 放疗， 化疗， 或其组合。 在某些方面， 其 它可用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行 组合癌症治疗的治疗剂包括其它抗血管发生剂。在一些其它方面， 其它用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行组合治疗的治疗剂包括针 对肿瘤生长中涉及的其它因素的拮抗剂， 所述的其它因素例如， EGFR， ErbB2(Her2)， ErbB3， ErbB4， 或 TNF。在一些方面， 将包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白与细胞因子 ( 例如， 刺激对肿瘤的免疫应答的细胞因子 ) 共同施用。特别适 合用于治疗癌症的示例性组合治疗在以下更详细描述。
     a. 靶向肿瘤相关的抗原的抗体与包含双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白的双特 异性结合蛋白的组合
     抗体疗法在癌症治疗中已获得了特别的成功， 因为某些肿瘤显示唯一的抗原、 种 系特异性抗原、 或相对于正常细胞而言过量存在的抗原。与单克隆抗体治疗的抗肿瘤活性 相关的一种机理是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)。 在 ADCC 中， 单克隆抗体结合至靶细胞 ( 例 如， 癌细胞 )， 而表达所述单克隆抗体的受体的特异性效应细胞 ( 例如， NK 细胞， 单核细胞， 粒细胞 ) 结合至该单克隆抗体 / 靶细胞复合物， 导致靶细胞死亡。在本发明的某些变化形 式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白与针对肿瘤 相关的抗原的单克隆抗体共同施用。 单抗的剂量和时程基于所共同施用的特定抗体的药代 动力学和毒物代谢动力学特性， 且应优化这些效果， 同时最小化可与施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白相关的任何毒性。
     当第一线治疗 (first line treatment) 失败时， 可指示需要与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和对肿瘤 - 相关的抗原的单克隆抗体 的组合治疗， 并可考虑将该组合治疗作为第二线治疗。本发明还提供， 对于新确诊的、 先前 未用抗癌剂治疗的患者群体 (“新患者” )， 和先前未接受任何单克隆抗体治疗的患者 (“首 次治疗患者” )， 使用该组合作为第一线治疗。
     双特异性结合蛋白也可用于在不存在任何直接的抗体介导的肿瘤细胞的 ADCC 情 况下与针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体组合治疗。例如， 在免疫系统中阻断抑制信号的抗 体可导致增强的免疫应答。实例包括 (1) 抗具有抑制功能的 B7R 家族的分子， 如， 细胞毒性 T 淋巴细胞 - 相关的抗原 4(CTLA-4)， 程序死亡 -1(PD-1)， B 和 T 淋巴细胞弱化子 (BTLA) 的 抗体 ； (2) 抗抑制性细胞因子如 IL-10、 TGFβ 的抗体 ； 和 (3) 消减或抑制遏制性细胞的功能 的抗体如抗 CD25 或 CTLA-4。 例如， 认为抗 CTLA4 单抗在小鼠和人中都抑制免疫抑制调节性 T 细胞 (Tregs) 的功能或抑制通过 T 细胞上 CTLA-4 与 APC 或肿瘤细胞上的 B7-1 或 B7-2 分 子的结合传递的抑制信号。
     表 8 是一些已经得到批准或正在接受测试的单克隆抗体的非排他性列表， 这些单 克隆抗体与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组 合治疗是可能的。
     表8： 用于与 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白组合使用的单克隆抗 体疗法
    49102448984 A CN 102449007 靶 TRAIL-R1 TRAIL-R2 CD40 HER2
     靶 EGF-R EGF-R EGF-R EGF-R α5β3 整联蛋白 CD152 CD49e MUC18(TIM- 状 ) TAG-72 粘蛋白 CD3 CD64(FcGR1) CEA EpCAM Lewis-Y-Ag
     药物名称 ABX-EGF EMD72000 MDX-214 爱必妥 (Erbitux) Vitaxin CTLA-4 整联蛋白 α5 ABX-MA1 Anatumomab Ecromeximab AntiCD64 CEA-Cide Panorex SGN15 药物名称 HGS-ETR1 HGS-ETR2 SGN40 赫赛汀说明书公司 HGS HGS46/82 页临床适应证 癌症 实体瘤 MM 乳腺癌Seattle Genetics Genentech临床适应证 CRC， NSCLC， RCC 实体瘤 EGF-R- 阳性肿瘤 CRC 银屑病， 前列腺癌 癌症 癌症 黑素瘤 癌症 黑素瘤 癌症 癌症 结肠直肠癌 癌症公司 Abgenix Merck Medarex Imclone AME/Lilly Medarex Protein Design LabsKyowa Hakko Medarex Immunomedics Centocor Seattle Geneticsb. 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白
     在一些实施方案中， 包含如本文所述的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合 蛋白的双特异性结合蛋白与酪氨酸激酶抑制剂组合使用。酪氨酸激酶是催化 γ 磷酸基团 从三磷酸腺苷转移至靶蛋白的酶。 酪氨酸激酶可分类为受体蛋白酪氨酸激酶和非受体蛋白 酪氨酸激酶。 它们在多种正常细胞过程中起关键作用， 包括通过生长受体的活化， 且影响多种细胞类型的增殖、 存活和生长。此外， 认为它们促进肿瘤细胞增殖， 诱导抗凋亡作用且促 进血管发生和转移。除了通过生长因子的活化， 通过体细胞突变的蛋白质激酶活化是肿瘤 发生的一种普遍机理。一些已鉴定的突变在 B-Raf 激酶， FLt3 激酶， BCR-ABL 激酶， c-KIT 激酶， 表皮生长因子 (EGFR) 和 PDGFR 途径中发生。Her2、 VEGFR 和 c-Met 是其他在癌症进 展和肿瘤发生涉及的重要的受体酪氨酸激酶 (RTK) 途径。因为大量细胞进程是由酪氨酸激 酶引发的， 它们已被确认为抑制剂的关键靶标。
     酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 是在细胞中起作用的小分子， 与三磷酸腺苷 (ATP) 竞争 对受体和非受体酪氨酸激酶两者的催化性酪氨酸激酶域的结合。 该竞争性结合阻断下游信 号传递的引发， 所述下游信号传递导致与这些信号事件相关的效应作用如生长、 存活和血 管发生。使用结构和计算手段， 从众多医药化学组合库鉴定出了大量抑制酪氨酸激酶的化 合物。
     认为大多数 TKI 通过直接抑制肿瘤细胞或通过抑制血管发生而抑制肿瘤生长。而 且， 某些 TKI， 包括索拉非尼和舒尼替尼， 通过 VEGF 家族受体影响信号传导。 在一些情况下， 已显示 TKI 可活化树突状细胞和其它天然免疫细胞， 如 NK 细胞的功能。这最近在动物模型 中对于伊马替尼进行了报道。伊马替尼是一种已被证明通过树突状细胞和 NK 细胞而增强 杀伤活性的 TKI( 综述参见 Smyth 等人， NEJM 354 ： 2282， 2006)。
     BAY 43-9006( 索 拉 非 尼， Nexavar ) 和 SU11248( 舒 尼 替 尼， Sutent ) 是 两 种 这 样 的 TKI， 它 们 最 近 获 准 用 于 转 移 性 肾 细 胞 癌 (RCC)。 许 多 其 它 TKI 处 于 晚 期 和 早 期 开 发 之 中， 用 于 治 疗 不 同 类 型 的 癌 症。 其 它 TKIs 包 括， 但不限于 ： 甲磺酸 伊 马 替 尼 (Gleevec Novartis) ； 吉 非 替 尼 (Iressa AstraZeneca) ； 埃罗替尼 盐 酸 盐 (Tarceva Genentech) ； 凡 德 他 尼 (Zactima AstraZeneca)，替 吡 法 尼 (Zarnestra Janssen-Cilag) ； 达 沙 替 尼 (Sprycel Bristol Myers Squibb) ； 洛那 法尼 (Sarasar Schering Plough) ； 瓦他拉尼琥珀酸盐 (Novartis， Schering AG) ； 拉 帕替尼 (Tykerb GlaxoSmithKline) ； 尼洛替尼 (Novartis) ； 来他替尼 (Cephalon) ； 帕 唑帕尼盐酸盐 (GlaxoSmithKline) ； 阿西替尼 (Pfizer) ； 卡奈替尼二盐酸盐 (Pfizer) ； 培 利 替 尼 (National Cancer Institute， Wyeth) ； 坦 度 替 尼 (Millennium) ； 博舒替 尼 (Wyeth) ； 司 马 沙 尼 (Sugen， Taiho) ； AZD-2171(AstraZeneca) ； VX-680(Merck， Vertex) ； EXEL-0999(Exelixis) ； ARRY-142886(Array BioPharma ，AstraZeneca) ； PD-0325901(Pfizer) ； AMG-706(Amgen) ； BIBF-1120(Boehringer Ingelheim) ； SU-6668(Taiho) ； CP-547632(OSI) ； (AEE-788(Novartis) ； BMS-582664(Bristol-Myers Squibb) ； JNK-401(Celgene) ； R-788(Rigel) ； AZD-1152HQPA(AstraZeneca) ； NM-3(Genzyme Oncology) ； CP-868596(Pfizer) ； BMS-599626(Bristol-Myers Squibb) ； PTC-299(PTC Therapeutics) ； ABT-869(Abbott) ； EXEL-2880(Exelixis) ； AG-024322(Pfizer) ； XL-820(Exelixis) ； OSI-930(OSI) ； XL-184(Exelixis) ； KRN-951(Kirin Brewery) ； CP-724714(OSI) ； E-7080(Eisai) ； HKI-272(Wyeth) ； CHIR-258(Chiron) ； ZK-304709(Schering A G) ； EXEL-7647(Exelixis) ； BAY-57-9352(Bayer) ； BIBW-2992(Boehringer Ingelheim) ； AV-412(AVEO) ； YN-968D1(Advenchen Laboratories) ；米 哚 妥 林 (Novartis) ；哌 立 福 辛 (AEterna Zentaris， Keryx， National Cancer Institute) ； AG-024322(Pfizer) ； AZD-1152(AstraZeneca) ；ON-01910Na(Onconova) ； 和 AZD-0530(AstraZeneca)。
     c. 化学治疗组合
     在某些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体的双特异性结合蛋白与一种 或多种化学治疗剂组合施用。化疗剂具有不同的作用方式， 例如， 通过影响 DNA 或 RNA 和 干扰细胞周期复制。以 DNA 水平或 RNA 水平作用化学治疗剂的实例为抗代谢物 ( 如硫唑 嘌呤， 阿糖胞苷， 磷酸氟达拉滨， 氟达拉滨， 吉西他滨， 阿糖胞苷， 克拉屈滨， 卡培他滨 6- 疏 基嘌呤， 6- 硫鸟嘌呤， 甲氨蝶呤， 5- 氟尿嘧啶和羟基脲 ) ； 烷化剂 ( 如美法仑， 白消安， 顺铂， 卡铂， 环磷酰胺， 异环磷酰胺， 达卡巴嗪， 丙卡巴肼， 苯丁酸氮芥， 塞替派， 洛莫司汀， 替莫唑 胺)； 抗有丝分裂剂 ( 如长春瑞滨， 长春新碱， 长春碱， 多西紫杉醇， 紫杉醇 ) ； 拓扑异构酶 抑制剂 ( 如多柔比星， 安吖啶， 伊立替康， 柔红霉素， 表柔比星， 丝裂霉素， 米托蒽醌， 伊达比 星， 替尼泊苷， 依托泊苷， 拓扑替康 ) ； 抗生素 ( 如放线菌素和博来霉素 ) ； 门冬酰胺酶 ； 蒽环 类抗生素或紫杉烷。
     d. 放射治疗组合
     在一些变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与放射治疗组合施用。某些肿瘤可用放射或放射性药物治疗。放射治疗通常用 于治疗不能切除的或不能手术的肿瘤和 / 或肿瘤转移物。放射治疗通常以三种方式递送。 外束放射在人体一定的距离之外给予， 包括 γ 射线 (60Co) 和 X- 射线。近程放疗使用与靶 137 192 组织一起或与靶组织接触的放射源， 例如 60Co， Cs， Ir， 或 125I。
     e. 激素药组合
     在一些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与激素或抗激素组合施用。 某些癌症与激素依赖相关， 包括， 例如， 卵巢癌， 乳腺 癌和前列腺癌。激素依赖性癌症的治疗可包括使用抗雄激素或抗雌激素化合物。用于癌症 治疗的激素和抗激素包括磷酸雌莫司汀， 磷酸聚雌二醇， 雌二醇， 阿那曲唑， 依西美坦， 来曲 唑， 他莫昔芬， 乙酸甲地孕酮， 醋酸甲羟孕酮， 奥曲肽， 乙酸环丙孕酮， 比卡鲁胺， 氟他胺， 曲 普瑞林， 亮丙瑞林， 布舍瑞林和戈舍瑞林。
     本发明进一步通过以下非限制性实例阐述。
     实施例 1 ： 筛选结合 VEGF-A 的抗体
     通 过 筛 选 Dyax Fab 310 噬 菌 体 文 库 (Dyax Corp.， Cambridge， MA) 来 鉴 别 结 合 VEGF-A 的抗体。选定的噬菌体 - 抗体文库选择和筛选方法使用抗原 (VEGF-A165， R&D Systems) 包被的聚苯乙烯免疫管 (NUNC， Denmark)。通过在少数轮的选择后增加严格性而 分离抗体。第一代抗体为 Fab 形式。通过 MluI(#R0198S， New England Biolabs， Beverly， MA) 酶消化产生可溶 Fab 抗体以去除 M13 噬菌体中的 geneIII 残株 (stump)。对 scFv 形式 的抗体使用了相同的选择、 筛选和裂解策略。
     实施例 2 ： 鉴别 VEGF-A 结合性 Fab 克隆
     通过基于平板的结合测定 (plate based binding assay) 来鉴别结合 VEGF-A 的 Fab 克隆。Costar(#9018)96- 孔板用 50μl VEGF-A(R&D Systems) 或 PDGF-D(SEQ ID NO ： 80) 同二聚体 (0.6μg/ml 在 0.1M NaHCO3， pH 9.6 中 )4 ℃包被过夜。第二天， 用 0.1 ％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。 各孔加入 100μl 2％牛乳 (#170-6404， Bio-Rad)/PBST， 室温封闭 1 小时。然后用 PBST 洗涤测试板三次。各孔加入 25ul 2％牛乳 /PBST， 然后添加25ul Fab 上清液。然后混合各孔， 在室温孵育 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。对于 Fab 检 测， 将 2％牛乳 /PBST 中的 50ul(1 ∶ 4000) 抗人 Fab 特异的 pAb-HRP(#31482， Pierce) 添 加至各孔， 室温保持 1 小时。然后用 PBST 洗涤板三次。将 50ul TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔， 显色 15 分钟， 然后添加 50ul 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以终止该反应。然后将平板在板读数器上以 450nm 读数。
     实施例 3 ： 将 VEGF-A 结合性 sFab 转化为 scFv
     对于一个第 2 轮， A 臂和 B 臂 VEGF-A 筛选的 Fab Dyax 噬菌体 DNA 池， 通过一套 3 步骤程序使用对各亚型的框架序列的引物扩增 λ、 κ 和重链可变区。第一轮 PCR 扩增各可 变框架区且添加合适的突出端以促进第 2 轮 PCR 反应。 第 2 轮 PCR 反应向正确的第 1 轮 PCR 产物的末端添加合适的 gly/ser 接头序列， 第 3 轮 PCR 反应将可变轻链 λ、 可变轻链 κ、 和 可变重链产物重叠以产生 LH 和 HL 两种取向的 scFv 产物， 然后其克隆至经 ApaLI/NotI- 消 化的 PIMD21 噬菌体展示载体。
     实施例 4 ： 抑制 VEGF 与 sVEGFR2 的结合的 sFab 和 scFv 的鉴别
     通过基于平板的中和测定筛选 VEGF-A Fab 和 scFv 克隆。 将 Costar(#9018)96- 孔 板用 100μl 抗人 IgG Fcγ- 特异抗体 (#109-005-098， Jackson Immunology)(1μg/ml， 在 0.1M NaHCO3 中， pH 9.6) 在 4℃包被过夜。第二天， 用 400ul 0.1％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。各孔加入 100μl 1％ BSA(#A3059-100G， ∑ )/PBST， 在室温 (RT) 阻断 1 小时。 用 PBST 洗涤板三次。将 100μl VEGFR2-Fc(SEQ ID NO ： 81)( 以 0.2μg/ml， 在 1 ％ BSA/ PBST 中 ) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。同时， 在一块单独的 96 孔板 (Costar 3357) 中， 将 65μl Fab 或 scFv 上清液添加至 65μl 生物素化 VEGF-A( 在 1％ BSA/PBST 中， 20ng/ml) 中， 在室温保持 1 小时。将经封闭的测定平板用 PBST 洗涤三次。各孔加入 100μl 上清液 / 生物素化 VEGF-A 复合物， 在室温保持 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。将 100μl 1％ BSA/ PBST 中的 (1 ∶ 4000) 链亲和素 -HRP(#21124， Pierce) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。然 后用 PBST 洗涤板三次。将 100μl TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔 以显色 20 分钟， 然后添加 100μl 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以停 止反应。然后将板以 450nm 在板读数器上读数。
     实施例 5 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的 相互作用的解离速率常数
     对人 VEGF-A 拮抗剂评估其与人 VEGF-A 的结合亲和力。
     VEGF-A 根据其解离速率常数使用表面等离子共振。通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的解离速率常数。解离速率常数 (kd(s-1)) 是反映该 复合物稳定性的值。其与浓度不相关， 因此适合用于筛选和评定未知浓度的样品。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结合亲和力。在 TM Biacore T-100 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合动力学和亲和力研究。 使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程方法。使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 将人 VEGF-A 共价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到约 200RU 的密度。将 VEGF-A 仅固定至活性流动 室 (active flow cell)。固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室上的剩余活性位点。用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。活化参照室， 然后用乙醇胺封闭。
     将 VEGF-A 拮抗剂上清液 ( 选自 Dyax 噬菌体文库筛选 ) 在流动缓冲液中 1 ∶ 3 稀释， 注射在表面上， 容许其特异结合至传感器芯片上的 VEGF-A， 结合时间为 5 分钟， 离解时 间为 5 分钟。双重注射 100nM VEGFR-2-Fc5 和 100nM 抗 VEGF-A 单克隆抗体 (AvastinTM， Genentech) 用作阳性对照。使用 30ul/min 的流速进行动力结合研究。所有结合实验在 25℃于 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的流动缓冲液中进行。还进行缓冲液注射以允许减少仪器干扰和误差。在循环之 间， 流动室用 10mM 甘氨酸， pH 1.5 洗涤以从表面去除结合的 VEGF-A 拮抗剂。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射进行处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个系列的注射中提供了一 致的结合表面。因为 VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 所得结合曲线与计算解离速率常数 (kd(s-1)) 的 1 ∶ 1 解离结合模型完全拟合。
     结果 ： 测定 VEGF-A 拮抗剂对人 VEGF-A 的解离速率分析。 所得结合曲线与 1 ∶ 1 解 离模型良好吻合。VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 因此仅报道解离速率常数 (kd(s-1))， 因 为 kd 与浓度不相关。计算的解离速率常数从最慢至最快排列。在这些测试条件下， VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用显示大范围的解离速率常数 (1.E-5-2.E-2(s-1))( 参见表 5)。为了比较， VEGFR-2-Fc5-VEGF-A 相互作用的 kd 为约 2.E-4s-1， 抗 VEGF-A 单克隆抗体 AvastinTM Fab-VEGF-A 相互作用为约 8.E-5s-1。
     表5： VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A scFvs 和对照物的相互作用的解离速率常数
    实施例 6 ： 衍生自大肠杆菌周质级分的蛋白质的纯化
     在大肠杆菌细胞的周质空间中表达了 scFv、 串联 scFv 和 sFab 蛋白质。 发酵规模从 25mL 摇瓶培养到 2L 分批补料的系统不等。 大肠杆菌细胞使用离心机旋转沉降为离心沉淀。 以每克湿细胞重量 2mL 的比例将湿细胞离心沉淀完全重悬浮于周质缓冲液 [0.2M Tris， 20％ (w/v) 蔗糖， 完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 (Roche)pH 7.5]。 过程中可包括或不包 括溶菌酶 ( 促进细胞壁降解的酶 )。 为确定是否使用溶菌酶， 将 500uL 重悬浮的离心沉淀转 移至 Eppendorf 管， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将 悬浮液在室温孵育 5 分钟。孵育后， 通过翻转来检测溶液的粘度增加。如果溶液粘在管壁 上， 那么可能发生了过早的细胞裂解， 则在准备的溶液中不包含溶菌酶。 如果溶液不粘在管
     壁上， 则将溶菌酶包含在准备的溶液中。 如果使用溶菌酶， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将悬浮液在室温孵育 4-6 分钟。 以每克初始湿细胞离心沉 淀重量 3mL 的比例添加冰冷的水， 并将溶液孵育至少 10 分钟但不长于 30 分钟。将剩余原 生质球在室温通过离心分离以 15,000xg( 或 10,000-20,000RPM， 以更快者为准 ) 离心沉淀 至少 15 分钟， 但不长于 45 分钟。将包含周质级分的上清液倒入新容器且使用称出的固体 调节至 25mM 咪唑， 500mMNaCl。 该溶液通过 0.22um 滤器过滤， 然后使用瓶顶滤器 (Nalgene) 纯化。
     固定的金属亲和色谱 (IMAC) 捕获
     常规上， 将 5mL HisTrap HP 柱 (GE Healthcare) 用于 IMAC 步骤， 然而， 柱的尺 寸可以按比例放大或缩小， 取决于通过分析 IMAC-SEC 测定法测得的周质部分中的 scFv 靶物的量。已显示该 IMAC 树脂的结合能力至少为 20mg/mL 填充床。如果使用尺寸大于 10mL 的柱， 优选内径为 2 和 5cm 的 Waters 玻璃柱 (Millipore)。使用合适的色谱工作站 (Akta Explorer， 使用 UNICORN 软件 4.1 和更高版本 [GE Healthcare]， 或 BioCAD Sprint， 700E， 或 Vision， 使用 Perfusion Chromatography 软件， 版本 3.00 或更高版本 [Applied Biosystems])， 将 IMAC 柱在 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 25mM 咪唑 pH 7.5 中平衡， 且周质级分 以不快于 190cm/hr 上柱直到耗尽。用平衡缓冲液洗涤柱子直到在不超过 190cm/hr 的流速 下在 UV A254nm 和 UV A280nm 的监测基线稳定至少 2 个 CV。使用 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 400mM 咪唑， pH 7.5 以不快于 190cm/hr 竞争性洗脱结合的蛋白。 洗脱级分通过 UV@A280nm、 分析型大小排阻色谱、 和 SDS-PAGE 评估蛋白质含量。
     其它色谱技术
     通过 SDS-PAGE 凝胶和分析型大小排阻色谱 (SEC) 评估 IMAC 池 (pool) 的纯度。 如 果该池不适合通过 SEC 最终提纯， 则使用其它色谱技术以进一步纯化靶 scFv 蛋白质以去除 残余宿主细胞污染物和聚集体。这些常规技术包括阴离子交换、 阳离子交换和疏水相互作 用。也使用其它基于亲和力的方法， 包括， 但不限于使用 c- 端 myc 标签， 借助抗 myc 树脂或 使用共价偶合至刚性珠子的合适的配体的配体亲和力方法。 这些其它技术的用处依具体的 蛋白质而定。
     大小排阻色谱法 (SEC)
     通过 UV@A280nm 和分析型 SEC 方法评估的蛋白质的量确定了所用的凝胶过滤柱 的尺寸 ： ＜ 1mg ＝ 10/300Superdex 200GL 柱， 1-10mg ＝ 16/60Superdex 200， ＞ 10mg ＝ 26/60Superdex 200( 均获自 GE Healthcare)。 IMAC 洗脱池使用 10kD MWCO Ultracel 离心 浓缩机 (Millipore) 浓缩， 且最终浓缩物体积不大于使用的凝胶过滤柱的体积的 3％。将 浓缩物注射入柱， 等度洗脱蛋白质， 流速不超过 76cm/hr 且不慢于 34cm/hr。通过 SDS-PAGE 分析洗脱级分， 制成合适的池。
     内毒素去除
     关于内毒素水平的最终产物规格依据一个特定群集的状态来确定。使用 10kD MWCO Ultracel 离心浓缩机 (Millipore) 将 SEC 池浓缩至＞ 0.25mg/mL( 通过 UV@A280nm 测定 )。Mustang E 0.22um 滤器 (PALL) 用 SEC 流动相缓冲液预润湿， 通过手动注射递送系 统将 SEC 浓缩物通过该滤器过滤， 流速为～ 1mL/min。使用 PTS EndoSafe 系统 (Charles River) 测试最终过滤产物的内毒素， UV@A280nm 浓度， 等分储存。实施例 7 ： 利用 293/KDR/KZ136/c22VEGF-A- 诱导的基于细胞的荧光素酶测定法鉴 别中和性抗人 VEGF scFv
     为筛选候选分子 (scFv) 中和人 VEGF-A 的活性的能力， 进行基于细胞的荧光素酶 测定法。293/KDR/KZ136/c22 细胞于 100μl 完全培养基 (DMEM， 10 ％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中以 10,000 细胞 / 孔的接种密度铺板于 96 孔不 透明白色组织培养处理板 (Costar#3917)， 在 37℃湿润的 5％ CO2 培养箱中孵育 48 小时。 48 小时后， 通过真空抽吸去除完全培养基， 用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 替换， 孵育过夜。
     第二天， 将候选 VEGF-A 中和性分子 (scFv， Fab)， 阳性对照 ( 贝伐单抗 ( 抗 VEGF-A 单克隆抗体， Genentech)， ranibizumab( 抗 VEGF-A 亲和力成熟 Fab， Genentech) 和内部制 备的贝伐单抗 Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一起在无血清培养基中以 1 ∶ 5 稀释从 200nM 连续稀释至 12pM。向这些之中， 添加等体积的 0.54nM VEGF-A165， 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 地中和分子或阳性对照。将这些在 37℃培养 60 分钟。培养后， 将培养基从 血清饥饿细胞吸出， 添加 100μl 上述复合物， 并在 37℃培养 4 小时。
     4 小时孵育后， 使用荧光素酶测定系统 (Promega， E1501) 根据制造商的说明进行 荧光素酶测定。简言之， 吸出培养基且将 25μl 1X is 缓冲液 (Promega， E153A) 添加至各 孔。将平板在室温孵育 20-30 分钟以平衡。使用微板发光计 (Berthold Technologies)、 以 40μl 的底物注射量、 1 秒的积分时间测量荧光素酶活性。使用分析软件 (Spotfire) 分析 数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     VEGF-A165 与其受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱发一个信号级联， 使驱使 荧光素酶报道基因转录的 STAT( 转录的信号转导物和活化剂 ) 和 / 或 SRE( 血清 - 响应元 素 ) 活化。荧光素酶活性的降低表明该 VEGF-A 介导的信号传递被中和。
     结果 ： 针对下表 6 所列的 scFv 在荧光素酶测试中筛选中和 VEGF- 诱导的活性。若 干被筛选的 scFvs 显示了显著抑制 ( 在表 6 中报道为 IC50 值 )。 IC50 值表示为中和 VEGF- 活 性 达 50 ％ 所 需 的 scFv 的 nM 浓 度。 贝 伐 单 抗 (AvastinTM)， LucentisTM， 和 AvastinTM Fab( 内部制备 ) 用作活性的对照。
     表6： scFvs 和对照在基于细胞的荧光素酶测定中的活性
     IC50(nM)
     AvastinTM LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 0.1-0.4 0.1-0.5 2.9-6.45 0.95 0.16-0.3 0.07实施例 8 ： 用于测定 VEGFA scFv 对人 VEGF-A- 刺激的 HUVEC 细胞的中和活性的增殖测定 为筛选对 VEGF-A 具有适中亲和力的中和 VEGF-A scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组 人 VEGF-A165 以 2.6nM 用作阳性对照。含有 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。将人 VEGF-A scFv 在 SFM 中连续稀释为 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内 皮细胞 (HUVEC) 铺板于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 该 HUVEC 细胞在 37℃， 5％ CO2 下在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中铺板 2 天。细 胞用 SFM 血清饥饿培养 24h， 用 2.6nM 在有或没有连续稀释的 VEGF-A scFv 的情况下刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H- 胸苷 ( 其掺入增殖中的细胞 ) 冲激 24h( 均在 37℃， 5％ CO2)。收 集细胞且使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 如表 7 所示的低 nM IC50 值可见， 大量在该测定中筛选的 scFvs 显示人 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖的有效中和。
     表7： HUVEC 增殖测试中的抗 VEGF-A scFv 中和活性
    
     scFvs 和对照 AvastinTM
     LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 c870e6
     0.3-0.8 14-17 1.00 0.8-2 0.7 1.6-4 IC50(nM) 0.3-0.6实施例 9 ： VEGF-A 拮抗剂的表位分拣 (Epitope Binning)
     进行表位分拣实验以测定哪种 VEGF-A 拮抗剂能同时结合至人 VEGF-A。竞争抗原 上的相同或重叠的结合位点 ( 表位 ) 的 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合， 在功能上分组到同一 家族或 “表位仓” (Epitope Bin) 中。不竞争抗原上的相同结合位点的 VEGF-A 拮抗剂能同 时结合， 被分组到不同的家族或表位仓中。 实验使用 Biacore T100TM 仪器进行。 Biacore 仅 仅是通常用于将抗体片段和单克隆抗体组 (panels) 分配至表位仓的多种测试形式中的一 种。许多文献 ( 例如， The Epitope Mapping Protocols， Methods in Molecular Biology， Volume 6， 6 Glenn E.Morris ed.) 描述了备选方法， 其可用于 “储藏” 抗体片段且预期能提 供关于 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合特征的参照数据。表位分拣实验使用可溶的天然 人 VEGF-A 作为抗原进行。材料和方法 ： 在 BIACORE T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行两 个单独的表位分拣实验。在两个实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 共 价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到密度约 800-1000RU。 固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室 上的剩余活性位点。通过用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。参照室也被活化， 然后用乙醇胺在没有 VEGF-A 拮抗剂的条件下封闭。
     在第一组实验中， 将第二 VEGF-A 拮抗剂和 VEGF-A 抗原稀释至 100nM。 注射 VEGF-A 抗原且使其特异结合于固定在传感器芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。VEGF-A 是二聚物， 因此对 每个 VEGF-A 拮抗剂而言存在两个潜在的结合位点。为保证所有结合位点被占据， 将先前固 定的第一 VEGF-A 拮抗剂注射在 VEGF-A 上。该步骤后， 注射第二 VEGF-A 拮抗剂以观察与 VEGF-A 的同时结合。
     在第二组分拣实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂再次共价固定至 BIACORECM5 传感器芯 片的单独的流动细胞。 然而， 在该实验中， 将 10nM VEGF-A 抗原与 1mM 第二 VEGF-A 拮抗剂预 混合， 然后以竞争形式注射在固定的第一 VEGF-A 拮抗剂上。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的缓 冲液中进行。还进行了缓冲液注射以减少仪器干扰和误差。在循环之间， 在每次注射循环 后通过注射 60 秒 10mM 甘氨酸 (pH 1.5， 50ul/min) 来再生俘获表面。这样做从该表面上去 除了结合的 VEGF-A。数据使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑。
     两组实验结果都由如下解释。如果第二 VEGF-A 拮抗剂不能与第一拮抗剂同时结 合至 VEGF-A 抗原， 则将其功能性归类到单一的家族或表位仓中。然而， 如果第二 VEGF-A 拮 抗剂能与第一拮抗剂同时结合至抗原 ( 通过显示芯片表面的质量增加 )， 则其归类到不同 的家族或表位仓中。 将各 VEGF-A 拮抗剂本身作为阴性对照进行测试以建立背景 ( 无结合 ) 信号水平。
     结果 ： 使用上述两组实验的结合数据， 将纯化的 VEGF-A 拮抗剂分配至表位仓中。 TM BIACORE 报道的信号 (RU， 应答单元 ) 与传感器芯片表面上的质量直接相关。一旦建立了 阴性对照相关的本底信号 (RU) 的水平 ( 相同 VEGF-A 拮抗剂用作第一和第二拮抗剂 )， 则 分拣结果报道为阳性或阴性结合。阳性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂能同时结合抗原。 阴性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合抗原。
     利用这些实验中阳性响应值和阴性响应值之间的差异将 VEGF-A 拮抗剂指配到三 个家族或表位仓中 ( 参见表 8)。第一表位仓以克隆 c636 产生的 VEGF-A 拮抗剂代表。第二 表位仓以 VEGF-A 拮抗剂 c868、 c1039 和 c1081 代表。值得注意的是， 当 c636 先与 VEGF-A 相互作用时， c868 和 c1039 都显示同时结合。当 c868 或 c1039 先与 VEGF-A 相互作用时， c636 不显示任何结合， 因此 c868 和 c1039 重叠了 c636 的表位。此外， VEGF-A 拮抗剂 c870 重叠了仓 #1 和仓 #2。第三表位仓由 VEGF-A 拮抗剂 c820 和阳性对照 VEGF-A 抗体 ( 小鼠抗 VEGF-A 单克隆抗体， R&D Systems) 代表。这些 VEGF-A 拮抗剂在所有其它 VEGF-A 拮抗剂的 存在下都显示同时结合。所有分拣实验中测试的拮抗剂都显示一定程度地中和 VEGF-A 促 分裂原活性。
     表8： 中和性 VEGF-A 拮抗剂的表位仓指配
    58102448984 A CN 102449007 表位仓 # 仓 #1 ： 仓 #2 ： 仓 #1/2 ： 仓 #3 ：
    说明书VEGF-A 拮抗剂 c636 c868， c1039， c1081 c870 c82055/82 页实施例 10 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结 合亲和力
     使用表面等离子共振评估克隆 c870 和 c1039 产生的一价人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合亲和力。 通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的亲 和力决定动力学速率常数和平衡解离常数用。 结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 是反映抗原 - 拮抗 剂复合物形成的速率的值。解离速率常数 (kd(s-1)) 为反映复合物稳定性的值。将结合速 率常数除以解离速率常数 (ka/kd) 得到平衡结合常数 (KA(M-1))。用解离速率常数除以结 合速率常数 (kd/ka) 得到平衡解离常数 (KD(M))。该值描述了相互作用的结合亲和力。KD 相同的相互作用可具有广泛变化的结合和解离速率常数。因此， 同时测量 ka 和 kd 有助于更 独特地描述相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量克隆 c870 和 c1039 产生的纯化的 VEGF-A 拮 抗剂的结合亲和力。在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合 动力学和亲和力研究。方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程。制备带有 His6/Myc 表位标签的 VEGF-A 拮抗剂。亲和力分析通过使用固定在 CM5 芯片上的抗 His6/ Myc 抗体俘获 VEGF-A 拮抗剂而进行。以 1 ∶ 1 摩尔比混合抗 His6 和抗 Myc 抗体， 并利用胺 偶联化学将它们共价固定至 CM5 传感器芯片， 达到为约 7500RU 的密度。 以 10ul/min 将 10nM VEGF-A 拮抗剂注射到单独的流动室上， 保持 1 分钟， 然后是 1 分钟稳定化时间。将 VEGF-A 连续的 1 ∶ 3 稀释物 (33.3nM-0.14nM) 注射在该表面上， 使之特异结合于被俘获在传感器 芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。进行每个浓度的 VEGF-A 的双重注射， 结合时间为 5 分钟， 离解 时间为 10 分钟。以 30μL/min 的流速进行动力学结合研究。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 500mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 0.1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的 缓冲液中进行。在循环之间， 用 50mM H3PO4 洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤将被俘获 的 VEGF-A 拮抗剂从固定化的抗体表面上去除， 且容许之后下一样品的结合。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个注射的顺序中提供一致的结 合表面。检查重复注射曲线的再现性。由于 VEGF-A 抗原形成二聚物， 将所得结合曲线整体 拟合于二价分析物相互作用模型。
     结果 ： 表征了两种 VEGFA 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力 ( 结果示于表 9)。 测量这 些人 VEGF-A 拮抗剂的结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 和解离速率常数 (kd(s-1))。由 ka 和 kd 值计 算 KD 和 KA。该数据与二价分析物模型良好拟合。该模型测量 ka(ka1 和 ka2) 和 kd(kd1 和 kd2) 的两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的单价动力学， 其报道于表 9。这些样品报道的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1。由 ka 和 kd 值计算出 KD 和 KA。所有三种 VEGF-A 拮抗剂显示对 VEGF-A 抗原类似的亲和力 (KD ＝ 0.7-1.0E-9M)， 且这些结果在两次独立运行 中一致。
     表9： VEGF-A 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力的表征
    实施例 11 ： 抗 VEGF-A 抗体的表位作图
     使 用 JPT VEGF-A RepliTopeTM 载 玻 片 对 克 隆 c870 和 c1039 产 生 的 单 克 隆 人 VEGF-A 抗体评价其与人 VEGF-A 的肽结合。
     材料和方法 ： 各 JPT 载玻片由一式三份如下所述的阵列组成。每个阵列的组成如 下： 连续的、 重叠的 VEGF-A 的 13aa 片段 ( 点 1-78)， 接着是连续、 重叠的 VEGF-A 的 20aa 片段 ( 点 85-115)。 此外， 各种测试抗体和小鼠和人 IgG 的对照点分布于各阵列的顶侧、 底侧和侧 面。 进行了一系列实验以测定 scFv c870 和 c1039 相对于人 VEGF-A 蛋白质的合成的直链肽 的结合能力。用 His/Myc 表位标签标记抗人 VEGF-A scFv。将 10-100μg/ml 的抗体溶液施 加至肽载玻片。然后将抗 His 和 / 或抗 Myc 抗体施加至载玻片。根据试剂盒描述的方法用 生物素化酪胺 (Tyramide) 扩增信号 (Renaissance TSATM Biotin System， PerkinElmer， #NEL700A)。结合的抗体使用链亲和素碱性磷酸酶和 DAKO Permanent Red 染料显色。
     数据使用自制显微镜载玻片扫描仪编辑， 其由 Nikon Eclipse TE2000U 倒置显微 镜， ASI MS-2000 电动台， Photometrics Cascade II 512 相机和 X-cite 120 荧光照明系统 组成。信号强度使用 MetaMorph v7.1 成像软件分析。
     结果 ： 结合肽的位置和序列示于下表 10。数字代表相对总体信号强度的肽的百分 比信号强度。
     表 10
    
    “β7 后” 区域是 VEGF 分子的肝素结合域。
     所有抗体均显示在 α2-β2 区周围有特异性结合位点。该数据表明被测抗体可分 为两类 ： 抗体 c870 优选 VEGF 的 c- 端侧， 而抗体 c1039 对蛋白质的 n- 端侧具有更强的结 合。抗体 c870 具有最少的结合肽而抗体 c1039 具有最分散的结合模式。各抗体的前两个 结合位点列于下表。
    
    
     结合等级 A2131/c1039 A2128/c870*表 1161102448984 A CN 102449007 1 2
    说明书α2-β2 α158/82 页β7 后 α2-β2实施例 12 ： 使用 VEGFR2 磷酸化测定法测试 VEGF-A 结合性 scFv 与抗鼠 VEGF-A 的 双特异性抗体的交叉反应性
     为筛选候选分子 (scFv， Fab 和双特异物 ) 中和鼠 VEGF-A 的活性的能力， 进行了 一项基于细胞的发光测定， 其测量 VEGFR2(KDR/Flk-1) 磷酸化。因为 mVEGF-A164 将与人 VEGFR2 交叉反应， 可使用基于人 VEGFR2 的报道物体系。将 293/KDR/KZ136/c22 细胞以 20,000 细胞 / 孔的密度在 100μl 完全培养基 (DMEM， 10％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠、 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中铺板于透明 96- 孔组织培养板， 且使之贴壁过夜。第二天， 通过 真空抽吸去除完全培养基， 并用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax) 替 换。将细胞温育过夜。
     第二天， 将候选的 VEGF-A 中和分子 (scFv， Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一道在 无血清培养基中以 1 ∶ 5 的稀释度从 200nM 连续稀释至 12pM。VEGFR2-Fc 用作中和的阳性 对照。向这些中添加等体积的 0.54nM 的 mVEGF-A164(493-MV-005， R&D Systems)， 以达到 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 的中和分子或阳性对照。将这些在 37℃孵育 60 分钟。
     孵育后， 通过真空抽吸从血清饥饿细胞去除培养基， 并用 100μl 上述复合物替 换。将细胞在 37℃孵育 10 分钟。孵育后， 通过真空抽吸去除培养基， 并轻柔地用 100μl 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS， Invitrogen) 洗涤细胞。通过真空抽吸去除 PBS， 将细胞在 25μl NP-40 溶解缓冲液 (Invitrogen Cat.#FNN0021) 中溶解， 该溶解缓冲液每 10mL 包含 1mM PMSF(Sigma， P-2714， 溶于 DMSO) 和 1 片 Complete Mini 片剂 (Roche， 11836153001)。 将溶解产物在 4℃在平台振荡器上孵育 20 分钟， 然后 4℃ 3000rpm 离心 10 分钟以使溶解产 物澄清。将溶解产物转移至新的 96- 孔微量滴定板上， -20℃放置直到测定。
     对于 VEGFR2 磷酸化发光测定， 根据制造商的说明使用细胞内蛋白质缓冲液试剂 盒 (Invitrogen LHB0002) 和 VEGFR2[pY1059] 抗体珠子试剂盒 (Invitrogen LHO0601)。 将 溶解产物解冻， 以 1 ∶ 5 与 80μl 测定稀释剂混合。将发光真空过滤板的孔用 200μl 工 作洗涤溶液预先润湿。以每孔 25μl 添加经稀释的珠子， 并用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 2 次。 洗涤后， 将 50μl 稀释的溶解产物和 50μl 稀释的检测抗体添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 室温 (RT) 孵育 3 小时。孵育后， 用 200μl 工作洗涤溶液洗涤珠 子 2X， 然后将 100μl 稀释的抗兔 IgG-RPE 添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 在室温孵育 30 分钟。孵育后， 将珠子用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 3X， 且重悬浮于 125μl 工作洗涤溶液。将珠子在平台振荡器上以 500rpm 重悬浮 30 秒， 用发光 -100 仪器 (BioRad) 读数。使用分析软件 (Spotfire) 分析数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     结果 ： mVEGF-A164 对人受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱导该受体的磷酸 化。该基于发光的测定将总 VEGF-R2 结合于与抗 VEGFR2 抗体缀合的、 荧光标记的珠子。利 用检测 [pY1059] 的磷酸化的第二抗体来检测有多少 VEGFR2 已被磷酸化。如下表 12 所示， 许多中和了人 VEGF-A 活性的 scFv 也在该测定抑制了小鼠 VEGF 活性。包含相同这些 scFv 的双特异性抗体也中和了小鼠 VEGF-A 活性。表 12 ： VEGF-A 特异 scFv 和双特异性抗体中和小鼠 VEGF-A 活性scFv c870 c1039 c1094 IC50(nM) 0.16 无活性 0.55实施例 13 ： 用于测定 scFvs 对小鼠 VEGFA(VEGF-A164) 刺激的 HUVEC 细胞的中和 活性的增殖测定
     为筛选中和小鼠 VEGF-A 的 scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组小鼠 VEGF-A164 以 2.6nM 用作阳性对照。含 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清 培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。scFv 分子在 SFM 中连续稀释至 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 铺板 于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 将 HUVEC 细胞在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中在 37℃， 5％ CO2 下铺板 2 天。将细胞用血清饥饿培养
    24h， 在或有或没有连续稀释的 VEGF-AscFv 的条件下用 2.6nM 刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H 胸苷脉冲 24h， 该胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 从如下表 13 所示低 nM IC50 值可见， 该测定中被筛选的多种 scFv 显示有效 地中和小鼠 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖。
     表 13 ： 通过 VEGF-A- 特异性 scFv 中和小鼠 VEGF-A 诱导的 HUVEC 增殖
     scFv c870 c1094 c1039
     IC50(nM) 0.36 2.84 无活性实施例 14 ： 构建可溶 FGFR3IIIc C-term Fc5 表达质粒以表达第一、 第二和第三细 胞外 Ig 样域或包括第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式
     生成了包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式的一系列表达构建体。这些人 FGFR3IIIc 序列 段与下游 C- 端 Fc5 序列融合。该系列中的构建体包括上述的序列区和一个点突变， 该点突 变分别在 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 262 处和 SEQ ID NO ： 10 的残基 142 处产生色氨酸残 基 ( 突变的 249 位以天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列为参照 ) 代替该位置上的丝氨酸。该突变 记录为 S249W。这些构建体通过 PCR 和同源重组使用编码上述 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段、 Fc5 片段和表达载体 pZMP31 产生。为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体指定的 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)， 产生了三个 PCR 片段且将它们一起通过酵母重组引入 pZMP31 载体。第一 片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列的 5’ 重叠， 后面是编码 S249W 点突变 的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列的 3’ 重叠。对于该片段， PCR 扩增反应 使用 5’ 寡核苷酸 zc62552((SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 起始于 SEQ ID NO ： 2 的 E36))。片段将克隆为 pZMP31， 使用 opTPA 前 导序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 1-35)。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反 向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与在 5’ 端 嵌套 Rec 序列的正向引物一起使用 )， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。
     第二片段呈现 ： 与上游人 FGFR3IIIc 序列的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的 人 FGFR3IIIc 的序列和与 Fc5 序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 389-620) 的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62556(SEQ ID NO ： 82)( 正向引物， 用于以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 sol.Rec 序列的 3’ 端的反向引 物一起使用 )。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62553(SEQ ID NO ： 6) ： ( 反向引物， 以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375。片段将具有重叠的 Fc5 序列 ) 进行， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模板。
     第三片段包含 Fc5 序列且呈现与人 FGFR3IIIc 的 5’ 重叠和与 pZMP31 载体序列的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62554(SEQ ID NO ： 7)。( 正向引物， 用 于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375)。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62555(SEQ ID NO ： 8)( 反向引物， 用于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 pZMP31 的序列 ) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1699， IL17REFc5 作 为模板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应条件如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 1 分 30 秒 ； 1 个循环， 72℃， 7 分钟。PCR 反应混合 物 1％琼脂糖凝胶上运行， 并使用 QIAquickTM 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从 凝胶提取对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 pZMP31 为哺乳动物表达载体， 其包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表 达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动 物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启动子， 增强子和复制起点， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及在酿酒酵母中的选择和复制所需的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     之前， 用 BglII 消化该质粒 pZMP31， 然后与下列上文提到过的凝胶提取的 PCR 片段 在酵母中重组。将 50μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 3μl 各个 PCR 片段插入 DNA 和约 50ng BglII 消化的 pZMP31 载体混合。将该混合物转移至 0.2cm 电穿孔小杯。使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF， 对酵母 / DNA 混合物进行电脉冲。 将 300μl 1.2M 山梨醇添加至小杯， 将酵母以 75μl 和 200μl 的等 分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。约 72 小时后， 将来自一块板的 Ura+ 酵母转化体 重悬于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062MTris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymo 裂合酶 /100ul 的 100ul Qiagen小提试剂盒缓冲液 P1。然后将该混合物在 37℃孵育约 15 分钟， 小提试剂盒的余下操作根 据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 酵母 DNA 制备物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。细胞以 1.75kV， 25μF、 400 欧姆电脉冲。电穿孔后， 添加 .5ml LB， 然后 将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼 脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择包含正确序列的一个克隆。使用可商购的试 剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明分离大规模质粒 DNA。
     使用相同的方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 其称为 MPET 构 建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)。 第一片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序 列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560((SEQ ID NO ： 11) ( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 Ig D2D3 形式。截 短的 FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 2 的 D156， Ig D2 的上游。将利用 opTPA 前导序 列克隆至 pZMP31 中的片段 ))。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 Rec 序列 的 5’ 端的正向引物一起使用 )) 进行， 且使用 clonetrackID #102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。片段使用如前文所述的相同 PCR 热循环制备， 并将该片段与上述第二和第三片段一起 引入 BglII 消化的 pzMP31 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。
     使用 Qiagen 大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。对于全 长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5， 和截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 分别称为 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2) 和 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)， 将 200μg 的每种 表达构建体大提质粒用约 240 单位的 BstB1 限制酶在 37℃消化 2 小时， 用苯酚 / 氯仿 / 异 戊醇洗涤， 然后用氯仿 / 异戊醇洗涤， 然后用乙醇沉淀过夜， 且在 1.5mL 微量离心机管离心。 倾出上清液， 用 1mL 70％乙醇洗涤离心沉淀， 在室温孵育 5 分钟。将管在微量离心机中以 14,000RPM 旋转 10 分钟， 且倾去离心沉淀的上清液。 在组织培养罩的无菌环境中， 将离心沉 淀在空气中干燥约 5 分钟， 然后重悬浮于 0.4ml 37℃预热的 CHO 细胞组织培养基中， 且使之 在 37℃孵育 10 分钟。 对 DNA 离心沉淀被溶解时， 对各个待电穿孔的载体， 将约 9x 106CHO 细 胞离心沉淀后重悬于 4ml CHO 细胞组织培养基中， 并与重悬的质粒 DNA 混合， 达到最终体积 为 800ul。将 DNA/ 细胞混合物置于 0.4cm 缝隙小杯中， 使用以下参数电穿孔 ； 950μF， 高电 容， 300V。然后， 对于每个质粒电穿孔组， 移出试管的内含物， 汇总， 用 CHO 细胞组织培养基 稀释至 25mL， 置于 125mL 摇瓶中。将瓶置于培养箱中振荡器上， 37℃， 5％ CO2120RPM 摇动。
     CHO 细胞用 500nM 甲氨蝶呤 (MTX) 进行营养物选择和扩增。选出的 CHO 细胞系称 为 MECL 1334(solFGFR3IIIc(23375)(S249W)Fc5) 和 MECL 1337(solFGFR3IIIc(143_375) (S249W)Fc5)。
     为测试表达， 使用电穿孔后汇集物第 3 代建立培养。将细胞离心后 .5e6c/ml 重悬 浮于 50ml 体积新鲜培养基 ( 无选择 )， 且使之如上所述进行 96 小时。通过蛋白质印迹证实 蛋白质表达。启动大型转瓶以产生用于纯化的蛋白质。利用第 6 代的转染后 CHO 细胞池 MECL 1334 和 MECL 1337， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 且添加 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来 自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070) 和 500nM 甲氨蝶呤， 开始生成 200ml 接种培 养物。将瓶在 37℃ 120rpm 和 6％ CO2 下培养。6 天后， 将每个 CHO 池瓶接种至一个 3L 转 瓶中， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 加有 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070)， 无选择， 达到 1L 工作体积， .5e6c/ml。将旋转瓶在 37℃， 95rpm 和 6％ CO2 培养。接种后约 24 小时后， 将另外 .5L 培养基添加至各个转瓶中以达到最终体 积为 1.5L， 继续培养。接种后约 8 天， 收集条件化培养基， 0.2μM 过滤后， 用于蛋白质纯化。
     用类似方法产生 FGFR3 Fc5 区的另外的构建体， 包括可溶全长和截短的形式， 没有 点突变， 或在序列中具有使得 SEQ ID NO ： 15 的 263 位和 SEQ ID NO ： 22 的 143 位的脯氨酸 残基改变为精氨酸 ( 标注为 P250R) 的突变 ( 突变的 250 位是参照天然 FGFR3IIIc 氨基酸 序列 )。该寡核苷酸和所得的构建体用相应的序列标识符标示于下。
     表 14
     pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)
    
    
    
    表 15 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)
    
    
    表 16 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)Fc5， 构建体 #1916(SEQ ID NOS ： 12 和 13)
    
    
    表 17 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1918(SEQ ID NOS ： 14 和 15)
    
    
    表 18 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)Fc5， 构建体 #1919(SEQ ID NOS ： 18 和 19)
    
    
    表 19 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1921(SEQ ID NOS ： 21 和 22)使用了类似方法产生 FGFR2αIIIc Fc5 的可溶形式的构建体区域， 包括可溶全长 和截短的形式， 没有点突变或在序列中具有使 SEQ ID NO ： 29 的 266 位和 SEQ ID NO ： 40 的 143 位的丝氨酸残基改变为标注为 S252W 的色氨酸， 或 SEQ ID NO ： 33 的 267 位和 SEQ ID NO ： 42 的 144 位的脯氨酸残基改变为精氨酸 ( 标注为 P253R) 的突变 ( 突变的位置是参照 天然 FGFR2αIIIc 氨基酸序列 )。
     表 20
     pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)Fc5， 构建体 #1945(SEQ ID NOS ： 23 和 24)
    
    
    
    表 21 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(S252W)Fc5， 构 建 体 #1946(SEQ ID NOS ： 28 和29)
    
    表 22 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(P253R)Fc5， 构 建 体 #1947(SEQ ID NOS ： 32 和33)
    
    
    表 23 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)Fc5， 构建体 #1948(SEQ ID NOS ： 36 和 37)
    
    表 24 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(S252W)Fc5， 构建体 #1949(SEQ ID NOS ： 39 和40
    
    表 25 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(P253R)Fc5， 构建体 #1950(SEQ ID NOS ： 41 和42)
    实施例 15 ： 多特异性、 可溶 FGFR3IIIc Fc5 VEGFA scFv 表达质粒的构建
     生成一系列表达构建体， 其包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或 具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式。这些人 FGFR3IIIc 序列区段 与下游 C- 端 Fc5、 接头、 下游 c- 端用于特异结合至 VEGF-A 的 scFv 序列融合。该系列中的 构建体包括上述的人 FGFR3IIIc 序列段和一个点突变 ( 其在 SEQ ID NO ： 64 的氨基酸 162 位 和 SEQ ID NO ： 62 的 142 位产生色氨酸残基以代替丝氨酸 )。该突变记录为 S249W。( 突变 的位置参考天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列 )。这些构建体通过使用 PCR 和同源重组 ( 利用编码 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段与 Fc5 序列和包含 VEGF-A scFv 序列 870e6 和 1094.1 的表达载体 pZMP31 进行 ) 而产生。
     为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5c870e6 和全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W) Fc5c1094.1 构建体， 产生 PCR 片段且通过酵母重组将其引入基于 pZMP31 的载体， 其中基 于 pZMP31 的载体包含接头和下游 VEGFAscFv 序列 870e6 或 1094.1( 称为 MVC 709-SEQ ID NO ： 43 和 44 ； 以及 MVC 710-SEQ ID NO ： 45 和 46)。该 PCR 片段包含 ： 与基于 pZMP31 的载体 序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序 列， Fc5 序列、 以及与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62552(SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 序列起始于 Ig D1 上游的 E23。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 使用 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NO ： 1) 作为模 板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 2 分钟 ； 1 循环， 72℃， 7 分钟。在 1％琼脂糖凝胶上运行 TM PCR 反应混合物， 且使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从凝胶提取 对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 MVC 709 和 MVC 710 是基于 pZMP31 的哺乳动物表达载体， 其包含鼠 Fc2、 接 头、 和 870e6(SEQ ID NO ： 43) 或 1094.1scFv(SEQ ID NO ： 45) 的下游序列、 VEGF-A 结合序列。 这些载体包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启 动子， 增强子和复制起始区， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及酿酒酵母中的选择和复制所需 的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     将质粒 MVC 709 和 MVC 710 用 BglII 限制酶消化， 然后与下列上文提到的凝胶提
     取的 PCR 片段在酵母中重组。将 60μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 5μl 的各个 PCR 片段插入的 DNA 和约 50ng BglII 消化的 MVC 709 和 MVC 710 载体混合。将该混合物转移 至 0.2cm 电穿孔小杯。对酵母 /DNA 混合物电冲激， 使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF。 将 400μl 1.2M 山梨醇添加至小 杯， 然后将酵母以 75μl 和 200μl 等分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。 约 72 小时后， + 将来自一块板的 Ura 酵母转化体重悬浮于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062M Tris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymolyase/100ul 的 100ul Qiagen MiniPrep 试剂盒缓冲液 P1。 然后将该混合物在 37℃孵 育约 15 分钟， Qiagen 小提试剂盒方案的其余步骤根据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 提取的酵母质粒 DNA 制备 物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。以 1.75kV、 25μF、 400 欧姆对细胞电冲激。电穿孔后， 添 加 .5ml LB， 然后将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板上 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择一个包含正确序列的克隆。大规模质粒 DNA 使用可商购的试剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明 分离。
     利用相同方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。一个片段包含 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列， Fc5 序列和与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560(SEQ ID NO ： 20)。( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片 段。片段将产生 Ig D2D3 形式。FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 60 的 D156， Ig D2 的上 游。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1920 作为模板 (SEQ ID NO ： 9)。
     使用与上述相同的 PCR 热循环产生该片段， 并引入 BglII 消化的 MVC709 和 MVC 710 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接头和下游 c- 端对 VEGFA 构建体结 合特异的 scFv 序列， 如上所述。
     编 码 全 长 的 或 截 短 的 可 溶 人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接 头 和 下 游 c- 端 对 结 合 VEGF-A 特异的 scFv 序列的质粒命名为 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 781)， 如 SEQ ID NOS ： 57 和 58 所示， FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 782)， 如 SEQ ID NOS ： 59 和 60 所 示， FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 783)， 如 SEQ ID NOS ： 61 和 62 所示， 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 784)， 如 SEQ ID NOS ： 63 和 64 所示。将这些质粒在 293F 细胞中瞬时表达 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#R790-07)。使用 QIAGEN 质粒大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。 将 293F 悬浮细胞在 293Freestyle 培养基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#12338-018) 中在 37 ℃， 6 ％ CO2 下在 3L 转瓶中 95RPM 培养。在即将转染之前添加新鲜培养基以得 到 1.5 升工作体积， 最终密度为 1x10E6 细胞 /mL。对于每个转瓶， 将 2mLLipofectAMINE 2000(Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#11668-019) 添 加 至 20mL Opti-MEM 培 养 基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#31985-070) 中， 且在另一试管中将 1.5mg 总质粒 DNA 在 20mL Opti-MEM 中稀释。各试管单独在在室温孵育 5 分钟， 然后混合 (combined) 且一起在室温下再孵育 30 分钟， 不时轻微混合。将脂质 -DNA 混合物添加至 293F 细胞的各转瓶， 然 后恢复至 37℃， 6％ CO2、 75RPM。 约 96 小时后， 收集该条件化培养基， 0.2μM 过滤， 用于蛋白 质纯化。
     实施例 16 ： 纯化方法
     将条件化培养基作为包含 0.02％叠氮化钠的 0.2μ 无菌过滤可输送物输送至纯 化。在将该培养基装载至亲和力俘获柱之前不进行其他调节。
     对于大规模纯化， ～ 10 升可输送物， 采用 POROS A50( 蛋白 A 亲和树脂 ) 的 87mL 柱床 2 厘米直径的柱子用于俘获过程的目的。对于小规模纯化 ( ～ 1-1.5 升可输送物 )， 使 用 4mL 柱床的 POROS Mab MabCapture 灌注色谱树脂。
     加载样品之前， 该柱用 20 柱体积的缓冲液 A(10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬 酸， 250mM[NH4]2S04， pH 7.3， 包含 0.02％叠氮化钠 (W/v)) 平衡。一旦平衡后， 以 20mL/ 分 钟 ( 对于大规模方法 )， 或 10mL/ 分钟 ( 对于小规模方法 ) 加载条件化培养基。当方法的装 载阶段完成时， 用 10-20 柱体积的平衡缓冲液从柱洗出未结合的蛋白质级分。结合的蛋白 质的洗脱通过下降的 pH 梯度完成， 该梯度是在平衡缓冲液 A 和具有以下组成的洗脱缓冲液 B 之间形成的 ： 10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬酸， 250mM[NH4]2S04， pH 3.0， 包含 0.02％ 叠氮化钠 (w/v)。大规模方法的洗脱流速为 30mL/ 分钟， 同时在缓冲液 A 和缓冲液 B 之间形 成 3 个柱体积的梯度。用 0.5mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (10mL)， 立即混合内含 物。小规模方法的洗脱使用相同缓冲液和 4 柱体积的梯度 ( 从缓冲液 A 至缓冲液 B)， 且流 速为 5mL/ 分钟。用 0.25mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (4mL)。立即混合所有洗脱液 级分以保证快速 pH 中和。
     将所有在 280 纳米波长具有正吸收的级分汇集， 进一步进行大小排阻色谱法步 骤。将汇集的蛋白质浓缩至 7ml( 大规模方法 ) 或 1.5mL( 小规模方法 ) 用于大小排阻色谱 法 (SEC)。 采用 SEC 色谱法的目的是缓冲液交换， 以及将少量多聚体或聚集物质与最终产物 区分开来。用于 SEC 和最终蛋白制剂的流动相为 35mM 磷酸钠， 120mM 氯化钠， pH 7.3。大规 模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (26/60 规格， 具有 321mL 柱床体积 ) 上 进行。小规模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (16/60 规格， 具有 120mL 柱 床体积 ) 上进行。根据方法规模， SEC 步骤的流速对大规模或小规模分别为 2.5mL/ 分钟或 1.5mL/ 分钟。汇集在主要对称的峰下的级分， 重点是从最终产物中排除任何少量的高分子 量材料。最终汇集物以 0.2μ 无菌过滤， 制备等分试样且储存于 -80℃。该相同方法用于处 理所有 FGFR 受体和可溶 FGF 受体 (FGFR) 和 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物。 3
     实施例 17 ： H- 胸苷增殖测定以测定可溶 FGF 受体对 FGF- 刺激的 HUVEC 细胞的中 和活性
     为筛选抑制多种 FGF 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人脐带内皮细胞 (HUVEC) 进行 3H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF1， 2， 4 和 6(R&D Systems， Inc.) 以 10ng/ml 在测定介质 (RPMI-1640， 1％ FBS， 1 单位 /ml 肝素和丙酮酸盐 ) 中使用。然后从 0.5-4ug/ ml( 取决于受体 ) 滴定的可溶人 FGFR(R&D Systems 和 ZymoGenetics)， 并在测定介质中 连续稀释至 32-4ng/ml。即 HUVEC 铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2000 细胞 / 孔。HUVEC 增殖测定体系在 37℃， 5％ CO2 培养 2 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸 苷 (Amersham， TRK120) 冲激 HUVEC18 小时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％CO2)。收集细胞， 在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结果 ： 所 有 测 定 的 FGFR 均 如 预 期 的 那 样 以 类 似 的 活 性 中 和 FGF1。FGFR1 和 FGFR2(R&D Systems) 强 力 地 中 和 所 有 FGF。 而 FGFR3 和 FGFR4(R&D Systems) 对 FGF2， 4 和 6 活 性 的 抑 制 弱 一 些。FGFR3A2258F(143_375， S249W)(SEQ ID NO ： 10) 和 FGFR3 A2256F(22_375， S249W)(SEQ ID NO ： 2) 强力地中和 FGF1， 2， 4 和 6， 且 IC50 值与 FGFR1 相 似。
     表 26
    实施例 18 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 LNCap 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 LNCap 细胞进行 3 了 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 以 200 至 1000ng/ml 在测定介 质 (RPMI-1640， 1％ BSA， ITS[ 胰岛素 - 转铁蛋白和硒 ]， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 [ 均获自 Invitrogen]) 中使用。然后从 1-2ug/ml 滴定 R&D Systems 的可溶人 FGFR(R1-R4)、 以及 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 31-15ng/ml。将 LNCap 细胞铺板 于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2500 细胞 / 孔。将该 LNCap 增殖测定在 3 37℃， 5％ CO2 培养 3 天。然后每孔用 1μCi H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将 LNCap 冲激 8 小
    时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结 果： R&D System 的 FGFRs R2-R4 中 和 FGF8b， 但 R1 则 否。 全 长 FGFR2A2556F(22_377)SEQ ID NO ： 24 ， A2557F(22_377)(S252W)SEQ ID NO ： 29 ， 和 A2558F(22_377)(P253R)SEQ ID NO ： 33 不中和 FGF8b。而截短的 FGFR2A2559F(145_377)SEQ ID NO ： 37， A2560F(145_377)(S252W)SEQ ID NO ： 40， 和 A2561F(145_377)(P253F)SEQ ID NO ： 42 确实中和 FGF8b， 类似于 R&D Systems FGFR2。FGFR3A2519F(143_375)(P250R) SEQ ID NO ： 22， A2256F(23_375)(S249W)SEQ ID NO ： 2 和 A2258F(143_375)(S249W)SEQ ID NO ： 10 中和 FGF8b， 但 A2518F(143_375)SEQ ID NO ： 19， A2257F(23_375)SEQ ID NO ： 13， 和 A2259F(23_375)(P250R)SEQ ID NO ： 15 则否。
     表 27
    ND， 未测定。
     实施例 19 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 MCF-7 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 MCF-7 细胞进行 3 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 在测定介质 (RPMI-1640， 5％ FBS， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 ) 中为 100ng/ml。从 10ug/ml 滴定来自 R&D Systems 的可溶人 FGFR-Fc(R1-R4) 和 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 78ng/ml。 将 MCF-7 细胞铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 1250 细胞 / 孔。将该
     MCF-7 增殖测定系统在 37℃， 5％ CO2 下培养 4 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将细胞冲激 8 小时， 该 3H- 胸苷掺入中的增殖细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细 胞且在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     实施例 20 ： 用于测定 sFGFR-Fc 对 FGF-9 刺激的 HCO 成骨细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为测定 sFGFR-Fc 构建体对 FGF-9- 刺激的成骨细胞增殖的中和作用， 进行 3H- 胸 苷测定。用人 FGF-9 刺激人成骨细胞生长。以 0.02nM 至 6nM 的浓度将 FGFR-Fc 蛋白质添 加至测定介质。观察到成骨细胞增殖的显著抑制， 并对各蛋白质计算 IC50。
     研究设计 ： 以 1.2nM 人 FGF-9(R&D Systems， Minneapolis， MN) 刺 激 人 颅 盖 成 骨 细 胞 (HCO ； ScienCell， Carlsbad， CA)。ObM 测 定 介 质 [ 成 骨 细 胞 基 础 培 养 基 (ObM， ScienCell)， 含有 0.5 ％胎牛血清 (FBS)， 2mM GlutaMax(Invitrogen， Carlsbad， CA)， 1mM 丙酮酸钠， 和 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 (Invitrogen)] 用作阴性对照。将人 FGFR1-Fc， FGFR2-Fc， FGFR3-Fc， 和 FGFR4-Fc(R&D Systems) 在 ObM 测定介质中连续稀释到 6nM， 2nM， 0.67nM， 0.22nM， 0.07nM， 和 0.02nM。对 FGFR3-Fc 突变体 (ZymoGenetics， Seattle， WA) 也 类似进行稀释。将 HCO 细胞在补充有 5％ FBS 和成骨细胞生长补充剂 (ObGS， ScienCell) 的 ObM 中铺板于在 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 1000 细胞 / 孔。将各板在 37℃， 5％ CO2 孵育过夜。细胞用 ObM 测定介质血清饥饿 24h， 在有或无连续稀释的 FGFR-Fc 的条件下 3 用 1.2nM FGF-9 刺激 24h， 用 1μCi 每孔的 H- 胸苷冲激 24h(GE Healthcare Biosciences， 3 Piscataway， NJ)， 该 H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37 ℃， 5 ％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果证实该突变体 FGFR3-Fc 构建体显著抑制人成骨细胞增殖， 且其 IC50 在 R&D Systems 的 FGFR3-Fc 的 3 倍范围内， 如图 3 所示， 图 2 显示全长 FGFR3-Fc 野生型和突变体 构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     表 28 ： 成骨细胞增殖测定中的 FGFR-Fc IC50.
    实施例 21 ： FGFR-Fc 野生型和突变体构建体与 FGF-8b 和 FGF-17 的结合
     为测定 FGFR-Fc 与其各自配体的结合能力， 进行 ELISA。 在室温在摇动下将重组人 FGF-8b 或 FGF-17(R&D Systems) 以 100nM 铺板于 Nunc Maxisorp 96- 孔板上保持 1h。各 板在室温用 BLOTTO(Thermo Fisher Scientific， Rockford， IL) 封闭 1h， 然后用 ELISA C 缓冲液 (137mM NaCl， 2.7mM KCl， 7.2mM Na2HPO4， 1.5mM KH2PO4， 0.05％ (v/w) 聚山梨酯 20， pH 7.2) 洗涤 5 次。FGFR-Fcs 用 PBS/0.1x BLOTTO/10ug/ml 猪肝素 (Sigma， St.Louis， MO) 稀释至 100nM， 然后制备 1 ∶ 2 连续稀释物， 到 0.10nM 为止。将 100μL FGFR-Fc 铺板且在 4℃培养过夜。 次日， 将各板用 ELISA C 洗涤 5 次， 然后在室温在摇动下用 2.5μg/mL 辣根过 氧化物酶缀合的抗人 Fc 抗体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories， West Grove， PA) 孵育 1h。用 ELISAC 洗涤 5 次后， 添加柠檬酸盐缓冲液中的 100μL OPD(5mg 邻苯二胺， 于 63mM 柠檬酸钠， 37mM 柠檬酸， pH 5.0， 0.03％ H2O2 中 ) 以进行检测。2-5 分钟后， 用 1N H2SO4 停止反应。各板使用 SoftMaxPro 软件在 490nm 读数。
     结果 ： 尽管野生型和突变体 FGFR2-Fcs 不显著结合至 FGF-8b 或 -17， 但有一些突 变体 FGFR3-Fc 构建体以大于野生型 FGFR3-Fc 的程度结合至 FGF-8b 和 FGF-17 两者， 如图 5A， 5B， 6A， 6B 和 7 所示。
     表 29 ： 野生型和突变体 FGFR3-Fc 构建体结合 FGF-8b 和 FGF-17.
    
    实施例 22 ： 通过表面等离子体共振测量 FGF 受体对 FGF 配体的结合亲和力
     通过表面等离子体共振测量可溶 FGF 受体 (FGFR) 与 FGF 配体的相互作用的动力 学速率常数、 平衡结合常数和平衡解离常数。 在该研究中检查多种形式的 FGFR3。 制备了有 两个或三个 Ig 样域， 且具有两个可能的点突变 (S249W 或 P250R) 的 FGFR3。FGFR3 都制备 为二聚体 Fc- 融合蛋白。对于这些研究， 利用 Fc 标签将 FGFR 分子俘获在先前用蛋白 A 固 定的 Biacore 芯片上。使 FGF 配体在含肝素的缓冲液中在该表面上流过。尽管 FGF 配体为 单体， 但认为它们在肝素的存在下结合为二聚物。 因此确定， 二价分析物模型是适合用于这
     些相互作用的。
     亲和力测定 ： 表征了 FGF 受体的对 FGF 配体的结合亲和力。对各相互作用测量结 -1 -1 合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s-1))。结合速率常数为反映配体 - 受体复合 物形成速率的值。解离速率常数为反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常表示为 平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是通过将解离速率常数除以结合速率 常数 (kd/ka) 获得的， 而 KA 是通过将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 获得的。具有类 似的 KD( 或类似的 KA) 的分子可能具有可广泛变化的结合和解离速率常数。 因此， 测量 ka 和 kd 以及 KA 或 KD 有助于更加独特地描述配体 - 受体相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 结合动力学和亲和力研究在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行。 Biacore T100TM 的方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 2.0 编程。因为各 FGF 受体分子包含人 Fc 域， 将生物素化蛋白 A(Thermo Fisher Scientific Inc， Rockford， IL) 用作俘获试剂用于这些研究。 将生物素化蛋白 A 在 HBS-EP 缓冲液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA， 0.05％表面活性剂 P20 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中 稀释至 50μg/mL 浓度， 然后俘获至 SA( 链亲和素 ) 传感器芯片的所有四个流动室上。每个 流动室获得约 1100RU 的密度。随后通过蛋白质 -A 以 150-250RU 的近似密度将各 FGF 受体 分子俘获至 SA 芯片的单独的流动室上。 Biacore 仪器测量结合于传感器芯片表面的蛋白质 的质量， 因此， 验证了各循环中受体的俘获。
     对于动力结合研究， 制备了 FGF 配体的从 200nM-0.06nM 的连续 1 ∶ 5 稀释物。将 这些样品注射在表面上， 并允许它们特异结合至传感器芯片俘获的 FGF 受体。以结合时间 为 7 分钟， 离解时间为 15 分钟进行各配体浓度的注射。以 50μL/min 的流速进行动力结合 研究。所有结合实验在 25℃在含 50μg/mL 肝素 (Calbiochem， La Jolla， Ca) 的 HBS-P 缓冲 液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 0.05％表面活性剂 P20， pH 7.4 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中进行。
     在循环之间， 用 20mM 盐酸洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤从蛋白 A 表面去 除俘获的 FGF 受体和任何结合的 FGF 配体， 便于接下来后一个测定样品的结合。数据使用 TM Biacore T100 评价软件 ( 版本 2.0) 编辑。数据通过减去参照流动室和空白注射处理。评 价基线稳定性以保证在整个注射顺序过程中再生步骤提供了一致的结合表面。 检查重复注 射曲线的再现性。将结合曲线整体拟合于二价分析物模型。
     结果 ： 确定了该二价分析物模型对这些相互作用而言是最适合的。 该模型对 ka(ka1 和 ka2) 以及 kd(kd1 和 kd2) 两者都测量两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的一价动 力学。这些样品报告的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1 和 KA1。第二组值 (ka2 和 kd2) 是指相互作用的亲合力， 没有报告。 尽管在残差中有一些趋向性 (trending)， 但与模型的拟 合对评估结合亲和力而言是令人满意的。表 30 详细列出了多种 FGFR3 分子与 FGF6 的结合 相互作用的动力学。全长 FGFR 分子 (23_375) 的亲和力类似于二域 FGFR 分子 (143_375) 的亲和力。该点突变增加对 FGF6 的亲和力， 且 S249W 的亲和力＞ P250R 的亲和力＞野生型 的亲和力。通常， 该亲和力的增加主要是由于较慢的解离速率常数导致的。
     表 30 ： FGF6 的结合亲和力
    实施例 23 ： 用于测定 FGFR-Fc 对肿瘤细胞的增殖的抑制的 3H- 胸苷增殖测定
     为测定 FGFR-Fc 抑制肿瘤细胞增殖的能力， 进行 3H- 胸苷测定。 将 Caki-1 和 DU145 肿瘤细胞以 2000 细胞 / 孔的密度铺板于 96- 孔平底板， 并在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。次 日， 将 FGFR-Fc 构建体在 RPMI 1640( 具有 0.5％ FBS， 1mM 丙酮酸钠， 和 2mM GlutaMAX) 中 以 20， 10， 和 5μg/mL 连续稀释， 并在 37 ℃， 5 ％ CO2 下铺板于孔保持 3 天。将细胞用每孔 3 1μCi H- 胸苷 (GE Healthcare Biosciences， Piscataway， NJ) 冲激 24h， 该 3H- 胸苷掺入 增殖中的细胞。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果 ： 在 20μg/mL， 截短的 FGFR3-FC S249W 突变体抑制 Caki-1 和 DU145 细胞二 者， 其抑制程度稍微大于野生型 FGFR2-Fc 或 FGFR3-Fc。图 8A 演示 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细 胞生长， 图 8B 演示 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞生长。
     表 31 ： 增殖的百分比抑制
    
    实施例 24 ： sFGFR-VEGF scFv 蛋白质抑制内皮细胞萌芽
     为测定包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 的功效， 如 (Darland et al， Dev Biol 264(2003)， 275) 所述建立内皮细胞和周皮细胞的体 外共培养系统。 在该共培养中， 将包被在 Cytodex 珠上的 HUVEC 与人间充质干细胞 (Lonzo) 在 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞条件化培养基的存在下在纤维蛋白凝胶中共培养。 在实验开始时或在实验第 7 天， 将 0.04-50nM 对照拮抗剂、 VEGF-A 拮抗剂或包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白添加至培养物。在添加拮抗剂后 的第 8 天使用 PFA 固定细胞。然后使用抗平滑肌细胞肌动蛋白 (aSMA) 或抗 PECAM 抗体通 过 IHC 染色细胞以分别识别周皮细胞和内皮细胞。在使用对照拮抗剂处理的孔中， 这些细
     胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。在用抗 VEGF-A、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受 体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明 拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     研究设计 ： 在第 1 天， Cytodex-3 珠用 HUVECs 包被， 在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。在 第 2 天， 在 24 孔板的孔中将 HUVEC 珠 (200 珠 / 孔 ) 与人间充质干细胞 (hMSC)(40,000 细 胞 / 孔 ) 一起包埋到纤维蛋白凝胶中。将 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞培养基的 1 ∶ 1 混合物与 2ng/mL HGF 一起添加至这些细胞。每两天替换培养基直到实验结束。在第 2 天 ( 从共培养开始起 ) 或第 7 天 ( 共培养形成后 ) 将拮抗剂添加至培养物。添加拮抗剂 后将细胞在 4％ PFA 中固定过夜。用抗 PECAM 或抗 SMA 抗体染色细胞， 然后用第二抗体 ( 缀 合有荧光剂 ) 染色。然后通过显微镜观察细胞， 对 10 珠 / 孔的代表组手动计数芽的数量和 长度。然后计算孔的平均值。
     结果 ： 在用对照拮抗剂处理的孔中， 细胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。 在用抗 VEGF-A 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     实施例 25 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白质预防性处理在 Nu/Nu 小鼠中抑制 A549 肺癌细胞生 长
     为测定 sFGFR 蛋白质是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 在第 0 天对多组小鼠皮下 注射 A549 肺癌肿瘤。然后多组小鼠 (n ＝ 10/gp) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周历时 4 周， 起始于肿瘤接种 1 天后。3X/ 周监测肿瘤体积 4 周。与 注射对照试剂的小鼠相比， 注射 sFGFR 蛋白质的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生 长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 6 用 2x 10 个 A549 细胞在右胁腹皮下注射。从第 1 天开始， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内 注射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周， 注射 4 周。使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。 肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤并用于组织学。 将将肿瘤固 定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密 度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 26 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白治疗处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞生长
     为测定是否 sFGFR 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 几组小鼠在第 0 天皮下注射 3 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm ， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试 剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹 膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。使用测径 器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 保持 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且肿瘤称重。肿瘤也交付进行组织学分析 用于微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 27 ： 使用 sFGFR-Fc 蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测试 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。然后对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试 剂， sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 自肿瘤接种 1 天后开始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历 时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿 瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤 固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管 密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 28 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌细 胞的生长
     为测定 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 3 DU145 前列腺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/ Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比 注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑 制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析 以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 29 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。对多组小鼠(n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂， sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后起。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂 的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小 鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射浓 度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-VEGFscFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿 瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血 管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白的小鼠肿瘤显 著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 30 ： 以双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到 3 尺寸 200mm ， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿 瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106 个 A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用 后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 31 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。对多 组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后开 始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对 肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历 时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内 皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 32 ： 使用双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 DU145 前列腺癌细胞在 Nu/ Nu 小鼠中的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。 当肿瘤 3 达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双 特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的 功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     根据上述， 应理解， 尽管为了说明的目的在此描述了本发明的具体实施方案， 但在 不偏离本发明的精神和范围的前提下可作出各种变化。因此， 本发明除了由所附权利要求 限定外不受限制。所有在此引用的公开物、 专利和专利申请以其整体通过提述并入本文用 于一切目的。86102448984 A CN 102449007
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     总之， 上述临床前数据和临床数据支持以下观点， 即阻止 VEGF 和 FGF 信号传递 途径二者的联合治疗在许多实体瘤中比单独的 VEGF 阻断可产生更好的抗肿瘤作用。这 些数据为肿瘤学中靶向这两种途径提供了强有力的概念证明性论据 (proof-of-concept rationale)。阻断这两种途径也可在其它血管发生疾病， 包括 AMD 中提供更好的功效。本 发明提供用于所述这些和其它用途的多特异性蛋白， 在本文的教导下， 其对本领域技术人 员将是显而易见的。 发明内容
     本发明提供双特异性结合蛋白， 其包含减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的抗 体 / 可溶受体双特异性结合蛋白。根据本发明， 该双特异性结合蛋白包含抗 VEGF-A 抗体 (VEGF-A 抗体 ) 部分的 VEGF-A 结合区和 FGF 受体的 FGF 结合部分， 如本文所述。本文所述 的 FGF 结合部分通常为可溶 FGF 受体 (FGFR)。本发明在某些实施方案中提供， 该双特异性 结合蛋白的可溶 FGF 受体部分包含本文所述的 FGFR3 或 FGFR2 的 FGF 受体部分。在其它实 施方案中， Fc 多肽融合至 FGFR 的 C- 端。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分和 VEGF-A 结 合部分为使用肽或多肽接头序列融合的多肽， 并且在这些情况下， 编码所述实施方案的多 核苷酸可表达为单一双特异性结合蛋白。
     本发明还提供， 双特异性结合蛋白的某些实施方案包含本文所述的 VEGF-A 抗体 部分。该 VEGF-A 抗体部分可进一步由本文所述的 scFV 多肽或 VL 和 VH 多肽构成。
     在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 特别是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体 部分， 其为选自以下的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 以及选自以下的 VEGF-A 抗体部分 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6 scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1 scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其为选自以下的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 和选 自以下的 VEGF-A 结合部分 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在其它实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白包括 FGFR3 部分和 VEGF-A 抗体 部分， 其选自 FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375) (S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包括 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其 为 选 自 以 下 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所 示 的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 和 选 自 以 下 的 VEGF-A 结 合 部 分 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6 scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性 抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分， 其为选自以下的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示 的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 和选 自以下的 VEGF-A 结合部分 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在其它方面， 本发明提供使用本文所述的双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白的方 法。在某些实施方案中， 该双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白可给予受试者以治疗以实体 瘤生长为特征的癌症， 如前列腺癌， 乳腺癌， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 成胶质细 胞瘤， 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和胃肠道间质瘤 (GIST)。
     本发明的这些和其它方面在参考以下发明详述和附图后将会是明显的。
     定义
     除非另有定义， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解 的所述方法和组合物的意思相同的意思。如本文所述， 以下术语和短语具有属于它们的意 思， 除非另有所述。
     “多肽” 为通过肽键结合的氨基酸残基的聚合物， 无论天然或合成产生的。少于约 10 个氨基酸残基的多肽通常称为 “肽” 。
     “蛋白质” 为包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可包含非肽组分， 如碳水 化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可通过产生蛋白质的细胞添加至蛋白质， 且将随着细胞的类型而改变。蛋白质在此根据它们的氨基酸主链结构定义 ； 取代基如碳水化合 物基团通常没有规定， 但仍然可存在。
     术语 “氨基 - 端” 和 “羧基 - 端” 在本文使用以表示多肽中的位置。当上下文允许 时， 这些术语用于以具体的多肽序列或的部分为参考表示近似或相关的位置。 例如， 位于多 肽中相关序列的羧基 - 端的某一序列是与该相关序列的羧基端相邻， 而不一定位于完整多 肽的羧基端。
     如本文所述， “核酸” 或 “核酸分子” 是指多核苷酸， 如脱氧核糖核酸 (DNA) 或核糖 核酸 (RNA)， 寡核苷酸， 聚合酶链反应 (PCR) 产生的片段， 和连接、 分裂、 核酸内切酶作用， 和 核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可由单体构成， 该单体为天然存在的核 苷酸 ( 如 DNA 和 RNA)， 或天然存在的核苷酸的类似物 ( 例如， 天然存在的核苷酸的 α- 对 映体形式 )， 或两者的组合。修饰的核苷酸可在糖部分和 / 或嘧啶或嘌呤碱基部分具有 变化。糖修饰包括， 例如， 用卤素、 烃基、 胺和叠氮基代替一个或多个羟基， 或糖可官能化 为醚或酯。而且， 整个糖部分可用立体上和电子上类似的结构， 如氮杂 - 糖和碳环的糖类 似物代替。碱基部分的修饰的实例包括烃基化嘌呤和嘧啶、 酰基化嘌呤或嘧啶， 或其它众 所周知的杂环的代替物。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯 键的类似物包括硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 硒代磷酸酯， 硒代磷酸酯， 苯胺基硫代磷酸酯 (phosphoroanilothioate)， 苯胺基磷酸酯 (phosphoranilidate)， 氨基磷酸酯， 等。 术语 “核 酸分子” 也包括所谓的 “肽核酸” ， 其包括连接至聚酰胺主链的天然存在的或修饰的核酸碱 基。核酸可为单链或双链。
     如本文所述， 术语 “拮抗剂” 表示在某个生物环境中减少另一化合物的活性的化合 物。例如， VEGF-A 拮抗剂为减少 VEGF-A 的生物活性的化合物， 且 FGFR 拮抗剂为减少 FGF 的生物活性的化合物。因为 VEGF-A 和 FGF 两者的活性取决于多种分子 ( 包括配体、 受体和 信号转导物 ) 的相互作用， 拮抗剂可通过直接作用于 VEGF-A 或 FGF， 或通过作用于同源生 物途径中的另一分子来减少活性。例如， FGF 拮抗剂可通过以下方式减少 FGF 活性， 例如， 通过结合至受体本身， 通过结合至其配体之一， 通过干扰受体二聚体化， 或通过干扰受体磷 酸化。拮抗剂包括但不限于抗体、 可溶受体、 和结合至配体或其受体， 或以其他方式干扰配 体 - 受体相互作用和 / 或其它受体功能的非蛋白质化合物。
     术语″受体″表示细胞相关的蛋白质， 其结合至生物活性分子 ( 即， 配体 ) 且介导 配体对细胞的作用。膜结合的受体以多域或多肽结构为特征， 其包含细胞外配体 - 结合域 和通常在信号转导中涉及的细胞内效应物结构域。配体与受体的结合导致受体中构象变 化， 导致效应物结构域和细胞中其它分子的相互作用。该相互作用进而导致细胞中代谢变 化。 与受体 - 配体相互作用相关的代谢事件包括基因转录、 磷酸化、 脱磷酸化、 环状 AMP 产生 的增加、 细胞钙动员、 膜脂质动员、 细胞粘附、 肌醇脂质的水解和磷脂的水解。通常， 受体可 为膜结合的、 可溶的或核内的 ； 单体的 ( 例如， 甲状腺刺激激素受体， β- 肾上腺素能受体 ) 或多聚体的 ( 例如， PDGF 受体、 生长激素受体、 IL-3 受体、 GM-CSF 受体、 G-CSF 受体、 红细胞 生成素受体和 IL-6 受体 )。
     “可溶受体” 是不结合于细胞膜的受体多肽。最常见的情况下， 可溶受体是缺乏跨 膜和胞浆域的配体 - 结合受体多肽。可溶受体可包括另外的氨基酸残基， 如提供多肽的纯 化或提供用于多肽连接至底物的位点的亲和标签。 许多细胞表面受体具有天然存在的可溶对应物， 它们是通过蛋白水解产生或从可变剪接的 mRNAs 翻译的。当受体多肽分别缺少跨 膜和细胞内多肽区段的足够部分以提供膜锚定或信号转导时， 称该受体多肽基本上没有跨 膜和细胞内多肽区段。
     如本文所述， 术语″ Fc- 融合蛋白″表示兼具异源蛋白质的结合特异性与免疫球 蛋白恒定域的效应物作用的抗体状分子。结构上， Fc- 融合蛋白包含具有所需结合特异性 的氨基酸序列 ( 其不同于抗体的抗原识别和结合位点 ( 即， 为″异源的″ ))， 和免疫球蛋白 恒定域序列的融合。Fc- 融合蛋白分子通常包括连续氨基酸序列， 其至少包含受体或配体 的结合位点。Fc- 融合蛋白中的免疫球蛋白恒定域序列可获自任何免疫球蛋白， 如 IgG-1， IgG-2， IgG-3， 或 IgG-4 亚型， IgA( 包括 IgA-1 和 IgA-2)， IgE， IgD 或 IgM。例如， 根据本发 明可用的 Fc- 融合蛋白为包含 FGFR3 受体的 FGF 结合部分而没有 FGFR3 受体的跨膜或细胞 质序列的多肽。在一个实施方案中， FGFR3 的细胞外域融合至免疫球蛋白序列的恒定域。
     术语 “抗体” 在本文使用是指机体响应抗原的存在而产生的、 结合至抗原的蛋白 质， 及其抗原 - 结合片段和工程化变体。因此， 术语 “抗体” 和 “抗体” 包括多克隆抗体、 亲 和纯化的多克隆抗体、 单克隆抗体、 和抗原 - 结合抗体片段， 如 F(ab’ )2 和 Fab 片段。遗传 工程完整的抗体和片段， 如嵌合抗体、 人源化抗体、 单链 Fv 片段、 单链抗体、 双抗体、 迷你抗 体、 线性抗体、 多价或多特异性杂合抗体等也包括在内。因此， 术语 “抗体” 可广义地用于包 括任何包含抗体的抗原结合位点且能结合至其抗原的蛋白质。 术语 “遗传工程抗体” 是指以下抗体， 其中氨基酸序列在天然抗体的氨基酸序列的 基础上被改变。因为重组 DNA 技术在抗体产生中的重要性， 不必限制为在天然抗体发现中 的氨基酸序列 ； 可重新设计抗体以得到所需特征。 可能的变化非常多， 可从仅改变一个或一 些氨基酸到例如可变区或恒定区的完全重新设计。通常， 对恒定区进行改变以改善或改变 如补体结合、 与细胞的相互作用和其它效应物作用等特征。 通常， 将对可变区进行变化以改 善抗原结合特征、 改善可变区稳定性、 或减少免疫原性风险。
     “抗体的抗原结合位点” 为抗体的足以结合至其抗原的部分。最小的该区通常 为可变域或其遗传工程变体。单域结合位点可产生自骆驼抗体 ( 参见 Muyldermans 和 Lauwereys， J.Mol.Recog.12 ： 131-140， 1999 ； Nguyen 等 人， EMBO J.19 ： 921-930， 2000) 或 其它物种的 VH 域以产生单域抗体 (“dAbs” ； 参见 Ward 等人， Nature 341 ： 544-546， 1989 ； 美国专利 No.6,248,516 to Winter 等人 )。在某些变化中， 抗原结合位点为仅具有 2 个天 然或非天然 ( 例如， 诱变处理的 ) 存在的重链可变域或轻链可变域， 或其组合的互补决定 区 (CDR) 的多肽区 ( 参见， 例如， Pessi 等人， Nature 362 ： 367-369， 1993 ； Qiu 等人， Nature Biotechnol.25 ： 921-929， 2007)。更一般的， 抗体的抗原结合位点包含结合至相同表位的 重链可变域和轻链可变域两者。在本发明中， “包含抗体的抗原结合位点” 的分子可进一步 包含一个或多个抗体的第二抗原结合位点 ( 其可结合至相同或不同表位或相同或不同抗 原 )， 肽接头， 免疫球蛋白恒定域， 免疫球蛋白铰链， 两亲性螺旋 ( 参见 Pack 和 Pluckthun， Biochem.31 ： 1579-1584， 1992)， 非 肽 接 头， 寡 核 苷 酸 ( 参 见 Chaudri 等 人， FEBSLetters 450 ： 23-26， 1999) 等， 且可为单体或多聚蛋白质。包含抗体的抗原结合位点的分子的实 例是本领域已知的， 包括例如 Fv 片段， 单链 Fv 片段 (scFv)， Fab 片段， 双抗体， 迷你抗体， Fab-scFv 融合物， 双特异性 (scFv)4-IgG， 和双特异性 (scFv)2-Fab。( 参见， 例如， Hu 等人， Cancer Res.56 ： 3055-3061， 1996 ； Atwell 等 人， Molecular Immunology 33 ： 1301-1312，
     “抗体的抗原结合位点” 为抗体的足以结合至其抗原的部分。最小的该区通常 为可变域或其遗传工程变体。单域结合位点可产生自骆驼抗体 ( 参见 Muyldermans 和 Lauwereys， J.Mol.Recog.12 ： 131-140， 1999 ； Nguyen 等 人， EMBO J.19 ： 921-930， 2000) 或 其它物种的 VH 域以产生单域抗体 (“dAbs” ； 参见 Ward 等人， Nature 341 ： 544-546， 1989 ； 美国专利 No.6,248,516 to Winter 等人 )。在某些变化中， 抗原结合位点为仅具有 2 个天 然或非天然 ( 例如， 诱变处理的 ) 存在的重链可变域或轻链可变域， 或其组合的互补决定 区 (CDR) 的多肽区 ( 参见， 例如， Pessi 等人， Nature 362 ： 367-369， 1993 ； Qiu 等人， Nature Biotechnol.25 ： 921-929， 2007)。更一般的， 抗体的抗原结合位点包含结合至相同表位的 重链可变域和轻链可变域两者。在本发明中， “包含抗体的抗原结合位点” 的分子可进一步 包含一个或多个抗体的第二抗原结合位点 ( 其可结合至相同或不同表位或相同或不同抗 原 )， 肽接头， 免疫球蛋白恒定域， 免疫球蛋白铰链， 两亲性螺旋 ( 参见 Pack 和 Pluckthun， Biochem.31 ： 1579-1584， 1992)， 非 肽 接 头， 寡 核 苷 酸 ( 参 见 Chaudri 等 人， FEBSLetters 450 ： 23-26， 1999) 等， 且可为单体或多聚蛋白质。包含抗体的抗原结合位点的分子的实 例是本领域已知的， 包括例如 Fv 片段， 单链 Fv 片段 (scFv)， Fab 片段， 双抗体， 迷你抗体， Fab-scFv 融合物， 双特异性 (scFv)4-IgG， 和双特异性 (scFv)2-Fab。( 参见， 例如， Hu 等人， Cancer Res.56 ： 3055-3061， 1996 ； Atwell 等 人， Molecular Immunology 33 ： 1301-1312，
     1996 ； Carter 和 Merchant， Curr.Opin.Biotechnol.8 ： 449-454， 1997 ； Zuo 等 人， Protein Engineering 13 ： 361-367， 2000 ； and Lu 等人， J.Immunol.Methods 267 ： 213-226， 2002)。
     如本文所述， 术语 “免疫球蛋白” 是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码 的多肽组成的蛋白质。 免疫球蛋白的一种形式构成抗体的基本结构单位。 该形式为四聚物， 且由两个相同的免疫球蛋白链对组成， 每个对具有一个轻链和一个重链。在每个对中， 轻 链和重链可变区一起负责结合至抗原， 且恒定区负责抗体效应物作用。免疫球蛋白通常在 脊椎动物生物中作为抗体起作用。已在高等脊椎动物中鉴定出五种免疫球蛋白 (IgG， IgA， IgM， IgD 和 IgE)。IgG 是主要的种类 ； 它通常作为血浆中第二丰富的蛋白质存在。在人中， IgG 由四个亚类组成， 称为 IgG1， IgG2， IgG3 和 IgG4。IgG 类的重链恒定区用希腊字母 γ 标识。例如， IgG1 亚类的免疫球蛋白包含 γ1 重链恒定区。各个免疫球蛋白重链具有由恒 定区蛋白质域 (CH1， 铰链， CH2， 和 CH3 ； IgG3 也包含 CH4 域 ) 组成的恒定区， 该恒定区蛋白质 域基本上为物种的给定亚类的变体。编码人和非人免疫球蛋白链的 DNA 序列是本领域已知 的。 ( 参见， 例如， Ellison 等人， DNA 1 ： 11-18， 1981 ； Ellison 等人， Nucleic Acids Res.10 ： 4071-4079， 1982 ； Kenten 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79 ： 6661-6665， 1982 ； Seno 等人， Nuc.Acids Res.11 ： 719-726， 1983 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323-327， 1988 ； Amster 等 人， Nuc.Acids Res.8 ： 2055-2065， 1980 ； Rusconi and Kohler， Nature 314 ： 330-334， 1985 ； Boss 等 人， Nuc.Acids Res.12 ： 3791-3806， 1984 ； Bothwell 等 人， Nature 298 ： 380-382， 1982 ； van der Loo 等 人， Immunogenetics 42 ： 333-341， 1995 ； Karlin 等 人， J.Mol. Evol.22 ： 195-208， 1985 ； Kindsvogel 等人， DNA 1 ： 335-343， 1982 ； Breiner 等人， 基因 18 ： 165-174， 1982 ； Kondo 等 人， Eur.J.Immunol.23 ： 245-249， 1993 ； and GenBank Accession No.J00228)。 关于免疫球蛋白结构和功能的综述可参见 Putnam， The Plasma Proteins， Vol V， Academic Press， Inc.， 49-140， 1987 ； 和 Padlan， Mol.Immunol.31 ： 169-217， 1994。术语 “免疫球蛋白” 在此使用为其一般意思， 表示完整抗体， 其组成链， 或链的片段， 依上下文而 定。
     全长免疫球蛋白 “轻链” ( 约 25Kd 或 214 个氨基酸 ) 由 NH2- 端的可变区基因 ( 编码 约 110 个氨基酸 ) 和 COOH- 端的 κ 或 λ 恒定区基因所编码。全长免疫球蛋白 “重链” (约 50Kd 或 446 个氨基酸 ) 由可变区基因 ( 编码约 116 个氨基酸 ) 和 γ， μ， α， δ， 或ε恒 定区基因 ( 编码约 330 个氨基酸 ) 编码， 后者分别定义抗体的同种型为 IgG， IgM， IgA， IgD， 或 IgE。在轻链和重链中， 可变区和恒定区通过约 12 或更多个氨基酸的 “J” 区连接， 且重链 还包括约 10 个或更多氨基酸的 “D” 区。( 通常参见 Fundamental Immunology(Paul， ed.， Raven Press， N.Y.， 2nd ed.1989)， Ch.7)。
     免疫球蛋白 “Fv” 片段包含重链可变域 (VH) 和轻链可变域 (VL)， 二者通过非共价相 互作用保持在一起。因此免疫球蛋白 Fv 片段包含单一抗原结合位点。Fv 片段的二聚结构 可进一步通过突变发生引入二硫键而稳定化。( 参见 Almog 等人， Proteins 31 ： 128-138， 1998.)
     如本文所述， 术语 “单链 Fv” 和 “单链抗体” 是指这样的抗体片段， 其在单一多肽链 中包含重链和轻链两者的可变区， 但缺乏恒定区。通常， 单链抗体进一步包含 VH 和 VL 域之 间的多肽接头， 其使得单链抗体能够形成允许抗原结合的所需结构。 单链抗体详细讨论于， 例如， Pluckthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies， vol.113(Rosenburg 和Moore eds.， Springer-Verlag， New York， 1994)， pp.269-315。( 也参见 WIPO Publication WO 88/01649 ； U.S.Patent Nos.4,946,778 和 5,260,203 ； Bird 等 人， Science 242 ： 423-426， 1988)。单链抗体也可为双特异性的和 / 或人源化的。
     “Fab 片段” 包含一个轻链以及一个重链的 CH1 和可变区。Fab 片段的重链不能与 另一重链分子形成二硫键。
     “Fab’ 片段” 包含一个轻链和一个重链， 所述重链还包含 CH1 和 CH2 域之间的恒定 区部分， 以使两个重链之间能够形成链间的二硫键而形成 F(ab’ )2 分子。
     “F(ab’ )2 片段” 包含两个轻链和含一部分 CH1 和 CH2 域之间的恒定区的两个重链， 以使两个重链之间形成链间二硫键。
     免疫球蛋白 “Fc 片段” ( 或 Fc 域 ) 为抗体中负责结合至细胞上的抗体受体和补体 的 C1q 组分的部分。Fc 代表 “片段结晶” ， 即容易形成蛋白质晶体的抗体的片段。独特的蛋 白质片段 ( 最初基于蛋白水解消化描述 ) 可定义免疫球蛋白的总体一般结构。如文献中最 初定义的， Fc 片段由二硫键连接的重链铰链区、 CH2 和 CH3 域组成。然而， 后来该术语被用于 指由下述部分组成的单链 ： CH3、 CH2、 和至少一部分铰链， 其中所述铰链的至少一部分足以与 另一条这样的链形成二硫键连接的二聚物。免疫球蛋白结构和功能的综述可参见 Putnam， The Plasma Proteins， Vol.V(Academic Press， Inc.， 1987)， pp.49-140 ； and Padlan， Mol. Immunol.31 ： 169-217， 1994。如本文所述， 术语 Fc 包括天然存在的序列的变体。 免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区间断的 “框架” 区组成。因此， 术 语 “高变区” 是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。该高变区包含来自 “互补决定区” 或 “CDR”的氨基酸残基 ( 例如， 在人中， 轻链可变域中的残基 24-34(L1)， 50-56(L2)， 和 89-97(L3)， 和重链可变域中的残基 31-35(H1)， 50-65(H2) 和 95-102(H3)( 氨基酸序列号基 于 EU 索引 ； 参见 Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5th Ed.Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， Md.(1991)) 和 / 或那些来自 “高变环 (loop)” 的残基 ( 在人中， 轻链可变域中的残基 26-32(L1)， 50-52(L2) 和 91-96(L3)， 和重链可变域中的 26-32(H1)， 53-55(H2) 和 96-101(H3) ； Chothia 和 Lesk， J.Mol.Biol.196 ： 901-917， 1987)( 兹将上述文献引入并入本文 )。 “框架区” 或 “FR” 残基 为除在此定义的高变区残基之外的那些的可变域残基。 不同轻链或重链的框架区的序列在 一个物种中相对保守。因此， “人框架区” 为基本上等同于 ( 约 85％或更多， 通常 90-95％ 或更多 ) 天然存在的人免疫球蛋白的框架区的框架区。抗体的框架区 ( 其为组分轻链和重 链的框架区的总体 ) 起到定位和对准 CDR 的作用。该 CDR 主要负责对抗原表位的结合。VL 域的 CDR L1、 L2 和 L3 在这里也分别称为 LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 ； VH 域的 CDR H1、 H2 和 H3 在这里也分别称为 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3。
     “嵌合抗体” 是这样的抗体， 其轻链和重链基因是从属于不同物种的免疫球蛋白可 变区和恒定区基因构建的 ( 典型地通过基因工程 )。 例如， 可以把小鼠单克隆抗体的基因的 可变区段连接于编码人恒定区的区段 ( 例如， 人 γ1 或 γ3 重链基因， 和人 κ 轻链基因 )。 因 此， 治疗嵌合抗体是一种杂合蛋白， 通常由小鼠抗体的可变域或抗原 - 结合域以及人抗体 的恒定域构成， 但也可使用其它哺乳动物物种。具体地， 嵌合抗体通过重组 DNA 技术制备， 其中用免疫球蛋白轻链、 重链或两者的铰链和恒定区的全部或部分代替另一动物的免疫球 蛋白轻链或重链的相应区域。这样， 亲本单克隆抗体的抗原 - 结合部分被嫁接到另一物种
     “嵌合抗体” 是这样的抗体， 其轻链和重链基因是从属于不同物种的免疫球蛋白可 变区和恒定区基因构建的 ( 典型地通过基因工程 )。 例如， 可以把小鼠单克隆抗体的基因的 可变区段连接于编码人恒定区的区段 ( 例如， 人 γ1 或 γ3 重链基因， 和人 κ 轻链基因 )。 因 此， 治疗嵌合抗体是一种杂合蛋白， 通常由小鼠抗体的可变域或抗原 - 结合域以及人抗体 的恒定域构成， 但也可使用其它哺乳动物物种。具体地， 嵌合抗体通过重组 DNA 技术制备， 其中用免疫球蛋白轻链、 重链或两者的铰链和恒定区的全部或部分代替另一动物的免疫球 蛋白轻链或重链的相应区域。这样， 亲本单克隆抗体的抗原 - 结合部分被嫁接到另一物种
     的抗体的骨架上。任选地可以通过替换暴露的残基来用类人表面 (human-like surface) 来 “遮掩” (cloak) 嵌合抗体， 其结果获得 “表面装饰的抗体” (veneered antibody)。
     如本文所述， 术语 “人抗体” 包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体， 且包括 从人免疫球蛋白库或从这样的动物分离的抗体 ： 该动物转入了一种或多种人免疫球蛋白基 因且不表达内源性免疫球蛋白， 这样的动物描述于例如 Kucherlapati 等人的美国专利号 5,939,598。
     术语 “人源化免疫球蛋白” 是指包含人框架区和源自非人 ( 例如， 小鼠或大鼠 ) 免 疫球蛋白的一个或多个 CDR 的免疫球蛋白。提供 CDR 的非人免疫球蛋白称为 “供者” ， 而提 供框架的人免疫球蛋白称为 “受者” 。 恒定区不需要存在， 但如果存在的话， 它们必须基本上 相同于人免疫球蛋白恒定区， 即， 至少约 85-90％， 优选约 95％或更多的相同。因此， 人源化 免疫球蛋白的所有部分， 除了可能的 CDR， 都基本上相同于天然人免疫球蛋白序列的对应部 分。在一些情况下， 人源化抗体可在人可变区框架域内保持非人残基以增强适当的结合特 征 ( 例如， 当抗体被人源化时可能需要框架中的突变以保留结合亲和力 )。 “人源化抗体” 为 包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如， 人源化抗体不会涵盖如上定义的 典型嵌合抗体， 因为， 例如， 嵌合抗体的整个可变区都是非人的。
     “双特异性抗体” 或 “双功能抗体” 为具有两个不同的重 / 轻链对和两个不同的结合 位点的杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法制备， 包括但不限于杂交瘤的融合或 Fab’ 片段的连接。 参见， 例如， Songsivilai & Lachmann， Clin.Exp.Immunol.79 ： 315-321， 1990 ； Kostelny 等人， J.Immunol.148 ： 1547-1553， 1992。
     “二价抗体” 不同于 “多特异性” 或 “多功能” 抗体， 在某些实施方案中， 为包含两个 具有相同抗原特异性的结合位点的抗体。
     术语 “双抗体” 是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段， 这样的片段在同一多肽 链 (VH-VL) 中包含连接至轻链可变域 (VL) 的重链可变域 (VH)。通过使用太短而不允许在相 同链上的两个域之间配对的接头， 各个域被强迫与另一链的互补域配对， 产生两个抗原结 合位点。双抗体更详细描述于， 例如， EP 404,097 ； WO 93/11161 ； 和 Hollinger 等人， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 6444-6448， 1993。
     术语 “迷你抗体” 在此是指仅编码天然或非天然 ( 例如， 经诱变处理的 ) 存在的 重链可变域或轻链可变域的 2 个互补决定区 (CDR)， 或其组合的多肽。迷你抗体的实例描 述于， 例如， Pessi 等人， Nature 362 ： 367-369， 1993 ； 和 Qiu 等人， Nature Biotechnol.25 ： 921-929， 2007。
     术语 “线性抗体” 是指 Zapata 等人， Protein Eng.8 ： 1057-1062， 1995 描述的抗体。 简言之， 这些抗体包含一对串联 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)， 形成一对抗原结合区。线性抗体可 为双特异性的或单特异性的。
     本文使用的术语 “单克隆抗体” 不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语 “单克 隆抗体” 是指衍生自单一克隆的抗体， 包括任何真核、 原核、 或噬菌体克隆， 而非其制备的方 法。
     本文使用的术语 “亲本抗体” 是指通过用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。 优 选地， 该亲本抗体具有人框架区， 且如果存在的话， 具有人抗体恒定区。 例如， 该亲本抗体可 为人源化的或人抗体。“变体” 抗 VEGF-A 抗体， 在此是指由于在在亲本抗体序列中添加、 缺失和 / 或取代 一个或多个氨基酸残基而与 “亲本” 抗 VEGF-A 抗体氨基酸序列的氨基酸序列不同的分子。 在优选的实施方案中， 该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中包含一个或多个氨基酸取 代。例如， 该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中可包含约 1 至约 10 个， 优选约 2 至约 5 个取代。 通常， 该变体具有这样的氨基酸序列， 其与亲本抗体重链或轻链可变域序列具有至 少 75％的氨基酸序列同一性， 更优选至少 80％， 更优选至少 85％， 更优选至少 90％， 且最优 选至少 95％的氨基酸序列同一性。相对于该序列的同一性或同源性在在此定义为， 在比对 序列并引入缺口 ( 如果必要的话 ) 以达到最大百分比序列同一性后， 候补序列中与亲本抗 体残基相同的氨基酸残基的百分比。N- 端、 C- 端、 或内部延伸、 缺失、 或插入抗体序列中都 不应解释为影响序列同一性或同源性。该变体保持结合人 VEGF-A 的能力， 且优选具有优于 亲本受者或抗体的性质。例如， 该变体可具有更强的结合亲和力、 增强的抑制 VEGF-A- 诱导 的生物活性 ( 例如血管发生或增殖 ) 的能力。为分析这样的性质， 人们应将变体的 Fab 形 式与亲本抗体的 Fab 形式， 或变体的全长形式与亲本抗体的全长形式进行比较， 例如， 因为 已发现在本文公开的生物活性测试中抗 VEGF-A 抗体的形式影响其活性。本文特别感兴趣 的变体抗体为当与亲本抗体相比， 显示约至少 3 倍， 5 倍， 10 倍， 20 倍， 或 50 倍的生物活性增 强的抗体。
     术语 “表位” 包括任何能特异结合至免疫球蛋白或 T- 细胞受体的蛋白质决定簇。 表位决定簇通常由化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链组成， 且通常具有特定的三维结 构特征， 以及特定的电荷特征。更具体地， 本文使用的术语 “VEGF-A 表位” 是指 VEGF-A 多 肽的在动物、 优选哺乳动物、 最优选小鼠或人中具有抗原性或免疫原性活性的部分。 具有免 疫原性活性的表位是 VEGF-A 多肽的可引发动物抗体应答的部分。具有抗原活性的表位是 VEGF-A 多肽中被抗体免疫特异性结合 ( 通过任何本领域众所周知的方法测定的， 例如通过 免疫测试测定的 ) 的部分。抗原性表位不一定是免疫原性的。
     “载体 (vector)” 是这样的核酸分子， 如质粒、 粘粒、 或噬菌体， 其具有在宿主细胞 中自主复制的能力。克隆载体通常包含一个或少数个限制核酸内切酶识别位点 ( 其允许以 可确定的方式插入核酸分子而不丧失载体的必需生物功能 )， 以及编码适用于鉴别和选择 克隆载体转化的细胞的标记基因的核苷酸序列。 标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄 青霉素抗性的基因。
     “表达载体” 是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常， 表达载体包括转 录启动子、 基因和转录终止子。通常将基因表达置于启动子的控制下， 这样的基因被称为 “可操作连接” 于启动子。同样， 如果调节元件调节核心启动子的活性， 则调节元件和核心启 动子是可操作连接的。
     术语 “表达” 是指基因产物的生物合成。例如， 在结构基因的情况下， 表达包括将 结构基因转录为 mRNA 和将 mRNA 翻译为一个或多个多肽。
     关于本文所述的蛋白质， 称 “与 SEQ ID NO 规定的氨基酸残基对应的氨基酸残基” 包括这些残基的翻译后修饰物。
     术语 “新血管形成” 和 “血管发生” 在此可互换使用。新血管形成和血管发生是指 新血管在细胞、 组织或器官中的生成。 血管发生的控制通常在某些疾病状态中改变， 而且在 许多情况下， 与疾病相关的病理损害与血管发生改变的不受调节的相关。 持续性的、 不受调节的血管发生在多种疾病状态 ( 包括那些以内皮细胞的异常生长为特征的疾病 ) 中发生， 且支持在这些症状 ( 包括血管的泄漏和渗透 ) 中观察到的病理损害。
     本文使用的术语 “新生血管疾患” 是指任何具有如下所述的病理的疾病或疾患， 所 述的病理至少部分地由增加的或不受调节的血管发生活性所介导。 这样的疾病或疾患的实 例包括各种癌症， 包括实体瘤 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及某些涉及新血管形成的眼病 (“新生血管性眼病” )。 该疾病或障碍特别适于某些抑制血管发生的治疗方法， 如本文进一步描述的。
     术语 “有效量” ， 在通过向本文所述的受试者给药 FGFR 和 / 或 VEGF-A 拮抗剂治疗 新生血管疾病的背景下， 是指该药物的量， 其足以抑制受试者的血管发生以抑制一种或多 种新生血管疾病的发生或改善所述疾病的症状。有效量的药剂根据本发明方法以 “有效方 案” 给药。术语 “有效方案” 是指足以实现治疗或预防疾病或疾患的给药的量和剂量频率的 组合。
     术语 “患者” 或 “受试者” ， 在治疗本文所述疾病或障碍的背景下， 包括哺乳动物， 例 如， 人和其它灵长类。该术语还包括家养动物， 例如， 牛， 猪， 羊， 马， 狗和猫。
     如果当将两个氨基酸序列以最大对应性比对时， 两个氨基酸序列的氨基酸残基相 同， 则两个氨基酸序列具有 “100％氨基酸序列同一性” 。类似的， 如果当以最大对应性比对 时两个核苷酸序列的核苷酸残基相同， 则两个核苷酸序列具有 “100％核苷酸序列同一性” 。 序列比较可使用标准软件程序 ( 如包括在 LASERGENE 生物信息学计算程序组中的程序， 由 DNASTAR(Madison， Wisconsin) 出品 ) 来进行。 其它用于通过确定最佳比对来比较两种核苷 酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Peruski 和 Peruski， The Internet and the New Biology ： Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press， Inc.1997) ； Wu 等人 (eds.)“ ，Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins， ” Methods in Gene Biotechnology 123-151(CRC Press， Inc.1997) ； Bishop(ed.)， Guide to Human Genome Computing(2nd ed.， Academic Press， Inc.1998))。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对彼此具有至少 80 ％， 至少 90 ％， 或至少 95％序列同一性， 则两个核苷酸或氨基酸序列认为是具有 “基本上类似的序列同一性” 或 “基本上序列同一性” 。
     百分比序列同一性通过常规方法测定。参见， 例如， Altschul 等人， Bull.Math. Bio.48 ： 603， 1986， 和 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1992。 例如， 可比对两个氨基酸序列以优化排列得分， 其使用的缺口形成罚分 (gap opening penalty) 为 10， 缺 口 延 伸 罚 分 (gap extension penalty) 为 1， 和 上 文 的 Henikoff 和 Henikoff 的 “BLOSUM62” 评分矩阵， 如表 1 所示 ( 氨基酸通过标准单字母代码表示 )。然后 百分比同一性如下计算 ： ([ 相同匹配的总数 ]/[ 较长序列的长度加上引入较长序列以比对 该两个序列的缺口数 ])(100)。
     表1： BLOSUM62 评分矩阵
    本领域技术人员理解存在许多已建立的算法以比对两个氨基酸序列。该 Pearson 和 Lipman 的 “FASTA” 相似性搜索算法是用于检测本文公开的氨基酸序列和第二氨基酸 序列所享有的同一性水平的合适的蛋白质比对方法。该 FASTA 算法描述于 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988， 和 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990。简言之， FASTA 首先表征序列相似性， 其方法是鉴别查询序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 2 的残基 25-266) 与测试序列共享的如下所述的区域， 它们或者具有最高的同一性密度 ( 如 果 ktup 变量为 1) 或最高的同一性成对数 ( 如果 ktup ＝ 2))， 不考虑保守氨基酸置换、 插 入、 或缺失。然后对具有最高同一性密度的 10 个区重新评分， 方法是使用氨基酸置换矩阵 比较所有成对的氨基酸的相似性， 再 “修剪” 区的末端以仅包括那些对最高评分有贡献的 残基。如果存在多个分数大于 “截断” 值 ( 基于序列长度和 ktup 值通过预定的公式计算 ) 的区， 则检查被修剪的起始区以确定这些区域能够被连接起来形成近似的带有缺口的比 对。最后， 将两个氨基酸序列的最高的得分区使用修饰的 Needleman-Wunsch-Sellers 算法 对准 (Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 444， 1970 ； Sellers， SIAM J.Appl.Math.26 ： 787， 1974)， 这种算法允许氨基酸插入和缺失。FASTA 分析的例示的参数为 ： ktup ＝ 1， 缺 口形成罚分＝ 10， 缺口延伸罚分＝ 1， 且置换矩阵＝ BLOSUM62。可通过修改评分矩阵文件 (“SMATRIX” ) 将这些参数引入 FASTA 程序， 如 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990 的附 件 2 所述。
     FASTA 也可用于测定核酸分子的序列同一性， 使用以上公开的比例。 对于核苷酸序 列比较， ktup 值范围可为 1 至 6， 优选 3 至 6， 最优选 3， 其它参数如上设定。
     附图简述
     图 1A-1C 描述某些免疫球蛋白 Fc 多肽的氨基酸序列。氨基酸序列数基于 EU 索 引 (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest， US Department of Health and Human Services， NIH， Bethesda， 1991)。阐述的序列包括野生型人序列 (“wt” ； SEQ ID NO ： 75) 和 5 个变体序列， 称为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， Fc4(SEQ ID NO ： 77)， Fc5(SEQ ID NO ： 74)， Fc6(SEQ ID NO ： 78)， 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。通常在与轻链恒 定区 (LC) 和重链恒定区 (HC) 的二硫键键合中涉及的 Cys 残基被标示出来。 “.” 表示与在 该位置的野生型的同一性。*** 表示终止密码子 ； C- 端 Lys 残基已从 Fc6 去除。示出了铰 链、 CH2 和 CH3 域的边界。
     图 2 描述了四价、 双特异性抗体 / 可溶受体组合， 其对两个不同的靶 ( 在此称为 αVEGF-A 和 FGFR 的配体结合域 ) 具有特异性。
     图 3 描 述 显 示 对 FGF-9- 刺 激 的 成 骨 细 胞 增 殖 的 可 变 抑 制 的 FGFR-Fc(R&D Systems)。
     图 4A 描 述 FGFR-Fc 构 建 体 (ZymoGenetics) 抑 制 FGF-9- 刺 激 的 增 殖。 全 长 FGFR3-Fc 野生型和突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50 ； 图 4B 描述截短的 FGFR3-Fc 突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     图 5A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-8b 的直接结合， 图 5B 描述 FGFR-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-8b 的直接结合。
     图 6A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-17 的直接结合， 图 6B 描述 FGFR2-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 7 描述 FGFR3-Fc 构建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 8A 描述 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细胞的生长， 图 8B 描述 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞 的生长。
     图 9 描述 FGF 受体家族的第二和第三 Ig 样域。
     发明描述
     I. 概述
     本发明通过提供新蛋白质， 即多特异性结合蛋白， 特别是双特异性结合蛋白， 解决 了本领域对于提供更多治疗剂以治疗癌症， 特别是实体瘤的需求。所述蛋白质包含与抗体 部分融合的可溶受体部分。如本文所述， 术语 “双特异性结合蛋白” 是指能通过至少两种具 有不同结合特异性的结合部分特异结合至少两种不同的靶分子的蛋白质。 该结合部分可以 是例如蛋白质 ( 例如， 抗体或可溶受体 ) 或小分子。 双特异性结合蛋白的结合部分可以是物 理连接的。如本文所述的本发明提供包含可溶受体部分和抗体部分的双特异性结合蛋白。
     在本发明中， 可溶的受体部分包含可溶的 FGF 受体或其部分， 而抗体部分包含 VEGF-A 抗体或其部分， 如本文所述。在某些实施方案中， 双特异性结合蛋白的两个或多个 不同的部分通过接头连接以形成多聚物 ( 例如， 二聚物 )。例如， 在包含至少两个多肽部分 ( 例如， 可溶 FGF 受体和 VEGF-A 抗体 ) 的融合的双特异性结合蛋白的情况下， 可利用肽接头 序列来分隔， 例如， 多肽组分， 将它们分隔成足以保证各多肽折叠为其二级和三级结构的距 离。
     在某些实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白减少 FGF 和 VEGF-A 两者的生物活 性。具体地， 本发明提供 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂， 特别是中和性抗 VEGF-A 抗体与 FGF 可溶受体的组合， 其减少通过 VEGF-A 受体和 FGF 受体的信号传递。使用这样的拮抗剂减少经由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可用于治疗多种具有至少部分以新血管形成为特征的病 理的疾病。例如， 在肿瘤中和肿瘤周围抑制藉由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可减少 肿瘤形成血管、 生长和转移的能力。
     FGF 受体的活化可活化多种信号转导途径， 包括磷脂酶 C、 磷脂酰肌醇 3- 激酶、 促分裂原活化的蛋白质激酶、 以及转录的信号转导物和活化剂 (STAT) 途径， 这些途径都 在前列腺癌进展中起作用。FGF 信号传导增加的净结果包括增强的增殖、 对细胞死亡的抗 性、 增加的活动力和侵袭力、 增加的血管发生、 增强的转移、 对化疗和放射的抗性和雄激素 非依赖性等， 这些都可增强肿瘤进展和临床侵占性。FGF 受体和 / 或 FGF 信号传导可直 接影响肿瘤细胞， 也可影响肿瘤血管发生 (Kwabi-Addo 等人， Endocrine-Related Cancer 11(4)709-724， 2004)。
     本发明提供减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂。该 FGF- 结合部分为可溶 FGF 受体 (FGFR) 且 VEGF-A- 结合部分为 VEGF-A 抗体。根据本发明， 该 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂为特异结合且减少 VEGF-A 和 FGF 活性的双特异性抗体 / 可溶受体 结合蛋白。本发明的双特异性结合蛋白在此详细描述。
     II.FGF 受体， 抗 VEGF-A 抗体， 和相关双特异性结合组合物
     A.FGF 受体
     该分子的 FGFR 部分为可溶受体。该 FGFR 包含三个 Ig 样域， 称为 D1， D2 和 D3。该 受体可包含 FGF 受体的 D1， D2， D3， 或可包含 D2， D3 而没有 D1。而且， 该受体可为天然受体 或在 D2-D3 区具有突变。该 FGFR 家族和域 D2 和 D3 示于图 1。
     已证实 D1 的截短可增加受体的亲和力和增强受体 / 配体相互作用 (Olsen 等人 PNAS 101 ： 935-940， 2004)。已知 FGFR1-3 由于在 D3 的羧基端的可变剪接而具有多个同种 型。从该知识出发， 本发明者制成了多种具有三个或两个 Ig 样域的变体可溶 FGF 受体， 且 表征了它们对 FGF 配体的结合亲和力。该 FGFR3 和 FGFR2 同种型 IIIc 是特别令人感兴趣 的， 因为它们比相应的 IIb 同种型对 FGF 2， 6， 8b， 9 和 17 具有更高的亲和力。
     FGF 受体可以基于它们对 FGF 配体的结合亲和力来定性。对给定的相互作用， 测 -1 -1 -1 量结合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s ))。结合速率常数是反映配体 - 受体 复合物形成速率的值。解离速率常数是反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常 表示为平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是将解离速率常数除以结合速 率常数 (kd/ka) 而获得， 而 KA 是将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 而获得。具有类似 KD( 或类似 KA) 的分子可具有在广范围内可变的结合和解离速率常数。当在标准体外测试 如 BIACORE 结合分析中测量时， 对本发明双特异性结合蛋白的结合亲和力将在 100nM 或更 少， 优选 10nM 或更少， 且更优选 1nM 或更少的范围。
     在某些实施方案中， FGFR 为 FGFR3IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 2 的第 262 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 9 的第 142 号氨基酸从 S 突变为 W。其它具 体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 15 的第 263 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 22 的第 143 号氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR3IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 10， 19 和 22 所示。
     在其它某些实施方案中， FGFR 为 FGFR2IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 29 的氨基酸数 X 或 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸数 Xa 从 S 突变为 W。其它具体 实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 33 的第 Y 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 42 的第 Ya 号 氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR2IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 37 和 42 所示。
     B.VEGF-A 抗体
     用于本发明的 VEGF-A 拮抗剂包括这样的分子， 它们结合至 VEGF-A 或 VEGF-A 受 体， 从而诱导 VEGF-A 对表达该受体， 例如， VEGFR-1， VEGFR-2， 神经纤毛蛋白 -1， 和 / 或神 经纤毛蛋白 -2 的细胞的活性。特别是， VEGF-A 拮抗剂包括抗 VEGF-A 抗体。其它合适的 VEGF-A 拮抗剂包括包含 VEGFR 细胞外域的可溶 VEGF-A 受体， 以及能抑制 VEGF-A 与其受体 的相互作用或能以其他方式抑制 VEGF-A 诱导的通过 VEGF-A 受体的细胞内信号传导的小分 子拮抗剂。此外， 可使用基于非抗体支架的结合蛋白质。( 参见， 例如， Koide 等人， J.Mol. Biol.284 ： 1141-1151， 1998 ； Hosse 等人蛋白质 Sci.15 ： 14-27， 2006， 以及其中的文献 )。 本 发明使用的优选的 VEGF-A 拮抗剂包括特异结合至 VEGF-A 的抗体， 包括也包含对 FGF 的结 合位点的双特异性抗体。对 VEGF-A 特异的抗体至少结合 VEGF-A 的可溶分泌形式， 且优选 还结合关联于细胞表面的形式。
     抗体在以下情况下被认为是特异结合的， 如果 (1) 它们显示结合活性的阈水平， 和 (2) 它们不显著与对照多肽分子交叉反应。例如， 如果抗 VEGF-A 抗体结合至 VEGF-A 多 肽、 肽或表位的亲和力为与对照 ( 非 VEGF-A) 多肽的结合亲和力的至少 10 倍， 则确定结合 6 -1 阈水平。 优选的是， 本发明中使用的抗体具有的结合亲和力 (Ka) 为 10 M 或更大， 优选 107M-1 或更大， 更优选 108M-1 或更大， 最优选 109M-1 或更大。抗体的结合亲和力可由本领域技术人 员容易地确定， 通常使用自动设备通过表面等离子共振测定。 其它方法是本领域已知的， 例 如 Scatchard 分析 (Scatchard， Ann.NY Acad.Sci.51 ： 660-672， 1949)。
     本发明的抗体包含保持抗原 - 结合特异性的完整抗体的部分或由其组成。合适的 抗体包括， 例如， 完全的人抗体 ； 人源化抗体 ； 嵌合抗体 ； 抗体片段例如 Fab， Fab’ ， F(ab)2， F(ab’ )2 和 Fv 抗体片段 ； 单链抗体 ； 和抗体重链或轻链的单体或二聚物或其混合物。本发 明的优选抗体为单克隆抗体。包含轻链的抗体可包含 κ 或 λ 轻链。
     在某些实施方案中， 本发明的抗体包括任何同种型的完整免疫球蛋白， 包括 IgA， IgG， IgE， IgD， 或 IgM( 包括其亚型 )。根据本发明的完整免疫球蛋白优选包括完整 IgG( 例 如， 完整 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 或 IgA2)。
     制备和分离多克隆抗体、 单克隆抗体和其抗原 - 结合抗体片段的方法是本领域已 知的。参见， 例如， Current Protocols in Immunology， (Cooligan 等人 eds.， John Wiley and Sons， Inc.2006) ； Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor， NY， 2nd ed.1989) ； 和 Monoclonal Hybridoma Antibodies ： Techn iques and Applications(Hurrell ed.， CRC Press， Inc.， Boca Raton， FL， 1982)。抗原结合片 段， 包括 scFv， 可根据本领域已知方法使用噬菌体展示文库制备。噬菌体展示也可用于基 于非抗体支架制备结合蛋白质 (Koide 等人， 上文 .)。制备重组人多克隆抗体的方法公开 于 Wiberg 等 人， Biotechnol Bioeng.94 ： 396-405， 2006 ； Meijer 等 人， J.Mol.Biol.358 ： 764-772， 2006 ； Haurum 等人， 美国专利申请公开 No.2002/0009453 ； 和 Haurum 等人， 美国专 利申请公开 No.2005/0180967。对本领域技术人员显而易见的是， 用于本发明的多克隆抗体可通过用免疫源性多 肽或多肽片段接种多种温血动物如马， 牛， 山羊， 绵羊， 狗， 鸡， 兔， 小鼠， 和大鼠的任一种而 产生。免疫原性多肽的免疫原性可通过使用佐剂， 如明矾 ( 氢氧化铝 ) 或弗氏完全或不完 全佐剂来增加。用于免疫的多肽还包括融合多肽， 如 VEGF-A 或其部分与免疫球蛋白多肽或 与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可为全长分子或其部分。如果多肽部分为半抗原 状， 其可有利地结合或连接至大分子载体 ( 如钥孔虫戚血兰素 (KLH)， 牛血清白蛋白 (BSA) 或破伤风类毒素 ) 以用于免疫。
     此外， 抗体可相对于与抗体靶 ( 例如， 直向同源物， 横向同源物 (paralogs))， 或其 序列变体相关的已知多肽进行筛选， 例如， 以分离对于结合靶蛋白或多肽而言高度特异的 抗体群体。这样的高特异性群体包括， 例如， 结合至人 VEGF-A 但不结合至小鼠 VEGF-A 的抗 体。 这种与相关多肽分子的交叉反应性的缺失通过， 例如， 使用标准蛋白质印迹分析通过检 测 VEGF-A 多肽而不检测已知的相关多肽的抗体显示 (Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人 eds.， Green and Wiley and Sons， NY 1993)) 或 ELISA( 酶免疫 测定 )(Immunoassay， A Practical Guide(Chan ed.， Academic Press， Inc.1987))。在 另一实例中， 针对 VEGF-A 多肽产生的抗体吸附到粘附在不可溶基质上的相关多肽上， 对 VEGF-A 多肽高度特异的抗体将在适当的缓冲条件下流过基质。筛选使得分离与已知的密 切相关的多肽无交叉反应性的多克隆和单克隆抗体成为可能 (Antibody ： A Laboratory Manual(Harlow and Lane eds.， Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988) ； Current Protocols in Immunology(Cooligan 等人 eds.， National Institutes of Health， John Wiley and Sons， Inc.1995)。特异抗体的筛选和分离是本领域已知的。参见 Fundamental Immunology(Paul ed.， Raven Press 1993) ； Getzoff 等 人， Adv.in Immunol.43 ： 1-98， 1988 ； Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice(Goding ed.， Academic Press Ltd.1996) ； Benjamin 等人， Ann.Rev.Immunol.2 ： 67-101， 1984。
     天然单克隆抗体 (“mAbs” ) 可通过， 例如， 用纯化的免疫原性蛋白或其片段免疫 受试者动物 ( 例如， 大鼠或小鼠 ) 而制备。在典型的程序中， 首先分别对动物给予腹腔内 (IP) 注射纯化的蛋白质或其片段， 通常与佐剂 ( 例如， 完全弗氏佐剂或 RIBI 佐剂 ( 获自 Sigma-Aldrich， St.Louis， MO)) 组合， 然后以例如两周的间隔加强 IP 注射纯化蛋白质。给 予第三加强注射后 7-10 天， 对动物放血并收集血清。视需要可以给予更多次的加强接种。 使用常规方法从高效价动物收集脾细胞和淋巴节细胞， 并使其融合至骨髓瘤细胞 ( 例如， 小鼠 SP2/0 或 Ag8 细胞 )。然后将该融合混合物在胸腺细胞的滋养层上培养或用合适的 培养基补充物培养 ( 包括可商购的补充物如杂交瘤融合和克隆补剂 ； Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)。融合后约 10 天， 使用标准测试 ( 例如 ELISA) 鉴别特异的产生抗体的 杂交瘤群。对于阳性池可进一步分析其阻断或减少靶蛋白的活性的能力。通过限制稀释克 隆阳性池。
     在某些方面， 本发明还包括多种单克隆抗体的用途， 所述多种单克隆抗体对单一 靶分子上对不同表位特异。组合使用这样的多种抗体可减少单一抗体所见的载体效应 (carrier effect)， 且还可通过 Fc 受体增加清除率和改善 ADCC。可组合使用两种、 三种或 多种单克隆抗体。
     天然抗体的氨基酸序列可通过使用重组 DNA 技术改变。因此， 抗体可进行重新设计以得到所需特征。相对其非修饰的形式， 修饰的抗体可提供例如改善的稳定性和 / 或治 疗功效。可能的变化有很多， 范围可以从改变仅一个或一些氨基酸到对例如可变区或恒定 区的完全重新设计。 制造恒定区的变化的目的通常是改善或改变特征， 如补体结合、 与膜的 相互作用和其它效应物作用。 通常， 制造可变区的变化以改善抗原结合特征， 改善可变区稳 定性， 或减少免疫原性的风险。噬菌体展示技术也可使用。参见， 例如， Huse 等人， Science 246 ： 1275-1281， 1989 ； Ladner 等人， 美国专利号 5,571,698。
     对 于 用 于 人 体 的 治 疗 用 抗 体， 通常需要根据已知方法将抗体的非人区人源 化。制备人源化抗体的方法公开于， 例如， 美国专利 5,530,101 ； 5,821,337 ； 5,585,089 ； 5,693,762 ； 和 6,180,370。通常， 人源化抗 VEGF-A 抗体包含小鼠供免者疫球蛋白的互补决 定区 (CDR) 和人受者免疫球蛋白的重链和轻链框架。 通常， 人框架区中的框架残基将被 CDR 供者抗体的相应残基取代， 以改变 ( 优选改善 ) 抗原结合。通过本领域众所周知的方法辨 别这些框架取代， 例如， 通过模仿 CDR 和框架残基的相互作用以鉴别对抗原结合重要的框 架残基和序列比较以鉴别在特定位置的一般的框架残基。( 参见， 例如， Queen 等人， 美国专 利号 5,585,089 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323， 1988)。
     非人源化嵌合抗体也可治疗性地使用 ( 例如， 在免疫抑制患者中 )。因此， 在一 些变化中， 根据本发明的抗体是从例如非人抗 VEGF-A 抗体衍生的嵌合抗体。优选地， 嵌合 抗体包含衍生自小鼠或大鼠抗体的可变区和衍生自人的恒定区， 以使该嵌合抗体当给予人 受试者时具有较长的半衰期和较低的免疫原性。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。 ( 参见例如， Morrison， Science 229 ： 1202， 1985 ； Oi 等人， BioTechniques 4 ： 214， 1986 ； Gillies 等人， J.Immunol.Methods 125 ： 191-202， 1989 ； 美国专利 5,807,715 ； 4,816,567 ； 和 4,816,397)。
     本发明还包括完全的人抗体， 如衍生自卵巢， 乳腺， 肾， 结肠直肠， 肺， 子宫内膜， 或 脑癌患者的外周血单核细胞的。该细胞可与骨髓瘤细胞融合， 例如， 以形成产生抗 VEGF-A 的完全的人抗体的杂交瘤细胞。人抗体也可以在转基因非人动物 ( 通常为小鼠 ) 中制备。 参见， 例如， Tomizuka 等人， 美国专利 No.7,041,870。通常， 非人哺乳动物就人重链基因座 和人轻链基因座而言是转基因的， 且相应的内源性免疫球蛋白基因座被失活。
     本发明的抗体可用它们所识别或特异结合的 VEGF-A 多肽的表位或部分来特指。 表位或多肽部分可例如， 用 SEQ ID NO ： 72 所示的 VEGF-A 多肽的表位或其它部分的 N- 端和 C- 端位置来特指。
     本发明的抗体具有这样的结合亲和力， 其包括的小于 5x 10-2M， 小于 10-2M， 小于 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x -10 -10 -11 -11 -12 -12 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10-13M， 小 -13 -14 -14 -15 -15 于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 或小于 10 M 解离常数 (Kd)。
     本发明的抗体进一步包括修饰的衍生物， 修饰的方式例如， 通过对抗体的任何类 型的分子共价连接， 以使共价连接不阻止抗体结合至其表位。合适的修饰包括， 例如， 岩藻 糖基化， 糖基化， 乙酰化， 聚乙二醇化， 磷酸化和酰胺化。 该抗体及其衍生物本身可通过已知 的保护基 / 封闭基、 蛋白酶剪切、 与细胞配体或其它蛋白质的连接等而衍生化。在本发明一 些实施方案中， 抗体的至少一个重链被岩藻糖基化。 在具体的变化形式中， 该岩藻糖基化是N- 连接的。在某些优选的实施方案中， 抗体的至少一个重链包含岩藻糖基化、 N- 连接的寡 糖。
     本发明的抗体可单独使用或作为与细胞毒素剂的免疫缀合物使用。在一些实施 方案中， 该试剂为化学治疗剂。在其它实施方案中， 该试剂为放射性同位素， 例如， 铅 -212， 铋 -212， 砹 -211， 碘 -131， 钪 -47， 铼 -186， 铼 -188， 钇 -90， 碘 -123， 碘 -125， 溴 -77， 铟 -111， 或可裂变核素如硼 -10 或锕系元素。在其它实施方案中， 该试剂为毒素或细胞毒素药物， 例 如蓖麻毒蛋白、 修饰的假单胞菌肠毒素 A、 加利车霉素 (calicheamicin)、 阿霉素、 5- 氟尿嘧 啶、 auristatin( 例如， auristatin E)、 美登木素 (maytansin)、 等。抗体和抗体片段与该试 剂的缀合方法是本领域已知的。
     本发明的抗体包括相对参照抗体 ( 例如， 具有表 2 或表 3 所示 VL 和 / 或 VH 序列 的参照抗体 ) 具有单个或多个氨基酸取代， 缺失， 添加， 或置换的变体， 以使该变体保持参 照抗体的一种或多种生物特性 ( 例如， 阻断 VEGF-A 与其各自的对应结构 (VEGF-A 受体 ) 的 结合， 阻断 VEGF-A 的生物活性， 结合亲和力 )。 本领域技术人员可制备具有单一或多重氨基 酸取代、 缺失、 加成或置换的变体。这些变体可包括， 例如 ： (a) 其中一个或多个氨基酸残基 被保守或非保守氨基酸置换的变体， (b) 其中一个或多个氨基酸被添加至多肽或从多肽被 删除的变体， (c) 其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体， 和 (d) 其中多肽与可赋予多肽 有用的特性的另一肽或多肽融合的变体， 所说的另一肽或多肽如融合配偶体、 蛋白标记物 或其它化学部分， 例如抗体的表位、 多组氨酸序列、 生物素部分等。本发明的抗体可包括以 下变体， 其中一个物种的氨基酸残基代替另一物种中的对应残基， 代替可发生在保守的或 非保守的位置。在另一实施方案中， 非保守的位置的氨基酸残基被保守的或非保守的残基 代替。 获得这些变体的技术， 包括遗传的 ( 抑制、 缺失、 突变等 )、 化学的和酶学的技术， 是本 领域技术人员已知的。
     结合至 VEGF-A 的示例性抗体已通过筛选噬菌体展示文库得以鉴定。通过噬菌 体展示的筛选方法详细描述于标准参考文章， 如 Babas， Phage Display ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab Press ， 2001) 和 Lo ， Benny K.C. ， A. ， Antibody Engineering(2004)。该噬菌体展示文库可用于将表达的蛋白质展示在细胞或其它物质的 表面， 以使互补的结合实体可以被功能性分离 (functionally isolated)。在一种这样的 噬菌体展示文库中， 将抗体轻链可变区和部分重链可变区与编码人抗体序列的合成 DNA 组 合， 然后它们在噬菌体和噬菌粒文库上作为 Fab 抗体片段被展示 (Dyax Human Antibody Libraries， Dyax Corp.， Cambridge， MA.)。因此， 抗体的可变轻链和重链片段可以以 Fab 形式被分离。然后可处理这些可变区以产生抗体， 包括抗原 - 结合片段， 如 scFv， 双特异性 scFv， 以及针对 VEGF-A 的多特异性、 多功能拮抗剂。
     使用该技术， 示例性 Fabs 的可变区已在本文所述得测试中因其结合和 / 或中和 VEGF-A 的特征而被鉴定出来。( 参见下文实施例 )。处理这些可变区以产生多种结合实体， 包括结合和 / 或中和 VEGF-A 的 scFv。下表 2 显示因其结合和中和 VEGF-A 的能力而被鉴定 出的抗 VEGF-A 抗体簇的核苷酸和氨基酸 SEQ ID NO. 标号， 而表 3 列出了对应于表 2 所列 的抗 VEGF-A 抗体的框架和 CDR 区的氨基酸残基位置。
    在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF-A 抗体包含表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的一 个或多个 CDR( 相应 CDR 区的边界分别示于表 3)。 例如， 在某些变化中， 该抗体包含表 2 所列
     的抗体的重链 CDR(HCDR1， HCDR2 和 HCDR3 区中的至少一个 ) 和 / 或相应的轻链 CDR(LCDR1， LCDR2， 和 LCDR3 区中的至少一个 )。在典型实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有表 2 所列的 抗体的两个或三个重链 CDR 和 / 或两个或三个轻链 CDR。在一些变化中， 其中抗 VEGF-A 抗 体具有表 2 所列的抗体的至少一个重链 CDR， 该抗体进一步包含至少一个相应的轻链 CDR。
     在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A 抗体包括重和 / 或轻链可变域， 该重链或轻链可 变域具有 (a) 对应于表 2 所列的抗体所示的重链或轻链 CDR 的一组三个 CDR， 和 (b) 一组四 个框架区。例如， 抗 VEGF-A 抗体可包含重和 / 或轻链可变域， 其中该重链或轻链可变域具 有 (a) 一组三个 CDR， 其中该组 CDR 源自表 2 所列的抗体， 和 (b) 一组四个框架区， 其中该组 框架区与表 2 所列的相同抗体的那组框架区相同或不同。
     在具体实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体包含与表 2 所列的抗体的重和 / 或轻链可变区 基本上相同的重链可变区和 / 或轻链可变区。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， LCDR1 具有 SEQ ID NO ： 66 的 残基 24-34 所示的氨基酸序列 ； LCDR2 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 50-56 所示的氨基酸序 列； LCDR3 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 89-97 所示的氨基酸序列 ； HCDR1 具有抗体 c1039 的 HCDR1 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 31-35) ； HCDR2 具有抗体 c1039 的 HCDR2 氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自 SEQ ID NOs ： 68 的氨基酸序列。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， LCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 23-35) ； LCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR2 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 51-57) ； LCDR3 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR3 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 90-100) ； HCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 31-35) ； HCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR2 氨基酸序 列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 99-102 的氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870， c1039 和 c1094 的抗体的 CDR LCDR1， LCDR2， LCDR3， HCDR1， HCDR2 和 HCDR3。例如， 在 具体实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的抗体的轻链和重链可 变域 (VL 和 VH)。
     在其它实施方案中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体包括含 CDR LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 的 VL 域和含 CDR HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 的 VH 域， 其中该组 VL 和 VH CDR 相对第二组 CDR 具有 3 个或更少个氨基酸取代， 其中所述第二组 CDR 具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的 抗体的 LCDR1、 LCDR2、 LCDR3、 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该 抗体在所述组的 CDR 中包含 0、 1 或 2 个氨基酸取代。
     本发明的抗 VEGF-A 抗体识别的表位通常包含人 VEGF-A165 的 5 个或更多个氨基酸 (SEQ ID NO ： 72 的残基 27-191)。优选的表位包含至少一个包含在一个或多个以下 VEGF-A 的多肽区内的氨基酸 ： HEVVKFMDVYQRSYCHPIETL(SEQ ID NO ： 72 的 氨 基 酸 残 基 38-58)， EYIFKPSCVPLMRCG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84)， EESNITMQIMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 98-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。 在某些实施方案中， 该 表位包含至少 2 个、 至少 3 个、 至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 或至少 7 个源自 SEQ ID NO ： 72 的残基 38-58、 70-84、 98-114、 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的氨基酸。 在一些变化形式中， 该 VEGF-A 表位是通过使用重叠 VEGF-A 肽 )( 例如 13- 聚肽， 其中在每对 依次的肽之间有例如 2 个氨基酸移位 ) 的肽微阵列表位作图而确定的表位。
     在上述抗 VEGF-A 抗体的具体变化形式中， 该抗 VEGF-A 表位包含包括在一个或多 个以下的 VEGF-A 多肽区内的至少一个氨基酸 ： KFMDVYQRSYC(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 42-52)， IFKPSCVPLMR(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 72-82)， IMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的 氨基酸残基 106-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。在某些实施方案中， 该表 位包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 42-52， 72-82， 106-114， 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的至少两个， 至少 3 个， 至少 4 个， 至少 5 个， 至少 6 个， 或至少 7 个氨基酸。
     在一些相关的变化形式中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体结合至如下所述的表位， 该表位包含 (a) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 38-58 或 42-52 所示的第一 VEGF-A 多肽区 内包含的一个或多个氨基酸， 和 (b) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84 或 72-82 所示的 第二 VEGF-A 多肽区内包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的某些实施方案中， 该表位 不包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 90 至 132 所示的 VEGF-A 的多肽区内包含的氨基酸 (EGLECVP TEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRP)。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， 该表位 进一步包含 (c) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 96-114 或 106-114 所示的第三 VEGF-A 多肽区内 包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a)、 (b) 和 (c) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， 该 抗体不以彼此的 10 倍以内的 Kd 值结合人和小鼠 VEGF-A。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它变化形式中， 该表位 进一步包含 (d) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 142-154 所示的第四 VEGF-A 多肽区内包含的一个 或多个氨基酸。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 抗 VEGF-A 抗 体 为 抗 体 片 段， 例 如 Fv、 Fab、 Fab’ 、 F(ab)2、 F(ab’ )2、 scFv、 或双特异性抗体。在一些优选的实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体为 scFv。结合 VEGF-A 的 scFv 实体可具有这样的取向， 其中轻链可变 (VL) 区位于重链可变 (VH) 区的氨基 端或者羧基端。在一些变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 X 所列的抗 VEGF-A 抗体的 CDR。 在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的 VL 和 VH 域。 在某些 实施方案中， 抗 VEGF-A scFv 的 CDR 或 VL 和 VH 域为选自 c870 c1039 和 c1094 的抗 VEGF-A 抗体的 CDR 或 VL 和 VH 域。在抗 VEGF-A scFv 的具体变化形式中， 该 scFv 包含如 SEQ ID NO ： 70(c1039scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 69 所示 ) ； SEQ ID NO ： 44(c870.1e6scFv ； 核 苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) ； 或 SEQ ID NO ： 46(c1094.1scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) 所述的氨基酸序列。此外， scFvs 可以多种双特异性抗体形式的任一种提供， 例如， 串联 scFv(tascFv)、 双 - 单链 Fv(biscFv)、 和具有融合至羧基端的单链 Fv(scFv) 的 完整单克隆抗体 (biAb)( 参见上文 )。
     C. 使用 Fc 蛋白质缀合的双特异性抗体 / 可溶受体组合
     双特异性结合蛋白通过免疫球蛋白重链的 Fc 区结合本发明的结合蛋白， 如图 2 所 例示的。该 Fc- 融合蛋白包含 IgG 分子的 Fc 区。在另一实施方案中， 该 Fc 区来自人 IgG1 分子。在一些实施方案中， 该免疫球蛋白融合物包括 IgG1 分子的铰链、 CH2 和 CH3 区， 或铰链、 CH1、 CH2 和 CH3 区。
     免 疫 球 蛋 白 融 合 物 的 制 备 也 参 见 美 国 专 利 No.5,428,130， 美国专利 No.5,843,725， 美国专利号 6,018,026， 和 Chamow 等人， TIBTECH， 14 ： 52-60(1996)。
     最简单和最直接的 Fc- 融合蛋白设计通常藉由免疫球蛋白重链的 Fc 区联合本发 明的拮抗剂多肽的结合域。在本发明的 Fc- 融合蛋白中， 编码结合组分的核酸融合至编码 免疫球蛋白恒定域序列的 N- 端的核酸的 C 端， 但是 N- 端融合物也是可能的。
     典型地， 这样的融合物中， 编码的嵌合多肽将至少保持免疫球蛋白重链的恒定区 的功能活性铰链、 CH2 和 CH3 域。还在恒定域的 Fc 部分的 C- 端， 或直接在重链的 CH1 或轻 链的对应区域的 N 端进行融合。 进行融合的精确位点不是关键的 ； 具体位点是公知的， 且可 加以选择以优化 Fc- 融合蛋白的生物活性、 分泌或结合特征。
     在一个优选的实施方案中， 该结合域序列融合至免疫球蛋白 G1(IgG1) 的 Fc 区的 N- 端。可以融合整个重链恒定区与结合域序列。然而， 更优选地， 融合中使用这样的序列， 其起始于化学限定 IgG Fc 的木瓜蛋白酶切割位点 ( 即残基 216， 将重链恒定区的第一残基 作为 114) 或其它免疫球蛋白中的类似位点紧邻上游的铰链区。在特别优选的实施方案中， 该结合域氨基酸序列融合至 (a) 铰链区和 CH2 和 CH3 或 (b)IgG 重链的 CH1、 铰链、 CH2 和 CH3 域。
     对于双特异性 Fc- 融合蛋白， Fc- 融合蛋白被组装为多聚体， 特别是异源二聚体或 异源四聚体。通常， 这些组装的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。一种基本的四链结构 单位是存在于 IgG、 IgD 和 IgE 中的形式。四链单位在高分子量免疫球蛋白中重复 ； IgM 通 常以通过二硫键保持在一起的四个基本单位的五聚体存在。IgA 球蛋白， 偶尔还有 IgG 球 蛋白， 也可在血清中以多聚体形式存在。 在多聚体的情况下， 四个单位的每一个可相同或不 同。
     或者， 可将 Fc 序列插入免疫球蛋白的重链和轻链序列之间， 而得到包含嵌合重链 的免疫球蛋白。在该实施方案中， 在免疫球蛋白的每条臂中 Fc 序列融合至免疫球蛋白重 链的 3 ′端， 或是在铰链和 CH2 域之间， 或是在 CH2 和 CH3 域之间。类似构建体已报道于 Hoogenboom 等人， Mol.Immunol.， 28 ： 1027-1037(1991)。
     尽管在本发明的 Fc- 融合蛋白中不需要免疫球蛋白轻链的存在， 但免疫球蛋白轻 链可共价连接于结合域 - 免疫球蛋白重链融合多肽， 或直接融合于结合域。在前者的情况 下， 通常将编码免疫球蛋白轻链的 DNA 与编码结合域免疫球蛋白重链融合蛋白的 DNA 共表 达。 当分泌时， 杂合的重链和轻链将被共价连接， 而提供一种包含两个由二硫键连接的免疫 球蛋白重链 - 轻链对的免疫球蛋白状结构。适合制备该结构的方法例如公开于美国专利 No.4,816,567。
     Fc- 融合蛋白最方便地通过将编码结合域部分的 cDNA 序列合框地融合于免疫球 蛋白 cDNA 序列而构建。 然而， 也可使用与基因组免疫球蛋白片段的融合 ( 参见， 例如 Aruffo 等人， Cell， 61 ： 1303-1313(1990) ； 和 Stamenkovic 等人， Cell， 66 ： 1133-1144(1991))。后 一类型的融合需要存在 Ig 调节序列以用于表达。基于自脾或外周血淋巴细胞衍生的 cDNA 库中公开的序列， 可以通过杂交或聚合酶链反应 (PCR) 技术来分离编码 IgG 重链恒定区的 cDNA。将编码 Fc- 融合蛋白的结合域和免疫球蛋白部分的 cDNA 串联地插入指导在所选的 宿主细胞中的高效表达的质粒载体中。已进行了特殊的修饰以制备用于产生本发明使用的 Fc 融合分子的 Fc 序列。具体 地， 产生 6 个版本的修饰的人 IgG1 Fc 用于生成 Fc 融合蛋白且命名为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， 以及 Fc4(SEQ ID NO ： 77)、 Fc5(SEQ ID NO ： 74)、 Fc6(SEQ ID NO ： 78)、 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。Fc4， Fc5 和 Fc6 包含突变以通过减少 FcγRI 结合和补体 C1q 结合而减少 Fc 介导 的效应物作用。Fc4 包含引入 Fc-488 的相同氨基酸置换。还引入了另外的氨基酸置换以减 少潜在的 Fc 介导的效应物作用。具体地说， 引入三个氨基酸置换以减少 FcγRI 结合。它 们是在 EU 索引位置 234、 235 和 237 的置换。已显示这些位置上的置换可减少与 FcγRI 的 结合 (Duncan 等人， Nature 332 ： 563(1988))。这些氨基酸置换还可减少 FcγRIIa 结合， 以 及 FcγRIII 结合 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000) ； Wines 等人， J.Immunol.164 ： 5313(2000))。
     数 个 研 究 组 描 述 了 EU 索 引 位 置 330 和 331 在 补 体 C1q 结 合 和 后 续 补 体 固 定 (complement fixation) 中的重要性 (Canfield 和 Morrison， J.Exp.Med.173 ： 1483(1991) ； Tao 等人， J.Exp.Med.178 ： 661(1993))。在 Fc4 的这些位置上引入氨基酸置换， 以减少补体 固定。Fc4 的 CH3 域与对应野生型多肽中的 CH3 域相同， 只是终止密码子从 TGA 变为 TAA， 以 便消除克隆的 DNA 在 dam+ 大肠杆菌菌株中生长时潜在的 dam 甲基化位点。 在 Fc5 中， 在 EU 索引位置 218 的精氨酸残基突变回至赖氨酸， 因为在包含该特定 Fc 的融合蛋白中没有使用 BglII 克隆方案。 Fc5 序列的其余部分与上文对 Fc4 的描述相符。
     Fc6 与 Fc5 相同， 只是羧基末端赖氨酸密码子已被消除。成熟免疫球蛋白的 C- 端 赖氨酸经常在翻译后从 B- 细胞分泌之前从成熟免疫球蛋白被去除， 或在血清循环过程中 被去除。因此， 在循环抗体上通常找不到 C- 端赖氨酸残基。像上述 Fc4 和 Fc5 一样， Fc6 序 列中的终止密码子变为 TAA。
     Fc7 与野生型 γ1 Fc 相同， 除了位于 CH2 域中的 EU 索引位置 297 处的氨基酸置换 之外。EU 索引位置 Asn-297 是一个 N- 连接型碳水化合物搭接的位点。由于碳水化合物结 构中可能的批次间差异， N- 连接的碳水化合物向重组表达的蛋白质中导入了潜在的变异性 来源。在一个消除这种潜在的变异性的尝试中， 将 Asn-297 突变为谷氨酰胺残基以防止在 该残基位置上的 N- 连接型碳水化合物的搭接。Fc 对于 FcRIII 的结合也涉及残基 297 处的 碳水化合物 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000))。因此， 去除碳水化合物应该会一 般性地减少包含重组 Fc7 的融合蛋白与 FcγR 的结合。与上面一样， Fc7 序列中的终止密 码子突变为 TAA。
     本发明也考虑这些分子的亮氨酸拉链形式。″亮氨酸拉链″是本领域的术语， 用来表示一种富含亮氨酸的序列， 其增强、 促进、 或驱动其融合配偶体 ( 例如， 亮氨酸拉链 与之融合或连接的序列或分子 ) 的二聚化或三聚化。现有技术已描述了多种亮氨酸拉链 多 肽。 参 见， 例 如， Landschulz 等 人， Science， 240 ： 1759(1988) ； 美 国 专 利 5,716,805 ； WO 94/10308 ； Hoppe 等人， FEBS Letters， 344 ： 1991(1994) ； Maniatis 等人， Nature， 341 ： 24(1989)。本领域技术人员将理解亮氨酸拉链序列可融合于本发明多肽的 5′或 3′端。
     融合蛋白的制备通常可使用标准技术， 包括化学缀合。融合蛋白也可在表达体系 中通过标准技术表达为重组蛋白质。合适的接头进一步在下文描述。
     接头可为天然存在的， 合成的， 或两者的组合。例如， 合成的接头可为随机化的接 头， 例如， 序列和尺寸都随机化。 在一方面， 随机化的接头可包含完全随机化的序列， 或任选
     地， 随机化的接头可基于天然接头序列。接头可包含， 例如， 非多肽部分 ( 例如多核苷酸 )、 多肽、 等。
     接头可为刚性的， 或者柔性的， 或两者的组合。 接头的柔性可以是接头和与接头相 互作用的亚单位两者的组成的函数。接头将两个选定的结合实体 ( 例如， 两个单独的多肽 或蛋白质， 如两个不同的抗体 ) 联接到一起， 并保持各实体为各别且离散的。该接头可允许 单独的、 离散的域的协作， 且保持各别的特性， 如对于多聚物中同一靶标的多个各别的结合 位点， 或者， 例如， 对于多聚物中不同靶标的多个各别的结合位点。 在一些情况下， 在两个连 接的结合实体之间， 或在接头和结合实体之间存在二硫桥。
     对于具体的要连接两个或多个结合实体的情况， 合适的接头的选择可取决于多个 参数， 包括例如结合实体的性质、 双特异性组合物结合的靶标的结构和性质、 和 / 或接头 ( 例如， 肽接头 ) 对蛋白水解和氧化的稳定性。
     特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸 (Gly)、 丝氨酸 (Ser)、 丙氨酸 (Ala) 和 苏氨酸 (Thr) 的氨基酸残基。例如， 肽接头可包含至少 75％ ( 基于肽接头中存在的残基总 数计算 )、 如至少 80％、 至少 85％、 或至少 90％的选自 Gly、 Ser、 Ala 和 Thr 的氨基酸残基。 该肽接头也可仅由 Gly、 Ser， Ala 和 / 或 Thr 残基组成。该接头多肽具有的长度应足以连 接两个结合实体， 使得它们采取相对彼此的正确构象以使它们保持所需的活性， 如结合靶 分子以及可其它能与这样的靶结合相关的活性 ( 例如， 对于给定生物分子的激动或拮抗活 性 )。
     适于该目的的合适长度是例如至少 1 个且通常少于约 50 个氨基酸残基的长度， 如 2-25 个氨基酸残基， 5-20 个氨基酸残基， 5-15 个氨基酸残基， 8-12 个氨基酸残基或 11 个残 基。其它合适的多肽接头尺寸可包括， 例如， 约 2 至约 15 个氨基酸， 约 3 至约 15 个、 约4至 约 12 个、 约 10 个、 约 8 个、 或约 6 个氨基酸。选择纳入接头多肽的氨基酸残基应显示以下 特性， 其不显著干扰多肽多聚物的活性或功能。 因此， 该肽接头从整体上说应不具有与多聚 物的活性或功能不一致的电荷， 不干扰内部折叠， 也不与一个或多个域中的氨基酸残基形 成会严重阻碍多聚物与所关注靶点的结合的键或其它相互作用。
     天然存在的以及人造的肽接头用于连接多肽成为新的连接的融合多肽的用途是 本 领 域 众 所 周 知 的 ( 参 见， 例 如， Hallewell 等 人， J.Biol.Chem.264， 5260-5268， 1989 ； Alfthan 等 人， Protein Eng.8， 725-731， 1995 ； Robinson and Sauer， Biochemistry 35， 109-116， 1996 ； Khandekar 等 人， J.Biol.Chem.272， 32190-32197， 1997 ； Fares 等 人， Endocrinology 139， 2459-2464， 1998 ； Smallshaw 等 人， Protein Eng.12， 623-630， 1999 ； 美国专利号 5,856,456)。
     广泛使用肽接头的一个实例是用于制备单链抗体， 其中轻链 (VL) 和重链 (VH) 的 可变区通过人造接头连接。在这个领域有大量的公开文献。一种广泛使用的肽接头是由 三个重复的 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 氨基酸序列 ((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO ： 73) 组成的 15 聚 物。 也已使用了其它接头， 还使用了噬菌体展示技术， 以及选择性传染噬菌体技术来多样化 和选择合适的接头序列 (Tang 等人， J.Biol.Chem.271， 15682-15686， 1996 ； Hennecke 等人， Protein Eng.11， 405-410， 1998)。肽接头已用于连接异源和同源二聚蛋白质 ( 如 T- 细胞 受体、 λCro 阻抑物、 P22 噬菌体 Arc 阻抑物、 IL-12、 TSH、 FSH、 IL-5 和干扰素 -γ) 中的各 个链。肽接头也已用于产生融合多肽。已使用多种接头， 在 Arc 阻抑物的情况下， 噬菌体展示已用于优化接头长度和组成以增加单链蛋白质的稳定性 ( 参见 Robinson 和 Sauer， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95， 5929-5934， 1998)。
     另 一 种 获 得 合 适 的 接 头 的 途 径 是 通 过 随 机 诱 变 来 优 化 简 单 的 接 头 ( 例 如， (Gly4Ser)n)。
     如上文讨论的， 通常优选肽接头具有至少一些柔性。因此， 在一些变化形式中， 肽 接头包含 1-25 个甘氨酸残基， 5-20 个甘氨酸残基， 5-15 个甘氨酸残基， 或 8-12 个甘氨酸残 基。特别合适的肽接头通常包含至少 50％的甘氨酸残基， 如至少 75％的甘氨酸残基。在一 些实施方案中， 肽接头仅包含甘氨酸残基。 在某些变化中， 该肽接头还包含甘氨酸之外的其 它残基。甘氨酸之外的优选残基包括 Ser， Ala 和 Thr， 特别是 Ser。
     在一些情况下， 向肽接头提供一些刚性是理想的或者是必须的。这可通过在肽接 头的氨基酸序列中包含脯氨酸残基而实现。 因此， 在另一实施方案中， 肽接头在肽接头的氨 基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如， 肽接头可具有这样的氨基酸序列， 其中至少 25％ ( 例如， 至少 50％或至少 75％ ) 的氨基酸残基为脯氨酸残基。在本发明一个具体的实 施方案中， 肽接头仅包含脯氨酸残基。
     在一些实施方案中， 修饰肽接头而引入包含供非多肽部分搭接的基团的氨基酸残 基。此类氨基酸残基的实例可为半胱氨酸或赖氨酸残基 ( 随后非多肽部分搭接于其上 )。 另一种备选方案是包括具有体内 N- 糖基化位点的氨基酸序列 ( 从而将糖部分 ( 体内 ) 连 接于肽接头 )。另一种选择是利用进化的 tRNAs 和 tRNA 合成酶 ( 参见， 例如， 美国专利申请 公开 2003/0082575) 遗传性地将非天然氨基酸掺入多肽结合实体或肽接头。例如， 酮-酪 氨酸的插入允许针对表达的多肽的位点特异性偶联。
     在某些变化形式中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基， 如一个半胱氨酸残基。 例 如， 在一些实施方案中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自 Gly， Ser， Ala 和 Thr 的 氨基酸残基。 在某些此类实施方案中， 肽接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基， 如仅有甘氨 酸残基和半胱氨酸残基。通常， 每个肽接头将仅包含一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残 基的具体肽接头的一个实例包括具有氨基酸序列 Glyn-Cys-Glym 的肽接头， 其中 n 和 m 各为 1-12 的整数， 例如， 3-9、 4-8、 或 4-7。
     如上所述， 本发明包括双特异性结合蛋白， 其包含 FGFR 和抗 VEGF-A 抗体的双特异 性抗体 / 可溶受体组合。在某些此类实施方案中， FGFR 和抗 VEGF-A 抗体共价连接 ( 例如， 通过肽接头 ) 以形成双特异性结合蛋白。在一些变化形式中， 该双特异性结合蛋白包含免 疫球蛋白重链恒定区， 例如， Fc 片段。特别合适的 Fc 片段包括， 例如， 包含修饰的 Fc 区以 减少或消除一种或多种效应物作用的 Fc 片段 ( 例如， Fc5， 具有 SEQ ID NO ： 74 所示的氨基 酸序列 )。
     例如， 在一些实施方案中， 根据本发明的减少 VEGF-A 和 FGF 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白包含如本文所述的抗 VEGF-A 抗体部分的结合区和 如本文所述的 FGFR3 的 FGF 结合部分。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为本文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 尤其是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体部 分和 VEGF-A 抗体部分的组合， 其中 FGF 受体部分为选自下组的 FGFR3 ： 如 SEQ ID NO ： 13 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)， 如 SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ：19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， 如 SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和如 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375) (P250R) ； 所 述 VEGF-A 抗 体 部 分 选 自 下 组 ： 如 SEQ ID NO ： 44 所 示 的 c870.1e6scFV， 如 SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， 如 SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和如 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合 部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 包 括 选 自 下 组 的 FGFR3 部 分 和 VEGF-A 抗 体 部 分 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W) Fc5c870e6pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包含 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分 和 VEGF-A 结 合 部 分， 所 述 FGF 结 合 部 分 为 选 自 下 组 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所 述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其 它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     III. 核酸， 宿主细胞， 和制备 VEGF-A 和 FGF 双特异性抗体 / 可溶受体组合蛋白的 方法
     本发明的可溶 FGFR 多肽可通过表达编码细胞外域或其部分的 DNA 制备。例如， 编 码包含 SEQ ID NO ： 13 的残基 36-388 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 FGFR3IIIc。 N- 端截 短的 FGFR3IIIc 可使用编码 SEQ ID NO ： 19 的残基 36-268 的多核苷酸。为制备 FGFR2IIIc， 可 使用编码 SEQ ID NO ： 24 的残基 36-391 的多核苷酸。在另一实例中， 编码包含 SEQ ID NO ： 37 的残基 36-268 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 N- 端截短的 FGFR2IIIc。优选该细胞外域多肽制备为基本上无跨膜和细胞内多肽区段的形式。为引导受体域从宿主细胞输出， 该 受体 DNA 连接至编码分泌肽的第二 DNA 片段， 如受体的天然信号序列。其它可使用的信号 序列包括 tPA 信号序列 ( 在以下实施例描述 )， CD33 信号序列或人生长激素信号序列。为 促进分泌的受体域的纯化， 可将 C- 端延伸物， 如多组氨酸标签、 物质 P、 FlagTM 肽 (Hopp 等 人， Biotechnology 6 ： 1204-1210， 1988 ； 获自 Eastman Kodak Co.， New Haven， CT) 或另一 有可用的抗体或特异性结合剂的多肽或蛋白质， 融合至受体多肽。
     本发明还包括编码本发明的抗体的重链和 / 或轻链的核酸。本发明的核酸包括这 样的核酸， 其具有与如上表 2 所列的编码 VL 和 / 或 VH 的多核苷酸基本相同的区域。本发明 的核酸还包括互补核酸。 在一些情况下， 当形成比对时， 各序列将是完全互补的 ( 无错配 )。 在其它情况下， 序列中可存在至多约 20％错配。 在本发明一些实施方案中， 提供了编码本发 明抗体的重链和轻链两者的核酸。 本文提供的核酸序列可使用密码子优化、 简并序列、 沉默 突变和其它 DNA 技术优化在特定宿主中表达后加以利用， 本发明涵盖这样的序列修饰。
     因此， 在一些方面， 本发明提供编码本文所述 FGFR 和 / 或 VEGF-A 抗体的一种或多 种多核苷酸 ( 例如， DNA 或 RNA)。在一些变化形式中， 本发明的多核苷酸编码结合并减少 FGF 和 VEGF-A 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白。本领域技术 人员将容易理解， 考虑到遗传密码的简并， 在这些多核苷酸分子中可能有大量的序列变化。
     本发明的核酸可克隆至载体中， 载体例如质粒， 粘粒， 杆粒 (bacmid)， 噬菌体， 人造 染色体 (BAC， YAC) 或病毒， 可向其中插入另一遗传序列或元件 (DNA 或 RNA) 以实现连接的 序列或原件的复制。在一些实施方案中， 该表达载体包含组成型活性启动子区段 ( 例如但 不限于 CMV， SV40， 延伸因子或 LTR 序列 ) 或诱导型启动子序列， 如类固醇可诱导的 pIND 载 体 (Invitrogen)， 在那里核酸的表达可被调节。 本发明的表达载体可进一步包括调节序列， 例如， 内部核糖体进入位点。该表达载体可通过例如转染被引入细胞。
     因此， 用于本发明中的蛋白质可根据常规技术在遗传工程化的宿主细胞中产生。 合适的宿主细胞为可用外源性 DNA 转化或转染且生长在培养物中的细胞类型， 包括细菌， 真菌细胞， 和培养的高等真核细胞 ( 包括培养的多细胞有机体的细胞 )， 特别是培养的哺乳 动物细胞。处理克隆 DNA 分子和向多种宿主细胞引入外源 DNA 的技术公开于 Sambrook 等 人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989)， 和 Ausubel 等人， 上文。
     通常， 在表达载体内， 编码感兴趣蛋白质的 DNA 序列可操作连接于其表达所需的 其它遗传元件， 通常包括转录启动子和终止子。该载体通常还包含一个或多个选择标记和 一个或多个复制起点， 不过， 本领域技术人员知道在某些体系内选择标记可提供在另外的 载体上， 且外源 DNA 的复制可通过整合至宿主细胞基因组中而提供。启动子、 终止子、 选择 标记、 载体和其它元件的选择是本领域常规技术的水平内的常规设计。许多这样的元件描 述于文献中且可获自商业供应者。
     为将重组蛋白质导向至宿主细胞的分泌途径， 在表达载体中提供分泌信号序列 ( 也称为前导序列， 前原序列或前序列 )。该分泌信号序列可为重组蛋白质的天然形式的， 或可衍生自另一分泌的蛋白质 ( 例如， t-PA ； 参见美国专利号 5,641,655) 或从头合成。该 分泌信号序列可操作连接至编码蛋白质的 DNA 序列， 即， 该两个序列在正确的读框中连接 并定位以将新合成的多肽引导至宿主细胞的分泌途径。 分泌信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的 DNA 序列的 5’ ， 但某些信号序列可位于感兴趣的 DNA 序列中的其它位置 ( 参见， 例 如， Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； Holland 等人， 美国专利号 5,143,830)。在具体的 变化形式中， 根据本发明使用的分泌信号序列具有选自下组的氨基酸序列 ： SEQ ID NOS ： 2， 10， 13， 15， 19， 22， 24， 29， 33， 37， 40， 42， 58， 60， 62 和 64 的残基 1-35。
     培养的哺乳动物细胞为制备用于本发明的重组蛋白质的合适的宿主。向哺乳动 物宿主细胞引入外源 DNA 的方法包括磷酸钙 - 介导的转染 (Wigler 等人， Cell 14 ： 725， 1978 ； Corsaro 和 Pearson， Somatic Cell Genetics 7 ： 603， 1981 ： Graham 和 Van der Eb， Virology 52 ： 456， 1973)， 电穿孔 (Neumann 等人， EMBO J.1 ： 841-845， 1982)， DEAE- 葡聚糖 介导的转染 (Ausubel 等人， 上文 )， 和脂质体介导的转染 (Hawley-Nelson 等人， Focus 15 ： 73， 1993 ； Ciccarone 等人， Focus 15 ： 80， 1993)。 重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的制备 公开于， 例如， Levinson 等人， 美国专利号 4,713,339 ； Hagen 等人， 美国专利号 4,784,950 ； Palmiter 等人， 美国专利号 4,579,821 ； 和 Ringold， 美国专利号 4,656,134。合适的哺乳动 物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞 (Vero ； ATCC CRL 1587)， 人胚胎肾细胞 (293-HEK ； ATCC CRL 1573)， 幼仓鼠肾细胞 (BHK-21， BHK-570 ； ATCC CRL 8544， ATCC CRL 10314)， 犬肾细胞 (MDCK ； ATCC CCL 34)， 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-K1 ； ATCC CCL61 ； CHO DG44 ； CHO DXB11(Hyclone， Logan， UT) ； 另参见， 例如， Chasin 等人， Som.Cell.Molec.Genet.12 ： 555， 1986))， 大鼠垂体细胞 (GH1 ； ATCC CCL82)， HeLa S3 细胞 (ATCC CCL2.2)， 大鼠肝癌细胞 (H-4-II-E ； ATCC CRL 1548)SV40- 转化的猴肾细胞 (COS-1 ； ATCC CRL 1650) 和鼠胚胎细胞 (NIH-3T3 ； ATCC CRL 1658)。 其他合适的细胞系是本领域已知的， 并且可以从公共保藏机构 如 American Type Culture Collection， Manassas， Virginia 获得。可使用强的转录启动 子， 如 SV-40 或巨细胞病毒的启动子。参见， 例如， 美国专利号 4,956,288。其它合适的启动 子包括来自金属硫蛋白基因的启动子 ( 美国专利 4,579,821 和 4,601,978) 和腺病毒主要 晚期启动子。
     药物选择通常用于选出已插入外源 DNA 的培养的哺乳动物细胞。这样的细胞通常 称为 “转染子” 。 在选择性试剂的存在下培养且能将感兴趣的的基因传至其后代的细胞称为 “稳定的转染子” 。示例性的选择标记包括编码对抗生素新霉素的抗性的基因， 其允许在新 霉素型药物如 G-418 等的存在下进行选择 ； 黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的 gpt 基因， 其允许宿主细胞在霉酚酸 / 黄嘌呤的存在下生长 ； 和提供对 zeocin， 博来霉素， 杀稻瘟素 (blastocidin)， 和潮霉素的抗性的标记 ( 参见， 例如， Gatignol 等人， Mol.Gen.Genet.207 ： 342， 1987 ； Drocourt 等人， Nucl.Acids Res.18 ： 4009， 1990)。选择系统也可用于增加感兴 。 扩增通过以下方式进行， 在低水平的选择剂的存在 趣基因的表达水平， 该过程称为 “扩增” 下培养转染子， 然后增加选择剂的量以选择出产生高水平的引入的基因的产物的细胞。可 扩增的选择标记的实例为二氢叶酸还原酶， 其赋予对甲氨蝶呤的抗性。其它药物抗性基因 ( 例如， 潮霉素抗性， 多药抗性， 嘌呤霉素乙酰基转移酶 ) 也可使用。
     其它高等真核细胞也可用作宿主， 包括昆虫细胞、 植物细胞和禽类细胞。 毛根土壤 杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 在植物细胞中作为用于表达基因的载体的用途已描述 于 Sinkar 等人， J.Biosci.(Bangalore)11 ： 47-58， 1987。昆虫细胞的转化和其中外源多肽 的产生公开于 Guarino 等人， 美国专利号 5,162,222 和 WIpO 公开 WO 94/06463。
     昆 虫 细 胞 可 被 通 常 衍 生 自 苜 蓿 丫 纹 夜 蛾 (Autographa californica) 核 型多 角 体 病 毒 (AcNPV) 的 重 组 杆 状 病 毒 感 染。 参 见 King 和 Possee， The Baculovirus Expression System ： A Laboratory Guide(Chapman & Hall， London) ； O’ Reilly 等 人， Baculovirus Expression Vectors ： A Laboratory Manual(Oxford University Press.， New York 1994) ； 和 Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology(Richardson ed.， Humana Press， Totowa， NJ， 1995)。重组杆状病毒也可通过使 用描述于 Luckow 等人 (J.Virol.67 ： 4566-4579， 1993) 的基于转座子的体系制备。这种 系统使用转移载体， 可以试剂盒的形式商购 (BAC-TO-BAC 试剂盒 ； Life Technologies， Gaithersburg， MD)。转移载体 ( 例如， PFASTBAC1 ； Life Technologies) 包含 Tn7 转座子， 以将编码感兴趣蛋白质的 DNA 移至作为大质粒 ( 称为 “杆粒” ) 保持在大肠杆菌中的杆状 病毒基因组中。参见 Hill-Perkins 和 Possee， J.Gen.Virol.71 ： 971-976， 1990 ； Bonning 等人， J.Gen.Virol.75 ： 1551-1556， 1994 ； 和 Chazenbalk 和 Rapoport， J.Biol.Chem.270 ： 1543-1549， 1995。此外， 转移载体可包括与上述编码多肽延伸物或亲和标签的 DNA 的合框 融合。使用本领域已知的技术， 将包含编码蛋白质的 DNA 序列的转移载体转化到大肠杆菌 宿主细胞中， 并从细胞中筛选包含断裂的 lacZ 基因 ( 其是重组杆状病毒的指示 ) 的杆粒。 使用一般技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒 DNA， 并用其转染草地贪夜蛾细胞， 如 Sf9 细胞。随后制备表达感兴趣蛋白质的重组病毒。重组病毒株通过本领域通常使用的方 法制备。 对 于 蛋 白 质 制 备， 重 组 病 毒 用 于 感 染 宿 主 细 胞， 通常为衍生自草地贪夜蛾 (Spodoptera fugiperda) 的 细 胞 系 ( 例 如， Sf9 或 Sf21 细 胞 ) 或 衍 生 自 粉 纹 夜 蛾 (Trichoplusia ni) 的细胞系 ( 例如， HIGH FIVE 细胞 ； Invitrogen， Carlsbad， CA)。一般 参 见 Glick 和 Pasternak， Molecular Biotechnology， Principles & Applications of Recombinant DNA(ASM Press， Washington， D.C.， 1994)。 也参见美国专利号 5,300,435。 无 血清培养基用于培养和保持细胞。合适的培养基制剂是本领域已知的且可获自供应商。细 胞从约 2-5x 105 细胞的接种密度生长至 1-2x 106 细胞的密度， 此时添加重组病毒株， 其感 染复数 (MOI) 为 0.1 至 10， 更典型接近 3。使用的步骤通常描述于可用的实验室手册 ( 参 见， 例如， King 和 Possee， 上文 ； O’ Reilly 等人， 上文 ； Richardson， 上文 )。
     真菌细胞， 包括酵母细胞， 也可用于本发明。 在这方面感兴趣的酵母物种包括酿酒 酵母， 毕赤酵母 (Pichia pastoris)， 和甲醇毕赤酵母。用外源 DNA 转化酿酒酵母细胞和由 此制备重组多肽的方法公开于， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kawasaki 等人， 美 国专利号 4,931,373 ； Brake， 美国专利号 4,870,008 ； Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； 通常是药物抗 和 Murray 等人， 美国专利号 4,845,075。依据由选择标记所确定的表型， 性、 或在特定营养素 ( 例如， 亮氨酸 ) 不存在的情况下生长的能力， 来选择转化的细胞。用 于酿酒酵母的载体系统的实例为 Kawasaki 等人 ( 美国专利号 4,931,373) 公开的 POT1 载体系统， 其允许通过含葡萄糖的培养基中培养来选择转化的细胞。用于酵母的合适的 启动子和终止子包括源自糖酵解酶基因 ( 参见， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kingsman 等人， 美国专利号 4,615,974 ； 和 Bitter， 美国专利号 4,977,092) 和醇脱氢酶基 因的那些。另参见美国专利号 4,990,446 ； 5,063,154 ； 5,139,936 ； 和 4,661,454。其它酵 母的转化体系， 包括多形汉逊酵母， 粟酒裂殖酵母， 乳酸克鲁维酵母， 脆壁克鲁维酵母， 玉米 黑粉菌 (Ustilago maydis)， 巴斯德毕赤酵母， 甲醇毕赤酵母， 季也蒙毕赤酵母， 和麦芽糖
     假丝酵母是本领域已知的。参见， 例如， Gleeson 等人， J.Gen.Microbiol.132 ： 3459-3465， 1986 ； Cregg， 美国专利号 4,882,279 ； 和 Raymond 等人， Yeast 14 ： 11-23， 1998。曲霉细胞 可根据 McKnight 等人， 美国专利号 4,935,349 的方法使用。转化产黄顶孢霉 (Acremonium chrysogenum) 的方法公开于 Sumino 等人， 美国专利号 5,162,228。转化链孢霉的方法公开 于 Lambowitz， 美国专利号 4,486,533。在甲醇毕赤酵母中制备重组蛋白质公开于美国专利 5,716,808 ； 5,736,383 ； 5,854,039 ； 和 5,888,768。
     原核宿主细胞， 包括细菌大肠杆菌、 芽孢杆菌属、 和其它属也是本发明中可用的宿 主细胞。转化这些宿主和表达其中克隆的外源 DNA 序列的技术是本领域已知的 ( 参见， 例 如， Sambrook 等人， 上文 )。当在细菌如大肠杆菌中表达重组蛋白质时， 该蛋白质可保持在 细胞质中， 通常作为不可溶颗粒， 或可通过细菌分泌序列导至周质空间。在前一情形， 将细 胞溶解， 回收颗粒并使用例如胍异硫氰酸酯或脲使其变性。然后变性的蛋白质可通过稀释 变性剂 ( 例如， 通过对脲与还原型和氧化型的谷胱甘肽的组合的溶液透析， 然后对缓冲盐 水溶液透析 ) 而重折叠和二聚化。或者， 该蛋白质可以可溶形式从细胞质回收， 并在不使 用变性剂的情况下分离。蛋白质作为水提取物 ( 例如磷酸盐缓冲盐水中的水提取物 ) 从 细胞回收。为了捕捉感兴趣的蛋白质， 将提取物直接施加至色谱介质， 如固定的抗体或肝 素 -Sepharose 柱。分泌的蛋白质可以以可溶的、 有功能的形式从周质空间回收， 方法是破 裂细胞 ( 通过， 例如， 超声处理或渗透压冲击 ) 以释放周质空间的内含物和回收蛋白质， 从 而无需变性和重折叠。 抗体， 包括单链抗体， 可在细菌宿主细胞中根据已知方法制备。 参见， 例如， Bird 等人， Science 242 ： 423-426， 1988 ； Huston 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5879-5883， 1988 ； 和 Pantoliano 等人， Biochem.30 ： 10117-10125， 1991。
     转化或转染的宿主细胞根据常规步骤在含营养素和所选宿主细胞的生长所需的 其它组分培养基中培养。 多种合适的培养基， 包括确定成分培养基和复合培养基， 是本领域 已知的， 且通常包括碳源、 氮源， 必需氨基酸， 维生素和矿物质。 培养基可按需要包含生长因 子或血清之类的成分。生长培养基通常会选择包含外源添加的 DNA 的细胞， 例如通过药物 选择或必须营养素的缺乏， 该必须营养素通过表达载体携带的或者共转染到宿主细胞中的 选择标记补充。
     包 含 VEGF-A 抗 体 / 可 溶 FGF 受 体 双 特 异 性 结 合 蛋 白 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 通 过 常 规 蛋 白 质 纯 化 方 法 纯 化， 通 常 通 过 色 谱 技 术 的 组 合 纯 化。 一 般 参 见 Affinity Chromatography ： Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology， Uppsala ，Sweden ， 1988) ； Scopes ，Protein Purification ： Principles and Practice(Springer-Verlag， New York 1994)。包含免疫球蛋白重链多肽的蛋白质可通过 亲和色谱法在固定的蛋白质 A 上纯化。可采用进一步的纯化步骤， 如凝胶过滤， 来获得所需 水平的纯度或提供脱盐， 缓冲液交换等。
     抗体可从细胞培养基通过已知方法， 如亲和色谱法使用常规柱和其它设备纯化。 在典型的程序中， 收集条件化培养基， 且可将其在 4℃储存至多 5 天。 为避免污染， 通常添加 抑菌剂 ( 例如， 叠氮化钠 )。降低培养基的 pH( 通常至 Ph ～ 5.5)， 如通过滴加冰醋酸。较 低的 pH 提供通过蛋白 G 树脂的最佳的 IgG 俘获。该蛋白质 G 柱的尺寸基于条件化培养基 的体积确定。用合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2 中和填充好的柱子。然 后使培养基通过中和的蛋白质 g 树脂， 流速由培养基体积和柱尺寸确定。保留穿透液以备可能的再次过柱。然后将具有俘获的抗体的树脂冲洗成中和缓冲液。使用酸性洗脱缓冲 液， 如 0.1M 甘氨酸， pH 2.7 或等价物将柱子洗脱为级分。中和各级分， 例如使用 2M tris， pH 8.0， 以 tris ∶甘氨酸的 1 ∶ 20 比例。汇集包含蛋白质的级分 ( 例如， 基于 A280)。汇集 的级分使用脱盐柱缓冲液交换至合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2。通过 A280 使用消光系数 1.44 测定浓度。内毒素水平可通过 LAL 测定法确定。纯化蛋白质可冷冻 储存， 通常在 -80℃。
     表达功能性 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的细胞在筛选测定中 使用。多种合适的测定是本领域已知的。这些测定基于对靶细胞中生物响应的检测。一 种这样的测试为细胞增殖测试。在存在或不存在测试化合物的情况下培养细胞， 且通过， 例如， 测量氚化的胸苷的掺入或通过基于 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四唑 鎓溴化物 (MTT) 的代谢分解的比色测定细胞增殖 (Mosman， J.Immunol.Meth.65 ： 55-63， 1983) 检测。一种备选的测定法形式使用进一步工程化以表达报道基因的细胞。该报道基 因连接于对受体连接的途径响应的启动子元件， 该测定法检测该报道基因的转录的活化。 在此方面， 优选的启动子元件为血清响应元件， 或称 SRE。( 参见， 例如， Shaw 等人， Cell 56 ： 563-572， 1989)。优选的该报道基因是荧光素酶基因。( 参见 de Wet 等人， Mol.Cell. Biol.7 ： 725， 1987.)。使用本领域已知方法通过发光检测荧光素酶基因的表达。( 参见， 例 如， Baumgartner 等 人， J.Biol.Chem.269 ： 29094-29101， 1994 ； Schenborn 和 Goiffin， Promega Notes 41 ： 11， 1993.)。荧光素酶活性测定试剂盒可购自， 例如， Promega Corp.， Madison， WI。该类型的靶细胞系可用于筛选化学物质库， 细胞条件化的培养基， 真菌培养 液， 土壤样， 水样， 等。 例如， 可在靶细胞上测定细胞条件化的培养基样品的库以鉴别产生配 体的细胞。 然后用阳性细胞在哺乳动物表达载体中产生 cDNA 文库， 将文库分池 (pools)， 转 染到宿主细胞中， 表达。 然后测定转染的细胞的培养基样品， 随后进一步分池， 再转染， 传代 培养， 且重新测定阳性细胞以分离编码配体的克隆 cDNA。
     IV. 治疗方法
     A. 概述
     在另一方面， 本发明提供抑制血管发生的方法， 特别是治疗与血管发生相关的疾 病或疾患的方法。一般而言， 该方法包括向受试者施用可有效抑制血管发生的量的包含双 特异性抗体 / 可溶受体组合的双特异性结合蛋白。更具体地， 对于治疗用途， 将该双特异性 结合蛋白施用于患有， 或有升高的风险患上以血管发生增加为特征的疾病或疾患 (“新生 血管疾病” ) 的患者。适合根据本发明治疗的新生血管疾病包括， 例如， 以实体瘤生长为特 征的癌症 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC)， 成胶质细 胞瘤， 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及多种新生血管眼病 ( 例如， 年龄相关的黄斑变性， 糖尿 病性视网膜病， 虹膜新生血管形成， 和新生血管性青光眼 )。其它适合根据本发明治疗的新 生血管疾病包括， 例如， 类风湿性关节炎， 银屑病， 动脉粥样硬化， 慢性炎症， 肺炎症， 先兆子 痫， 心包渗漏 ( 如与心包炎相关的 )， 和胸腔积液。
     在本文所述治疗方法的每一实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的递送方式符合与寻求治疗的疾病 或疾患的管理相关的常规方法学。根据本文的公开， 在足以预防或治疗疾病或疾患的条件 下、 以足以预防或治疗疾病或疾患的时间向需要该治疗的受试者施用有效量的拮抗剂。施用本文描述的双特异性结合蛋白的受试者包括有较高的风险发生特定的与血 管发生相关的疾病或疾患的患者， 也包括表现出现有的新生血管疾病的患者。在某些实施 方案中， 该受试者已诊断为患有寻求治疗的疾病或疾患。 而且， 可在治疗过程中监测受试者 任何疾病或疾患的变化 ( 例如， 监测疾病或疾患的临床症状的增加或减少 )。
     在预防性的应用中， 将药物组合物或药物施用于对特定疾病易感或具有其他风险 的患者， 施用的量足以消除或减少疾病的风险或延迟疾病的发生。 在治疗性的应用中， 将组 合物或药物施用于疑似患有， 或已患有该疾病的患者， 施用的量足以治愈， 或至少部分阻止 该疾病症状及其并发症。足以实现该目的的量称为治疗有效量或药物有效量。在预防和治 疗方案两者中， 药物通常施用多个剂量直到达到充分的响应 ( 例如， 抑制不合适的血管发 生活性 )。通常， 监测该响应， 如果期望响应开始消退则给予重复的剂量。
     为鉴别用于根据本发明的方法治疗的受试患者， 可使用公认的筛选方法来确定 与特定的新生血管疾病相关的风险因素或确定受试者中确认的已有疾病的状态。这样的 方法可包括， 例如， 确定个体是否有亲属被诊断有特定疾病。筛选方法还可包括， 例如， 对 已知具有可遗传的成分的具体疾病进行常规病情检查以确定家族状态。例如， 多种癌症 还已知具有某些可遗传的成分。癌症的可遗传的成分包括， 例如， 多种转化中的基因 ( 例 如， Ras， Raf， EGFR， cMet， 及其他 ) 内的突变， 某些 HLA 和杀伤抑制性受体 (KIR) 分子的有 无， 或癌细胞能直接或间接调节细胞如 NK 细胞和 T 细胞的免疫抑制的机理 ( 参见， 例如， Ljunggren 和 Malmberg， Nature Rev.Immunol.7 ： 329-339， 2007 ； Boyton 和 Altmann， Clin. Exp.Immunol.149 ： 1-8， 2007)。 为此目的， 可常规性地使用核苷酸探针鉴定携带与感兴趣的 具体疾病相关的遗传标记的个体。 此外， 很多种免疫方法是本领域已知的， 可用于鉴别特定 疾病的标记。例如， 有多种 ELISA 免疫测定方法可以使用， 且为本领域公知， 这些方法使用 单克隆抗体探针检测与特定肿瘤相关的抗原。 可按照已知的患者症状， 年龄因素， 相关风险 因素等的指示来实施筛选。 这些方法允许临床医师常规地选择需要本文所述治疗方法的患 者。根据这些方法， 血管发生的抑制可作为独立治疗过程进行， 或作为其它治疗的后续的、 辅助的、 或协同的治疗方案。
     对于施用， 该包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白配制为药物组合物。 包含双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合的药物组合物可根 据已知方法配制以制备可药用组合物， 其中将治疗分子与可药用的载体组合为混合物。如 果组合物的施用可被接受的患者耐受， 则其称为 “可药用的载体” 。无菌磷酸盐缓冲盐水为 可药用的载体的一个实例。其它合适的载体是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995))。制剂可进一步包括一种或多种赋形剂， 防腐剂， 增溶剂， 缓冲剂， 用于防止小瓶 表面上蛋白质损失的白蛋白等。单特异性拮抗剂可单独配制或以组合制剂提供。
     包含含有 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的 药物组合物以有效量施用于受试者。根据本发明的方法， 拮抗剂可通过多种施用方式施用 于受试者， 包括例如， 肌内， 皮下， 静脉内， 心房内， 关节内， 肠胃外， 鼻内， 肺内， 经皮， 胸膜 内， 鞘内， 和口腔施用途径。对于治疗新生血管眼病的药物用途， 该双特异性结合蛋白通常 根据常规方法配制为用于玻璃体内注射。对于治疗和预防目的， 拮抗剂可以以下方式施用 于受试者 ： 单次推注递送、 长时间连续递送 ( 例如， 连续经皮递送 )， 或以重复的施用方案( 例如， 基于每小时， 每日， 或每周 )。
     组合物的 “治疗有效量” 是产生统计学显著效果的量， 如疾病进展的统计学显著减 少或器官功能的统计学显著改善。精确剂量将通过临床医师根据公认的标准确定， 其中考 虑治疗症状的性质和严重性、 患者特征等。剂量的确定在本领域技术人员水平范围内。
     此语境中有效剂量的确定通常基于动物模型研究， 然后是人体临床试验， 并通过 确定可显著减少模型受试者中受试者疾病或疾患的发生或严重性的有效剂量和施用方案 来指导。本发明的组合物的有效剂量根据多种不同的因素改变， 包括施用手段， 靶位点， 患 者生理状态， 患者为人还是动物， 施用的其它药物， 该治疗为预防性还是治疗性， 以及组合 物本身具体活性及其在个体中引起所需响应的能力。通常， 该患者是人， 但在一些疾病中， 该患者可为非人哺乳动物。通常， 对剂量方案进行调节以提供最佳治疗响应， 即， 优化安全 性和功效。 因此， 治疗性或预防性有效量也是这样的量， 其中抑制血管发生的有利作用大于 任何不想要的副作用。 对于施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白， 剂量通常为约 0.1μg 至 100mg/kg 或 1μg/kg 至约 50mg/kg， 更通常为 10μg 至 5mg/kg 受试者体重。 在更具体的实施方案中， 药物的有效量为约 1μg/kg 至约 20mg/kg， 约 10μg/kg 至约 10mg/kg， 或约 0.1mg/kg 至约 5mg/kg。该范围的剂量可通过单一或多次 施用实现， 包括， 例如， 每日施用多次或每日、 每周、 每两周或每月施用一次。 例如， 在某些变 化形式中， 施用方案由初始施用和之后的间隔一周或两周的多次施用组成。另一方案由初 始施用和之后的间隔一月或两月的多次施用组成。 或者， 施用可以是不规则的， 通过监测 NK 细胞活性和 / 或疾病或疾患的临床症状来指示。
     药物组合物的剂量可由主治医师加以改变以保持靶位处所需的浓度。例如， 如果 选择静脉内递送模式， 靶组织处血流中药物的局部浓度可为约 1-50 纳摩尔组合物 / 升， 有 时为约 1.0 纳摩尔 / 升至 10， 15， 或 25 纳摩尔 / 升， 取决于受试者的状态和预计的测量响 应。可基于递送方式 ( 例如是经表皮递送还是递送至粘膜的表面 ) 选择较高或较低浓度。 剂量也应基于施用的制剂 ( 例如， 鼻喷雾剂对粉末， 缓释口服或注射颗粒， 经皮制剂等 ) 的 释放速率而调节。为达到相同的血清浓度水平， 例如， 释放速率为 5 纳摩尔 ( 标准条件下 ) 的缓慢释放颗粒的施用剂量为释放速率为 10 纳摩尔的颗粒的剂量的约两倍。
     包括含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的药物 组合物可以以液体形式、 喷雾剂或固体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液、 气雾剂、 滴液、 表面用溶液和口服悬液。示例性的固体形式包括胶囊、 片剂和控释形式。后一形式的 示例有微渗透压泵和植入物。 ( 参见， 例如， Bremer 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 239， 1997 ； Ranade， Drug Delivery Systems 95-123 中的 “Implants in Drug Delivery， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Bremer 等人， Protein Delivery ： Physical Systems 239-254 中的 “Protein Delivery with Infusion Pumps， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Yewey 等 人， Protein Delivery ： Physical Systems 93-117 中 的 “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997))。其它固体形式包括乳膏， 糊剂， 其它表面敷剂等。
     脂质体提供了一种手段来向受试者递送治疗多肽， 例如， 静脉内递送， 向腹膜 内递送， 鞘内递送， 肌内递送， 皮下递送， 或通过口服施用、 吸入、 或鼻内施用递送。脂 质体为微囊泡， 其由围绕着水性隔室的一个或多个脂质双层组成。( 参见， 一般性的，Bakker-Woudenberg 等 人， Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1) ： S61， 1993 ； Kim， Drugs 46 ： 618， 1993 ； Ranade， Drug Delivery Systems 3-24 中 的 “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995))。脂质体的组成与细胞膜相似， 因此， 脂质体可安全施用且生物可降解。取决于制备 方法， 脂质体可为单层的或多层的， 且脂质体的尺寸可变化， 直径从 0.02μm 至大于 10μm 不等。 多种试剂可包囊在脂质体中 ： 疏水试剂分配在双层中， 而亲水性试剂分配在内部水性 空间中。( 参见， 例如， Machy 等人， Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987) ； Ostro 等人， American J.Hosp.Pharm.46 ： 1576， 1989)。 而且， 可通过改变脂 质体尺寸、 双层的数量、 脂质组成、 以及脂质体的电荷和表面特征来控制包囊的试剂的治疗 可利用度 (therapeutic availability)。
     脂质体可吸附至几乎任何类型的细胞， 然后缓慢释放包囊的试剂。 或者， 吸附的脂 质体可被吞噬性的细胞内吞。 内吞作用之后发生脂质体脂质的溶酶体内降解和包囊的试剂 的释放 ( 参见 Scherphof 等人， Ann.N.Y.Acad.Sci.446 ： 368， 1985)。静脉内施用后， 小的脂 质体 (0.1 至 1.0μm) 通常被主要位于肝和脾中网状内皮系统的细胞所摄取， 而大于 3.0μm 的脂质体沉积在肺中。 网状内皮系统的细胞对较小脂质体的这种优先吸收作用已经被利用 来将化学治疗剂递送至巨噬细胞和肝的肿瘤。 可通过多种方法避开网状内皮系统， 包括用大剂量的脂质体颗粒饱和， 或通过药 理手段选择性地对巨噬细胞灭活 ( 参见 Claassen 等人， Biochim.Biophys.Acta 802 ： 428， 1984)。 此外， 已显示将用糖脂或聚乙二醇衍生化的磷脂掺入脂质体膜可导致网状内皮系统 的吸收显著减少 ( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1068 ： 133， 1991 ； Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     也可在制备脂质体时通过改变磷脂组成或向脂质体插入受体或反受体 (counter-receptors) 以靶向特定细胞或器官。例如， 制备为带有高含量非离子表面活性 剂的脂质体已被用于靶向肝。( 参见， 例如， Hayakawa 等人的日本专利 04-244,018 ； Kato 等人， Biol.Pharm.Bull.16 ： 960， 1993)。这些制剂通过以下方式制备 ： 在甲醇中混合大豆 磷脂酰胆碱、 α- 生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油 (HCO-60)， 真空浓缩该混合物， 然后用水复 原该混合物。二棕榈酰基磷脂酰胆碱 (DPPC) 和大豆衍生的甾酰基葡糖苷混合物 (SG) 和胆 固醇 (Ch) 的脂质体制剂已显示靶向肝。( 参见 Shimizu 等人， Biol.Pharm.Bull.20 ： 881， 1997)。
     或者， 可将多种靶向性反受体连接于脂质体的表面， 如抗体， 抗体片段， 碳水化合 物， 维生素， 和转运蛋白。例如， 为了靶向肝脏， 可用支链型的半乳糖基脂质衍生物修饰脂 质体以靶向脱唾液酸糖蛋白 ( 半乳糖 ) 受体， 此类受体仅在肝细胞表面表达。( 参见 Kato 和 Sugiyama， Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14 ： 287， 1997 ； Murahashi 等 人， Biol. Pharm.Bull.20 ： 259， 1997)。根据一种更通用的组织靶向方法， 用对靶细胞表达的反受体 特异的生物素化抗体预先标记靶细胞。( 参见 Harasym 等人， Adv.Drug Deliv.Rev.32 ： 99， 1998)。血浆清除游离抗体后， 施用链亲和素缀合的脂质体。在另一方法中， 将靶向性抗体 直接连接至脂质体。( 参见 Harasym 等人， 上文 )。
    多 肽 和 抗 体 可 使 用 蛋 白 质 微 囊 化 的 标 准 技 术 包 封 在 脂 质 体 中。( 参 见， 例 如， Anderson 等 人， Infect.Immun.31 ： 1099， 1981 ； Anderson 等 人， Cancer Res.50 ：
     1853， 1990 ； Cohen 等 人， Biochim.Biophys.Acta 1063 ： 95， 1991 ； Alving 等 人 Liposome Technology(Vol.III)317 中的 “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies， ” (Gregoriadis， ed.， CRC Press， 2nd ed.1993) ； Wassef 等人， Meth.Enzymol.149 ： 124， 1987.)。如上所述， 治疗上有用的脂质体可包含多种组分。例如， 脂质体可包含聚 ( 乙 二醇 ) 的脂质衍生物。( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     已设计了可降解聚合物微球以保持治疗蛋白质的高全身水平。 微球从可降解聚合 物制备， 如丙交酯乙交酯共聚物 (PLG)， 聚酸酐， 聚 ( 原酸酯 )， 非生物可降解的乙基乙酸乙 烯酯聚合物， 其中蛋白质圈闭在聚合物中。( 参见， 例如， Gombotz 和 Pettit， Bioconjugate Chem.6 ： 332， 1995 ； Ranade， “Role of Polymers in Drug Delivery， ” in Drug Delivery Systems 51-93(Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Roskos and Maskiewicz， “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery， ” in Protein Delivery ： PhysicalSystems 45-92(Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Bartus 等人， Science 281 ： 1161， 1998 ； Putney and Burke， Nature Biotechnology 16 ： 153， 1998 ； Putney， Curr..Opin.Chem.Biol.2 ： 548， 1998)。聚乙二醇 (PEG) 包被的纳米球 也可提供静脉内施用治疗蛋白质的载体。( 参见， 例如， Gref 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 167， 1997)。
     本领域技术人员可设计其它剂型， 例如可见， Ansel 和 Popovich， Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lea & Febiger ， 5th ed.1990) ； Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995)， 和 Ranade 和 Hollinger， Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)。
     本文所述的药物组合物也可在联合治疗的背景下使用。术语 “联合治疗” 在本文 使用时， 是指对受试者施用至少一个治疗有效剂量的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特 异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和另一治疗剂。 例如， 在癌症免疫治疗的背景下， 包含含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组合物可用作血管发 生抑制剂与化疗或放射联合。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白可与常规类型的化疗或放射协同作用。 该双特异性结合蛋白可进一步减少肿 瘤负担并可使得化疗剂的杀灭作用更有效。
     显示血管发生抑制活性的本发明的组合物也可与免疫调节化合物 ( 包括多种细 胞因子和共刺激 / 抑制分子 ) 联合使用。它们可包括， 但不限于， 使用刺激抗癌免疫应答 的细胞因子。例如， 组合使用 IL-2 和 IL-12 在 T- 细胞淋巴瘤， 鳞状上皮细胞癌， 和肺癌中 显示有益作用。( 参见 Zaki 等人， J.Invest.Dermatol.118 ： 366-71， 2002 ； Li 等人， Arch. Otolaryngol.Head Neck Surg.127 ： 1319-24， 2001 ； Hiraki 等人， Lung Cancer 35 ： 329-33， 2002)。 此外， VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白可与共刺激基于免疫的效应细 胞上发现的多种细胞表面分子的试剂组合， 如 CD137 的活化。( 参见 Wilcox 等人， J.Clin. Invest.109 ： 651-9， 2002) 或 CTLA4 的抑制 (Chambers 等人， Ann.Rev.Immunol.19 ： 565-94， 2001)。或者， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可 与通过与 TRAIL- 相关的受体的相互作用诱导肿瘤细胞凋亡的试剂一起使用。 ( 参见， 例如， Takeda 等人， J.Exp.Med.195 ： 161-9， 2002 ； Srivastava， Neoplasia 3 ： 535-46， 2001)。这 样的试剂包括 TRAIL 配体， TRAIL 配体 -Ig 融合物， 抗 TRAIL 抗体， 等。在其它变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与不特异靶向血管发生的单克隆抗体治疗联合使用。 该联合治疗特别用于治疗 癌症， 其中使用单克隆抗体， 特别是针对肿瘤表达的抗原的抗体， 正在成为对许多肿瘤 ( 包 括乳腺细胞癌 ( 曲妥单抗或 HERCEPTIN ) 和结肠癌 ( 西妥昔单抗或 ERBITUX )) 的标准做 法。
     药物组合物可作为试剂盒提供， 该试剂盒包含含本文所述的治疗组合物的容器。 治疗组合物可提供为， 例如， 单剂或多剂施用的可注射溶液形式， 或作为在注射前复原的无 菌粉末。或者， 该试剂盒可包括用于施用治疗组合物的干粉分散器， 液体气雾剂发生器， 或 喷雾器。该试剂盒可进一步包含关于适应症和药物组合物的用途的书面信息。
     B. 癌症治疗
     1. 癌症类型
     根据本发明可治疗的癌症包括以实体瘤的存在为特征的癌症。如前人讨论的， 肿 瘤组织中血管的量是涉及实体瘤形成的癌症的强的负面预后指标 ( 参见， 例如， Weidner 等 人， (1992)， 上文 ； Weidner 等人， (1993)， 上文 ； Li 等人， 上文 ； Foss 等人， 上文 )， 且 VEGF 和 FGF 信号分子家族都显示出在实体瘤相关的新血管形成中起关键作用。下表 4 列出一些特 征为实体瘤形成的癌症， 主要通过靶组织分类。
     表4： 涉及实体瘤形成的示例性癌症
    
    因此， 在某些实施方案中， 本文所述的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白用于治疗特征为存在实体瘤的癌症， 例如， 表 4 所列的任一 种癌症。 例如， 在一些实施方案中， 要根据本发明治疗的癌症选自下列 ： 头颈部癌症 ( 例如， 口腔， 口咽， 鼻咽， 下咽， 鼻腔或鼻旁窦， 喉， 唇， 或唾液腺的癌症 ) ； 肺癌 ( 例如， 非小细胞肺
     癌， 小细胞癌， 或间皮瘤 ) ； 胃肠道癌 ( 例如， 结肠直肠癌， 胃癌， 食管癌， 或肛门癌 ) ； 胃肠 道间质瘤 (GIST) ； 胰腺癌 ； 胰腺腺泡细胞癌 ； 小肠的癌症 ； 肝癌或胆系癌 ( 例如， 肝细胞腺 瘤， 肝细胞癌， 血管肉瘤， 肝外或肝内胆管肉瘤， 法特壶腹癌， 或胆囊癌 ) ； 乳腺癌 ( 例如， 转 移性乳腺癌或炎性乳腺癌 ) ； 妇科癌症 ( 例如， 子宫颈癌， 卵巢癌， 输卵管癌症， 腹膜癌， 阴道 癌， 外阴癌症， 妊娠性滋养层细胞瘤形成， 或子宫癌， 包括子宫内膜癌或子宫肉瘤 ) ； 泌尿道 癌症 ( 例如， 前列腺癌 ； 膀胱癌 ； 阴茎癌 ； 尿道癌， 或肾癌， 例如， 肾细胞癌或移行细胞癌， 包 括肾盂和输尿管 ) ； 睾丸癌 ； 中枢神经系统 (CNS) 癌症如颅内肿瘤 ( 例如， 星形细胞瘤， 间 变性星形细胞瘤， 成胶质细胞瘤， 少突胶质细胞瘤， 间变性少突胶质细胞瘤， 室管膜瘤， 原发 性 CNS 淋巴瘤， 成神经管细胞瘤， 生殖细胞瘤， 松果腺瘤， 脑膜瘤， 垂体肿瘤， 神经鞘肿瘤 ( 例 如， 神经鞘瘤 )， 脊索瘤， 颅咽管瘤， 脉络丛肿瘤 ( 例如， 脉络丛癌 ) ； 或其它神经元或神经胶 质起源的颅内肿瘤 ) 或脊髓肿瘤 ( 例如， 神经鞘瘤， 脑膜瘤 ) ； 内分泌瘤 ( 例如， 甲状腺癌， 例如， 甲状腺癌， 髓样癌症， 或甲状腺淋巴瘤 ； 胰腺内分泌肿瘤， 例如， 胰岛素瘤或胰高血糖 素瘤 ； 肾上腺癌， 例如， 嗜铬细胞瘤 ； 类癌瘤 ； 或甲状旁腺癌 ) ； 皮肤癌 ( 例如， 鳞状上皮细胞 癌； 基底细胞癌 ； 卡波西肉瘤 ； 或恶性黑素瘤， 例如， 眼内黑素瘤 ) ； 骨癌 ( 例如， 骨肉瘤， 例 如， 骨肉瘤， 骨软骨瘤， 或尤因氏肉瘤 ) ； 多发性骨髓瘤 ； 绿色瘤 ； 软组织肉瘤 ( 例如， 纤维性 肿瘤或纤维组织细胞瘤 ) ； 平滑肌或骨骼肌肿瘤 ； 血液或淋巴管血管周围肿瘤 ( 例如， 卡波 西肉瘤 ) ； 滑膜肿瘤 ； 间皮瘤 ； 神经肿瘤 ； 副神经节肿瘤 ； 骨骼外软骨或骨肿瘤 ； 和多能间质 瘤。
     在一些变化形式中， 待治疗的癌症是儿童期癌症， 例如， 脑癌， 神经母细胞瘤， 维尔 姆斯瘤 ( 肾胚细胞瘤 )， 横纹肌肉瘤， 视网膜母细胞瘤， 或肝母细胞瘤。
     在其它变化形式中， 癌症为免疫治疗敏感性癌症， 例如， 黑素瘤， 肾癌， 乳腺癌， 前 列腺癌， 结肠直肠癌， 子宫颈癌， 卵巢癌， 或肺癌。
     在以下进一步详细描述上述癌症中的一些， 包括一些评价 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用的相关动物模型。
     a. 前列腺癌
     前列腺癌是男性生殖系统中发现于膀胱下侧、 直肠之前的一个腺体中的异常生 长。几乎所有前列腺癌都产生自前列腺中的分泌性腺细胞， 因此都是前列腺腺癌。在美国， 前列腺癌症是男性中的普通恶性癌症， 仅次于肺癌。 前列腺癌主要为老年男性的肿瘤， 当扩 散时其经常响应于治疗， 且当局部化时可被治愈。估计 17％的男性将在一生中被诊断出前 列腺癌。该肿瘤通常作为小的、 界限清楚的病变发生， 且可经常作为多发性原发肿瘤存在 (Villers 等人 .1992)。进展在局部和远端都发生， 通常达到精囊、 射精管和骨盆淋巴结， 在 更晚期达到骨、 肝和肺。一旦转移发生， 癌细胞增殖的速率加快。
     包含可溶 FGF 受体和抗 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物对肿瘤响应的作用可 在小鼠模型中评估， 有可用的前列腺癌小鼠模型 (Ahmad 等人综述， Expert Rev Mol Med， 10 ： e16(2008))， 在实施例 12 中有提供。
     b. 黑素瘤
     浅表性播散性黑素瘤是最普通类型的黑素瘤。约十分之七 (70％ ) 为该类型。它 们最经常发生于中年人。 最通常的位置为女性的腿上， 而男性中其更通常在躯干上， 特别是 背部。它们开始时往往穿过皮肤表面扩散， 这被称为放射生长期。如果在该阶段去除黑素瘤， 治愈的几率非常高。如果不去除黑素瘤， 其将开始向下更深地生长进入皮肤层。然后它 就有在血流或淋巴系统中扩散至身体其它部分的风险。 结节性黑素瘤最通常在胸或背上发 生。其最通常发现于中年人。如果不去除， 其容易很快地生长进入皮肤深处。该类型的黑 素瘤经常从皮肤表面凸起， 触觉像肿块。可为极深褐 - 黑色或黑色。恶性雀斑样黑素瘤最 经常存在于脸上， 特别是老年人。其生长缓慢， 发展可历时数年。肢端黑素瘤通常存在于 手掌， 足底或趾甲周围。其它的极少见类型的皮肤黑素瘤包括无黑色素性黑素瘤 ( 其中黑 素瘤失去其色素且呈现白色区域 ) 和结缔组织增生性黑素瘤 ( 其包括纤维疤组织 )。恶性 黑素瘤可从皮肤之外的身体部分发生， 但这非常少见。可能受影响的身体部分为眼、 口、 指 ( 趾 ) 甲下 ( 称为甲下黑素瘤 )、 外阴或阴道组织， 或身体内部。
     大多数黑素瘤首先是正常皮肤外观的变化。这可看起来像异常的新痣。少于三分 之一在现有的痣中发生。可能难以认出痣和黑素瘤的差异， 但可使用以下清单辅助。其已 知为 ABCD 清单。不对称性 - 普通的痣通常形状对称。黑素瘤很可能为不规则的或不对称 的。 边界 - 痣通常具有界限清晰的规则边界。 黑素瘤更可能具有锯齿状边缘的不规则边界。 颜色 - 痣通常为均匀棕色的。黑素瘤倾向于具有多于一种颜色。它们可以有不同的色调， 棕色混合有黑、 红、 粉、 白色或淡蓝色。直径 - 痣通常不大于铅笔的平端 ( 径向约 6mm)。黑 素瘤通常直径大于 7mm。通常痣可从皮肤凸起和 / 或可有毛。搔痒、 结痂或出血也可发生 于黑素瘤 - 这些是较少出现的迹象但不应忽视 (cancerbacup 互联网网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于 下列文献中所述的的鼠黑素瘤模型中评估 Hermans 等人， Cancer Res.63 ： 8408-13， 2003 ； Ramont 等 人， Exp.Cell.Res.29 ： 1-10， 2003 ； Safwat 等 人， J.Exp.Ther.Oncol.3 ： 161-8， 2003 ； 和 Fidler， Nat New Biol.242 ： 148-9， 1973。
     c. 肾细胞癌
     肾细胞癌为涉及肾小管细胞中的癌性变化的肾癌形式， 其为成人肾癌的最普遍形 式。细胞为什么会变为癌性还未知。吸烟史极大增加发生肾细胞癌的风险。一些人也可 能自遗传获得了发生肾细胞癌的增加的风险， 且家族肾癌病史增加该风险。患有希普尔病 ( 一种影响脑毛细血管的遗传疾病 ) 的人， 通常也发生肾细胞癌。 需要透析治疗的肾疾病也 增加发生肾细胞癌的风险。最初症状通常为尿血。有时两个肾都受累。该癌症容易转移或 扩散， 最经常转移或扩散至肺和其它器官， 且约三分之一的患者在诊断时已转移 (Medline Plus Medical Encyclopedia 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白 的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠肾细胞癌模型中 评估 ： Sayers 等人， Cancer Res.50 ： 5414-20， 1990 ； Salup 等人， Immunol.138 ： 641-7， 1987 ； 和 Luan 等人， Transplatation 73 ： 1565-72， 2002。
     d. 子宫颈癌
     子宫颈为通向阴道的子宫的颈部。 子宫颈癌， 也称为宫颈癌， 发生自子宫颈表面的 异常细胞。 子宫颈癌是影响女性的最常见癌症之一。 在子宫颈癌发生之前通常有发育异常， 子宫颈表面细胞的癌前变化。 这些异常细胞可发展为浸润性癌症。 一旦该癌症出现， 其可经 由四个阶段进展。这些阶段是根据癌症扩散的程度定义的。癌症扩散得越多， 治疗可能约 深切。 子宫颈癌有两种主要类型 ： (1) 鳞状类型 ( 表皮样癌 ) ： 这是最常见的类型， 占子宫颈 癌的约 80％至 85％。该癌症可由性传播疾病引起。一种这样的性病为人乳头状瘤病毒， 其引起尖锐湿疣。该癌症肿瘤在子宫颈上生长并进入子宫颈。该癌症通常起始于子宫颈表面 且可在早期通过巴氏涂片诊断。(2) 腺癌 ： 该类型的子宫颈癌发生于子宫颈管中的宫颈腺 的组织。早期子宫颈癌通常不引起症状。该癌症通常通过巴氏涂片和骨盆检查检测。这就 是为什么你一旦有性活动就应开始进行巴氏涂片和骨盆检查的原因。 从未有性活动的健康 年轻女性应在 18 岁之前进行首次每年的骨盆检查。晚期子宫颈癌引起异常阴道出血或在 预期外的时间 ( 如月经期之间， 性交后， 或绝经后 ) 排出血污。异常阴道排放可为混浊的或 带血的或可包含具有恶味的粘液。 癌症晚期可引起疼痛 (University of Michigan Health System 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠子宫颈癌模型中评估 ： Ahn 等人， Hum. Gene.Ther.14 ： 1389-99， 2003 ； Hussain 等人， Oncology 49 ： 237-40， 1992 ； 和 Sengupta 等 人， Oncology 48 ： 258-61， 1991。
     e. 头颈部肿瘤
     大多数头颈部癌症是称为 “癌” (carcinoma) 的类型 ( 特别是鳞状上皮细胞癌 )。 头颈部的癌起源于构成口、 鼻、 喉或耳的内层， 或覆盖舌的表面层的细胞。 然而， 头颈部癌症 可发生于其它类型的细胞。淋巴瘤发生于淋巴系统细胞。肉瘤发生于构成肌肉、 软骨或血 管的支持性细胞。黑素瘤起始于称为黑素细胞的细胞， 这类细胞给予眼和皮肤颜色。头颈 部的癌症的症状将取决于其位置 - 例如， 舌癌可引起一些语言迟钝。最通常的症状为发生 的头或颈的、 几周内不痊愈的溃疡或损伤区域 ； 吞咽困难， 或咀嚼或吞咽时疼痛 ； 呼吸或讲 话困难， 如持续性呼吸杂音， 语言迟钝或嘶哑 ； 口中麻木感觉 ； 持续鼻塞， 或鼻出血 ； 持续耳 痛， 耳鸣， 或听力困难 ； 口或颈肿胀或肿块 ； 面部或上颌疼痛 ； 在吸烟或咀嚼烟草的人群中， 癌前变化可发生于口的衬里， 或在舌上。 这些可显现为持续白斑 ( 粘膜白斑病 ) 或红斑 ( 粘 膜红斑病 )。它们通常不疼但有时会溃疡且可出血 (Cancerbacup 网站 )。包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下 列文献中所述的鼠头颈肿瘤模型中评估 ： Kuriakose 等人， Head Neck 22 ： 57-63， 2000 ； Cao 等人， Clin.Cancer Res.5 ： 1925-34， 1999 ； Hier 等人， Laryngoscope 105 ： 1077-80， 1995 ； Braakhuis 等人， Cancer Res.51 ： 211-4， 1991 ； Baker， Laryngoscope 95 ： 43-56， 1985 ； 和 Dong 等人， Cancer Gene.Ther.10 ： 96-104， 2003。
     f. 脑癌
     已知脑组织中产生的肿瘤称为脑的原发性肿瘤。 原发性脑肿瘤根据其发源的细胞 类型或其产生的脑的部位命名。最常见的原发性脑肿瘤为神经胶质瘤。它们产生于胶质细 胞。神经胶质瘤有许多类型。(1) 星形细胞瘤 - 该肿瘤产生自呈星形的胶质细胞， 称为星形 细胞。在成人中， 星形细胞瘤最经常产生自大脑。在儿童中， 它们发生于脑干、 大脑和小脑。 III 级星形细胞瘤有时称为间变性星形细胞瘤。IV 级星形细胞瘤通常称为多形性星形细胞 瘤。 (2) 脑干神经胶质瘤 - 该肿瘤发生于脑最下方的部分。 脑干神经胶质瘤最经常在幼儿和 中年成人中诊断出。 (3) 室管膜瘤 - 该肿瘤产生自脑室或脊髓中心管的衬底细胞。 它们最常 见于儿童和年轻成人。(4) 少突胶质细胞瘤 - 这种罕见的肿瘤是由生成覆盖和保护神经的 脂肪物质的细胞发生的。这些肿瘤通常发生于大脑中。它们生长缓慢且通常不扩散进入周 围脑组织。 它们在中年成人中最普遍。 脑肿瘤的症状取决于肿瘤尺寸、 类型和位置。 当肿瘤 压迫神经或损伤某一区域的脑时可引起症状。 当脑肿胀或液体在颅骨中累积时也可产生症状。这些是最常见的脑肿瘤症状 ： 头痛 ( 通常在早晨更严重 ) ； 恶心或呕吐 ； 语言、 视觉、 或 听觉的改变 ； 平衡或行走问题 ； 情绪、 个性、 或集中能力的改变 ； 记忆问题 ； 肌肉跳动或颤搐 ( 癫痫发作或惊厥 ) ； 和手臂或腿的麻木或麻刺感 (National Cancer Institute’ s 网站 )。 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作 用可在类似于下列文献中所述的神经胶质瘤动物模型中评估 ： Schueneman 等人， Cancer Res.63 ： 4009-16， 2003 ； Martinet 等 人， Eur.J.Surg.Oncol.29 ： 351-7， 2003 ； Bello 等 人， Clin.CancerRes.8 ： 3539-48， 2002 ； Ishikawa 等 人， Cancer Sci.95 ： 98-103， 2004 ； Degen 等 人， J.Neurosurg.99 ： 893-8， 2003 ； Engelhard 等 人， Neurosurgery 48 ： 616-24， 2001 ； Watanabe 等人， Neurol.Res.24 ： 485-90， 2002 ； 和 Lumniczky 等人， Cancer Gene Ther.9 ： 44-52， 2002。
     g. 甲状腺癌
     乳头状和滤泡状甲状腺癌占所有甲状腺癌的 80 至 90％。这两种类型都起始于甲 状腺的滤泡细胞。大多数乳头状和滤泡状甲状腺癌倾向于生长缓慢。如果早期检出， 大多 数可成功治疗。髓样甲状腺癌占甲状腺癌病例的 5 至 10％。它在 C 细胞而非滤泡细胞中 产生。如果在甲状腺髓样癌扩散至身体其它部分之前被发现和治疗， 其易于控制。甲状腺 未分化癌为最少见的一类甲状腺癌 ( 仅占病例的 1 至 2％ )。其在滤泡细胞中发生。该癌 细胞高度异常且难以识别。该类型的癌症通常非常难以控制， 因为癌细胞倾向于非常快速 生长和扩散。早期甲状腺癌经常不产生症状。但随着癌症生长， 症状可包括 ： 出现在颈前 部接近喉结的团块或结节 ； 声嘶或正常声音讲话困难 ； 淋巴结肿胀， 尤其在颈部 ； 吞咽或呼 吸困难 ； 或咽喉或颈疼痛 (National Cancer Institute 的网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可 溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下述文 献的小鼠或大鼠甲状腺肿瘤模型中评估 ： Quidville 等人， Endocrinology 145 ： 2561-71， 2004( 小鼠模型 ) ； Cranston 等人， Cancer Res.63 ： 4777-80， 2003( 小鼠模型 ) ； Zhang 等 人， Clin Endocrinol(Oxf).52 ： 687-94， 2000( 大鼠模型 ) ； 和 Zhang 等人， Endocrinology 140 ： 2152-8， 1999( 大鼠模型 )。
     h. 肝癌
     有两种不同类型的原发性肝癌。最通常的种类称为肝癌或肝细胞癌 (HCC)， 源 自肝的主要细胞 ( 肝细胞 )。该类型通常限于肝， 尽管偶尔其延伸至其它器官。其经常 发生于患有一种称为肝硬化的肝病的人中。还有一种稀有的肝癌亚型， 称为纤维板层 (Fibrolamellar) 肝癌， 其可发生于年轻人中且与之前的肝疾病不相关。 另一类型的原发性 肝癌称为胆管癌或胆管癌症， 因为其起始于胆管衬底的细胞。大多数患有肝癌的人还通常 具有称为肝硬化的肝病。 肝硬化是由于多种原因， 包括感染和长期大量饮酒， 而在整个肝中 发生的细小的瘢痕形成。然而， 仅有小比例的肝硬化的人产生原发性肝癌。感染乙型肝炎 或丙型肝炎病毒可导致肝癌， 且也可为肝硬化的原因， 这增加产生肝癌的风险。 患有稀有症 状称为血色病 ( 其引起体内铁的过量沉积 ) 的人， 具有更高的发生肝癌的几率。因此， 本发 明的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可用于治疗 肝细胞癌、 预防肝细胞癌、 抑制肝细胞癌进展， 延迟肝细胞癌发生， 和 / 或减少与肝细胞癌 相关的至少一种症候或症状严重性或抑制与肝细胞癌相关的至少一种症候或症状。 肝细胞 癌可与肝炎 ( 例如， 甲型肝炎， 乙型肝炎， 丙型肝炎和丁型肝炎 ) 感染相关或不相关。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响 应的作用可在肝细胞癌转基因小鼠模型中评估， 其包括单独的转化生长因子 -α(TFG-α) 的过表达 (Jhappan 等人， Cell， 61 ： 1137-1146， 1990 ； Sandgren 等人， Mol.Cell.Biol.， 13 ： 320-330， 1993 ； Sandgren 等 人， Oncogene 4 ： 715-724， 1989 ； 和 Lee 等 人， CancerRes.52 ： 5162 ： 5170， 1992) 或 其 与 c-myc(Murakami 等 人， Cancer Res.， 53 ： 1719-1723， 1993)， 突 变 的 H-ras(Saitoh 等 人， Oncogene 5 ： 1195-2000， 1990)， 编 码 HbsAg 和 HBx 的 乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 (Toshkov 等 人， Hepatology 20 ： 1162-1172， 1994 ； Koike 等 人， Hepatology 19 ： 810-819， 1994)， SV40 大 T 抗 原 (Sepulveda 等 人， Cancer Res.49 ： 6108-6117， 1989 ； Schirmacher 等人， Am.J.Pathol.， 139 ： 231-241， 1991) 和 FGF19(Nicholes 等人， American Journal of Pathology， 160 ： 2295-2307， 2002) 的组合的过表达。
     i. 肺癌
     包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤 响应的作用可在人小细胞肺癌 / 非小细胞肺癌异种移植模型中评估。简言之， 将人肿瘤 移植至免疫缺陷小鼠， 然后用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白单独治疗或与其它可用于通过评估肿瘤生长证实治疗的功效的药物组合治 疗这些小鼠 (Nemati 等人， Clin Cancer Res.6 ： 2075-86， 2000 ； 和 Hu 等人， Clin.Cancer Res.10 ： 7662-70， 2004)。
     2. 实体瘤的终点和抗肿瘤活性
     尽管各种规程对肿瘤响应评估可能有不同的定义， 但 RECIST( 实体瘤的响应评 价标准 ) 标准目前被认为是国立癌症研究所用于评估肿瘤响应的推荐的指导方针 ( 参见 Therasse 等人， J.Natl.Cancer Inst.92 ： 205-216， 2000)。根据 RECIST 标准， 肿瘤响应是 指减少或消除所有可测的病变或转移。 在以下条件下， 疾病通常认为是可测量的 ： 疾病包含 可在至少一个维度上可以被准确测量为≥ 20mm( 用常规技术 ) 或≥ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的损伤， 且通过医学照相或 X- 射线、 计算机轴断层摄影术 (CT)、 磁共振成像 (MRI) 或临床检 测 ( 如果损伤是表面的 ) 可见具有清楚限定的边界。不可测量的疾病是指以下疾病， 其由 ＜ 20mm( 用常规技术 ) 或＜ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的病变， 和确实不可测的病变 ( 太小而 不能准确测量 ) 构成。不可测量的疾病包括胸腔积液， 腹水， 和间接证据证明的疾病。
     规程需要目标状态的标准以评估实体瘤响应。代表性的标准包括以下 ： (1) 完全 响应 (CR)， 定义为所有可测量的疾病的完全消失 ； 无新的病变 ； 无疾病相关的症状 ； 无不可 测量的疾病的证据 ； (2) 部分响应 (PR)， 定义为靶病变的最长直径的总和降低 30％ ； (3) 进 行性疾病 (PD)， 定义为靶病变的最长直径的总和增加 20％或出现任何新病变 ； (4) 稳定或 无响应， 定义为未达到 CR、 PR、 或进行性疾病的标准者。( 参见 Therasse 等人， 上文 )。
     其他在肿瘤学领域中公认的终点包括总存活 (OS)， 无疾病存活 (D6FS)， 目标应答 率 (ORR)， 进展前时间 (TTP)， 和无进展存活 (PFS)( 参见 Guidance for Industry ： Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics， 2005 年 4 月， Center for Drug Evaluation and Research， FDA， Rockville， MD)。
     3. 组合癌症疗法
     如上讨论的， 在某些实施方案中， 将双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合与 治疗新生血管疾病的第二药剂组合使用。当用于治疗癌症时， 本发明的拮抗剂可用于与常规癌症治疗组合使用， 常规癌症治疗例如， 外科手术， 放疗， 化疗， 或其组合。 在某些方面， 其 它可用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行 组合癌症治疗的治疗剂包括其它抗血管发生剂。在一些其它方面， 其它用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行组合治疗的治疗剂包括针 对肿瘤生长中涉及的其它因素的拮抗剂， 所述的其它因素例如， EGFR， ErbB2(Her2)， ErbB3， ErbB4， 或 TNF。在一些方面， 将包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白与细胞因子 ( 例如， 刺激对肿瘤的免疫应答的细胞因子 ) 共同施用。特别适 合用于治疗癌症的示例性组合治疗在以下更详细描述。
     a. 靶向肿瘤相关的抗原的抗体与包含双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白的双特 异性结合蛋白的组合
     抗体疗法在癌症治疗中已获得了特别的成功， 因为某些肿瘤显示唯一的抗原、 种 系特异性抗原、 或相对于正常细胞而言过量存在的抗原。与单克隆抗体治疗的抗肿瘤活性 相关的一种机理是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)。 在 ADCC 中， 单克隆抗体结合至靶细胞 ( 例 如， 癌细胞 )， 而表达所述单克隆抗体的受体的特异性效应细胞 ( 例如， NK 细胞， 单核细胞， 粒细胞 ) 结合至该单克隆抗体 / 靶细胞复合物， 导致靶细胞死亡。在本发明的某些变化形 式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白与针对肿瘤 相关的抗原的单克隆抗体共同施用。 单抗的剂量和时程基于所共同施用的特定抗体的药代 动力学和毒物代谢动力学特性， 且应优化这些效果， 同时最小化可与施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白相关的任何毒性。
     当第一线治疗 (first line treatment) 失败时， 可指示需要与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和对肿瘤 - 相关的抗原的单克隆抗体 的组合治疗， 并可考虑将该组合治疗作为第二线治疗。本发明还提供， 对于新确诊的、 先前 未用抗癌剂治疗的患者群体 (“新患者” )， 和先前未接受任何单克隆抗体治疗的患者 (“首 次治疗患者” )， 使用该组合作为第一线治疗。
     双特异性结合蛋白也可用于在不存在任何直接的抗体介导的肿瘤细胞的 ADCC 情 况下与针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体组合治疗。例如， 在免疫系统中阻断抑制信号的抗 体可导致增强的免疫应答。实例包括 (1) 抗具有抑制功能的 B7R 家族的分子， 如， 细胞毒性 T 淋巴细胞 - 相关的抗原 4(CTLA-4)， 程序死亡 -1(PD-1)， B 和 T 淋巴细胞弱化子 (BTLA) 的 抗体 ； (2) 抗抑制性细胞因子如 IL-10、 TGFβ 的抗体 ； 和 (3) 消减或抑制遏制性细胞的功能 的抗体如抗 CD25 或 CTLA-4。 例如， 认为抗 CTLA4 单抗在小鼠和人中都抑制免疫抑制调节性 T 细胞 (Tregs) 的功能或抑制通过 T 细胞上 CTLA-4 与 APC 或肿瘤细胞上的 B7-1 或 B7-2 分 子的结合传递的抑制信号。
     表 8 是一些已经得到批准或正在接受测试的单克隆抗体的非排他性列表， 这些单 克隆抗体与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组 合治疗是可能的。
     表8： 用于与 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白组合使用的单克隆抗 体疗法
    49102448984 A CN 102449007 靶 TRAIL-R1 TRAIL-R2 CD40 HER2
     靶 EGF-R EGF-R EGF-R EGF-R α5β3 整联蛋白 CD152 CD49e MUC18(TIM- 状 ) TAG-72 粘蛋白 CD3 CD64(FcGR1) CEA EpCAM Lewis-Y-Ag
     药物名称 ABX-EGF EMD72000 MDX-214 爱必妥 (Erbitux) Vitaxin CTLA-4 整联蛋白 α5 ABX-MA1 Anatumomab Ecromeximab AntiCD64 CEA-Cide Panorex SGN15 药物名称 HGS-ETR1 HGS-ETR2 SGN40 赫赛汀说明书公司 HGS HGS46/82 页临床适应证 癌症 实体瘤 MM 乳腺癌Seattle Genetics Genentech临床适应证 CRC， NSCLC， RCC 实体瘤 EGF-R- 阳性肿瘤 CRC 银屑病， 前列腺癌 癌症 癌症 黑素瘤 癌症 黑素瘤 癌症 癌症 结肠直肠癌 癌症公司 Abgenix Merck Medarex Imclone AME/Lilly Medarex Protein Design LabsKyowa Hakko Medarex Immunomedics Centocor Seattle Geneticsb. 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白
     在一些实施方案中， 包含如本文所述的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合 蛋白的双特异性结合蛋白与酪氨酸激酶抑制剂组合使用。酪氨酸激酶是催化 γ 磷酸基团 从三磷酸腺苷转移至靶蛋白的酶。 酪氨酸激酶可分类为受体蛋白酪氨酸激酶和非受体蛋白 酪氨酸激酶。 它们在多种正常细胞过程中起关键作用， 包括通过生长受体的活化， 且影响多种细胞类型的增殖、 存活和生长。此外， 认为它们促进肿瘤细胞增殖， 诱导抗凋亡作用且促 进血管发生和转移。除了通过生长因子的活化， 通过体细胞突变的蛋白质激酶活化是肿瘤 发生的一种普遍机理。一些已鉴定的突变在 B-Raf 激酶， FLt3 激酶， BCR-ABL 激酶， c-KIT 激酶， 表皮生长因子 (EGFR) 和 PDGFR 途径中发生。Her2、 VEGFR 和 c-Met 是其他在癌症进 展和肿瘤发生涉及的重要的受体酪氨酸激酶 (RTK) 途径。因为大量细胞进程是由酪氨酸激 酶引发的， 它们已被确认为抑制剂的关键靶标。
     酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 是在细胞中起作用的小分子， 与三磷酸腺苷 (ATP) 竞争 对受体和非受体酪氨酸激酶两者的催化性酪氨酸激酶域的结合。 该竞争性结合阻断下游信 号传递的引发， 所述下游信号传递导致与这些信号事件相关的效应作用如生长、 存活和血 管发生。使用结构和计算手段， 从众多医药化学组合库鉴定出了大量抑制酪氨酸激酶的化 合物。
     认为大多数 TKI 通过直接抑制肿瘤细胞或通过抑制血管发生而抑制肿瘤生长。而 且， 某些 TKI， 包括索拉非尼和舒尼替尼， 通过 VEGF 家族受体影响信号传导。 在一些情况下， 已显示 TKI 可活化树突状细胞和其它天然免疫细胞， 如 NK 细胞的功能。这最近在动物模型 中对于伊马替尼进行了报道。伊马替尼是一种已被证明通过树突状细胞和 NK 细胞而增强 杀伤活性的 TKI( 综述参见 Smyth 等人， NEJM 354 ： 2282， 2006)。
     BAY 43-9006( 索 拉 非 尼， Nexavar ) 和 SU11248( 舒 尼 替 尼， Sutent ) 是 两 种 这 样 的 TKI， 它 们 最 近 获 准 用 于 转 移 性 肾 细 胞 癌 (RCC)。 许 多 其 它 TKI 处 于 晚 期 和 早 期 开 发 之 中， 用 于 治 疗 不 同 类 型 的 癌 症。 其 它 TKIs 包 括， 但不限于 ： 甲磺酸 伊 马 替 尼 (Gleevec Novartis) ； 吉 非 替 尼 (Iressa AstraZeneca) ； 埃罗替尼 盐 酸 盐 (Tarceva Genentech) ； 凡 德 他 尼 (Zactima AstraZeneca)，替 吡 法 尼 (Zarnestra Janssen-Cilag) ； 达 沙 替 尼 (Sprycel Bristol Myers Squibb) ； 洛那 法尼 (Sarasar Schering Plough) ； 瓦他拉尼琥珀酸盐 (Novartis， Schering AG) ； 拉 帕替尼 (Tykerb GlaxoSmithKline) ； 尼洛替尼 (Novartis) ； 来他替尼 (Cephalon) ； 帕 唑帕尼盐酸盐 (GlaxoSmithKline) ； 阿西替尼 (Pfizer) ； 卡奈替尼二盐酸盐 (Pfizer) ； 培 利 替 尼 (National Cancer Institute， Wyeth) ； 坦 度 替 尼 (Millennium) ； 博舒替 尼 (Wyeth) ； 司 马 沙 尼 (Sugen， Taiho) ； AZD-2171(AstraZeneca) ； VX-680(Merck， Vertex) ； EXEL-0999(Exelixis) ； ARRY-142886(Array BioPharma ，AstraZeneca) ； PD-0325901(Pfizer) ； AMG-706(Amgen) ； BIBF-1120(Boehringer Ingelheim) ； SU-6668(Taiho) ； CP-547632(OSI) ； (AEE-788(Novartis) ； BMS-582664(Bristol-Myers Squibb) ； JNK-401(Celgene) ； R-788(Rigel) ； AZD-1152HQPA(AstraZeneca) ； NM-3(Genzyme Oncology) ； CP-868596(Pfizer) ； BMS-599626(Bristol-Myers Squibb) ； PTC-299(PTC Therapeutics) ； ABT-869(Abbott) ； EXEL-2880(Exelixis) ； AG-024322(Pfizer) ； XL-820(Exelixis) ； OSI-930(OSI) ； XL-184(Exelixis) ； KRN-951(Kirin Brewery) ； CP-724714(OSI) ； E-7080(Eisai) ； HKI-272(Wyeth) ； CHIR-258(Chiron) ； ZK-304709(Schering A G) ； EXEL-7647(Exelixis) ； BAY-57-9352(Bayer) ； BIBW-2992(Boehringer Ingelheim) ； AV-412(AVEO) ； YN-968D1(Advenchen Laboratories) ；米 哚 妥 林 (Novartis) ；哌 立 福 辛 (AEterna Zentaris， Keryx， National Cancer Institute) ； AG-024322(Pfizer) ； AZD-1152(AstraZeneca) ；ON-01910Na(Onconova) ； 和 AZD-0530(AstraZeneca)。
     c. 化学治疗组合
     在某些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体的双特异性结合蛋白与一种 或多种化学治疗剂组合施用。化疗剂具有不同的作用方式， 例如， 通过影响 DNA 或 RNA 和 干扰细胞周期复制。以 DNA 水平或 RNA 水平作用化学治疗剂的实例为抗代谢物 ( 如硫唑 嘌呤， 阿糖胞苷， 磷酸氟达拉滨， 氟达拉滨， 吉西他滨， 阿糖胞苷， 克拉屈滨， 卡培他滨 6- 疏 基嘌呤， 6- 硫鸟嘌呤， 甲氨蝶呤， 5- 氟尿嘧啶和羟基脲 ) ； 烷化剂 ( 如美法仑， 白消安， 顺铂， 卡铂， 环磷酰胺， 异环磷酰胺， 达卡巴嗪， 丙卡巴肼， 苯丁酸氮芥， 塞替派， 洛莫司汀， 替莫唑 胺)； 抗有丝分裂剂 ( 如长春瑞滨， 长春新碱， 长春碱， 多西紫杉醇， 紫杉醇 ) ； 拓扑异构酶 抑制剂 ( 如多柔比星， 安吖啶， 伊立替康， 柔红霉素， 表柔比星， 丝裂霉素， 米托蒽醌， 伊达比 星， 替尼泊苷， 依托泊苷， 拓扑替康 ) ； 抗生素 ( 如放线菌素和博来霉素 ) ； 门冬酰胺酶 ； 蒽环 类抗生素或紫杉烷。
     d. 放射治疗组合
     在一些变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与放射治疗组合施用。某些肿瘤可用放射或放射性药物治疗。放射治疗通常用 于治疗不能切除的或不能手术的肿瘤和 / 或肿瘤转移物。放射治疗通常以三种方式递送。 外束放射在人体一定的距离之外给予， 包括 γ 射线 (60Co) 和 X- 射线。近程放疗使用与靶 137 192 组织一起或与靶组织接触的放射源， 例如 60Co， Cs， Ir， 或 125I。
     e. 激素药组合
     在一些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与激素或抗激素组合施用。 某些癌症与激素依赖相关， 包括， 例如， 卵巢癌， 乳腺 癌和前列腺癌。激素依赖性癌症的治疗可包括使用抗雄激素或抗雌激素化合物。用于癌症 治疗的激素和抗激素包括磷酸雌莫司汀， 磷酸聚雌二醇， 雌二醇， 阿那曲唑， 依西美坦， 来曲 唑， 他莫昔芬， 乙酸甲地孕酮， 醋酸甲羟孕酮， 奥曲肽， 乙酸环丙孕酮， 比卡鲁胺， 氟他胺， 曲 普瑞林， 亮丙瑞林， 布舍瑞林和戈舍瑞林。
     本发明进一步通过以下非限制性实例阐述。
     实施例 1 ： 筛选结合 VEGF-A 的抗体
     通 过 筛 选 Dyax Fab 310 噬 菌 体 文 库 (Dyax Corp.， Cambridge， MA) 来 鉴 别 结 合 VEGF-A 的抗体。选定的噬菌体 - 抗体文库选择和筛选方法使用抗原 (VEGF-A165， R&D Systems) 包被的聚苯乙烯免疫管 (NUNC， Denmark)。通过在少数轮的选择后增加严格性而 分离抗体。第一代抗体为 Fab 形式。通过 MluI(#R0198S， New England Biolabs， Beverly， MA) 酶消化产生可溶 Fab 抗体以去除 M13 噬菌体中的 geneIII 残株 (stump)。对 scFv 形式 的抗体使用了相同的选择、 筛选和裂解策略。
     实施例 2 ： 鉴别 VEGF-A 结合性 Fab 克隆
     通过基于平板的结合测定 (plate based binding assay) 来鉴别结合 VEGF-A 的 Fab 克隆。Costar(#9018)96- 孔板用 50μl VEGF-A(R&D Systems) 或 PDGF-D(SEQ ID NO ： 80) 同二聚体 (0.6μg/ml 在 0.1M NaHCO3， pH 9.6 中 )4 ℃包被过夜。第二天， 用 0.1 ％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。 各孔加入 100μl 2％牛乳 (#170-6404， Bio-Rad)/PBST， 室温封闭 1 小时。然后用 PBST 洗涤测试板三次。各孔加入 25ul 2％牛乳 /PBST， 然后添加25ul Fab 上清液。然后混合各孔， 在室温孵育 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。对于 Fab 检 测， 将 2％牛乳 /PBST 中的 50ul(1 ∶ 4000) 抗人 Fab 特异的 pAb-HRP(#31482， Pierce) 添 加至各孔， 室温保持 1 小时。然后用 PBST 洗涤板三次。将 50ul TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔， 显色 15 分钟， 然后添加 50ul 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以终止该反应。然后将平板在板读数器上以 450nm 读数。
     实施例 3 ： 将 VEGF-A 结合性 sFab 转化为 scFv
     对于一个第 2 轮， A 臂和 B 臂 VEGF-A 筛选的 Fab Dyax 噬菌体 DNA 池， 通过一套 3 步骤程序使用对各亚型的框架序列的引物扩增 λ、 κ 和重链可变区。第一轮 PCR 扩增各可 变框架区且添加合适的突出端以促进第 2 轮 PCR 反应。 第 2 轮 PCR 反应向正确的第 1 轮 PCR 产物的末端添加合适的 gly/ser 接头序列， 第 3 轮 PCR 反应将可变轻链 λ、 可变轻链 κ、 和 可变重链产物重叠以产生 LH 和 HL 两种取向的 scFv 产物， 然后其克隆至经 ApaLI/NotI- 消 化的 PIMD21 噬菌体展示载体。
     实施例 4 ： 抑制 VEGF 与 sVEGFR2 的结合的 sFab 和 scFv 的鉴别
     通过基于平板的中和测定筛选 VEGF-A Fab 和 scFv 克隆。 将 Costar(#9018)96- 孔 板用 100μl 抗人 IgG Fcγ- 特异抗体 (#109-005-098， Jackson Immunology)(1μg/ml， 在 0.1M NaHCO3 中， pH 9.6) 在 4℃包被过夜。第二天， 用 400ul 0.1％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。各孔加入 100μl 1％ BSA(#A3059-100G， ∑ )/PBST， 在室温 (RT) 阻断 1 小时。 用 PBST 洗涤板三次。将 100μl VEGFR2-Fc(SEQ ID NO ： 81)( 以 0.2μg/ml， 在 1 ％ BSA/ PBST 中 ) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。同时， 在一块单独的 96 孔板 (Costar 3357) 中， 将 65μl Fab 或 scFv 上清液添加至 65μl 生物素化 VEGF-A( 在 1％ BSA/PBST 中， 20ng/ml) 中， 在室温保持 1 小时。将经封闭的测定平板用 PBST 洗涤三次。各孔加入 100μl 上清液 / 生物素化 VEGF-A 复合物， 在室温保持 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。将 100μl 1％ BSA/ PBST 中的 (1 ∶ 4000) 链亲和素 -HRP(#21124， Pierce) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。然 后用 PBST 洗涤板三次。将 100μl TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔 以显色 20 分钟， 然后添加 100μl 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以停 止反应。然后将板以 450nm 在板读数器上读数。
     实施例 5 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的 相互作用的解离速率常数
     对人 VEGF-A 拮抗剂评估其与人 VEGF-A 的结合亲和力。
     VEGF-A 根据其解离速率常数使用表面等离子共振。通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的解离速率常数。解离速率常数 (kd(s-1)) 是反映该 复合物稳定性的值。其与浓度不相关， 因此适合用于筛选和评定未知浓度的样品。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结合亲和力。在 TM Biacore T-100 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合动力学和亲和力研究。 使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程方法。使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 将人 VEGF-A 共价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到约 200RU 的密度。将 VEGF-A 仅固定至活性流动 室 (active flow cell)。固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室上的剩余活性位点。用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。活化参照室， 然后用乙醇胺封闭。
     将 VEGF-A 拮抗剂上清液 ( 选自 Dyax 噬菌体文库筛选 ) 在流动缓冲液中 1 ∶ 3 稀释， 注射在表面上， 容许其特异结合至传感器芯片上的 VEGF-A， 结合时间为 5 分钟， 离解时 间为 5 分钟。双重注射 100nM VEGFR-2-Fc5 和 100nM 抗 VEGF-A 单克隆抗体 (AvastinTM， Genentech) 用作阳性对照。使用 30ul/min 的流速进行动力结合研究。所有结合实验在 25℃于 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的流动缓冲液中进行。还进行缓冲液注射以允许减少仪器干扰和误差。在循环之 间， 流动室用 10mM 甘氨酸， pH 1.5 洗涤以从表面去除结合的 VEGF-A 拮抗剂。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射进行处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个系列的注射中提供了一 致的结合表面。因为 VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 所得结合曲线与计算解离速率常数 (kd(s-1)) 的 1 ∶ 1 解离结合模型完全拟合。
     结果 ： 测定 VEGF-A 拮抗剂对人 VEGF-A 的解离速率分析。 所得结合曲线与 1 ∶ 1 解 离模型良好吻合。VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 因此仅报道解离速率常数 (kd(s-1))， 因 为 kd 与浓度不相关。计算的解离速率常数从最慢至最快排列。在这些测试条件下， VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用显示大范围的解离速率常数 (1.E-5-2.E-2(s-1))( 参见表 5)。为了比较， VEGFR-2-Fc5-VEGF-A 相互作用的 kd 为约 2.E-4s-1， 抗 VEGF-A 单克隆抗体 AvastinTM Fab-VEGF-A 相互作用为约 8.E-5s-1。
     表5： VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A scFvs 和对照物的相互作用的解离速率常数
    实施例 6 ： 衍生自大肠杆菌周质级分的蛋白质的纯化
     在大肠杆菌细胞的周质空间中表达了 scFv、 串联 scFv 和 sFab 蛋白质。 发酵规模从 25mL 摇瓶培养到 2L 分批补料的系统不等。 大肠杆菌细胞使用离心机旋转沉降为离心沉淀。 以每克湿细胞重量 2mL 的比例将湿细胞离心沉淀完全重悬浮于周质缓冲液 [0.2M Tris， 20％ (w/v) 蔗糖， 完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 (Roche)pH 7.5]。 过程中可包括或不包 括溶菌酶 ( 促进细胞壁降解的酶 )。 为确定是否使用溶菌酶， 将 500uL 重悬浮的离心沉淀转 移至 Eppendorf 管， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将 悬浮液在室温孵育 5 分钟。孵育后， 通过翻转来检测溶液的粘度增加。如果溶液粘在管壁 上， 那么可能发生了过早的细胞裂解， 则在准备的溶液中不包含溶菌酶。 如果溶液不粘在管
     壁上， 则将溶菌酶包含在准备的溶液中。 如果使用溶菌酶， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将悬浮液在室温孵育 4-6 分钟。 以每克初始湿细胞离心沉 淀重量 3mL 的比例添加冰冷的水， 并将溶液孵育至少 10 分钟但不长于 30 分钟。将剩余原 生质球在室温通过离心分离以 15,000xg( 或 10,000-20,000RPM， 以更快者为准 ) 离心沉淀 至少 15 分钟， 但不长于 45 分钟。将包含周质级分的上清液倒入新容器且使用称出的固体 调节至 25mM 咪唑， 500mMNaCl。 该溶液通过 0.22um 滤器过滤， 然后使用瓶顶滤器 (Nalgene) 纯化。
     固定的金属亲和色谱 (IMAC) 捕获
     常规上， 将 5mL HisTrap HP 柱 (GE Healthcare) 用于 IMAC 步骤， 然而， 柱的尺 寸可以按比例放大或缩小， 取决于通过分析 IMAC-SEC 测定法测得的周质部分中的 scFv 靶物的量。已显示该 IMAC 树脂的结合能力至少为 20mg/mL 填充床。如果使用尺寸大于 10mL 的柱， 优选内径为 2 和 5cm 的 Waters 玻璃柱 (Millipore)。使用合适的色谱工作站 (Akta Explorer， 使用 UNICORN 软件 4.1 和更高版本 [GE Healthcare]， 或 BioCAD Sprint， 700E， 或 Vision， 使用 Perfusion Chromatography 软件， 版本 3.00 或更高版本 [Applied Biosystems])， 将 IMAC 柱在 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 25mM 咪唑 pH 7.5 中平衡， 且周质级分 以不快于 190cm/hr 上柱直到耗尽。用平衡缓冲液洗涤柱子直到在不超过 190cm/hr 的流速 下在 UV A254nm 和 UV A280nm 的监测基线稳定至少 2 个 CV。使用 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 400mM 咪唑， pH 7.5 以不快于 190cm/hr 竞争性洗脱结合的蛋白。 洗脱级分通过 UV@A280nm、 分析型大小排阻色谱、 和 SDS-PAGE 评估蛋白质含量。
     其它色谱技术
     通过 SDS-PAGE 凝胶和分析型大小排阻色谱 (SEC) 评估 IMAC 池 (pool) 的纯度。 如 果该池不适合通过 SEC 最终提纯， 则使用其它色谱技术以进一步纯化靶 scFv 蛋白质以去除 残余宿主细胞污染物和聚集体。这些常规技术包括阴离子交换、 阳离子交换和疏水相互作 用。也使用其它基于亲和力的方法， 包括， 但不限于使用 c- 端 myc 标签， 借助抗 myc 树脂或 使用共价偶合至刚性珠子的合适的配体的配体亲和力方法。 这些其它技术的用处依具体的 蛋白质而定。
     大小排阻色谱法 (SEC)
     通过 UV@A280nm 和分析型 SEC 方法评估的蛋白质的量确定了所用的凝胶过滤柱 的尺寸 ： ＜ 1mg ＝ 10/300Superdex 200GL 柱， 1-10mg ＝ 16/60Superdex 200， ＞ 10mg ＝ 26/60Superdex 200( 均获自 GE Healthcare)。 IMAC 洗脱池使用 10kD MWCO Ultracel 离心 浓缩机 (Millipore) 浓缩， 且最终浓缩物体积不大于使用的凝胶过滤柱的体积的 3％。将 浓缩物注射入柱， 等度洗脱蛋白质， 流速不超过 76cm/hr 且不慢于 34cm/hr。通过 SDS-PAGE 分析洗脱级分， 制成合适的池。
     内毒素去除
     关于内毒素水平的最终产物规格依据一个特定群集的状态来确定。使用 10kD MWCO Ultracel 离心浓缩机 (Millipore) 将 SEC 池浓缩至＞ 0.25mg/mL( 通过 UV@A280nm 测定 )。Mustang E 0.22um 滤器 (PALL) 用 SEC 流动相缓冲液预润湿， 通过手动注射递送系 统将 SEC 浓缩物通过该滤器过滤， 流速为～ 1mL/min。使用 PTS EndoSafe 系统 (Charles River) 测试最终过滤产物的内毒素， UV@A280nm 浓度， 等分储存。实施例 7 ： 利用 293/KDR/KZ136/c22VEGF-A- 诱导的基于细胞的荧光素酶测定法鉴 别中和性抗人 VEGF scFv
     为筛选候选分子 (scFv) 中和人 VEGF-A 的活性的能力， 进行基于细胞的荧光素酶 测定法。293/KDR/KZ136/c22 细胞于 100μl 完全培养基 (DMEM， 10 ％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中以 10,000 细胞 / 孔的接种密度铺板于 96 孔不 透明白色组织培养处理板 (Costar#3917)， 在 37℃湿润的 5％ CO2 培养箱中孵育 48 小时。 48 小时后， 通过真空抽吸去除完全培养基， 用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 替换， 孵育过夜。
     第二天， 将候选 VEGF-A 中和性分子 (scFv， Fab)， 阳性对照 ( 贝伐单抗 ( 抗 VEGF-A 单克隆抗体， Genentech)， ranibizumab( 抗 VEGF-A 亲和力成熟 Fab， Genentech) 和内部制 备的贝伐单抗 Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一起在无血清培养基中以 1 ∶ 5 稀释从 200nM 连续稀释至 12pM。向这些之中， 添加等体积的 0.54nM VEGF-A165， 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 地中和分子或阳性对照。将这些在 37℃培养 60 分钟。培养后， 将培养基从 血清饥饿细胞吸出， 添加 100μl 上述复合物， 并在 37℃培养 4 小时。
     4 小时孵育后， 使用荧光素酶测定系统 (Promega， E1501) 根据制造商的说明进行 荧光素酶测定。简言之， 吸出培养基且将 25μl 1X is 缓冲液 (Promega， E153A) 添加至各 孔。将平板在室温孵育 20-30 分钟以平衡。使用微板发光计 (Berthold Technologies)、 以 40μl 的底物注射量、 1 秒的积分时间测量荧光素酶活性。使用分析软件 (Spotfire) 分析 数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     VEGF-A165 与其受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱发一个信号级联， 使驱使 荧光素酶报道基因转录的 STAT( 转录的信号转导物和活化剂 ) 和 / 或 SRE( 血清 - 响应元 素 ) 活化。荧光素酶活性的降低表明该 VEGF-A 介导的信号传递被中和。
     结果 ： 针对下表 6 所列的 scFv 在荧光素酶测试中筛选中和 VEGF- 诱导的活性。若 干被筛选的 scFvs 显示了显著抑制 ( 在表 6 中报道为 IC50 值 )。 IC50 值表示为中和 VEGF- 活 性 达 50 ％ 所 需 的 scFv 的 nM 浓 度。 贝 伐 单 抗 (AvastinTM)， LucentisTM， 和 AvastinTM Fab( 内部制备 ) 用作活性的对照。
     表6： scFvs 和对照在基于细胞的荧光素酶测定中的活性
     IC50(nM)
     AvastinTM LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 0.1-0.4 0.1-0.5 2.9-6.45 0.95 0.16-0.3 0.07实施例 8 ： 用于测定 VEGFA scFv 对人 VEGF-A- 刺激的 HUVEC 细胞的中和活性的增殖测定 为筛选对 VEGF-A 具有适中亲和力的中和 VEGF-A scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组 人 VEGF-A165 以 2.6nM 用作阳性对照。含有 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。将人 VEGF-A scFv 在 SFM 中连续稀释为 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内 皮细胞 (HUVEC) 铺板于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 该 HUVEC 细胞在 37℃， 5％ CO2 下在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中铺板 2 天。细 胞用 SFM 血清饥饿培养 24h， 用 2.6nM 在有或没有连续稀释的 VEGF-A scFv 的情况下刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H- 胸苷 ( 其掺入增殖中的细胞 ) 冲激 24h( 均在 37℃， 5％ CO2)。收 集细胞且使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 如表 7 所示的低 nM IC50 值可见， 大量在该测定中筛选的 scFvs 显示人 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖的有效中和。
     表7： HUVEC 增殖测试中的抗 VEGF-A scFv 中和活性
    
     scFvs 和对照 AvastinTM
     LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 c870e6
     0.3-0.8 14-17 1.00 0.8-2 0.7 1.6-4 IC50(nM) 0.3-0.6实施例 9 ： VEGF-A 拮抗剂的表位分拣 (Epitope Binning)
     进行表位分拣实验以测定哪种 VEGF-A 拮抗剂能同时结合至人 VEGF-A。竞争抗原 上的相同或重叠的结合位点 ( 表位 ) 的 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合， 在功能上分组到同一 家族或 “表位仓” (Epitope Bin) 中。不竞争抗原上的相同结合位点的 VEGF-A 拮抗剂能同 时结合， 被分组到不同的家族或表位仓中。 实验使用 Biacore T100TM 仪器进行。 Biacore 仅 仅是通常用于将抗体片段和单克隆抗体组 (panels) 分配至表位仓的多种测试形式中的一 种。许多文献 ( 例如， The Epitope Mapping Protocols， Methods in Molecular Biology， Volume 6， 6 Glenn E.Morris ed.) 描述了备选方法， 其可用于 “储藏” 抗体片段且预期能提 供关于 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合特征的参照数据。表位分拣实验使用可溶的天然 人 VEGF-A 作为抗原进行。材料和方法 ： 在 BIACORE T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行两 个单独的表位分拣实验。在两个实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 共 价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到密度约 800-1000RU。 固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室 上的剩余活性位点。通过用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。参照室也被活化， 然后用乙醇胺在没有 VEGF-A 拮抗剂的条件下封闭。
     在第一组实验中， 将第二 VEGF-A 拮抗剂和 VEGF-A 抗原稀释至 100nM。 注射 VEGF-A 抗原且使其特异结合于固定在传感器芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。VEGF-A 是二聚物， 因此对 每个 VEGF-A 拮抗剂而言存在两个潜在的结合位点。为保证所有结合位点被占据， 将先前固 定的第一 VEGF-A 拮抗剂注射在 VEGF-A 上。该步骤后， 注射第二 VEGF-A 拮抗剂以观察与 VEGF-A 的同时结合。
     在第二组分拣实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂再次共价固定至 BIACORECM5 传感器芯 片的单独的流动细胞。 然而， 在该实验中， 将 10nM VEGF-A 抗原与 1mM 第二 VEGF-A 拮抗剂预 混合， 然后以竞争形式注射在固定的第一 VEGF-A 拮抗剂上。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的缓 冲液中进行。还进行了缓冲液注射以减少仪器干扰和误差。在循环之间， 在每次注射循环 后通过注射 60 秒 10mM 甘氨酸 (pH 1.5， 50ul/min) 来再生俘获表面。这样做从该表面上去 除了结合的 VEGF-A。数据使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑。
     两组实验结果都由如下解释。如果第二 VEGF-A 拮抗剂不能与第一拮抗剂同时结 合至 VEGF-A 抗原， 则将其功能性归类到单一的家族或表位仓中。然而， 如果第二 VEGF-A 拮 抗剂能与第一拮抗剂同时结合至抗原 ( 通过显示芯片表面的质量增加 )， 则其归类到不同 的家族或表位仓中。 将各 VEGF-A 拮抗剂本身作为阴性对照进行测试以建立背景 ( 无结合 ) 信号水平。
     结果 ： 使用上述两组实验的结合数据， 将纯化的 VEGF-A 拮抗剂分配至表位仓中。 TM BIACORE 报道的信号 (RU， 应答单元 ) 与传感器芯片表面上的质量直接相关。一旦建立了 阴性对照相关的本底信号 (RU) 的水平 ( 相同 VEGF-A 拮抗剂用作第一和第二拮抗剂 )， 则 分拣结果报道为阳性或阴性结合。阳性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂能同时结合抗原。 阴性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合抗原。
     利用这些实验中阳性响应值和阴性响应值之间的差异将 VEGF-A 拮抗剂指配到三 个家族或表位仓中 ( 参见表 8)。第一表位仓以克隆 c636 产生的 VEGF-A 拮抗剂代表。第二 表位仓以 VEGF-A 拮抗剂 c868、 c1039 和 c1081 代表。值得注意的是， 当 c636 先与 VEGF-A 相互作用时， c868 和 c1039 都显示同时结合。当 c868 或 c1039 先与 VEGF-A 相互作用时， c636 不显示任何结合， 因此 c868 和 c1039 重叠了 c636 的表位。此外， VEGF-A 拮抗剂 c870 重叠了仓 #1 和仓 #2。第三表位仓由 VEGF-A 拮抗剂 c820 和阳性对照 VEGF-A 抗体 ( 小鼠抗 VEGF-A 单克隆抗体， R&D Systems) 代表。这些 VEGF-A 拮抗剂在所有其它 VEGF-A 拮抗剂的 存在下都显示同时结合。所有分拣实验中测试的拮抗剂都显示一定程度地中和 VEGF-A 促 分裂原活性。
     表8： 中和性 VEGF-A 拮抗剂的表位仓指配
    58102448984 A CN 102449007 表位仓 # 仓 #1 ： 仓 #2 ： 仓 #1/2 ： 仓 #3 ：
    说明书VEGF-A 拮抗剂 c636 c868， c1039， c1081 c870 c82055/82 页实施例 10 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结 合亲和力
     使用表面等离子共振评估克隆 c870 和 c1039 产生的一价人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合亲和力。 通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的亲 和力决定动力学速率常数和平衡解离常数用。 结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 是反映抗原 - 拮抗 剂复合物形成的速率的值。解离速率常数 (kd(s-1)) 为反映复合物稳定性的值。将结合速 率常数除以解离速率常数 (ka/kd) 得到平衡结合常数 (KA(M-1))。用解离速率常数除以结 合速率常数 (kd/ka) 得到平衡解离常数 (KD(M))。该值描述了相互作用的结合亲和力。KD 相同的相互作用可具有广泛变化的结合和解离速率常数。因此， 同时测量 ka 和 kd 有助于更 独特地描述相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量克隆 c870 和 c1039 产生的纯化的 VEGF-A 拮 抗剂的结合亲和力。在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合 动力学和亲和力研究。方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程。制备带有 His6/Myc 表位标签的 VEGF-A 拮抗剂。亲和力分析通过使用固定在 CM5 芯片上的抗 His6/ Myc 抗体俘获 VEGF-A 拮抗剂而进行。以 1 ∶ 1 摩尔比混合抗 His6 和抗 Myc 抗体， 并利用胺 偶联化学将它们共价固定至 CM5 传感器芯片， 达到为约 7500RU 的密度。 以 10ul/min 将 10nM VEGF-A 拮抗剂注射到单独的流动室上， 保持 1 分钟， 然后是 1 分钟稳定化时间。将 VEGF-A 连续的 1 ∶ 3 稀释物 (33.3nM-0.14nM) 注射在该表面上， 使之特异结合于被俘获在传感器 芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。进行每个浓度的 VEGF-A 的双重注射， 结合时间为 5 分钟， 离解 时间为 10 分钟。以 30μL/min 的流速进行动力学结合研究。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 500mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 0.1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的 缓冲液中进行。在循环之间， 用 50mM H3PO4 洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤将被俘获 的 VEGF-A 拮抗剂从固定化的抗体表面上去除， 且容许之后下一样品的结合。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个注射的顺序中提供一致的结 合表面。检查重复注射曲线的再现性。由于 VEGF-A 抗原形成二聚物， 将所得结合曲线整体 拟合于二价分析物相互作用模型。
     结果 ： 表征了两种 VEGFA 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力 ( 结果示于表 9)。 测量这 些人 VEGF-A 拮抗剂的结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 和解离速率常数 (kd(s-1))。由 ka 和 kd 值计 算 KD 和 KA。该数据与二价分析物模型良好拟合。该模型测量 ka(ka1 和 ka2) 和 kd(kd1 和 kd2) 的两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的单价动力学， 其报道于表 9。这些样品报道的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1。由 ka 和 kd 值计算出 KD 和 KA。所有三种 VEGF-A 拮抗剂显示对 VEGF-A 抗原类似的亲和力 (KD ＝ 0.7-1.0E-9M)， 且这些结果在两次独立运行 中一致。
     表9： VEGF-A 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力的表征
    实施例 11 ： 抗 VEGF-A 抗体的表位作图
     使 用 JPT VEGF-A RepliTopeTM 载 玻 片 对 克 隆 c870 和 c1039 产 生 的 单 克 隆 人 VEGF-A 抗体评价其与人 VEGF-A 的肽结合。
     材料和方法 ： 各 JPT 载玻片由一式三份如下所述的阵列组成。每个阵列的组成如 下： 连续的、 重叠的 VEGF-A 的 13aa 片段 ( 点 1-78)， 接着是连续、 重叠的 VEGF-A 的 20aa 片段 ( 点 85-115)。 此外， 各种测试抗体和小鼠和人 IgG 的对照点分布于各阵列的顶侧、 底侧和侧 面。 进行了一系列实验以测定 scFv c870 和 c1039 相对于人 VEGF-A 蛋白质的合成的直链肽 的结合能力。用 His/Myc 表位标签标记抗人 VEGF-A scFv。将 10-100μg/ml 的抗体溶液施 加至肽载玻片。然后将抗 His 和 / 或抗 Myc 抗体施加至载玻片。根据试剂盒描述的方法用 生物素化酪胺 (Tyramide) 扩增信号 (Renaissance TSATM Biotin System， PerkinElmer， #NEL700A)。结合的抗体使用链亲和素碱性磷酸酶和 DAKO Permanent Red 染料显色。
     数据使用自制显微镜载玻片扫描仪编辑， 其由 Nikon Eclipse TE2000U 倒置显微 镜， ASI MS-2000 电动台， Photometrics Cascade II 512 相机和 X-cite 120 荧光照明系统 组成。信号强度使用 MetaMorph v7.1 成像软件分析。
     结果 ： 结合肽的位置和序列示于下表 10。数字代表相对总体信号强度的肽的百分 比信号强度。
     表 10
    
    “β7 后” 区域是 VEGF 分子的肝素结合域。
     所有抗体均显示在 α2-β2 区周围有特异性结合位点。该数据表明被测抗体可分 为两类 ： 抗体 c870 优选 VEGF 的 c- 端侧， 而抗体 c1039 对蛋白质的 n- 端侧具有更强的结 合。抗体 c870 具有最少的结合肽而抗体 c1039 具有最分散的结合模式。各抗体的前两个 结合位点列于下表。
    
    
     结合等级 A2131/c1039 A2128/c870*表 1161102448984 A CN 102449007 1 2
    说明书α2-β2 α158/82 页β7 后 α2-β2实施例 12 ： 使用 VEGFR2 磷酸化测定法测试 VEGF-A 结合性 scFv 与抗鼠 VEGF-A 的 双特异性抗体的交叉反应性
     为筛选候选分子 (scFv， Fab 和双特异物 ) 中和鼠 VEGF-A 的活性的能力， 进行了 一项基于细胞的发光测定， 其测量 VEGFR2(KDR/Flk-1) 磷酸化。因为 mVEGF-A164 将与人 VEGFR2 交叉反应， 可使用基于人 VEGFR2 的报道物体系。将 293/KDR/KZ136/c22 细胞以 20,000 细胞 / 孔的密度在 100μl 完全培养基 (DMEM， 10％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠、 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中铺板于透明 96- 孔组织培养板， 且使之贴壁过夜。第二天， 通过 真空抽吸去除完全培养基， 并用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax) 替 换。将细胞温育过夜。
     第二天， 将候选的 VEGF-A 中和分子 (scFv， Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一道在 无血清培养基中以 1 ∶ 5 的稀释度从 200nM 连续稀释至 12pM。VEGFR2-Fc 用作中和的阳性 对照。向这些中添加等体积的 0.54nM 的 mVEGF-A164(493-MV-005， R&D Systems)， 以达到 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 的中和分子或阳性对照。将这些在 37℃孵育 60 分钟。
     孵育后， 通过真空抽吸从血清饥饿细胞去除培养基， 并用 100μl 上述复合物替 换。将细胞在 37℃孵育 10 分钟。孵育后， 通过真空抽吸去除培养基， 并轻柔地用 100μl 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS， Invitrogen) 洗涤细胞。通过真空抽吸去除 PBS， 将细胞在 25μl NP-40 溶解缓冲液 (Invitrogen Cat.#FNN0021) 中溶解， 该溶解缓冲液每 10mL 包含 1mM PMSF(Sigma， P-2714， 溶于 DMSO) 和 1 片 Complete Mini 片剂 (Roche， 11836153001)。 将溶解产物在 4℃在平台振荡器上孵育 20 分钟， 然后 4℃ 3000rpm 离心 10 分钟以使溶解产 物澄清。将溶解产物转移至新的 96- 孔微量滴定板上， -20℃放置直到测定。
     对于 VEGFR2 磷酸化发光测定， 根据制造商的说明使用细胞内蛋白质缓冲液试剂 盒 (Invitrogen LHB0002) 和 VEGFR2[pY1059] 抗体珠子试剂盒 (Invitrogen LHO0601)。 将 溶解产物解冻， 以 1 ∶ 5 与 80μl 测定稀释剂混合。将发光真空过滤板的孔用 200μl 工 作洗涤溶液预先润湿。以每孔 25μl 添加经稀释的珠子， 并用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 2 次。 洗涤后， 将 50μl 稀释的溶解产物和 50μl 稀释的检测抗体添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 室温 (RT) 孵育 3 小时。孵育后， 用 200μl 工作洗涤溶液洗涤珠 子 2X， 然后将 100μl 稀释的抗兔 IgG-RPE 添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 在室温孵育 30 分钟。孵育后， 将珠子用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 3X， 且重悬浮于 125μl 工作洗涤溶液。将珠子在平台振荡器上以 500rpm 重悬浮 30 秒， 用发光 -100 仪器 (BioRad) 读数。使用分析软件 (Spotfire) 分析数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     结果 ： mVEGF-A164 对人受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱导该受体的磷酸 化。该基于发光的测定将总 VEGF-R2 结合于与抗 VEGFR2 抗体缀合的、 荧光标记的珠子。利 用检测 [pY1059] 的磷酸化的第二抗体来检测有多少 VEGFR2 已被磷酸化。如下表 12 所示， 许多中和了人 VEGF-A 活性的 scFv 也在该测定抑制了小鼠 VEGF 活性。包含相同这些 scFv 的双特异性抗体也中和了小鼠 VEGF-A 活性。表 12 ： VEGF-A 特异 scFv 和双特异性抗体中和小鼠 VEGF-A 活性scFv c870 c1039 c1094 IC50(nM) 0.16 无活性 0.55实施例 13 ： 用于测定 scFvs 对小鼠 VEGFA(VEGF-A164) 刺激的 HUVEC 细胞的中和 活性的增殖测定
     为筛选中和小鼠 VEGF-A 的 scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组小鼠 VEGF-A164 以 2.6nM 用作阳性对照。含 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清 培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。scFv 分子在 SFM 中连续稀释至 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 铺板 于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 将 HUVEC 细胞在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中在 37℃， 5％ CO2 下铺板 2 天。将细胞用血清饥饿培养
    24h， 在或有或没有连续稀释的 VEGF-AscFv 的条件下用 2.6nM 刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H 胸苷脉冲 24h， 该胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 从如下表 13 所示低 nM IC50 值可见， 该测定中被筛选的多种 scFv 显示有效 地中和小鼠 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖。
     表 13 ： 通过 VEGF-A- 特异性 scFv 中和小鼠 VEGF-A 诱导的 HUVEC 增殖
     scFv c870 c1094 c1039
     IC50(nM) 0.36 2.84 无活性实施例 14 ： 构建可溶 FGFR3IIIc C-term Fc5 表达质粒以表达第一、 第二和第三细 胞外 Ig 样域或包括第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式
     生成了包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式的一系列表达构建体。这些人 FGFR3IIIc 序列 段与下游 C- 端 Fc5 序列融合。该系列中的构建体包括上述的序列区和一个点突变， 该点突 变分别在 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 262 处和 SEQ ID NO ： 10 的残基 142 处产生色氨酸残 基 ( 突变的 249 位以天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列为参照 ) 代替该位置上的丝氨酸。该突变 记录为 S249W。这些构建体通过 PCR 和同源重组使用编码上述 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段、 Fc5 片段和表达载体 pZMP31 产生。为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体指定的 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)， 产生了三个 PCR 片段且将它们一起通过酵母重组引入 pZMP31 载体。第一 片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列的 5’ 重叠， 后面是编码 S249W 点突变 的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列的 3’ 重叠。对于该片段， PCR 扩增反应 使用 5’ 寡核苷酸 zc62552((SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 起始于 SEQ ID NO ： 2 的 E36))。片段将克隆为 pZMP31， 使用 opTPA 前 导序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 1-35)。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反 向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与在 5’ 端 嵌套 Rec 序列的正向引物一起使用 )， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。
     第二片段呈现 ： 与上游人 FGFR3IIIc 序列的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的 人 FGFR3IIIc 的序列和与 Fc5 序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 389-620) 的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62556(SEQ ID NO ： 82)( 正向引物， 用于以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 sol.Rec 序列的 3’ 端的反向引 物一起使用 )。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62553(SEQ ID NO ： 6) ： ( 反向引物， 以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375。片段将具有重叠的 Fc5 序列 ) 进行， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模板。
     第三片段包含 Fc5 序列且呈现与人 FGFR3IIIc 的 5’ 重叠和与 pZMP31 载体序列的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62554(SEQ ID NO ： 7)。( 正向引物， 用 于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375)。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62555(SEQ ID NO ： 8)( 反向引物， 用于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 pZMP31 的序列 ) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1699， IL17REFc5 作 为模板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应条件如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 1 分 30 秒 ； 1 个循环， 72℃， 7 分钟。PCR 反应混合 物 1％琼脂糖凝胶上运行， 并使用 QIAquickTM 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从 凝胶提取对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 pZMP31 为哺乳动物表达载体， 其包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表 达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动 物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启动子， 增强子和复制起点， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及在酿酒酵母中的选择和复制所需的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     之前， 用 BglII 消化该质粒 pZMP31， 然后与下列上文提到过的凝胶提取的 PCR 片段 在酵母中重组。将 50μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 3μl 各个 PCR 片段插入 DNA 和约 50ng BglII 消化的 pZMP31 载体混合。将该混合物转移至 0.2cm 电穿孔小杯。使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF， 对酵母 / DNA 混合物进行电脉冲。 将 300μl 1.2M 山梨醇添加至小杯， 将酵母以 75μl 和 200μl 的等 分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。约 72 小时后， 将来自一块板的 Ura+ 酵母转化体 重悬于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062MTris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymo 裂合酶 /100ul 的 100ul Qiagen小提试剂盒缓冲液 P1。然后将该混合物在 37℃孵育约 15 分钟， 小提试剂盒的余下操作根 据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 酵母 DNA 制备物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。细胞以 1.75kV， 25μF、 400 欧姆电脉冲。电穿孔后， 添加 .5ml LB， 然后 将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼 脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择包含正确序列的一个克隆。使用可商购的试 剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明分离大规模质粒 DNA。
     使用相同的方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 其称为 MPET 构 建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)。 第一片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序 列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560((SEQ ID NO ： 11) ( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 Ig D2D3 形式。截 短的 FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 2 的 D156， Ig D2 的上游。将利用 opTPA 前导序 列克隆至 pZMP31 中的片段 ))。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 Rec 序列 的 5’ 端的正向引物一起使用 )) 进行， 且使用 clonetrackID #102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。片段使用如前文所述的相同 PCR 热循环制备， 并将该片段与上述第二和第三片段一起 引入 BglII 消化的 pzMP31 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。
     使用 Qiagen 大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。对于全 长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5， 和截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 分别称为 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2) 和 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)， 将 200μg 的每种 表达构建体大提质粒用约 240 单位的 BstB1 限制酶在 37℃消化 2 小时， 用苯酚 / 氯仿 / 异 戊醇洗涤， 然后用氯仿 / 异戊醇洗涤， 然后用乙醇沉淀过夜， 且在 1.5mL 微量离心机管离心。 倾出上清液， 用 1mL 70％乙醇洗涤离心沉淀， 在室温孵育 5 分钟。将管在微量离心机中以 14,000RPM 旋转 10 分钟， 且倾去离心沉淀的上清液。 在组织培养罩的无菌环境中， 将离心沉 淀在空气中干燥约 5 分钟， 然后重悬浮于 0.4ml 37℃预热的 CHO 细胞组织培养基中， 且使之 在 37℃孵育 10 分钟。 对 DNA 离心沉淀被溶解时， 对各个待电穿孔的载体， 将约 9x 106CHO 细 胞离心沉淀后重悬于 4ml CHO 细胞组织培养基中， 并与重悬的质粒 DNA 混合， 达到最终体积 为 800ul。将 DNA/ 细胞混合物置于 0.4cm 缝隙小杯中， 使用以下参数电穿孔 ； 950μF， 高电 容， 300V。然后， 对于每个质粒电穿孔组， 移出试管的内含物， 汇总， 用 CHO 细胞组织培养基 稀释至 25mL， 置于 125mL 摇瓶中。将瓶置于培养箱中振荡器上， 37℃， 5％ CO2120RPM 摇动。
     CHO 细胞用 500nM 甲氨蝶呤 (MTX) 进行营养物选择和扩增。选出的 CHO 细胞系称 为 MECL 1334(solFGFR3IIIc(23375)(S249W)Fc5) 和 MECL 1337(solFGFR3IIIc(143_375) (S249W)Fc5)。
     为测试表达， 使用电穿孔后汇集物第 3 代建立培养。将细胞离心后 .5e6c/ml 重悬 浮于 50ml 体积新鲜培养基 ( 无选择 )， 且使之如上所述进行 96 小时。通过蛋白质印迹证实 蛋白质表达。启动大型转瓶以产生用于纯化的蛋白质。利用第 6 代的转染后 CHO 细胞池 MECL 1334 和 MECL 1337， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 且添加 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来 自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070) 和 500nM 甲氨蝶呤， 开始生成 200ml 接种培 养物。将瓶在 37℃ 120rpm 和 6％ CO2 下培养。6 天后， 将每个 CHO 池瓶接种至一个 3L 转 瓶中， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 加有 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070)， 无选择， 达到 1L 工作体积， .5e6c/ml。将旋转瓶在 37℃， 95rpm 和 6％ CO2 培养。接种后约 24 小时后， 将另外 .5L 培养基添加至各个转瓶中以达到最终体 积为 1.5L， 继续培养。接种后约 8 天， 收集条件化培养基， 0.2μM 过滤后， 用于蛋白质纯化。
     用类似方法产生 FGFR3 Fc5 区的另外的构建体， 包括可溶全长和截短的形式， 没有 点突变， 或在序列中具有使得 SEQ ID NO ： 15 的 263 位和 SEQ ID NO ： 22 的 143 位的脯氨酸 残基改变为精氨酸 ( 标注为 P250R) 的突变 ( 突变的 250 位是参照天然 FGFR3IIIc 氨基酸 序列 )。该寡核苷酸和所得的构建体用相应的序列标识符标示于下。
     表 14
     pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)
    
    
    
    表 15 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)
    
    
    表 16 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)Fc5， 构建体 #1916(SEQ ID NOS ： 12 和 13)
    
    
    表 17 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1918(SEQ ID NOS ： 14 和 15)
    
    
    表 18 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)Fc5， 构建体 #1919(SEQ ID NOS ： 18 和 19)
    
    
    表 19 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1921(SEQ ID NOS ： 21 和 22)使用了类似方法产生 FGFR2αIIIc Fc5 的可溶形式的构建体区域， 包括可溶全长 和截短的形式， 没有点突变或在序列中具有使 SEQ ID NO ： 29 的 266 位和 SEQ ID NO ： 40 的 143 位的丝氨酸残基改变为标注为 S252W 的色氨酸， 或 SEQ ID NO ： 33 的 267 位和 SEQ ID NO ： 42 的 144 位的脯氨酸残基改变为精氨酸 ( 标注为 P253R) 的突变 ( 突变的位置是参照 天然 FGFR2αIIIc 氨基酸序列 )。
     表 20
     pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)Fc5， 构建体 #1945(SEQ ID NOS ： 23 和 24)
    
    
    
    表 21 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(S252W)Fc5， 构 建 体 #1946(SEQ ID NOS ： 28 和29)
    
    表 22 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(P253R)Fc5， 构 建 体 #1947(SEQ ID NOS ： 32 和33)
    
    
    表 23 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)Fc5， 构建体 #1948(SEQ ID NOS ： 36 和 37)
    
    表 24 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(S252W)Fc5， 构建体 #1949(SEQ ID NOS ： 39 和40
    
    表 25 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(P253R)Fc5， 构建体 #1950(SEQ ID NOS ： 41 和42)
    实施例 15 ： 多特异性、 可溶 FGFR3IIIc Fc5 VEGFA scFv 表达质粒的构建
     生成一系列表达构建体， 其包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或 具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式。这些人 FGFR3IIIc 序列区段 与下游 C- 端 Fc5、 接头、 下游 c- 端用于特异结合至 VEGF-A 的 scFv 序列融合。该系列中的 构建体包括上述的人 FGFR3IIIc 序列段和一个点突变 ( 其在 SEQ ID NO ： 64 的氨基酸 162 位 和 SEQ ID NO ： 62 的 142 位产生色氨酸残基以代替丝氨酸 )。该突变记录为 S249W。( 突变 的位置参考天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列 )。这些构建体通过使用 PCR 和同源重组 ( 利用编码 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段与 Fc5 序列和包含 VEGF-A scFv 序列 870e6 和 1094.1 的表达载体 pZMP31 进行 ) 而产生。
     为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5c870e6 和全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W) Fc5c1094.1 构建体， 产生 PCR 片段且通过酵母重组将其引入基于 pZMP31 的载体， 其中基 于 pZMP31 的载体包含接头和下游 VEGFAscFv 序列 870e6 或 1094.1( 称为 MVC 709-SEQ ID NO ： 43 和 44 ； 以及 MVC 710-SEQ ID NO ： 45 和 46)。该 PCR 片段包含 ： 与基于 pZMP31 的载体 序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序 列， Fc5 序列、 以及与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62552(SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 序列起始于 Ig D1 上游的 E23。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 使用 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NO ： 1) 作为模 板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 2 分钟 ； 1 循环， 72℃， 7 分钟。在 1％琼脂糖凝胶上运行 TM PCR 反应混合物， 且使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从凝胶提取 对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 MVC 709 和 MVC 710 是基于 pZMP31 的哺乳动物表达载体， 其包含鼠 Fc2、 接 头、 和 870e6(SEQ ID NO ： 43) 或 1094.1scFv(SEQ ID NO ： 45) 的下游序列、 VEGF-A 结合序列。 这些载体包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启 动子， 增强子和复制起始区， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及酿酒酵母中的选择和复制所需 的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     将质粒 MVC 709 和 MVC 710 用 BglII 限制酶消化， 然后与下列上文提到的凝胶提
     取的 PCR 片段在酵母中重组。将 60μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 5μl 的各个 PCR 片段插入的 DNA 和约 50ng BglII 消化的 MVC 709 和 MVC 710 载体混合。将该混合物转移 至 0.2cm 电穿孔小杯。对酵母 /DNA 混合物电冲激， 使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF。 将 400μl 1.2M 山梨醇添加至小 杯， 然后将酵母以 75μl 和 200μl 等分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。 约 72 小时后， + 将来自一块板的 Ura 酵母转化体重悬浮于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062M Tris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymolyase/100ul 的 100ul Qiagen MiniPrep 试剂盒缓冲液 P1。 然后将该混合物在 37℃孵 育约 15 分钟， Qiagen 小提试剂盒方案的其余步骤根据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 提取的酵母质粒 DNA 制备 物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。以 1.75kV、 25μF、 400 欧姆对细胞电冲激。电穿孔后， 添 加 .5ml LB， 然后将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板上 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择一个包含正确序列的克隆。大规模质粒 DNA 使用可商购的试剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明 分离。
     利用相同方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。一个片段包含 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列， Fc5 序列和与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560(SEQ ID NO ： 20)。( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片 段。片段将产生 Ig D2D3 形式。FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 60 的 D156， Ig D2 的上 游。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1920 作为模板 (SEQ ID NO ： 9)。
     使用与上述相同的 PCR 热循环产生该片段， 并引入 BglII 消化的 MVC709 和 MVC 710 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接头和下游 c- 端对 VEGFA 构建体结 合特异的 scFv 序列， 如上所述。
     编 码 全 长 的 或 截 短 的 可 溶 人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接 头 和 下 游 c- 端 对 结 合 VEGF-A 特异的 scFv 序列的质粒命名为 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 781)， 如 SEQ ID NOS ： 57 和 58 所示， FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 782)， 如 SEQ ID NOS ： 59 和 60 所 示， FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 783)， 如 SEQ ID NOS ： 61 和 62 所示， 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 784)， 如 SEQ ID NOS ： 63 和 64 所示。将这些质粒在 293F 细胞中瞬时表达 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#R790-07)。使用 QIAGEN 质粒大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。 将 293F 悬浮细胞在 293Freestyle 培养基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#12338-018) 中在 37 ℃， 6 ％ CO2 下在 3L 转瓶中 95RPM 培养。在即将转染之前添加新鲜培养基以得 到 1.5 升工作体积， 最终密度为 1x10E6 细胞 /mL。对于每个转瓶， 将 2mLLipofectAMINE 2000(Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#11668-019) 添 加 至 20mL Opti-MEM 培 养 基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#31985-070) 中， 且在另一试管中将 1.5mg 总质粒 DNA 在 20mL Opti-MEM 中稀释。各试管单独在在室温孵育 5 分钟， 然后混合 (combined) 且一起在室温下再孵育 30 分钟， 不时轻微混合。将脂质 -DNA 混合物添加至 293F 细胞的各转瓶， 然 后恢复至 37℃， 6％ CO2、 75RPM。 约 96 小时后， 收集该条件化培养基， 0.2μM 过滤， 用于蛋白 质纯化。
     实施例 16 ： 纯化方法
     将条件化培养基作为包含 0.02％叠氮化钠的 0.2μ 无菌过滤可输送物输送至纯 化。在将该培养基装载至亲和力俘获柱之前不进行其他调节。
     对于大规模纯化， ～ 10 升可输送物， 采用 POROS A50( 蛋白 A 亲和树脂 ) 的 87mL 柱床 2 厘米直径的柱子用于俘获过程的目的。对于小规模纯化 ( ～ 1-1.5 升可输送物 )， 使 用 4mL 柱床的 POROS Mab MabCapture 灌注色谱树脂。
     加载样品之前， 该柱用 20 柱体积的缓冲液 A(10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬 酸， 250mM[NH4]2S04， pH 7.3， 包含 0.02％叠氮化钠 (W/v)) 平衡。一旦平衡后， 以 20mL/ 分 钟 ( 对于大规模方法 )， 或 10mL/ 分钟 ( 对于小规模方法 ) 加载条件化培养基。当方法的装 载阶段完成时， 用 10-20 柱体积的平衡缓冲液从柱洗出未结合的蛋白质级分。结合的蛋白 质的洗脱通过下降的 pH 梯度完成， 该梯度是在平衡缓冲液 A 和具有以下组成的洗脱缓冲液 B 之间形成的 ： 10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬酸， 250mM[NH4]2S04， pH 3.0， 包含 0.02％ 叠氮化钠 (w/v)。大规模方法的洗脱流速为 30mL/ 分钟， 同时在缓冲液 A 和缓冲液 B 之间形 成 3 个柱体积的梯度。用 0.5mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (10mL)， 立即混合内含 物。小规模方法的洗脱使用相同缓冲液和 4 柱体积的梯度 ( 从缓冲液 A 至缓冲液 B)， 且流 速为 5mL/ 分钟。用 0.25mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (4mL)。立即混合所有洗脱液 级分以保证快速 pH 中和。
     将所有在 280 纳米波长具有正吸收的级分汇集， 进一步进行大小排阻色谱法步 骤。将汇集的蛋白质浓缩至 7ml( 大规模方法 ) 或 1.5mL( 小规模方法 ) 用于大小排阻色谱 法 (SEC)。 采用 SEC 色谱法的目的是缓冲液交换， 以及将少量多聚体或聚集物质与最终产物 区分开来。用于 SEC 和最终蛋白制剂的流动相为 35mM 磷酸钠， 120mM 氯化钠， pH 7.3。大规 模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (26/60 规格， 具有 321mL 柱床体积 ) 上 进行。小规模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (16/60 规格， 具有 120mL 柱 床体积 ) 上进行。根据方法规模， SEC 步骤的流速对大规模或小规模分别为 2.5mL/ 分钟或 1.5mL/ 分钟。汇集在主要对称的峰下的级分， 重点是从最终产物中排除任何少量的高分子 量材料。最终汇集物以 0.2μ 无菌过滤， 制备等分试样且储存于 -80℃。该相同方法用于处 理所有 FGFR 受体和可溶 FGF 受体 (FGFR) 和 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物。 3
     实施例 17 ： H- 胸苷增殖测定以测定可溶 FGF 受体对 FGF- 刺激的 HUVEC 细胞的中 和活性
     为筛选抑制多种 FGF 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人脐带内皮细胞 (HUVEC) 进行 3H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF1， 2， 4 和 6(R&D Systems， Inc.) 以 10ng/ml 在测定介质 (RPMI-1640， 1％ FBS， 1 单位 /ml 肝素和丙酮酸盐 ) 中使用。然后从 0.5-4ug/ ml( 取决于受体 ) 滴定的可溶人 FGFR(R&D Systems 和 ZymoGenetics)， 并在测定介质中 连续稀释至 32-4ng/ml。即 HUVEC 铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2000 细胞 / 孔。HUVEC 增殖测定体系在 37℃， 5％ CO2 培养 2 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸 苷 (Amersham， TRK120) 冲激 HUVEC18 小时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％CO2)。收集细胞， 在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结果 ： 所 有 测 定 的 FGFR 均 如 预 期 的 那 样 以 类 似 的 活 性 中 和 FGF1。FGFR1 和 FGFR2(R&D Systems) 强 力 地 中 和 所 有 FGF。 而 FGFR3 和 FGFR4(R&D Systems) 对 FGF2， 4 和 6 活 性 的 抑 制 弱 一 些。FGFR3A2258F(143_375， S249W)(SEQ ID NO ： 10) 和 FGFR3 A2256F(22_375， S249W)(SEQ ID NO ： 2) 强力地中和 FGF1， 2， 4 和 6， 且 IC50 值与 FGFR1 相 似。
     表 26
    实施例 18 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 LNCap 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 LNCap 细胞进行 3 了 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 以 200 至 1000ng/ml 在测定介 质 (RPMI-1640， 1％ BSA， ITS[ 胰岛素 - 转铁蛋白和硒 ]， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 [ 均获自 Invitrogen]) 中使用。然后从 1-2ug/ml 滴定 R&D Systems 的可溶人 FGFR(R1-R4)、 以及 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 31-15ng/ml。将 LNCap 细胞铺板 于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2500 细胞 / 孔。将该 LNCap 增殖测定在 3 37℃， 5％ CO2 培养 3 天。然后每孔用 1μCi H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将 LNCap 冲激 8 小
    时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结 果： R&D System 的 FGFRs R2-R4 中 和 FGF8b， 但 R1 则 否。 全 长 FGFR2A2556F(22_377)SEQ ID NO ： 24 ， A2557F(22_377)(S252W)SEQ ID NO ： 29 ， 和 A2558F(22_377)(P253R)SEQ ID NO ： 33 不中和 FGF8b。而截短的 FGFR2A2559F(145_377)SEQ ID NO ： 37， A2560F(145_377)(S252W)SEQ ID NO ： 40， 和 A2561F(145_377)(P253F)SEQ ID NO ： 42 确实中和 FGF8b， 类似于 R&D Systems FGFR2。FGFR3A2519F(143_375)(P250R) SEQ ID NO ： 22， A2256F(23_375)(S249W)SEQ ID NO ： 2 和 A2258F(143_375)(S249W)SEQ ID NO ： 10 中和 FGF8b， 但 A2518F(143_375)SEQ ID NO ： 19， A2257F(23_375)SEQ ID NO ： 13， 和 A2259F(23_375)(P250R)SEQ ID NO ： 15 则否。
     表 27
    ND， 未测定。
     实施例 19 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 MCF-7 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 MCF-7 细胞进行 3 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 在测定介质 (RPMI-1640， 5％ FBS， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 ) 中为 100ng/ml。从 10ug/ml 滴定来自 R&D Systems 的可溶人 FGFR-Fc(R1-R4) 和 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 78ng/ml。 将 MCF-7 细胞铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 1250 细胞 / 孔。将该
     MCF-7 增殖测定系统在 37℃， 5％ CO2 下培养 4 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将细胞冲激 8 小时， 该 3H- 胸苷掺入中的增殖细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细 胞且在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     实施例 20 ： 用于测定 sFGFR-Fc 对 FGF-9 刺激的 HCO 成骨细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为测定 sFGFR-Fc 构建体对 FGF-9- 刺激的成骨细胞增殖的中和作用， 进行 3H- 胸 苷测定。用人 FGF-9 刺激人成骨细胞生长。以 0.02nM 至 6nM 的浓度将 FGFR-Fc 蛋白质添 加至测定介质。观察到成骨细胞增殖的显著抑制， 并对各蛋白质计算 IC50。
     研究设计 ： 以 1.2nM 人 FGF-9(R&D Systems， Minneapolis， MN) 刺 激 人 颅 盖 成 骨 细 胞 (HCO ； ScienCell， Carlsbad， CA)。ObM 测 定 介 质 [ 成 骨 细 胞 基 础 培 养 基 (ObM， ScienCell)， 含有 0.5 ％胎牛血清 (FBS)， 2mM GlutaMax(Invitrogen， Carlsbad， CA)， 1mM 丙酮酸钠， 和 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 (Invitrogen)] 用作阴性对照。将人 FGFR1-Fc， FGFR2-Fc， FGFR3-Fc， 和 FGFR4-Fc(R&D Systems) 在 ObM 测定介质中连续稀释到 6nM， 2nM， 0.67nM， 0.22nM， 0.07nM， 和 0.02nM。对 FGFR3-Fc 突变体 (ZymoGenetics， Seattle， WA) 也 类似进行稀释。将 HCO 细胞在补充有 5％ FBS 和成骨细胞生长补充剂 (ObGS， ScienCell) 的 ObM 中铺板于在 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 1000 细胞 / 孔。将各板在 37℃， 5％ CO2 孵育过夜。细胞用 ObM 测定介质血清饥饿 24h， 在有或无连续稀释的 FGFR-Fc 的条件下 3 用 1.2nM FGF-9 刺激 24h， 用 1μCi 每孔的 H- 胸苷冲激 24h(GE Healthcare Biosciences， 3 Piscataway， NJ)， 该 H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37 ℃， 5 ％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果证实该突变体 FGFR3-Fc 构建体显著抑制人成骨细胞增殖， 且其 IC50 在 R&D Systems 的 FGFR3-Fc 的 3 倍范围内， 如图 3 所示， 图 2 显示全长 FGFR3-Fc 野生型和突变体 构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     表 28 ： 成骨细胞增殖测定中的 FGFR-Fc IC50.
    实施例 21 ： FGFR-Fc 野生型和突变体构建体与 FGF-8b 和 FGF-17 的结合
     为测定 FGFR-Fc 与其各自配体的结合能力， 进行 ELISA。 在室温在摇动下将重组人 FGF-8b 或 FGF-17(R&D Systems) 以 100nM 铺板于 Nunc Maxisorp 96- 孔板上保持 1h。各 板在室温用 BLOTTO(Thermo Fisher Scientific， Rockford， IL) 封闭 1h， 然后用 ELISA C 缓冲液 (137mM NaCl， 2.7mM KCl， 7.2mM Na2HPO4， 1.5mM KH2PO4， 0.05％ (v/w) 聚山梨酯 20， pH 7.2) 洗涤 5 次。FGFR-Fcs 用 PBS/0.1x BLOTTO/10ug/ml 猪肝素 (Sigma， St.Louis， MO) 稀释至 100nM， 然后制备 1 ∶ 2 连续稀释物， 到 0.10nM 为止。将 100μL FGFR-Fc 铺板且在 4℃培养过夜。 次日， 将各板用 ELISA C 洗涤 5 次， 然后在室温在摇动下用 2.5μg/mL 辣根过 氧化物酶缀合的抗人 Fc 抗体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories， West Grove， PA) 孵育 1h。用 ELISAC 洗涤 5 次后， 添加柠檬酸盐缓冲液中的 100μL OPD(5mg 邻苯二胺， 于 63mM 柠檬酸钠， 37mM 柠檬酸， pH 5.0， 0.03％ H2O2 中 ) 以进行检测。2-5 分钟后， 用 1N H2SO4 停止反应。各板使用 SoftMaxPro 软件在 490nm 读数。
     结果 ： 尽管野生型和突变体 FGFR2-Fcs 不显著结合至 FGF-8b 或 -17， 但有一些突 变体 FGFR3-Fc 构建体以大于野生型 FGFR3-Fc 的程度结合至 FGF-8b 和 FGF-17 两者， 如图 5A， 5B， 6A， 6B 和 7 所示。
     表 29 ： 野生型和突变体 FGFR3-Fc 构建体结合 FGF-8b 和 FGF-17.
    
    实施例 22 ： 通过表面等离子体共振测量 FGF 受体对 FGF 配体的结合亲和力
     通过表面等离子体共振测量可溶 FGF 受体 (FGFR) 与 FGF 配体的相互作用的动力 学速率常数、 平衡结合常数和平衡解离常数。 在该研究中检查多种形式的 FGFR3。 制备了有 两个或三个 Ig 样域， 且具有两个可能的点突变 (S249W 或 P250R) 的 FGFR3。FGFR3 都制备 为二聚体 Fc- 融合蛋白。对于这些研究， 利用 Fc 标签将 FGFR 分子俘获在先前用蛋白 A 固 定的 Biacore 芯片上。使 FGF 配体在含肝素的缓冲液中在该表面上流过。尽管 FGF 配体为 单体， 但认为它们在肝素的存在下结合为二聚物。 因此确定， 二价分析物模型是适合用于这
     些相互作用的。
     亲和力测定 ： 表征了 FGF 受体的对 FGF 配体的结合亲和力。对各相互作用测量结 -1 -1 合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s-1))。结合速率常数为反映配体 - 受体复合 物形成速率的值。解离速率常数为反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常表示为 平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是通过将解离速率常数除以结合速率 常数 (kd/ka) 获得的， 而 KA 是通过将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 获得的。具有类 似的 KD( 或类似的 KA) 的分子可能具有可广泛变化的结合和解离速率常数。 因此， 测量 ka 和 kd 以及 KA 或 KD 有助于更加独特地描述配体 - 受体相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 结合动力学和亲和力研究在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行。 Biacore T100TM 的方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 2.0 编程。因为各 FGF 受体分子包含人 Fc 域， 将生物素化蛋白 A(Thermo Fisher Scientific Inc， Rockford， IL) 用作俘获试剂用于这些研究。 将生物素化蛋白 A 在 HBS-EP 缓冲液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA， 0.05％表面活性剂 P20 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中 稀释至 50μg/mL 浓度， 然后俘获至 SA( 链亲和素 ) 传感器芯片的所有四个流动室上。每个 流动室获得约 1100RU 的密度。随后通过蛋白质 -A 以 150-250RU 的近似密度将各 FGF 受体 分子俘获至 SA 芯片的单独的流动室上。 Biacore 仪器测量结合于传感器芯片表面的蛋白质 的质量， 因此， 验证了各循环中受体的俘获。
     对于动力结合研究， 制备了 FGF 配体的从 200nM-0.06nM 的连续 1 ∶ 5 稀释物。将 这些样品注射在表面上， 并允许它们特异结合至传感器芯片俘获的 FGF 受体。以结合时间 为 7 分钟， 离解时间为 15 分钟进行各配体浓度的注射。以 50μL/min 的流速进行动力结合 研究。所有结合实验在 25℃在含 50μg/mL 肝素 (Calbiochem， La Jolla， Ca) 的 HBS-P 缓冲 液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 0.05％表面活性剂 P20， pH 7.4 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中进行。
     在循环之间， 用 20mM 盐酸洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤从蛋白 A 表面去 除俘获的 FGF 受体和任何结合的 FGF 配体， 便于接下来后一个测定样品的结合。数据使用 TM Biacore T100 评价软件 ( 版本 2.0) 编辑。数据通过减去参照流动室和空白注射处理。评 价基线稳定性以保证在整个注射顺序过程中再生步骤提供了一致的结合表面。 检查重复注 射曲线的再现性。将结合曲线整体拟合于二价分析物模型。
     结果 ： 确定了该二价分析物模型对这些相互作用而言是最适合的。 该模型对 ka(ka1 和 ka2) 以及 kd(kd1 和 kd2) 两者都测量两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的一价动 力学。这些样品报告的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1 和 KA1。第二组值 (ka2 和 kd2) 是指相互作用的亲合力， 没有报告。 尽管在残差中有一些趋向性 (trending)， 但与模型的拟 合对评估结合亲和力而言是令人满意的。表 30 详细列出了多种 FGFR3 分子与 FGF6 的结合 相互作用的动力学。全长 FGFR 分子 (23_375) 的亲和力类似于二域 FGFR 分子 (143_375) 的亲和力。该点突变增加对 FGF6 的亲和力， 且 S249W 的亲和力＞ P250R 的亲和力＞野生型 的亲和力。通常， 该亲和力的增加主要是由于较慢的解离速率常数导致的。
     表 30 ： FGF6 的结合亲和力
    实施例 23 ： 用于测定 FGFR-Fc 对肿瘤细胞的增殖的抑制的 3H- 胸苷增殖测定
     为测定 FGFR-Fc 抑制肿瘤细胞增殖的能力， 进行 3H- 胸苷测定。 将 Caki-1 和 DU145 肿瘤细胞以 2000 细胞 / 孔的密度铺板于 96- 孔平底板， 并在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。次 日， 将 FGFR-Fc 构建体在 RPMI 1640( 具有 0.5％ FBS， 1mM 丙酮酸钠， 和 2mM GlutaMAX) 中 以 20， 10， 和 5μg/mL 连续稀释， 并在 37 ℃， 5 ％ CO2 下铺板于孔保持 3 天。将细胞用每孔 3 1μCi H- 胸苷 (GE Healthcare Biosciences， Piscataway， NJ) 冲激 24h， 该 3H- 胸苷掺入 增殖中的细胞。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果 ： 在 20μg/mL， 截短的 FGFR3-FC S249W 突变体抑制 Caki-1 和 DU145 细胞二 者， 其抑制程度稍微大于野生型 FGFR2-Fc 或 FGFR3-Fc。图 8A 演示 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细 胞生长， 图 8B 演示 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞生长。
     表 31 ： 增殖的百分比抑制
    
    实施例 24 ： sFGFR-VEGF scFv 蛋白质抑制内皮细胞萌芽
     为测定包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 的功效， 如 (Darland et al， Dev Biol 264(2003)， 275) 所述建立内皮细胞和周皮细胞的体 外共培养系统。 在该共培养中， 将包被在 Cytodex 珠上的 HUVEC 与人间充质干细胞 (Lonzo) 在 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞条件化培养基的存在下在纤维蛋白凝胶中共培养。 在实验开始时或在实验第 7 天， 将 0.04-50nM 对照拮抗剂、 VEGF-A 拮抗剂或包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白添加至培养物。在添加拮抗剂后 的第 8 天使用 PFA 固定细胞。然后使用抗平滑肌细胞肌动蛋白 (aSMA) 或抗 PECAM 抗体通 过 IHC 染色细胞以分别识别周皮细胞和内皮细胞。在使用对照拮抗剂处理的孔中， 这些细
     胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。在用抗 VEGF-A、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受 体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明 拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     研究设计 ： 在第 1 天， Cytodex-3 珠用 HUVECs 包被， 在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。在 第 2 天， 在 24 孔板的孔中将 HUVEC 珠 (200 珠 / 孔 ) 与人间充质干细胞 (hMSC)(40,000 细 胞 / 孔 ) 一起包埋到纤维蛋白凝胶中。将 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞培养基的 1 ∶ 1 混合物与 2ng/mL HGF 一起添加至这些细胞。每两天替换培养基直到实验结束。在第 2 天 ( 从共培养开始起 ) 或第 7 天 ( 共培养形成后 ) 将拮抗剂添加至培养物。添加拮抗剂 后将细胞在 4％ PFA 中固定过夜。用抗 PECAM 或抗 SMA 抗体染色细胞， 然后用第二抗体 ( 缀 合有荧光剂 ) 染色。然后通过显微镜观察细胞， 对 10 珠 / 孔的代表组手动计数芽的数量和 长度。然后计算孔的平均值。
     结果 ： 在用对照拮抗剂处理的孔中， 细胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。 在用抗 VEGF-A 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     实施例 25 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白质预防性处理在 Nu/Nu 小鼠中抑制 A549 肺癌细胞生 长
     为测定 sFGFR 蛋白质是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 在第 0 天对多组小鼠皮下 注射 A549 肺癌肿瘤。然后多组小鼠 (n ＝ 10/gp) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周历时 4 周， 起始于肿瘤接种 1 天后。3X/ 周监测肿瘤体积 4 周。与 注射对照试剂的小鼠相比， 注射 sFGFR 蛋白质的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生 长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 6 用 2x 10 个 A549 细胞在右胁腹皮下注射。从第 1 天开始， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内 注射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周， 注射 4 周。使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。 肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤并用于组织学。 将将肿瘤固 定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密 度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 26 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白治疗处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞生长
     为测定是否 sFGFR 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 几组小鼠在第 0 天皮下注射 3 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm ， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试 剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹 膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。使用测径 器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 保持 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且肿瘤称重。肿瘤也交付进行组织学分析 用于微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 27 ： 使用 sFGFR-Fc 蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测试 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。然后对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试 剂， sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 自肿瘤接种 1 天后开始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历 时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿 瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤 固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管 密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 28 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌细 胞的生长
     为测定 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 3 DU145 前列腺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/ Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比 注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑 制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析 以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 29 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。对多组小鼠(n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂， sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后起。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂 的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小 鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射浓 度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-VEGFscFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿 瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血 管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白的小鼠肿瘤显 著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 30 ： 以双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到 3 尺寸 200mm ， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿 瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106 个 A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用 后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 31 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。对多 组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后开 始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对 肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历 时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内 皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 32 ： 使用双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 DU145 前列腺癌细胞在 Nu/ Nu 小鼠中的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。 当肿瘤 3 达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双 特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的 功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     根据上述， 应理解， 尽管为了说明的目的在此描述了本发明的具体实施方案， 但在 不偏离本发明的精神和范围的前提下可作出各种变化。因此， 本发明除了由所附权利要求 限定外不受限制。所有在此引用的公开物、 专利和专利申请以其整体通过提述并入本文用 于一切目的。86102448984 A CN 102449007
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     术语 “表位” 包括任何能特异结合至免疫球蛋白或 T- 细胞受体的蛋白质决定簇。 表位决定簇通常由化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链组成， 且通常具有特定的三维结 构特征， 以及特定的电荷特征。更具体地， 本文使用的术语 “VEGF-A 表位” 是指 VEGF-A 多 肽的在动物、 优选哺乳动物、 最优选小鼠或人中具有抗原性或免疫原性活性的部分。 具有免 疫原性活性的表位是 VEGF-A 多肽的可引发动物抗体应答的部分。具有抗原活性的表位是 VEGF-A 多肽中被抗体免疫特异性结合 ( 通过任何本领域众所周知的方法测定的， 例如通过 免疫测试测定的 ) 的部分。抗原性表位不一定是免疫原性的。
     “载体 (vector)” 是这样的核酸分子， 如质粒、 粘粒、 或噬菌体， 其具有在宿主细胞 中自主复制的能力。克隆载体通常包含一个或少数个限制核酸内切酶识别位点 ( 其允许以 可确定的方式插入核酸分子而不丧失载体的必需生物功能 )， 以及编码适用于鉴别和选择 克隆载体转化的细胞的标记基因的核苷酸序列。 标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄 青霉素抗性的基因。
     “表达载体” 是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常， 表达载体包括转 录启动子、 基因和转录终止子。通常将基因表达置于启动子的控制下， 这样的基因被称为 “可操作连接” 于启动子。同样， 如果调节元件调节核心启动子的活性， 则调节元件和核心启 动子是可操作连接的。
     术语 “表达” 是指基因产物的生物合成。例如， 在结构基因的情况下， 表达包括将 结构基因转录为 mRNA 和将 mRNA 翻译为一个或多个多肽。
     关于本文所述的蛋白质， 称 “与 SEQ ID NO 规定的氨基酸残基对应的氨基酸残基” 包括这些残基的翻译后修饰物。
     术语 “新血管形成” 和 “血管发生” 在此可互换使用。新血管形成和血管发生是指 新血管在细胞、 组织或器官中的生成。 血管发生的控制通常在某些疾病状态中改变， 而且在 许多情况下， 与疾病相关的病理损害与血管发生改变的不受调节的相关。 持续性的、 不受调节的血管发生在多种疾病状态 ( 包括那些以内皮细胞的异常生长为特征的疾病 ) 中发生， 且支持在这些症状 ( 包括血管的泄漏和渗透 ) 中观察到的病理损害。
     本文使用的术语 “新生血管疾患” 是指任何具有如下所述的病理的疾病或疾患， 所 述的病理至少部分地由增加的或不受调节的血管发生活性所介导。 这样的疾病或疾患的实 例包括各种癌症， 包括实体瘤 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及某些涉及新血管形成的眼病 (“新生血管性眼病” )。 该疾病或障碍特别适于某些抑制血管发生的治疗方法， 如本文进一步描述的。
     术语 “有效量” ， 在通过向本文所述的受试者给药 FGFR 和 / 或 VEGF-A 拮抗剂治疗 新生血管疾病的背景下， 是指该药物的量， 其足以抑制受试者的血管发生以抑制一种或多 种新生血管疾病的发生或改善所述疾病的症状。有效量的药剂根据本发明方法以 “有效方 案” 给药。术语 “有效方案” 是指足以实现治疗或预防疾病或疾患的给药的量和剂量频率的 组合。
     术语 “患者” 或 “受试者” ， 在治疗本文所述疾病或障碍的背景下， 包括哺乳动物， 例 如， 人和其它灵长类。该术语还包括家养动物， 例如， 牛， 猪， 羊， 马， 狗和猫。
     如果当将两个氨基酸序列以最大对应性比对时， 两个氨基酸序列的氨基酸残基相 同， 则两个氨基酸序列具有 “100％氨基酸序列同一性” 。类似的， 如果当以最大对应性比对 时两个核苷酸序列的核苷酸残基相同， 则两个核苷酸序列具有 “100％核苷酸序列同一性” 。 序列比较可使用标准软件程序 ( 如包括在 LASERGENE 生物信息学计算程序组中的程序， 由 DNASTAR(Madison， Wisconsin) 出品 ) 来进行。 其它用于通过确定最佳比对来比较两种核苷 酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Peruski 和 Peruski， The Internet and the New Biology ： Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press， Inc.1997) ； Wu 等人 (eds.)“ ，Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins， ” Methods in Gene Biotechnology 123-151(CRC Press， Inc.1997) ； Bishop(ed.)， Guide to Human Genome Computing(2nd ed.， Academic Press， Inc.1998))。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对彼此具有至少 80 ％， 至少 90 ％， 或至少 95％序列同一性， 则两个核苷酸或氨基酸序列认为是具有 “基本上类似的序列同一性” 或 “基本上序列同一性” 。
     百分比序列同一性通过常规方法测定。参见， 例如， Altschul 等人， Bull.Math. Bio.48 ： 603， 1986， 和 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1992。 例如， 可比对两个氨基酸序列以优化排列得分， 其使用的缺口形成罚分 (gap opening penalty) 为 10， 缺 口 延 伸 罚 分 (gap extension penalty) 为 1， 和 上 文 的 Henikoff 和 Henikoff 的 “BLOSUM62” 评分矩阵， 如表 1 所示 ( 氨基酸通过标准单字母代码表示 )。然后 百分比同一性如下计算 ： ([ 相同匹配的总数 ]/[ 较长序列的长度加上引入较长序列以比对 该两个序列的缺口数 ])(100)。
     表1： BLOSUM62 评分矩阵
     本领域技术人员理解存在许多已建立的算法以比对两个氨基酸序列。该 Pearson 和 Lipman 的 “FASTA” 相似性搜索算法是用于检测本文公开的氨基酸序列和第二氨基酸 序列所享有的同一性水平的合适的蛋白质比对方法。该 FASTA 算法描述于 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988， 和 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990。简言之， FASTA 首先表征序列相似性， 其方法是鉴别查询序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 2 的残基 25-266) 与测试序列共享的如下所述的区域， 它们或者具有最高的同一性密度 ( 如 果 ktup 变量为 1) 或最高的同一性成对数 ( 如果 ktup ＝ 2))， 不考虑保守氨基酸置换、 插 入、 或缺失。然后对具有最高同一性密度的 10 个区重新评分， 方法是使用氨基酸置换矩阵 比较所有成对的氨基酸的相似性， 再 “修剪” 区的末端以仅包括那些对最高评分有贡献的 残基。如果存在多个分数大于 “截断” 值 ( 基于序列长度和 ktup 值通过预定的公式计算 ) 的区， 则检查被修剪的起始区以确定这些区域能够被连接起来形成近似的带有缺口的比 对。最后， 将两个氨基酸序列的最高的得分区使用修饰的 Needleman-Wunsch-Sellers 算法 对准 (Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 444， 1970 ； Sellers， SIAM J.Appl.Math.26 ： 787， 1974)， 这种算法允许氨基酸插入和缺失。FASTA 分析的例示的参数为 ： ktup ＝ 1， 缺 口形成罚分＝ 10， 缺口延伸罚分＝ 1， 且置换矩阵＝ BLOSUM62。可通过修改评分矩阵文件 (“SMATRIX” ) 将这些参数引入 FASTA 程序， 如 Pearson， Meth.Enzymol.183 ： 63， 1990 的附 件 2 所述。
     FASTA 也可用于测定核酸分子的序列同一性， 使用以上公开的比例。 对于核苷酸序 列比较， ktup 值范围可为 1 至 6， 优选 3 至 6， 最优选 3， 其它参数如上设定。
     附图简述
     FASTA 也可用于测定核酸分子的序列同一性， 使用以上公开的比例。 对于核苷酸序 列比较， ktup 值范围可为 1 至 6， 优选 3 至 6， 最优选 3， 其它参数如上设定。
     附图简述
     图 1A-1C 描述某些免疫球蛋白 Fc 多肽的氨基酸序列。氨基酸序列数基于 EU 索 引 (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest， US Department of Health and Human Services， NIH， Bethesda， 1991)。阐述的序列包括野生型人序列 (“wt” ； SEQ ID NO ： 75) 和 5 个变体序列， 称为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， Fc4(SEQ ID NO ： 77)， Fc5(SEQ ID NO ： 74)， Fc6(SEQ ID NO ： 78)， 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。通常在与轻链恒 定区 (LC) 和重链恒定区 (HC) 的二硫键键合中涉及的 Cys 残基被标示出来。 “.” 表示与在 该位置的野生型的同一性。*** 表示终止密码子 ； C- 端 Lys 残基已从 Fc6 去除。示出了铰 链、 CH2 和 CH3 域的边界。
     图 2 描述了四价、 双特异性抗体 / 可溶受体组合， 其对两个不同的靶 ( 在此称为 αVEGF-A 和 FGFR 的配体结合域 ) 具有特异性。
     图 3 描 述 显 示 对 FGF-9- 刺 激 的 成 骨 细 胞 增 殖 的 可 变 抑 制 的 FGFR-Fc(R&D Systems)。
     图 4A 描 述 FGFR-Fc 构 建 体 (ZymoGenetics) 抑 制 FGF-9- 刺 激 的 增 殖。 全 长 FGFR3-Fc 野生型和突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50 ； 图 4B 描述截短的 FGFR3-Fc 突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     图 5A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-8b 的直接结合， 图 5B 描述 FGFR-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-8b 的直接结合。
     图 6A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-17 的直接结合， 图 6B 描述 FGFR2-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 7 描述 FGFR3-Fc 构建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 8A 描述 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细胞的生长， 图 8B 描述 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞 的生长。
     图 9 描述 FGF 受体家族的第二和第三 Ig 样域。
     发明描述
     I. 概述
     本发明通过提供新蛋白质， 即多特异性结合蛋白， 特别是双特异性结合蛋白， 解决 了本领域对于提供更多治疗剂以治疗癌症， 特别是实体瘤的需求。所述蛋白质包含与抗体 部分融合的可溶受体部分。如本文所述， 术语 “双特异性结合蛋白” 是指能通过至少两种具 有不同结合特异性的结合部分特异结合至少两种不同的靶分子的蛋白质。 该结合部分可以 是例如蛋白质 ( 例如， 抗体或可溶受体 ) 或小分子。 双特异性结合蛋白的结合部分可以是物 理连接的。如本文所述的本发明提供包含可溶受体部分和抗体部分的双特异性结合蛋白。
     在本发明中， 可溶的受体部分包含可溶的 FGF 受体或其部分， 而抗体部分包含 VEGF-A 抗体或其部分， 如本文所述。在某些实施方案中， 双特异性结合蛋白的两个或多个 不同的部分通过接头连接以形成多聚物 ( 例如， 二聚物 )。例如， 在包含至少两个多肽部分 ( 例如， 可溶 FGF 受体和 VEGF-A 抗体 ) 的融合的双特异性结合蛋白的情况下， 可利用肽接头 序列来分隔， 例如， 多肽组分， 将它们分隔成足以保证各多肽折叠为其二级和三级结构的距 离。
     在某些实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白减少 FGF 和 VEGF-A 两者的生物活 性。具体地， 本发明提供 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂， 特别是中和性抗 VEGF-A 抗体与 FGF 可溶受体的组合， 其减少通过 VEGF-A 受体和 FGF 受体的信号传递。使用这样的拮抗剂减少经由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可用于治疗多种具有至少部分以新血管形成为特征的病 理的疾病。例如， 在肿瘤中和肿瘤周围抑制藉由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可减少 肿瘤形成血管、 生长和转移的能力。
     FGF 受体的活化可活化多种信号转导途径， 包括磷脂酶 C、 磷脂酰肌醇 3- 激酶、 促分裂原活化的蛋白质激酶、 以及转录的信号转导物和活化剂 (STAT) 途径， 这些途径都 在前列腺癌进展中起作用。FGF 信号传导增加的净结果包括增强的增殖、 对细胞死亡的抗 性、 增加的活动力和侵袭力、 增加的血管发生、 增强的转移、 对化疗和放射的抗性和雄激素 非依赖性等， 这些都可增强肿瘤进展和临床侵占性。FGF 受体和 / 或 FGF 信号传导可直 接影响肿瘤细胞， 也可影响肿瘤血管发生 (Kwabi-Addo 等人， Endocrine-Related Cancer 11(4)709-724， 2004)。
     本发明提供减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂。该 FGF- 结合部分为可溶 FGF 受体 (FGFR) 且 VEGF-A- 结合部分为 VEGF-A 抗体。根据本发明， 该 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂为特异结合且减少 VEGF-A 和 FGF 活性的双特异性抗体 / 可溶受体 结合蛋白。本发明的双特异性结合蛋白在此详细描述。
     II.FGF 受体， 抗 VEGF-A 抗体， 和相关双特异性结合组合物
     A.FGF 受体
     该分子的 FGFR 部分为可溶受体。该 FGFR 包含三个 Ig 样域， 称为 D1， D2 和 D3。该 受体可包含 FGF 受体的 D1， D2， D3， 或可包含 D2， D3 而没有 D1。而且， 该受体可为天然受体 或在 D2-D3 区具有突变。该 FGFR 家族和域 D2 和 D3 示于图 1。
     已证实 D1 的截短可增加受体的亲和力和增强受体 / 配体相互作用 (Olsen 等人 PNAS 101 ： 935-940， 2004)。已知 FGFR1-3 由于在 D3 的羧基端的可变剪接而具有多个同种 型。从该知识出发， 本发明者制成了多种具有三个或两个 Ig 样域的变体可溶 FGF 受体， 且 表征了它们对 FGF 配体的结合亲和力。该 FGFR3 和 FGFR2 同种型 IIIc 是特别令人感兴趣 的， 因为它们比相应的 IIb 同种型对 FGF 2， 6， 8b， 9 和 17 具有更高的亲和力。
     FGF 受体可以基于它们对 FGF 配体的结合亲和力来定性。对给定的相互作用， 测 -1 -1 -1 量结合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s ))。结合速率常数是反映配体 - 受体 复合物形成速率的值。解离速率常数是反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常 表示为平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是将解离速率常数除以结合速 率常数 (kd/ka) 而获得， 而 KA 是将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 而获得。具有类似 KD( 或类似 KA) 的分子可具有在广范围内可变的结合和解离速率常数。当在标准体外测试 如 BIACORE 结合分析中测量时， 对本发明双特异性结合蛋白的结合亲和力将在 100nM 或更 少， 优选 10nM 或更少， 且更优选 1nM 或更少的范围。
     在某些实施方案中， FGFR 为 FGFR3IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 2 的第 262 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 9 的第 142 号氨基酸从 S 突变为 W。其它具 体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 15 的第 263 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 22 的第 143 号氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR3IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 10， 19 和 22 所示。
     在其它某些实施方案中， FGFR 为 FGFR2IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 29 的氨基酸数 X 或 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸数 Xa 从 S 突变为 W。其它具体 实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 33 的第 Y 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 42 的第 Ya 号 氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR2IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 37 和 42 所示。
     B.VEGF-A 抗体
     用于本发明的 VEGF-A 拮抗剂包括这样的分子， 它们结合至 VEGF-A 或 VEGF-A 受 体， 从而诱导 VEGF-A 对表达该受体， 例如， VEGFR-1， VEGFR-2， 神经纤毛蛋白 -1， 和 / 或神 经纤毛蛋白 -2 的细胞的活性。特别是， VEGF-A 拮抗剂包括抗 VEGF-A 抗体。其它合适的 VEGF-A 拮抗剂包括包含 VEGFR 细胞外域的可溶 VEGF-A 受体， 以及能抑制 VEGF-A 与其受体 的相互作用或能以其他方式抑制 VEGF-A 诱导的通过 VEGF-A 受体的细胞内信号传导的小分 子拮抗剂。此外， 可使用基于非抗体支架的结合蛋白质。( 参见， 例如， Koide 等人， J.Mol. Biol.284 ： 1141-1151， 1998 ； Hosse 等人蛋白质 Sci.15 ： 14-27， 2006， 以及其中的文献 )。 本 发明使用的优选的 VEGF-A 拮抗剂包括特异结合至 VEGF-A 的抗体， 包括也包含对 FGF 的结 合位点的双特异性抗体。对 VEGF-A 特异的抗体至少结合 VEGF-A 的可溶分泌形式， 且优选 还结合关联于细胞表面的形式。
     抗体在以下情况下被认为是特异结合的， 如果 (1) 它们显示结合活性的阈水平， 和 (2) 它们不显著与对照多肽分子交叉反应。例如， 如果抗 VEGF-A 抗体结合至 VEGF-A 多 肽、 肽或表位的亲和力为与对照 ( 非 VEGF-A) 多肽的结合亲和力的至少 10 倍， 则确定结合 6 -1 阈水平。 优选的是， 本发明中使用的抗体具有的结合亲和力 (Ka) 为 10 M 或更大， 优选 107M-1 或更大， 更优选 108M-1 或更大， 最优选 109M-1 或更大。抗体的结合亲和力可由本领域技术人 员容易地确定， 通常使用自动设备通过表面等离子共振测定。 其它方法是本领域已知的， 例 如 Scatchard 分析 (Scatchard， Ann.NY Acad.Sci.51 ： 660-672， 1949)。
     本发明的抗体包含保持抗原 - 结合特异性的完整抗体的部分或由其组成。合适的 抗体包括， 例如， 完全的人抗体 ； 人源化抗体 ； 嵌合抗体 ； 抗体片段例如 Fab， Fab’ ， F(ab)2， F(ab’ )2 和 Fv 抗体片段 ； 单链抗体 ； 和抗体重链或轻链的单体或二聚物或其混合物。本发 明的优选抗体为单克隆抗体。包含轻链的抗体可包含 κ 或 λ 轻链。
     在某些实施方案中， 本发明的抗体包括任何同种型的完整免疫球蛋白， 包括 IgA， IgG， IgE， IgD， 或 IgM( 包括其亚型 )。根据本发明的完整免疫球蛋白优选包括完整 IgG( 例 如， 完整 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 或 IgA2)。
     制备和分离多克隆抗体、 单克隆抗体和其抗原 - 结合抗体片段的方法是本领域已 知的。参见， 例如， Current Protocols in Immunology， (Cooligan 等人 eds.， John Wiley and Sons， Inc.2006) ； Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor， NY， 2nd ed.1989) ； 和 Monoclonal Hybridoma Antibodies ： Techn iques and Applications(Hurrell ed.， CRC Press， Inc.， Boca Raton， FL， 1982)。抗原结合片 段， 包括 scFv， 可根据本领域已知方法使用噬菌体展示文库制备。噬菌体展示也可用于基 于非抗体支架制备结合蛋白质 (Koide 等人， 上文 .)。制备重组人多克隆抗体的方法公开 于 Wiberg 等 人， Biotechnol Bioeng.94 ： 396-405， 2006 ； Meijer 等 人， J.Mol.Biol.358 ： 764-772， 2006 ； Haurum 等人， 美国专利申请公开 No.2002/0009453 ； 和 Haurum 等人， 美国专 利申请公开 No.2005/0180967。对本领域技术人员显而易见的是， 用于本发明的多克隆抗体可通过用免疫源性多 肽或多肽片段接种多种温血动物如马， 牛， 山羊， 绵羊， 狗， 鸡， 兔， 小鼠， 和大鼠的任一种而 产生。免疫原性多肽的免疫原性可通过使用佐剂， 如明矾 ( 氢氧化铝 ) 或弗氏完全或不完 全佐剂来增加。用于免疫的多肽还包括融合多肽， 如 VEGF-A 或其部分与免疫球蛋白多肽或 与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可为全长分子或其部分。如果多肽部分为半抗原 状， 其可有利地结合或连接至大分子载体 ( 如钥孔虫戚血兰素 (KLH)， 牛血清白蛋白 (BSA) 或破伤风类毒素 ) 以用于免疫。
     此外， 抗体可相对于与抗体靶 ( 例如， 直向同源物， 横向同源物 (paralogs))， 或其 序列变体相关的已知多肽进行筛选， 例如， 以分离对于结合靶蛋白或多肽而言高度特异的 抗体群体。这样的高特异性群体包括， 例如， 结合至人 VEGF-A 但不结合至小鼠 VEGF-A 的抗 体。 这种与相关多肽分子的交叉反应性的缺失通过， 例如， 使用标准蛋白质印迹分析通过检 测 VEGF-A 多肽而不检测已知的相关多肽的抗体显示 (Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人 eds.， Green and Wiley and Sons， NY 1993)) 或 ELISA( 酶免疫 测定 )(Immunoassay， A Practical Guide(Chan ed.， Academic Press， Inc.1987))。在 另一实例中， 针对 VEGF-A 多肽产生的抗体吸附到粘附在不可溶基质上的相关多肽上， 对 VEGF-A 多肽高度特异的抗体将在适当的缓冲条件下流过基质。筛选使得分离与已知的密 切相关的多肽无交叉反应性的多克隆和单克隆抗体成为可能 (Antibody ： A Laboratory Manual(Harlow and Lane eds.， Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988) ； Current Protocols in Immunology(Cooligan 等人 eds.， National Institutes of Health， John Wiley and Sons， Inc.1995)。特异抗体的筛选和分离是本领域已知的。参见 Fundamental Immunology(Paul ed.， Raven Press 1993) ； Getzoff 等 人， Adv.in Immunol.43 ： 1-98， 1988 ； Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice(Goding ed.， Academic Press Ltd.1996) ； Benjamin 等人， Ann.Rev.Immunol.2 ： 67-101， 1984。
     天然单克隆抗体 (“mAbs” ) 可通过， 例如， 用纯化的免疫原性蛋白或其片段免疫 受试者动物 ( 例如， 大鼠或小鼠 ) 而制备。在典型的程序中， 首先分别对动物给予腹腔内 (IP) 注射纯化的蛋白质或其片段， 通常与佐剂 ( 例如， 完全弗氏佐剂或 RIBI 佐剂 ( 获自 Sigma-Aldrich， St.Louis， MO)) 组合， 然后以例如两周的间隔加强 IP 注射纯化蛋白质。给 予第三加强注射后 7-10 天， 对动物放血并收集血清。视需要可以给予更多次的加强接种。 使用常规方法从高效价动物收集脾细胞和淋巴节细胞， 并使其融合至骨髓瘤细胞 ( 例如， 小鼠 SP2/0 或 Ag8 细胞 )。然后将该融合混合物在胸腺细胞的滋养层上培养或用合适的 培养基补充物培养 ( 包括可商购的补充物如杂交瘤融合和克隆补剂 ； Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)。融合后约 10 天， 使用标准测试 ( 例如 ELISA) 鉴别特异的产生抗体的 杂交瘤群。对于阳性池可进一步分析其阻断或减少靶蛋白的活性的能力。通过限制稀释克 隆阳性池。
     在某些方面， 本发明还包括多种单克隆抗体的用途， 所述多种单克隆抗体对单一 靶分子上对不同表位特异。组合使用这样的多种抗体可减少单一抗体所见的载体效应 (carrier effect)， 且还可通过 Fc 受体增加清除率和改善 ADCC。可组合使用两种、 三种或 多种单克隆抗体。
     天然抗体的氨基酸序列可通过使用重组 DNA 技术改变。因此， 抗体可进行重新设计以得到所需特征。相对其非修饰的形式， 修饰的抗体可提供例如改善的稳定性和 / 或治 疗功效。可能的变化有很多， 范围可以从改变仅一个或一些氨基酸到对例如可变区或恒定 区的完全重新设计。 制造恒定区的变化的目的通常是改善或改变特征， 如补体结合、 与膜的 相互作用和其它效应物作用。 通常， 制造可变区的变化以改善抗原结合特征， 改善可变区稳 定性， 或减少免疫原性的风险。噬菌体展示技术也可使用。参见， 例如， Huse 等人， Science 246 ： 1275-1281， 1989 ； Ladner 等人， 美国专利号 5,571,698。
     对 于 用 于 人 体 的 治 疗 用 抗 体， 通常需要根据已知方法将抗体的非人区人源 化。制备人源化抗体的方法公开于， 例如， 美国专利 5,530,101 ； 5,821,337 ； 5,585,089 ； 5,693,762 ； 和 6,180,370。通常， 人源化抗 VEGF-A 抗体包含小鼠供免者疫球蛋白的互补决 定区 (CDR) 和人受者免疫球蛋白的重链和轻链框架。 通常， 人框架区中的框架残基将被 CDR 供者抗体的相应残基取代， 以改变 ( 优选改善 ) 抗原结合。通过本领域众所周知的方法辨 别这些框架取代， 例如， 通过模仿 CDR 和框架残基的相互作用以鉴别对抗原结合重要的框 架残基和序列比较以鉴别在特定位置的一般的框架残基。( 参见， 例如， Queen 等人， 美国专 利号 5,585,089 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323， 1988)。
     非人源化嵌合抗体也可治疗性地使用 ( 例如， 在免疫抑制患者中 )。因此， 在一 些变化中， 根据本发明的抗体是从例如非人抗 VEGF-A 抗体衍生的嵌合抗体。优选地， 嵌合 抗体包含衍生自小鼠或大鼠抗体的可变区和衍生自人的恒定区， 以使该嵌合抗体当给予人 受试者时具有较长的半衰期和较低的免疫原性。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。 ( 参见例如， Morrison， Science 229 ： 1202， 1985 ； Oi 等人， BioTechniques 4 ： 214， 1986 ； Gillies 等人， J.Immunol.Methods 125 ： 191-202， 1989 ； 美国专利 5,807,715 ； 4,816,567 ； 和 4,816,397)。
     本发明还包括完全的人抗体， 如衍生自卵巢， 乳腺， 肾， 结肠直肠， 肺， 子宫内膜， 或 脑癌患者的外周血单核细胞的。该细胞可与骨髓瘤细胞融合， 例如， 以形成产生抗 VEGF-A 的完全的人抗体的杂交瘤细胞。人抗体也可以在转基因非人动物 ( 通常为小鼠 ) 中制备。 参见， 例如， Tomizuka 等人， 美国专利 No.7,041,870。通常， 非人哺乳动物就人重链基因座 和人轻链基因座而言是转基因的， 且相应的内源性免疫球蛋白基因座被失活。
     本发明的抗体可用它们所识别或特异结合的 VEGF-A 多肽的表位或部分来特指。 表位或多肽部分可例如， 用 SEQ ID NO ： 72 所示的 VEGF-A 多肽的表位或其它部分的 N- 端和 C- 端位置来特指。
     本发明的抗体具有这样的结合亲和力， 其包括的小于 5x 10-2M， 小于 10-2M， 小于 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x -10 -10 -11 -11 -12 -12 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10-13M， 小 -13 -14 -14 -15 -15 于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 或小于 10 M 解离常数 (Kd)。
     本发明的抗体进一步包括修饰的衍生物， 修饰的方式例如， 通过对抗体的任何类 型的分子共价连接， 以使共价连接不阻止抗体结合至其表位。合适的修饰包括， 例如， 岩藻 糖基化， 糖基化， 乙酰化， 聚乙二醇化， 磷酸化和酰胺化。 该抗体及其衍生物本身可通过已知 的保护基 / 封闭基、 蛋白酶剪切、 与细胞配体或其它蛋白质的连接等而衍生化。在本发明一 些实施方案中， 抗体的至少一个重链被岩藻糖基化。 在具体的变化形式中， 该岩藻糖基化是N- 连接的。在某些优选的实施方案中， 抗体的至少一个重链包含岩藻糖基化、 N- 连接的寡 糖。
     本发明的抗体可单独使用或作为与细胞毒素剂的免疫缀合物使用。在一些实施 方案中， 该试剂为化学治疗剂。在其它实施方案中， 该试剂为放射性同位素， 例如， 铅 -212， 铋 -212， 砹 -211， 碘 -131， 钪 -47， 铼 -186， 铼 -188， 钇 -90， 碘 -123， 碘 -125， 溴 -77， 铟 -111， 或可裂变核素如硼 -10 或锕系元素。在其它实施方案中， 该试剂为毒素或细胞毒素药物， 例 如蓖麻毒蛋白、 修饰的假单胞菌肠毒素 A、 加利车霉素 (calicheamicin)、 阿霉素、 5- 氟尿嘧 啶、 auristatin( 例如， auristatin E)、 美登木素 (maytansin)、 等。抗体和抗体片段与该试 剂的缀合方法是本领域已知的。
     本发明的抗体包括相对参照抗体 ( 例如， 具有表 2 或表 3 所示 VL 和 / 或 VH 序列 的参照抗体 ) 具有单个或多个氨基酸取代， 缺失， 添加， 或置换的变体， 以使该变体保持参 照抗体的一种或多种生物特性 ( 例如， 阻断 VEGF-A 与其各自的对应结构 (VEGF-A 受体 ) 的 结合， 阻断 VEGF-A 的生物活性， 结合亲和力 )。 本领域技术人员可制备具有单一或多重氨基 酸取代、 缺失、 加成或置换的变体。这些变体可包括， 例如 ： (a) 其中一个或多个氨基酸残基 被保守或非保守氨基酸置换的变体， (b) 其中一个或多个氨基酸被添加至多肽或从多肽被 删除的变体， (c) 其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体， 和 (d) 其中多肽与可赋予多肽 有用的特性的另一肽或多肽融合的变体， 所说的另一肽或多肽如融合配偶体、 蛋白标记物 或其它化学部分， 例如抗体的表位、 多组氨酸序列、 生物素部分等。本发明的抗体可包括以 下变体， 其中一个物种的氨基酸残基代替另一物种中的对应残基， 代替可发生在保守的或 非保守的位置。在另一实施方案中， 非保守的位置的氨基酸残基被保守的或非保守的残基 代替。 获得这些变体的技术， 包括遗传的 ( 抑制、 缺失、 突变等 )、 化学的和酶学的技术， 是本 领域技术人员已知的。
     结合至 VEGF-A 的示例性抗体已通过筛选噬菌体展示文库得以鉴定。通过噬菌 体展示的筛选方法详细描述于标准参考文章， 如 Babas， Phage Display ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab Press ， 2001) 和 Lo ， Benny K.C. ， A. ， Antibody Engineering(2004)。该噬菌体展示文库可用于将表达的蛋白质展示在细胞或其它物质的 表面， 以使互补的结合实体可以被功能性分离 (functionally isolated)。在一种这样的 噬菌体展示文库中， 将抗体轻链可变区和部分重链可变区与编码人抗体序列的合成 DNA 组 合， 然后它们在噬菌体和噬菌粒文库上作为 Fab 抗体片段被展示 (Dyax Human Antibody Libraries， Dyax Corp.， Cambridge， MA.)。因此， 抗体的可变轻链和重链片段可以以 Fab 形式被分离。然后可处理这些可变区以产生抗体， 包括抗原 - 结合片段， 如 scFv， 双特异性 scFv， 以及针对 VEGF-A 的多特异性、 多功能拮抗剂。
     使用该技术， 示例性 Fabs 的可变区已在本文所述得测试中因其结合和 / 或中和 VEGF-A 的特征而被鉴定出来。( 参见下文实施例 )。处理这些可变区以产生多种结合实体， 包括结合和 / 或中和 VEGF-A 的 scFv。下表 2 显示因其结合和中和 VEGF-A 的能力而被鉴定 出的抗 VEGF-A 抗体簇的核苷酸和氨基酸 SEQ ID NO. 标号， 而表 3 列出了对应于表 2 所列 的抗 VEGF-A 抗体的框架和 CDR 区的氨基酸残基位置。
    在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF-A 抗体包含表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的一 个或多个 CDR( 相应 CDR 区的边界分别示于表 3)。 例如， 在某些变化中， 该抗体包含表 2 所列
     的抗体的重链 CDR(HCDR1， HCDR2 和 HCDR3 区中的至少一个 ) 和 / 或相应的轻链 CDR(LCDR1， LCDR2， 和 LCDR3 区中的至少一个 )。在典型实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有表 2 所列的 抗体的两个或三个重链 CDR 和 / 或两个或三个轻链 CDR。在一些变化中， 其中抗 VEGF-A 抗 体具有表 2 所列的抗体的至少一个重链 CDR， 该抗体进一步包含至少一个相应的轻链 CDR。
     在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A 抗体包括重和 / 或轻链可变域， 该重链或轻链可 变域具有 (a) 对应于表 2 所列的抗体所示的重链或轻链 CDR 的一组三个 CDR， 和 (b) 一组四 个框架区。例如， 抗 VEGF-A 抗体可包含重和 / 或轻链可变域， 其中该重链或轻链可变域具 有 (a) 一组三个 CDR， 其中该组 CDR 源自表 2 所列的抗体， 和 (b) 一组四个框架区， 其中该组 框架区与表 2 所列的相同抗体的那组框架区相同或不同。
     在具体实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体包含与表 2 所列的抗体的重和 / 或轻链可变区 基本上相同的重链可变区和 / 或轻链可变区。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， LCDR1 具有 SEQ ID NO ： 66 的 残基 24-34 所示的氨基酸序列 ； LCDR2 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 50-56 所示的氨基酸序 列； LCDR3 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 89-97 所示的氨基酸序列 ； HCDR1 具有抗体 c1039 的 HCDR1 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 31-35) ； HCDR2 具有抗体 c1039 的 HCDR2 氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自 SEQ ID NOs ： 68 的氨基酸序列。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， LCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 23-35) ； LCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR2 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 51-57) ； LCDR3 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR3 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 90-100) ； HCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 31-35) ； HCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR2 氨基酸序 列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 99-102 的氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870， c1039 和 c1094 的抗体的 CDR LCDR1， LCDR2， LCDR3， HCDR1， HCDR2 和 HCDR3。例如， 在 具体实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的抗体的轻链和重链可 变域 (VL 和 VH)。
     在其它实施方案中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体包括含 CDR LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 的 VL 域和含 CDR HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 的 VH 域， 其中该组 VL 和 VH CDR 相对第二组 CDR 具有 3 个或更少个氨基酸取代， 其中所述第二组 CDR 具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的 抗体的 LCDR1、 LCDR2、 LCDR3、 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该 抗体在所述组的 CDR 中包含 0、 1 或 2 个氨基酸取代。
     本发明的抗 VEGF-A 抗体识别的表位通常包含人 VEGF-A165 的 5 个或更多个氨基酸 (SEQ ID NO ： 72 的残基 27-191)。优选的表位包含至少一个包含在一个或多个以下 VEGF-A 的多肽区内的氨基酸 ： HEVVKFMDVYQRSYCHPIETL(SEQ ID NO ： 72 的 氨 基 酸 残 基 38-58)， EYIFKPSCVPLMRCG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84)， EESNITMQIMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 98-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。 在某些实施方案中， 该 表位包含至少 2 个、 至少 3 个、 至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 或至少 7 个源自 SEQ ID NO ： 72 的残基 38-58、 70-84、 98-114、 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的氨基酸。 在一些变化形式中， 该 VEGF-A 表位是通过使用重叠 VEGF-A 肽 )( 例如 13- 聚肽， 其中在每对 依次的肽之间有例如 2 个氨基酸移位 ) 的肽微阵列表位作图而确定的表位。
     在上述抗 VEGF-A 抗体的具体变化形式中， 该抗 VEGF-A 表位包含包括在一个或多 个以下的 VEGF-A 多肽区内的至少一个氨基酸 ： KFMDVYQRSYC(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 42-52)， IFKPSCVPLMR(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 72-82)， IMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的 氨基酸残基 106-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。在某些实施方案中， 该表 位包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 42-52， 72-82， 106-114， 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的至少两个， 至少 3 个， 至少 4 个， 至少 5 个， 至少 6 个， 或至少 7 个氨基酸。
     在一些相关的变化形式中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体结合至如下所述的表位， 该表位包含 (a) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 38-58 或 42-52 所示的第一 VEGF-A 多肽区 内包含的一个或多个氨基酸， 和 (b) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84 或 72-82 所示的 第二 VEGF-A 多肽区内包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的某些实施方案中， 该表位 不包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 90 至 132 所示的 VEGF-A 的多肽区内包含的氨基酸 (EGLECVP TEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRP)。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， 该表位 进一步包含 (c) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 96-114 或 106-114 所示的第三 VEGF-A 多肽区内 包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a)、 (b) 和 (c) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， 该 抗体不以彼此的 10 倍以内的 Kd 值结合人和小鼠 VEGF-A。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它变化形式中， 该表位 进一步包含 (d) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 142-154 所示的第四 VEGF-A 多肽区内包含的一个 或多个氨基酸。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 抗 VEGF-A 抗 体 为 抗 体 片 段， 例 如 Fv、 Fab、 Fab’ 、 F(ab)2、 F(ab’ )2、 scFv、 或双特异性抗体。在一些优选的实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体为 scFv。结合 VEGF-A 的 scFv 实体可具有这样的取向， 其中轻链可变 (VL) 区位于重链可变 (VH) 区的氨基 端或者羧基端。在一些变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 X 所列的抗 VEGF-A 抗体的 CDR。 在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的 VL 和 VH 域。 在某些 实施方案中， 抗 VEGF-A scFv 的 CDR 或 VL 和 VH 域为选自 c870 c1039 和 c1094 的抗 VEGF-A 抗体的 CDR 或 VL 和 VH 域。在抗 VEGF-A scFv 的具体变化形式中， 该 scFv 包含如 SEQ ID NO ： 70(c1039scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 69 所示 ) ； SEQ ID NO ： 44(c870.1e6scFv ； 核 苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) ； 或 SEQ ID NO ： 46(c1094.1scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) 所述的氨基酸序列。此外， scFvs 可以多种双特异性抗体形式的任一种提供， 例如， 串联 scFv(tascFv)、 双 - 单链 Fv(biscFv)、 和具有融合至羧基端的单链 Fv(scFv) 的 完整单克隆抗体 (biAb)( 参见上文 )。
     C. 使用 Fc 蛋白质缀合的双特异性抗体 / 可溶受体组合
     双特异性结合蛋白通过免疫球蛋白重链的 Fc 区结合本发明的结合蛋白， 如图 2 所 例示的。该 Fc- 融合蛋白包含 IgG 分子的 Fc 区。在另一实施方案中， 该 Fc 区来自人 IgG1 分子。在一些实施方案中， 该免疫球蛋白融合物包括 IgG1 分子的铰链、 CH2 和 CH3 区， 或铰链、 CH1、 CH2 和 CH3 区。
     免 疫 球 蛋 白 融 合 物 的 制 备 也 参 见 美 国 专 利 No.5,428,130， 美国专利 No.5,843,725， 美国专利号 6,018,026， 和 Chamow 等人， TIBTECH， 14 ： 52-60(1996)。
     最简单和最直接的 Fc- 融合蛋白设计通常藉由免疫球蛋白重链的 Fc 区联合本发 明的拮抗剂多肽的结合域。在本发明的 Fc- 融合蛋白中， 编码结合组分的核酸融合至编码 免疫球蛋白恒定域序列的 N- 端的核酸的 C 端， 但是 N- 端融合物也是可能的。
     典型地， 这样的融合物中， 编码的嵌合多肽将至少保持免疫球蛋白重链的恒定区 的功能活性铰链、 CH2 和 CH3 域。还在恒定域的 Fc 部分的 C- 端， 或直接在重链的 CH1 或轻 链的对应区域的 N 端进行融合。 进行融合的精确位点不是关键的 ； 具体位点是公知的， 且可 加以选择以优化 Fc- 融合蛋白的生物活性、 分泌或结合特征。
     在一个优选的实施方案中， 该结合域序列融合至免疫球蛋白 G1(IgG1) 的 Fc 区的 N- 端。可以融合整个重链恒定区与结合域序列。然而， 更优选地， 融合中使用这样的序列， 其起始于化学限定 IgG Fc 的木瓜蛋白酶切割位点 ( 即残基 216， 将重链恒定区的第一残基 作为 114) 或其它免疫球蛋白中的类似位点紧邻上游的铰链区。在特别优选的实施方案中， 该结合域氨基酸序列融合至 (a) 铰链区和 CH2 和 CH3 或 (b)IgG 重链的 CH1、 铰链、 CH2 和 CH3 域。
     对于双特异性 Fc- 融合蛋白， Fc- 融合蛋白被组装为多聚体， 特别是异源二聚体或 异源四聚体。通常， 这些组装的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。一种基本的四链结构 单位是存在于 IgG、 IgD 和 IgE 中的形式。四链单位在高分子量免疫球蛋白中重复 ； IgM 通 常以通过二硫键保持在一起的四个基本单位的五聚体存在。IgA 球蛋白， 偶尔还有 IgG 球 蛋白， 也可在血清中以多聚体形式存在。 在多聚体的情况下， 四个单位的每一个可相同或不 同。
     或者， 可将 Fc 序列插入免疫球蛋白的重链和轻链序列之间， 而得到包含嵌合重链 的免疫球蛋白。在该实施方案中， 在免疫球蛋白的每条臂中 Fc 序列融合至免疫球蛋白重 链的 3 ′端， 或是在铰链和 CH2 域之间， 或是在 CH2 和 CH3 域之间。类似构建体已报道于 Hoogenboom 等人， Mol.Immunol.， 28 ： 1027-1037(1991)。
     尽管在本发明的 Fc- 融合蛋白中不需要免疫球蛋白轻链的存在， 但免疫球蛋白轻 链可共价连接于结合域 - 免疫球蛋白重链融合多肽， 或直接融合于结合域。在前者的情况 下， 通常将编码免疫球蛋白轻链的 DNA 与编码结合域免疫球蛋白重链融合蛋白的 DNA 共表 达。 当分泌时， 杂合的重链和轻链将被共价连接， 而提供一种包含两个由二硫键连接的免疫 球蛋白重链 - 轻链对的免疫球蛋白状结构。适合制备该结构的方法例如公开于美国专利 No.4,816,567。
     Fc- 融合蛋白最方便地通过将编码结合域部分的 cDNA 序列合框地融合于免疫球 蛋白 cDNA 序列而构建。 然而， 也可使用与基因组免疫球蛋白片段的融合 ( 参见， 例如 Aruffo 等人， Cell， 61 ： 1303-1313(1990) ； 和 Stamenkovic 等人， Cell， 66 ： 1133-1144(1991))。后 一类型的融合需要存在 Ig 调节序列以用于表达。基于自脾或外周血淋巴细胞衍生的 cDNA 库中公开的序列， 可以通过杂交或聚合酶链反应 (PCR) 技术来分离编码 IgG 重链恒定区的 cDNA。将编码 Fc- 融合蛋白的结合域和免疫球蛋白部分的 cDNA 串联地插入指导在所选的 宿主细胞中的高效表达的质粒载体中。已进行了特殊的修饰以制备用于产生本发明使用的 Fc 融合分子的 Fc 序列。具体 地， 产生 6 个版本的修饰的人 IgG1 Fc 用于生成 Fc 融合蛋白且命名为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， 以及 Fc4(SEQ ID NO ： 77)、 Fc5(SEQ ID NO ： 74)、 Fc6(SEQ ID NO ： 78)、 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。Fc4， Fc5 和 Fc6 包含突变以通过减少 FcγRI 结合和补体 C1q 结合而减少 Fc 介导 的效应物作用。Fc4 包含引入 Fc-488 的相同氨基酸置换。还引入了另外的氨基酸置换以减 少潜在的 Fc 介导的效应物作用。具体地说， 引入三个氨基酸置换以减少 FcγRI 结合。它 们是在 EU 索引位置 234、 235 和 237 的置换。已显示这些位置上的置换可减少与 FcγRI 的 结合 (Duncan 等人， Nature 332 ： 563(1988))。这些氨基酸置换还可减少 FcγRIIa 结合， 以 及 FcγRIII 结合 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000) ； Wines 等人， J.Immunol.164 ： 5313(2000))。
     数 个 研 究 组 描 述 了 EU 索 引 位 置 330 和 331 在 补 体 C1q 结 合 和 后 续 补 体 固 定 (complement fixation) 中的重要性 (Canfield 和 Morrison， J.Exp.Med.173 ： 1483(1991) ； Tao 等人， J.Exp.Med.178 ： 661(1993))。在 Fc4 的这些位置上引入氨基酸置换， 以减少补体 固定。Fc4 的 CH3 域与对应野生型多肽中的 CH3 域相同， 只是终止密码子从 TGA 变为 TAA， 以 便消除克隆的 DNA 在 dam+ 大肠杆菌菌株中生长时潜在的 dam 甲基化位点。 在 Fc5 中， 在 EU 索引位置 218 的精氨酸残基突变回至赖氨酸， 因为在包含该特定 Fc 的融合蛋白中没有使用 BglII 克隆方案。 Fc5 序列的其余部分与上文对 Fc4 的描述相符。
     Fc6 与 Fc5 相同， 只是羧基末端赖氨酸密码子已被消除。成熟免疫球蛋白的 C- 端 赖氨酸经常在翻译后从 B- 细胞分泌之前从成熟免疫球蛋白被去除， 或在血清循环过程中 被去除。因此， 在循环抗体上通常找不到 C- 端赖氨酸残基。像上述 Fc4 和 Fc5 一样， Fc6 序 列中的终止密码子变为 TAA。
     Fc7 与野生型 γ1 Fc 相同， 除了位于 CH2 域中的 EU 索引位置 297 处的氨基酸置换 之外。EU 索引位置 Asn-297 是一个 N- 连接型碳水化合物搭接的位点。由于碳水化合物结 构中可能的批次间差异， N- 连接的碳水化合物向重组表达的蛋白质中导入了潜在的变异性 来源。在一个消除这种潜在的变异性的尝试中， 将 Asn-297 突变为谷氨酰胺残基以防止在 该残基位置上的 N- 连接型碳水化合物的搭接。Fc 对于 FcRIII 的结合也涉及残基 297 处的 碳水化合物 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000))。因此， 去除碳水化合物应该会一 般性地减少包含重组 Fc7 的融合蛋白与 FcγR 的结合。与上面一样， Fc7 序列中的终止密 码子突变为 TAA。
     本发明也考虑这些分子的亮氨酸拉链形式。″亮氨酸拉链″是本领域的术语， 用来表示一种富含亮氨酸的序列， 其增强、 促进、 或驱动其融合配偶体 ( 例如， 亮氨酸拉链 与之融合或连接的序列或分子 ) 的二聚化或三聚化。现有技术已描述了多种亮氨酸拉链 多 肽。 参 见， 例 如， Landschulz 等 人， Science， 240 ： 1759(1988) ； 美 国 专 利 5,716,805 ； WO 94/10308 ； Hoppe 等人， FEBS Letters， 344 ： 1991(1994) ； Maniatis 等人， Nature， 341 ： 24(1989)。本领域技术人员将理解亮氨酸拉链序列可融合于本发明多肽的 5′或 3′端。
     融合蛋白的制备通常可使用标准技术， 包括化学缀合。融合蛋白也可在表达体系 中通过标准技术表达为重组蛋白质。合适的接头进一步在下文描述。
     接头可为天然存在的， 合成的， 或两者的组合。例如， 合成的接头可为随机化的接 头， 例如， 序列和尺寸都随机化。 在一方面， 随机化的接头可包含完全随机化的序列， 或任选
     地， 随机化的接头可基于天然接头序列。接头可包含， 例如， 非多肽部分 ( 例如多核苷酸 )、 多肽、 等。
     接头可为刚性的， 或者柔性的， 或两者的组合。 接头的柔性可以是接头和与接头相 互作用的亚单位两者的组成的函数。接头将两个选定的结合实体 ( 例如， 两个单独的多肽 或蛋白质， 如两个不同的抗体 ) 联接到一起， 并保持各实体为各别且离散的。该接头可允许 单独的、 离散的域的协作， 且保持各别的特性， 如对于多聚物中同一靶标的多个各别的结合 位点， 或者， 例如， 对于多聚物中不同靶标的多个各别的结合位点。 在一些情况下， 在两个连 接的结合实体之间， 或在接头和结合实体之间存在二硫桥。
     对于具体的要连接两个或多个结合实体的情况， 合适的接头的选择可取决于多个 参数， 包括例如结合实体的性质、 双特异性组合物结合的靶标的结构和性质、 和 / 或接头 ( 例如， 肽接头 ) 对蛋白水解和氧化的稳定性。
     特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸 (Gly)、 丝氨酸 (Ser)、 丙氨酸 (Ala) 和 苏氨酸 (Thr) 的氨基酸残基。例如， 肽接头可包含至少 75％ ( 基于肽接头中存在的残基总 数计算 )、 如至少 80％、 至少 85％、 或至少 90％的选自 Gly、 Ser、 Ala 和 Thr 的氨基酸残基。 该肽接头也可仅由 Gly、 Ser， Ala 和 / 或 Thr 残基组成。该接头多肽具有的长度应足以连 接两个结合实体， 使得它们采取相对彼此的正确构象以使它们保持所需的活性， 如结合靶 分子以及可其它能与这样的靶结合相关的活性 ( 例如， 对于给定生物分子的激动或拮抗活 性 )。
     适于该目的的合适长度是例如至少 1 个且通常少于约 50 个氨基酸残基的长度， 如 2-25 个氨基酸残基， 5-20 个氨基酸残基， 5-15 个氨基酸残基， 8-12 个氨基酸残基或 11 个残 基。其它合适的多肽接头尺寸可包括， 例如， 约 2 至约 15 个氨基酸， 约 3 至约 15 个、 约4至 约 12 个、 约 10 个、 约 8 个、 或约 6 个氨基酸。选择纳入接头多肽的氨基酸残基应显示以下 特性， 其不显著干扰多肽多聚物的活性或功能。 因此， 该肽接头从整体上说应不具有与多聚 物的活性或功能不一致的电荷， 不干扰内部折叠， 也不与一个或多个域中的氨基酸残基形 成会严重阻碍多聚物与所关注靶点的结合的键或其它相互作用。
     天然存在的以及人造的肽接头用于连接多肽成为新的连接的融合多肽的用途是 本 领 域 众 所 周 知 的 ( 参 见， 例 如， Hallewell 等 人， J.Biol.Chem.264， 5260-5268， 1989 ； Alfthan 等 人， Protein Eng.8， 725-731， 1995 ； Robinson and Sauer， Biochemistry 35， 109-116， 1996 ； Khandekar 等 人， J.Biol.Chem.272， 32190-32197， 1997 ； Fares 等 人， Endocrinology 139， 2459-2464， 1998 ； Smallshaw 等 人， Protein Eng.12， 623-630， 1999 ； 美国专利号 5,856,456)。
     广泛使用肽接头的一个实例是用于制备单链抗体， 其中轻链 (VL) 和重链 (VH) 的 可变区通过人造接头连接。在这个领域有大量的公开文献。一种广泛使用的肽接头是由 三个重复的 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 氨基酸序列 ((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO ： 73) 组成的 15 聚 物。 也已使用了其它接头， 还使用了噬菌体展示技术， 以及选择性传染噬菌体技术来多样化 和选择合适的接头序列 (Tang 等人， J.Biol.Chem.271， 15682-15686， 1996 ； Hennecke 等人， Protein Eng.11， 405-410， 1998)。肽接头已用于连接异源和同源二聚蛋白质 ( 如 T- 细胞 受体、 λCro 阻抑物、 P22 噬菌体 Arc 阻抑物、 IL-12、 TSH、 FSH、 IL-5 和干扰素 -γ) 中的各 个链。肽接头也已用于产生融合多肽。已使用多种接头， 在 Arc 阻抑物的情况下， 噬菌体展示已用于优化接头长度和组成以增加单链蛋白质的稳定性 ( 参见 Robinson 和 Sauer， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95， 5929-5934， 1998)。
     另 一 种 获 得 合 适 的 接 头 的 途 径 是 通 过 随 机 诱 变 来 优 化 简 单 的 接 头 ( 例 如， (Gly4Ser)n)。
     如上文讨论的， 通常优选肽接头具有至少一些柔性。因此， 在一些变化形式中， 肽 接头包含 1-25 个甘氨酸残基， 5-20 个甘氨酸残基， 5-15 个甘氨酸残基， 或 8-12 个甘氨酸残 基。特别合适的肽接头通常包含至少 50％的甘氨酸残基， 如至少 75％的甘氨酸残基。在一 些实施方案中， 肽接头仅包含甘氨酸残基。 在某些变化中， 该肽接头还包含甘氨酸之外的其 它残基。甘氨酸之外的优选残基包括 Ser， Ala 和 Thr， 特别是 Ser。
     在一些情况下， 向肽接头提供一些刚性是理想的或者是必须的。这可通过在肽接 头的氨基酸序列中包含脯氨酸残基而实现。 因此， 在另一实施方案中， 肽接头在肽接头的氨 基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如， 肽接头可具有这样的氨基酸序列， 其中至少 25％ ( 例如， 至少 50％或至少 75％ ) 的氨基酸残基为脯氨酸残基。在本发明一个具体的实 施方案中， 肽接头仅包含脯氨酸残基。
     在一些实施方案中， 修饰肽接头而引入包含供非多肽部分搭接的基团的氨基酸残 基。此类氨基酸残基的实例可为半胱氨酸或赖氨酸残基 ( 随后非多肽部分搭接于其上 )。 另一种备选方案是包括具有体内 N- 糖基化位点的氨基酸序列 ( 从而将糖部分 ( 体内 ) 连 接于肽接头 )。另一种选择是利用进化的 tRNAs 和 tRNA 合成酶 ( 参见， 例如， 美国专利申请 公开 2003/0082575) 遗传性地将非天然氨基酸掺入多肽结合实体或肽接头。例如， 酮-酪 氨酸的插入允许针对表达的多肽的位点特异性偶联。
     在某些变化形式中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基， 如一个半胱氨酸残基。 例 如， 在一些实施方案中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自 Gly， Ser， Ala 和 Thr 的 氨基酸残基。 在某些此类实施方案中， 肽接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基， 如仅有甘氨 酸残基和半胱氨酸残基。通常， 每个肽接头将仅包含一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残 基的具体肽接头的一个实例包括具有氨基酸序列 Glyn-Cys-Glym 的肽接头， 其中 n 和 m 各为 1-12 的整数， 例如， 3-9、 4-8、 或 4-7。
     如上所述， 本发明包括双特异性结合蛋白， 其包含 FGFR 和抗 VEGF-A 抗体的双特异 性抗体 / 可溶受体组合。在某些此类实施方案中， FGFR 和抗 VEGF-A 抗体共价连接 ( 例如， 通过肽接头 ) 以形成双特异性结合蛋白。在一些变化形式中， 该双特异性结合蛋白包含免 疫球蛋白重链恒定区， 例如， Fc 片段。特别合适的 Fc 片段包括， 例如， 包含修饰的 Fc 区以 减少或消除一种或多种效应物作用的 Fc 片段 ( 例如， Fc5， 具有 SEQ ID NO ： 74 所示的氨基 酸序列 )。
     例如， 在一些实施方案中， 根据本发明的减少 VEGF-A 和 FGF 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白包含如本文所述的抗 VEGF-A 抗体部分的结合区和 如本文所述的 FGFR3 的 FGF 结合部分。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为本文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 尤其是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体部 分和 VEGF-A 抗体部分的组合， 其中 FGF 受体部分为选自下组的 FGFR3 ： 如 SEQ ID NO ： 13 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)， 如 SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ：19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， 如 SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和如 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375) (P250R) ； 所 述 VEGF-A 抗 体 部 分 选 自 下 组 ： 如 SEQ ID NO ： 44 所 示 的 c870.1e6scFV， 如 SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， 如 SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和如 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合 部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 包 括 选 自 下 组 的 FGFR3 部 分 和 VEGF-A 抗 体 部 分 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W) Fc5c870e6pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包含 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分 和 VEGF-A 结 合 部 分， 所 述 FGF 结 合 部 分 为 选 自 下 组 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所 述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其 它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     III. 核酸， 宿主细胞， 和制备 VEGF-A 和 FGF 双特异性抗体 / 可溶受体组合蛋白的 方法
     本发明的可溶 FGFR 多肽可通过表达编码细胞外域或其部分的 DNA 制备。例如， 编 码包含 SEQ ID NO ： 13 的残基 36-388 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 FGFR3IIIc。 N- 端截 短的 FGFR3IIIc 可使用编码 SEQ ID NO ： 19 的残基 36-268 的多核苷酸。为制备 FGFR2IIIc， 可 使用编码 SEQ ID NO ： 24 的残基 36-391 的多核苷酸。在另一实例中， 编码包含 SEQ ID NO ： 37 的残基 36-268 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 N- 端截短的 FGFR2IIIc。优选该细胞外域多肽制备为基本上无跨膜和细胞内多肽区段的形式。为引导受体域从宿主细胞输出， 该 受体 DNA 连接至编码分泌肽的第二 DNA 片段， 如受体的天然信号序列。其它可使用的信号 序列包括 tPA 信号序列 ( 在以下实施例描述 )， CD33 信号序列或人生长激素信号序列。为 促进分泌的受体域的纯化， 可将 C- 端延伸物， 如多组氨酸标签、 物质 P、 FlagTM 肽 (Hopp 等 人， Biotechnology 6 ： 1204-1210， 1988 ； 获自 Eastman Kodak Co.， New Haven， CT) 或另一 有可用的抗体或特异性结合剂的多肽或蛋白质， 融合至受体多肽。
     本发明还包括编码本发明的抗体的重链和 / 或轻链的核酸。本发明的核酸包括这 样的核酸， 其具有与如上表 2 所列的编码 VL 和 / 或 VH 的多核苷酸基本相同的区域。本发明 的核酸还包括互补核酸。 在一些情况下， 当形成比对时， 各序列将是完全互补的 ( 无错配 )。 在其它情况下， 序列中可存在至多约 20％错配。 在本发明一些实施方案中， 提供了编码本发 明抗体的重链和轻链两者的核酸。 本文提供的核酸序列可使用密码子优化、 简并序列、 沉默 突变和其它 DNA 技术优化在特定宿主中表达后加以利用， 本发明涵盖这样的序列修饰。
     因此， 在一些方面， 本发明提供编码本文所述 FGFR 和 / 或 VEGF-A 抗体的一种或多 种多核苷酸 ( 例如， DNA 或 RNA)。在一些变化形式中， 本发明的多核苷酸编码结合并减少 FGF 和 VEGF-A 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白。本领域技术 人员将容易理解， 考虑到遗传密码的简并， 在这些多核苷酸分子中可能有大量的序列变化。
     本发明的核酸可克隆至载体中， 载体例如质粒， 粘粒， 杆粒 (bacmid)， 噬菌体， 人造 染色体 (BAC， YAC) 或病毒， 可向其中插入另一遗传序列或元件 (DNA 或 RNA) 以实现连接的 序列或原件的复制。在一些实施方案中， 该表达载体包含组成型活性启动子区段 ( 例如但 不限于 CMV， SV40， 延伸因子或 LTR 序列 ) 或诱导型启动子序列， 如类固醇可诱导的 pIND 载 体 (Invitrogen)， 在那里核酸的表达可被调节。 本发明的表达载体可进一步包括调节序列， 例如， 内部核糖体进入位点。该表达载体可通过例如转染被引入细胞。
     因此， 用于本发明中的蛋白质可根据常规技术在遗传工程化的宿主细胞中产生。 合适的宿主细胞为可用外源性 DNA 转化或转染且生长在培养物中的细胞类型， 包括细菌， 真菌细胞， 和培养的高等真核细胞 ( 包括培养的多细胞有机体的细胞 )， 特别是培养的哺乳 动物细胞。处理克隆 DNA 分子和向多种宿主细胞引入外源 DNA 的技术公开于 Sambrook 等 人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989)， 和 Ausubel 等人， 上文。
     通常， 在表达载体内， 编码感兴趣蛋白质的 DNA 序列可操作连接于其表达所需的 其它遗传元件， 通常包括转录启动子和终止子。该载体通常还包含一个或多个选择标记和 一个或多个复制起点， 不过， 本领域技术人员知道在某些体系内选择标记可提供在另外的 载体上， 且外源 DNA 的复制可通过整合至宿主细胞基因组中而提供。启动子、 终止子、 选择 标记、 载体和其它元件的选择是本领域常规技术的水平内的常规设计。许多这样的元件描 述于文献中且可获自商业供应者。
     为将重组蛋白质导向至宿主细胞的分泌途径， 在表达载体中提供分泌信号序列 ( 也称为前导序列， 前原序列或前序列 )。该分泌信号序列可为重组蛋白质的天然形式的， 或可衍生自另一分泌的蛋白质 ( 例如， t-PA ； 参见美国专利号 5,641,655) 或从头合成。该 分泌信号序列可操作连接至编码蛋白质的 DNA 序列， 即， 该两个序列在正确的读框中连接 并定位以将新合成的多肽引导至宿主细胞的分泌途径。 分泌信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的 DNA 序列的 5’ ， 但某些信号序列可位于感兴趣的 DNA 序列中的其它位置 ( 参见， 例 如， Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； Holland 等人， 美国专利号 5,143,830)。在具体的 变化形式中， 根据本发明使用的分泌信号序列具有选自下组的氨基酸序列 ： SEQ ID NOS ： 2， 10， 13， 15， 19， 22， 24， 29， 33， 37， 40， 42， 58， 60， 62 和 64 的残基 1-35。
     培养的哺乳动物细胞为制备用于本发明的重组蛋白质的合适的宿主。向哺乳动 物宿主细胞引入外源 DNA 的方法包括磷酸钙 - 介导的转染 (Wigler 等人， Cell 14 ： 725， 1978 ； Corsaro 和 Pearson， Somatic Cell Genetics 7 ： 603， 1981 ： Graham 和 Van der Eb， Virology 52 ： 456， 1973)， 电穿孔 (Neumann 等人， EMBO J.1 ： 841-845， 1982)， DEAE- 葡聚糖 介导的转染 (Ausubel 等人， 上文 )， 和脂质体介导的转染 (Hawley-Nelson 等人， Focus 15 ： 73， 1993 ； Ciccarone 等人， Focus 15 ： 80， 1993)。 重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的制备 公开于， 例如， Levinson 等人， 美国专利号 4,713,339 ； Hagen 等人， 美国专利号 4,784,950 ； Palmiter 等人， 美国专利号 4,579,821 ； 和 Ringold， 美国专利号 4,656,134。合适的哺乳动 物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞 (Vero ； ATCC CRL 1587)， 人胚胎肾细胞 (293-HEK ； ATCC CRL 1573)， 幼仓鼠肾细胞 (BHK-21， BHK-570 ； ATCC CRL 8544， ATCC CRL 10314)， 犬肾细胞 (MDCK ； ATCC CCL 34)， 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-K1 ； ATCC CCL61 ； CHO DG44 ； CHO DXB11(Hyclone， Logan， UT) ； 另参见， 例如， Chasin 等人， Som.Cell.Molec.Genet.12 ： 555， 1986))， 大鼠垂体细胞 (GH1 ； ATCC CCL82)， HeLa S3 细胞 (ATCC CCL2.2)， 大鼠肝癌细胞 (H-4-II-E ； ATCC CRL 1548)SV40- 转化的猴肾细胞 (COS-1 ； ATCC CRL 1650) 和鼠胚胎细胞 (NIH-3T3 ； ATCC CRL 1658)。 其他合适的细胞系是本领域已知的， 并且可以从公共保藏机构 如 American Type Culture Collection， Manassas， Virginia 获得。可使用强的转录启动 子， 如 SV-40 或巨细胞病毒的启动子。参见， 例如， 美国专利号 4,956,288。其它合适的启动 子包括来自金属硫蛋白基因的启动子 ( 美国专利 4,579,821 和 4,601,978) 和腺病毒主要 晚期启动子。
     药物选择通常用于选出已插入外源 DNA 的培养的哺乳动物细胞。这样的细胞通常 称为 “转染子” 。 在选择性试剂的存在下培养且能将感兴趣的的基因传至其后代的细胞称为 “稳定的转染子” 。示例性的选择标记包括编码对抗生素新霉素的抗性的基因， 其允许在新 霉素型药物如 G-418 等的存在下进行选择 ； 黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的 gpt 基因， 其允许宿主细胞在霉酚酸 / 黄嘌呤的存在下生长 ； 和提供对 zeocin， 博来霉素， 杀稻瘟素 (blastocidin)， 和潮霉素的抗性的标记 ( 参见， 例如， Gatignol 等人， Mol.Gen.Genet.207 ： 342， 1987 ； Drocourt 等人， Nucl.Acids Res.18 ： 4009， 1990)。选择系统也可用于增加感兴 。 扩增通过以下方式进行， 在低水平的选择剂的存在 趣基因的表达水平， 该过程称为 “扩增” 下培养转染子， 然后增加选择剂的量以选择出产生高水平的引入的基因的产物的细胞。可 扩增的选择标记的实例为二氢叶酸还原酶， 其赋予对甲氨蝶呤的抗性。其它药物抗性基因 ( 例如， 潮霉素抗性， 多药抗性， 嘌呤霉素乙酰基转移酶 ) 也可使用。
     其它高等真核细胞也可用作宿主， 包括昆虫细胞、 植物细胞和禽类细胞。 毛根土壤 杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 在植物细胞中作为用于表达基因的载体的用途已描述 于 Sinkar 等人， J.Biosci.(Bangalore)11 ： 47-58， 1987。昆虫细胞的转化和其中外源多肽 的产生公开于 Guarino 等人， 美国专利号 5,162,222 和 WIpO 公开 WO 94/06463。
     昆 虫 细 胞 可 被 通 常 衍 生 自 苜 蓿 丫 纹 夜 蛾 (Autographa californica) 核 型多 角 体 病 毒 (AcNPV) 的 重 组 杆 状 病 毒 感 染。 参 见 King 和 Possee， The Baculovirus Expression System ： A Laboratory Guide(Chapman & Hall， London) ； O’ Reilly 等 人， Baculovirus Expression Vectors ： A Laboratory Manual(Oxford University Press.， New York 1994) ； 和 Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology(Richardson ed.， Humana Press， Totowa， NJ， 1995)。重组杆状病毒也可通过使 用描述于 Luckow 等人 (J.Virol.67 ： 4566-4579， 1993) 的基于转座子的体系制备。这种 系统使用转移载体， 可以试剂盒的形式商购 (BAC-TO-BAC 试剂盒 ； Life Technologies， Gaithersburg， MD)。转移载体 ( 例如， PFASTBAC1 ； Life Technologies) 包含 Tn7 转座子， 以将编码感兴趣蛋白质的 DNA 移至作为大质粒 ( 称为 “杆粒” ) 保持在大肠杆菌中的杆状 病毒基因组中。参见 Hill-Perkins 和 Possee， J.Gen.Virol.71 ： 971-976， 1990 ； Bonning 等人， J.Gen.Virol.75 ： 1551-1556， 1994 ； 和 Chazenbalk 和 Rapoport， J.Biol.Chem.270 ： 1543-1549， 1995。此外， 转移载体可包括与上述编码多肽延伸物或亲和标签的 DNA 的合框 融合。使用本领域已知的技术， 将包含编码蛋白质的 DNA 序列的转移载体转化到大肠杆菌 宿主细胞中， 并从细胞中筛选包含断裂的 lacZ 基因 ( 其是重组杆状病毒的指示 ) 的杆粒。 使用一般技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒 DNA， 并用其转染草地贪夜蛾细胞， 如 Sf9 细胞。随后制备表达感兴趣蛋白质的重组病毒。重组病毒株通过本领域通常使用的方 法制备。 对 于 蛋 白 质 制 备， 重 组 病 毒 用 于 感 染 宿 主 细 胞， 通常为衍生自草地贪夜蛾 (Spodoptera fugiperda) 的 细 胞 系 ( 例 如， Sf9 或 Sf21 细 胞 ) 或 衍 生 自 粉 纹 夜 蛾 (Trichoplusia ni) 的细胞系 ( 例如， HIGH FIVE 细胞 ； Invitrogen， Carlsbad， CA)。一般 参 见 Glick 和 Pasternak， Molecular Biotechnology， Principles & Applications of Recombinant DNA(ASM Press， Washington， D.C.， 1994)。 也参见美国专利号 5,300,435。 无 血清培养基用于培养和保持细胞。合适的培养基制剂是本领域已知的且可获自供应商。细 胞从约 2-5x 105 细胞的接种密度生长至 1-2x 106 细胞的密度， 此时添加重组病毒株， 其感 染复数 (MOI) 为 0.1 至 10， 更典型接近 3。使用的步骤通常描述于可用的实验室手册 ( 参 见， 例如， King 和 Possee， 上文 ； O’ Reilly 等人， 上文 ； Richardson， 上文 )。
     真菌细胞， 包括酵母细胞， 也可用于本发明。 在这方面感兴趣的酵母物种包括酿酒 酵母， 毕赤酵母 (Pichia pastoris)， 和甲醇毕赤酵母。用外源 DNA 转化酿酒酵母细胞和由 此制备重组多肽的方法公开于， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kawasaki 等人， 美 国专利号 4,931,373 ； Brake， 美国专利号 4,870,008 ； Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； 通常是药物抗 和 Murray 等人， 美国专利号 4,845,075。依据由选择标记所确定的表型， 性、 或在特定营养素 ( 例如， 亮氨酸 ) 不存在的情况下生长的能力， 来选择转化的细胞。用 于酿酒酵母的载体系统的实例为 Kawasaki 等人 ( 美国专利号 4,931,373) 公开的 POT1 载体系统， 其允许通过含葡萄糖的培养基中培养来选择转化的细胞。用于酵母的合适的 启动子和终止子包括源自糖酵解酶基因 ( 参见， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kingsman 等人， 美国专利号 4,615,974 ； 和 Bitter， 美国专利号 4,977,092) 和醇脱氢酶基 因的那些。另参见美国专利号 4,990,446 ； 5,063,154 ； 5,139,936 ； 和 4,661,454。其它酵 母的转化体系， 包括多形汉逊酵母， 粟酒裂殖酵母， 乳酸克鲁维酵母， 脆壁克鲁维酵母， 玉米 黑粉菌 (Ustilago maydis)， 巴斯德毕赤酵母， 甲醇毕赤酵母， 季也蒙毕赤酵母， 和麦芽糖
     假丝酵母是本领域已知的。参见， 例如， Gleeson 等人， J.Gen.Microbiol.132 ： 3459-3465， 1986 ； Cregg， 美国专利号 4,882,279 ； 和 Raymond 等人， Yeast 14 ： 11-23， 1998。曲霉细胞 可根据 McKnight 等人， 美国专利号 4,935,349 的方法使用。转化产黄顶孢霉 (Acremonium chrysogenum) 的方法公开于 Sumino 等人， 美国专利号 5,162,228。转化链孢霉的方法公开 于 Lambowitz， 美国专利号 4,486,533。在甲醇毕赤酵母中制备重组蛋白质公开于美国专利 5,716,808 ； 5,736,383 ； 5,854,039 ； 和 5,888,768。
     原核宿主细胞， 包括细菌大肠杆菌、 芽孢杆菌属、 和其它属也是本发明中可用的宿 主细胞。转化这些宿主和表达其中克隆的外源 DNA 序列的技术是本领域已知的 ( 参见， 例 如， Sambrook 等人， 上文 )。当在细菌如大肠杆菌中表达重组蛋白质时， 该蛋白质可保持在 细胞质中， 通常作为不可溶颗粒， 或可通过细菌分泌序列导至周质空间。在前一情形， 将细 胞溶解， 回收颗粒并使用例如胍异硫氰酸酯或脲使其变性。然后变性的蛋白质可通过稀释 变性剂 ( 例如， 通过对脲与还原型和氧化型的谷胱甘肽的组合的溶液透析， 然后对缓冲盐 水溶液透析 ) 而重折叠和二聚化。或者， 该蛋白质可以可溶形式从细胞质回收， 并在不使 用变性剂的情况下分离。蛋白质作为水提取物 ( 例如磷酸盐缓冲盐水中的水提取物 ) 从 细胞回收。为了捕捉感兴趣的蛋白质， 将提取物直接施加至色谱介质， 如固定的抗体或肝 素 -Sepharose 柱。分泌的蛋白质可以以可溶的、 有功能的形式从周质空间回收， 方法是破 裂细胞 ( 通过， 例如， 超声处理或渗透压冲击 ) 以释放周质空间的内含物和回收蛋白质， 从 而无需变性和重折叠。 抗体， 包括单链抗体， 可在细菌宿主细胞中根据已知方法制备。 参见， 例如， Bird 等人， Science 242 ： 423-426， 1988 ； Huston 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5879-5883， 1988 ； 和 Pantoliano 等人， Biochem.30 ： 10117-10125， 1991。
     转化或转染的宿主细胞根据常规步骤在含营养素和所选宿主细胞的生长所需的 其它组分培养基中培养。 多种合适的培养基， 包括确定成分培养基和复合培养基， 是本领域 已知的， 且通常包括碳源、 氮源， 必需氨基酸， 维生素和矿物质。 培养基可按需要包含生长因 子或血清之类的成分。生长培养基通常会选择包含外源添加的 DNA 的细胞， 例如通过药物 选择或必须营养素的缺乏， 该必须营养素通过表达载体携带的或者共转染到宿主细胞中的 选择标记补充。
     包 含 VEGF-A 抗 体 / 可 溶 FGF 受 体 双 特 异 性 结 合 蛋 白 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 通 过 常 规 蛋 白 质 纯 化 方 法 纯 化， 通 常 通 过 色 谱 技 术 的 组 合 纯 化。 一 般 参 见 Affinity Chromatography ： Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology， Uppsala ，Sweden ， 1988) ； Scopes ，Protein Purification ： Principles and Practice(Springer-Verlag， New York 1994)。包含免疫球蛋白重链多肽的蛋白质可通过 亲和色谱法在固定的蛋白质 A 上纯化。可采用进一步的纯化步骤， 如凝胶过滤， 来获得所需 水平的纯度或提供脱盐， 缓冲液交换等。
     抗体可从细胞培养基通过已知方法， 如亲和色谱法使用常规柱和其它设备纯化。 在典型的程序中， 收集条件化培养基， 且可将其在 4℃储存至多 5 天。 为避免污染， 通常添加 抑菌剂 ( 例如， 叠氮化钠 )。降低培养基的 pH( 通常至 Ph ～ 5.5)， 如通过滴加冰醋酸。较 低的 pH 提供通过蛋白 G 树脂的最佳的 IgG 俘获。该蛋白质 G 柱的尺寸基于条件化培养基 的体积确定。用合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2 中和填充好的柱子。然 后使培养基通过中和的蛋白质 g 树脂， 流速由培养基体积和柱尺寸确定。保留穿透液以备可能的再次过柱。然后将具有俘获的抗体的树脂冲洗成中和缓冲液。使用酸性洗脱缓冲 液， 如 0.1M 甘氨酸， pH 2.7 或等价物将柱子洗脱为级分。中和各级分， 例如使用 2M tris， pH 8.0， 以 tris ∶甘氨酸的 1 ∶ 20 比例。汇集包含蛋白质的级分 ( 例如， 基于 A280)。汇集 的级分使用脱盐柱缓冲液交换至合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2。通过 A280 使用消光系数 1.44 测定浓度。内毒素水平可通过 LAL 测定法确定。纯化蛋白质可冷冻 储存， 通常在 -80℃。
     表达功能性 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的细胞在筛选测定中 使用。多种合适的测定是本领域已知的。这些测定基于对靶细胞中生物响应的检测。一 种这样的测试为细胞增殖测试。在存在或不存在测试化合物的情况下培养细胞， 且通过， 例如， 测量氚化的胸苷的掺入或通过基于 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四唑 鎓溴化物 (MTT) 的代谢分解的比色测定细胞增殖 (Mosman， J.Immunol.Meth.65 ： 55-63， 1983) 检测。一种备选的测定法形式使用进一步工程化以表达报道基因的细胞。该报道基 因连接于对受体连接的途径响应的启动子元件， 该测定法检测该报道基因的转录的活化。 在此方面， 优选的启动子元件为血清响应元件， 或称 SRE。( 参见， 例如， Shaw 等人， Cell 56 ： 563-572， 1989)。优选的该报道基因是荧光素酶基因。( 参见 de Wet 等人， Mol.Cell. Biol.7 ： 725， 1987.)。使用本领域已知方法通过发光检测荧光素酶基因的表达。( 参见， 例 如， Baumgartner 等 人， J.Biol.Chem.269 ： 29094-29101， 1994 ； Schenborn 和 Goiffin， Promega Notes 41 ： 11， 1993.)。荧光素酶活性测定试剂盒可购自， 例如， Promega Corp.， Madison， WI。该类型的靶细胞系可用于筛选化学物质库， 细胞条件化的培养基， 真菌培养 液， 土壤样， 水样， 等。 例如， 可在靶细胞上测定细胞条件化的培养基样品的库以鉴别产生配 体的细胞。 然后用阳性细胞在哺乳动物表达载体中产生 cDNA 文库， 将文库分池 (pools)， 转 染到宿主细胞中， 表达。 然后测定转染的细胞的培养基样品， 随后进一步分池， 再转染， 传代 培养， 且重新测定阳性细胞以分离编码配体的克隆 cDNA。
     IV. 治疗方法
     A. 概述
     在另一方面， 本发明提供抑制血管发生的方法， 特别是治疗与血管发生相关的疾 病或疾患的方法。一般而言， 该方法包括向受试者施用可有效抑制血管发生的量的包含双 特异性抗体 / 可溶受体组合的双特异性结合蛋白。更具体地， 对于治疗用途， 将该双特异性 结合蛋白施用于患有， 或有升高的风险患上以血管发生增加为特征的疾病或疾患 (“新生 血管疾病” ) 的患者。适合根据本发明治疗的新生血管疾病包括， 例如， 以实体瘤生长为特 征的癌症 ( 例如， 胰腺癌， 肾细胞癌 (RCC)， 结肠直肠癌， 非小细胞肺癌 (NSCLC)， 成胶质细 胞瘤， 和胃肠道间质瘤 (GIST)) 以及多种新生血管眼病 ( 例如， 年龄相关的黄斑变性， 糖尿 病性视网膜病， 虹膜新生血管形成， 和新生血管性青光眼 )。其它适合根据本发明治疗的新 生血管疾病包括， 例如， 类风湿性关节炎， 银屑病， 动脉粥样硬化， 慢性炎症， 肺炎症， 先兆子 痫， 心包渗漏 ( 如与心包炎相关的 )， 和胸腔积液。
     在本文所述治疗方法的每一实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的递送方式符合与寻求治疗的疾病 或疾患的管理相关的常规方法学。根据本文的公开， 在足以预防或治疗疾病或疾患的条件 下、 以足以预防或治疗疾病或疾患的时间向需要该治疗的受试者施用有效量的拮抗剂。施用本文描述的双特异性结合蛋白的受试者包括有较高的风险发生特定的与血 管发生相关的疾病或疾患的患者， 也包括表现出现有的新生血管疾病的患者。在某些实施 方案中， 该受试者已诊断为患有寻求治疗的疾病或疾患。 而且， 可在治疗过程中监测受试者 任何疾病或疾患的变化 ( 例如， 监测疾病或疾患的临床症状的增加或减少 )。
     在预防性的应用中， 将药物组合物或药物施用于对特定疾病易感或具有其他风险 的患者， 施用的量足以消除或减少疾病的风险或延迟疾病的发生。 在治疗性的应用中， 将组 合物或药物施用于疑似患有， 或已患有该疾病的患者， 施用的量足以治愈， 或至少部分阻止 该疾病症状及其并发症。足以实现该目的的量称为治疗有效量或药物有效量。在预防和治 疗方案两者中， 药物通常施用多个剂量直到达到充分的响应 ( 例如， 抑制不合适的血管发 生活性 )。通常， 监测该响应， 如果期望响应开始消退则给予重复的剂量。
     为鉴别用于根据本发明的方法治疗的受试患者， 可使用公认的筛选方法来确定 与特定的新生血管疾病相关的风险因素或确定受试者中确认的已有疾病的状态。这样的 方法可包括， 例如， 确定个体是否有亲属被诊断有特定疾病。筛选方法还可包括， 例如， 对 已知具有可遗传的成分的具体疾病进行常规病情检查以确定家族状态。例如， 多种癌症 还已知具有某些可遗传的成分。癌症的可遗传的成分包括， 例如， 多种转化中的基因 ( 例 如， Ras， Raf， EGFR， cMet， 及其他 ) 内的突变， 某些 HLA 和杀伤抑制性受体 (KIR) 分子的有 无， 或癌细胞能直接或间接调节细胞如 NK 细胞和 T 细胞的免疫抑制的机理 ( 参见， 例如， Ljunggren 和 Malmberg， Nature Rev.Immunol.7 ： 329-339， 2007 ； Boyton 和 Altmann， Clin. Exp.Immunol.149 ： 1-8， 2007)。 为此目的， 可常规性地使用核苷酸探针鉴定携带与感兴趣的 具体疾病相关的遗传标记的个体。 此外， 很多种免疫方法是本领域已知的， 可用于鉴别特定 疾病的标记。例如， 有多种 ELISA 免疫测定方法可以使用， 且为本领域公知， 这些方法使用 单克隆抗体探针检测与特定肿瘤相关的抗原。 可按照已知的患者症状， 年龄因素， 相关风险 因素等的指示来实施筛选。 这些方法允许临床医师常规地选择需要本文所述治疗方法的患 者。根据这些方法， 血管发生的抑制可作为独立治疗过程进行， 或作为其它治疗的后续的、 辅助的、 或协同的治疗方案。
     对于施用， 该包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白配制为药物组合物。 包含双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合的药物组合物可根 据已知方法配制以制备可药用组合物， 其中将治疗分子与可药用的载体组合为混合物。如 果组合物的施用可被接受的患者耐受， 则其称为 “可药用的载体” 。无菌磷酸盐缓冲盐水为 可药用的载体的一个实例。其它合适的载体是本领域技术人员众所周知的。( 参见， 例如， Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995))。制剂可进一步包括一种或多种赋形剂， 防腐剂， 增溶剂， 缓冲剂， 用于防止小瓶 表面上蛋白质损失的白蛋白等。单特异性拮抗剂可单独配制或以组合制剂提供。
     包含含有 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的 药物组合物以有效量施用于受试者。根据本发明的方法， 拮抗剂可通过多种施用方式施用 于受试者， 包括例如， 肌内， 皮下， 静脉内， 心房内， 关节内， 肠胃外， 鼻内， 肺内， 经皮， 胸膜 内， 鞘内， 和口腔施用途径。对于治疗新生血管眼病的药物用途， 该双特异性结合蛋白通常 根据常规方法配制为用于玻璃体内注射。对于治疗和预防目的， 拮抗剂可以以下方式施用 于受试者 ： 单次推注递送、 长时间连续递送 ( 例如， 连续经皮递送 )， 或以重复的施用方案( 例如， 基于每小时， 每日， 或每周 )。
     组合物的 “治疗有效量” 是产生统计学显著效果的量， 如疾病进展的统计学显著减 少或器官功能的统计学显著改善。精确剂量将通过临床医师根据公认的标准确定， 其中考 虑治疗症状的性质和严重性、 患者特征等。剂量的确定在本领域技术人员水平范围内。
     此语境中有效剂量的确定通常基于动物模型研究， 然后是人体临床试验， 并通过 确定可显著减少模型受试者中受试者疾病或疾患的发生或严重性的有效剂量和施用方案 来指导。本发明的组合物的有效剂量根据多种不同的因素改变， 包括施用手段， 靶位点， 患 者生理状态， 患者为人还是动物， 施用的其它药物， 该治疗为预防性还是治疗性， 以及组合 物本身具体活性及其在个体中引起所需响应的能力。通常， 该患者是人， 但在一些疾病中， 该患者可为非人哺乳动物。通常， 对剂量方案进行调节以提供最佳治疗响应， 即， 优化安全 性和功效。 因此， 治疗性或预防性有效量也是这样的量， 其中抑制血管发生的有利作用大于 任何不想要的副作用。 对于施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白， 剂量通常为约 0.1μg 至 100mg/kg 或 1μg/kg 至约 50mg/kg， 更通常为 10μg 至 5mg/kg 受试者体重。 在更具体的实施方案中， 药物的有效量为约 1μg/kg 至约 20mg/kg， 约 10μg/kg 至约 10mg/kg， 或约 0.1mg/kg 至约 5mg/kg。该范围的剂量可通过单一或多次 施用实现， 包括， 例如， 每日施用多次或每日、 每周、 每两周或每月施用一次。 例如， 在某些变 化形式中， 施用方案由初始施用和之后的间隔一周或两周的多次施用组成。另一方案由初 始施用和之后的间隔一月或两月的多次施用组成。 或者， 施用可以是不规则的， 通过监测 NK 细胞活性和 / 或疾病或疾患的临床症状来指示。
     药物组合物的剂量可由主治医师加以改变以保持靶位处所需的浓度。例如， 如果 选择静脉内递送模式， 靶组织处血流中药物的局部浓度可为约 1-50 纳摩尔组合物 / 升， 有 时为约 1.0 纳摩尔 / 升至 10， 15， 或 25 纳摩尔 / 升， 取决于受试者的状态和预计的测量响 应。可基于递送方式 ( 例如是经表皮递送还是递送至粘膜的表面 ) 选择较高或较低浓度。 剂量也应基于施用的制剂 ( 例如， 鼻喷雾剂对粉末， 缓释口服或注射颗粒， 经皮制剂等 ) 的 释放速率而调节。为达到相同的血清浓度水平， 例如， 释放速率为 5 纳摩尔 ( 标准条件下 ) 的缓慢释放颗粒的施用剂量为释放速率为 10 纳摩尔的颗粒的剂量的约两倍。
     包括含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的药物 组合物可以以液体形式、 喷雾剂或固体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液、 气雾剂、 滴液、 表面用溶液和口服悬液。示例性的固体形式包括胶囊、 片剂和控释形式。后一形式的 示例有微渗透压泵和植入物。 ( 参见， 例如， Bremer 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 239， 1997 ； Ranade， Drug Delivery Systems 95-123 中的 “Implants in Drug Delivery， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Bremer 等人， Protein Delivery ： Physical Systems 239-254 中的 “Protein Delivery with Infusion Pumps， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Yewey 等 人， Protein Delivery ： Physical Systems 93-117 中 的 “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant， ” (Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997))。其它固体形式包括乳膏， 糊剂， 其它表面敷剂等。
     脂质体提供了一种手段来向受试者递送治疗多肽， 例如， 静脉内递送， 向腹膜 内递送， 鞘内递送， 肌内递送， 皮下递送， 或通过口服施用、 吸入、 或鼻内施用递送。脂 质体为微囊泡， 其由围绕着水性隔室的一个或多个脂质双层组成。( 参见， 一般性的，Bakker-Woudenberg 等 人， Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1) ： S61， 1993 ； Kim， Drugs 46 ： 618， 1993 ； Ranade， Drug Delivery Systems 3-24 中 的 “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers， ” (Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995))。脂质体的组成与细胞膜相似， 因此， 脂质体可安全施用且生物可降解。取决于制备 方法， 脂质体可为单层的或多层的， 且脂质体的尺寸可变化， 直径从 0.02μm 至大于 10μm 不等。 多种试剂可包囊在脂质体中 ： 疏水试剂分配在双层中， 而亲水性试剂分配在内部水性 空间中。( 参见， 例如， Machy 等人， Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987) ； Ostro 等人， American J.Hosp.Pharm.46 ： 1576， 1989)。 而且， 可通过改变脂 质体尺寸、 双层的数量、 脂质组成、 以及脂质体的电荷和表面特征来控制包囊的试剂的治疗 可利用度 (therapeutic availability)。
     脂质体可吸附至几乎任何类型的细胞， 然后缓慢释放包囊的试剂。 或者， 吸附的脂 质体可被吞噬性的细胞内吞。 内吞作用之后发生脂质体脂质的溶酶体内降解和包囊的试剂 的释放 ( 参见 Scherphof 等人， Ann.N.Y.Acad.Sci.446 ： 368， 1985)。静脉内施用后， 小的脂 质体 (0.1 至 1.0μm) 通常被主要位于肝和脾中网状内皮系统的细胞所摄取， 而大于 3.0μm 的脂质体沉积在肺中。 网状内皮系统的细胞对较小脂质体的这种优先吸收作用已经被利用 来将化学治疗剂递送至巨噬细胞和肝的肿瘤。 可通过多种方法避开网状内皮系统， 包括用大剂量的脂质体颗粒饱和， 或通过药 理手段选择性地对巨噬细胞灭活 ( 参见 Claassen 等人， Biochim.Biophys.Acta 802 ： 428， 1984)。 此外， 已显示将用糖脂或聚乙二醇衍生化的磷脂掺入脂质体膜可导致网状内皮系统 的吸收显著减少 ( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1068 ： 133， 1991 ； Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     也可在制备脂质体时通过改变磷脂组成或向脂质体插入受体或反受体 (counter-receptors) 以靶向特定细胞或器官。例如， 制备为带有高含量非离子表面活性 剂的脂质体已被用于靶向肝。( 参见， 例如， Hayakawa 等人的日本专利 04-244,018 ； Kato 等人， Biol.Pharm.Bull.16 ： 960， 1993)。这些制剂通过以下方式制备 ： 在甲醇中混合大豆 磷脂酰胆碱、 α- 生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油 (HCO-60)， 真空浓缩该混合物， 然后用水复 原该混合物。二棕榈酰基磷脂酰胆碱 (DPPC) 和大豆衍生的甾酰基葡糖苷混合物 (SG) 和胆 固醇 (Ch) 的脂质体制剂已显示靶向肝。( 参见 Shimizu 等人， Biol.Pharm.Bull.20 ： 881， 1997)。
     或者， 可将多种靶向性反受体连接于脂质体的表面， 如抗体， 抗体片段， 碳水化合 物， 维生素， 和转运蛋白。例如， 为了靶向肝脏， 可用支链型的半乳糖基脂质衍生物修饰脂 质体以靶向脱唾液酸糖蛋白 ( 半乳糖 ) 受体， 此类受体仅在肝细胞表面表达。( 参见 Kato 和 Sugiyama， Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14 ： 287， 1997 ； Murahashi 等 人， Biol. Pharm.Bull.20 ： 259， 1997)。根据一种更通用的组织靶向方法， 用对靶细胞表达的反受体 特异的生物素化抗体预先标记靶细胞。( 参见 Harasym 等人， Adv.Drug Deliv.Rev.32 ： 99， 1998)。血浆清除游离抗体后， 施用链亲和素缀合的脂质体。在另一方法中， 将靶向性抗体 直接连接至脂质体。( 参见 Harasym 等人， 上文 )。
    多 肽 和 抗 体 可 使 用 蛋 白 质 微 囊 化 的 标 准 技 术 包 封 在 脂 质 体 中。( 参 见， 例 如， Anderson 等 人， Infect.Immun.31 ： 1099， 1981 ； Anderson 等 人， Cancer Res.50 ：
     1853， 1990 ； Cohen 等 人， Biochim.Biophys.Acta 1063 ： 95， 1991 ； Alving 等 人 Liposome Technology(Vol.III)317 中的 “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies， ” (Gregoriadis， ed.， CRC Press， 2nd ed.1993) ； Wassef 等人， Meth.Enzymol.149 ： 124， 1987.)。如上所述， 治疗上有用的脂质体可包含多种组分。例如， 脂质体可包含聚 ( 乙 二醇 ) 的脂质衍生物。( 参见 Allen 等人， Biochim.Biophys.Acta 1150 ： 9， 1993)。
     已设计了可降解聚合物微球以保持治疗蛋白质的高全身水平。 微球从可降解聚合 物制备， 如丙交酯乙交酯共聚物 (PLG)， 聚酸酐， 聚 ( 原酸酯 )， 非生物可降解的乙基乙酸乙 烯酯聚合物， 其中蛋白质圈闭在聚合物中。( 参见， 例如， Gombotz 和 Pettit， Bioconjugate Chem.6 ： 332， 1995 ； Ranade， “Role of Polymers in Drug Delivery， ” in Drug Delivery Systems 51-93(Ranade 和 Hollinger， eds.， CRC Press 1995) ； Roskos and Maskiewicz， “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery， ” in Protein Delivery ： PhysicalSystems 45-92(Sanders 和 Hendren， eds.， Plenum Press 1997) ； Bartus 等人， Science 281 ： 1161， 1998 ； Putney and Burke， Nature Biotechnology 16 ： 153， 1998 ； Putney， Curr..Opin.Chem.Biol.2 ： 548， 1998)。聚乙二醇 (PEG) 包被的纳米球 也可提供静脉内施用治疗蛋白质的载体。( 参见， 例如， Gref 等人， Pharm.Biotechnol.10 ： 167， 1997)。
     本领域技术人员可设计其它剂型， 例如可见， Ansel 和 Popovich， Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lea & Febiger ， 5th ed.1990) ； Gennaro(ed.)， Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 19th ed.1995)， 和 Ranade 和 Hollinger， Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)。
     本文所述的药物组合物也可在联合治疗的背景下使用。术语 “联合治疗” 在本文 使用时， 是指对受试者施用至少一个治疗有效剂量的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特 异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和另一治疗剂。 例如， 在癌症免疫治疗的背景下， 包含含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组合物可用作血管发 生抑制剂与化疗或放射联合。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白可与常规类型的化疗或放射协同作用。 该双特异性结合蛋白可进一步减少肿 瘤负担并可使得化疗剂的杀灭作用更有效。
     显示血管发生抑制活性的本发明的组合物也可与免疫调节化合物 ( 包括多种细 胞因子和共刺激 / 抑制分子 ) 联合使用。它们可包括， 但不限于， 使用刺激抗癌免疫应答 的细胞因子。例如， 组合使用 IL-2 和 IL-12 在 T- 细胞淋巴瘤， 鳞状上皮细胞癌， 和肺癌中 显示有益作用。( 参见 Zaki 等人， J.Invest.Dermatol.118 ： 366-71， 2002 ； Li 等人， Arch. Otolaryngol.Head Neck Surg.127 ： 1319-24， 2001 ； Hiraki 等人， Lung Cancer 35 ： 329-33， 2002)。 此外， VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白可与共刺激基于免疫的效应细 胞上发现的多种细胞表面分子的试剂组合， 如 CD137 的活化。( 参见 Wilcox 等人， J.Clin. Invest.109 ： 651-9， 2002) 或 CTLA4 的抑制 (Chambers 等人， Ann.Rev.Immunol.19 ： 565-94， 2001)。或者， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可 与通过与 TRAIL- 相关的受体的相互作用诱导肿瘤细胞凋亡的试剂一起使用。 ( 参见， 例如， Takeda 等人， J.Exp.Med.195 ： 161-9， 2002 ； Srivastava， Neoplasia 3 ： 535-46， 2001)。这 样的试剂包括 TRAIL 配体， TRAIL 配体 -Ig 融合物， 抗 TRAIL 抗体， 等。在其它变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与不特异靶向血管发生的单克隆抗体治疗联合使用。 该联合治疗特别用于治疗 癌症， 其中使用单克隆抗体， 特别是针对肿瘤表达的抗原的抗体， 正在成为对许多肿瘤 ( 包 括乳腺细胞癌 ( 曲妥单抗或 HERCEPTIN ) 和结肠癌 ( 西妥昔单抗或 ERBITUX )) 的标准做 法。
     药物组合物可作为试剂盒提供， 该试剂盒包含含本文所述的治疗组合物的容器。 治疗组合物可提供为， 例如， 单剂或多剂施用的可注射溶液形式， 或作为在注射前复原的无 菌粉末。或者， 该试剂盒可包括用于施用治疗组合物的干粉分散器， 液体气雾剂发生器， 或 喷雾器。该试剂盒可进一步包含关于适应症和药物组合物的用途的书面信息。
     B. 癌症治疗
     1. 癌症类型
     根据本发明可治疗的癌症包括以实体瘤的存在为特征的癌症。如前人讨论的， 肿 瘤组织中血管的量是涉及实体瘤形成的癌症的强的负面预后指标 ( 参见， 例如， Weidner 等 人， (1992)， 上文 ； Weidner 等人， (1993)， 上文 ； Li 等人， 上文 ； Foss 等人， 上文 )， 且 VEGF 和 FGF 信号分子家族都显示出在实体瘤相关的新血管形成中起关键作用。下表 4 列出一些特 征为实体瘤形成的癌症， 主要通过靶组织分类。
     表4： 涉及实体瘤形成的示例性癌症
    
    因此， 在某些实施方案中， 本文所述的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白用于治疗特征为存在实体瘤的癌症， 例如， 表 4 所列的任一 种癌症。 例如， 在一些实施方案中， 要根据本发明治疗的癌症选自下列 ： 头颈部癌症 ( 例如， 口腔， 口咽， 鼻咽， 下咽， 鼻腔或鼻旁窦， 喉， 唇， 或唾液腺的癌症 ) ； 肺癌 ( 例如， 非小细胞肺
     癌， 小细胞癌， 或间皮瘤 ) ； 胃肠道癌 ( 例如， 结肠直肠癌， 胃癌， 食管癌， 或肛门癌 ) ； 胃肠 道间质瘤 (GIST) ； 胰腺癌 ； 胰腺腺泡细胞癌 ； 小肠的癌症 ； 肝癌或胆系癌 ( 例如， 肝细胞腺 瘤， 肝细胞癌， 血管肉瘤， 肝外或肝内胆管肉瘤， 法特壶腹癌， 或胆囊癌 ) ； 乳腺癌 ( 例如， 转 移性乳腺癌或炎性乳腺癌 ) ； 妇科癌症 ( 例如， 子宫颈癌， 卵巢癌， 输卵管癌症， 腹膜癌， 阴道 癌， 外阴癌症， 妊娠性滋养层细胞瘤形成， 或子宫癌， 包括子宫内膜癌或子宫肉瘤 ) ； 泌尿道 癌症 ( 例如， 前列腺癌 ； 膀胱癌 ； 阴茎癌 ； 尿道癌， 或肾癌， 例如， 肾细胞癌或移行细胞癌， 包 括肾盂和输尿管 ) ； 睾丸癌 ； 中枢神经系统 (CNS) 癌症如颅内肿瘤 ( 例如， 星形细胞瘤， 间 变性星形细胞瘤， 成胶质细胞瘤， 少突胶质细胞瘤， 间变性少突胶质细胞瘤， 室管膜瘤， 原发 性 CNS 淋巴瘤， 成神经管细胞瘤， 生殖细胞瘤， 松果腺瘤， 脑膜瘤， 垂体肿瘤， 神经鞘肿瘤 ( 例 如， 神经鞘瘤 )， 脊索瘤， 颅咽管瘤， 脉络丛肿瘤 ( 例如， 脉络丛癌 ) ； 或其它神经元或神经胶 质起源的颅内肿瘤 ) 或脊髓肿瘤 ( 例如， 神经鞘瘤， 脑膜瘤 ) ； 内分泌瘤 ( 例如， 甲状腺癌， 例如， 甲状腺癌， 髓样癌症， 或甲状腺淋巴瘤 ； 胰腺内分泌肿瘤， 例如， 胰岛素瘤或胰高血糖 素瘤 ； 肾上腺癌， 例如， 嗜铬细胞瘤 ； 类癌瘤 ； 或甲状旁腺癌 ) ； 皮肤癌 ( 例如， 鳞状上皮细胞 癌； 基底细胞癌 ； 卡波西肉瘤 ； 或恶性黑素瘤， 例如， 眼内黑素瘤 ) ； 骨癌 ( 例如， 骨肉瘤， 例 如， 骨肉瘤， 骨软骨瘤， 或尤因氏肉瘤 ) ； 多发性骨髓瘤 ； 绿色瘤 ； 软组织肉瘤 ( 例如， 纤维性 肿瘤或纤维组织细胞瘤 ) ； 平滑肌或骨骼肌肿瘤 ； 血液或淋巴管血管周围肿瘤 ( 例如， 卡波 西肉瘤 ) ； 滑膜肿瘤 ； 间皮瘤 ； 神经肿瘤 ； 副神经节肿瘤 ； 骨骼外软骨或骨肿瘤 ； 和多能间质 瘤。
     在一些变化形式中， 待治疗的癌症是儿童期癌症， 例如， 脑癌， 神经母细胞瘤， 维尔 姆斯瘤 ( 肾胚细胞瘤 )， 横纹肌肉瘤， 视网膜母细胞瘤， 或肝母细胞瘤。
     在其它变化形式中， 癌症为免疫治疗敏感性癌症， 例如， 黑素瘤， 肾癌， 乳腺癌， 前 列腺癌， 结肠直肠癌， 子宫颈癌， 卵巢癌， 或肺癌。
     在以下进一步详细描述上述癌症中的一些， 包括一些评价 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用的相关动物模型。
     a. 前列腺癌
     前列腺癌是男性生殖系统中发现于膀胱下侧、 直肠之前的一个腺体中的异常生 长。几乎所有前列腺癌都产生自前列腺中的分泌性腺细胞， 因此都是前列腺腺癌。在美国， 前列腺癌症是男性中的普通恶性癌症， 仅次于肺癌。 前列腺癌主要为老年男性的肿瘤， 当扩 散时其经常响应于治疗， 且当局部化时可被治愈。估计 17％的男性将在一生中被诊断出前 列腺癌。该肿瘤通常作为小的、 界限清楚的病变发生， 且可经常作为多发性原发肿瘤存在 (Villers 等人 .1992)。进展在局部和远端都发生， 通常达到精囊、 射精管和骨盆淋巴结， 在 更晚期达到骨、 肝和肺。一旦转移发生， 癌细胞增殖的速率加快。
     包含可溶 FGF 受体和抗 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物对肿瘤响应的作用可 在小鼠模型中评估， 有可用的前列腺癌小鼠模型 (Ahmad 等人综述， Expert Rev Mol Med， 10 ： e16(2008))， 在实施例 12 中有提供。
     b. 黑素瘤
     浅表性播散性黑素瘤是最普通类型的黑素瘤。约十分之七 (70％ ) 为该类型。它 们最经常发生于中年人。 最通常的位置为女性的腿上， 而男性中其更通常在躯干上， 特别是 背部。它们开始时往往穿过皮肤表面扩散， 这被称为放射生长期。如果在该阶段去除黑素瘤， 治愈的几率非常高。如果不去除黑素瘤， 其将开始向下更深地生长进入皮肤层。然后它 就有在血流或淋巴系统中扩散至身体其它部分的风险。 结节性黑素瘤最通常在胸或背上发 生。其最通常发现于中年人。如果不去除， 其容易很快地生长进入皮肤深处。该类型的黑 素瘤经常从皮肤表面凸起， 触觉像肿块。可为极深褐 - 黑色或黑色。恶性雀斑样黑素瘤最 经常存在于脸上， 特别是老年人。其生长缓慢， 发展可历时数年。肢端黑素瘤通常存在于 手掌， 足底或趾甲周围。其它的极少见类型的皮肤黑素瘤包括无黑色素性黑素瘤 ( 其中黑 素瘤失去其色素且呈现白色区域 ) 和结缔组织增生性黑素瘤 ( 其包括纤维疤组织 )。恶性 黑素瘤可从皮肤之外的身体部分发生， 但这非常少见。可能受影响的身体部分为眼、 口、 指 ( 趾 ) 甲下 ( 称为甲下黑素瘤 )、 外阴或阴道组织， 或身体内部。
     大多数黑素瘤首先是正常皮肤外观的变化。这可看起来像异常的新痣。少于三分 之一在现有的痣中发生。可能难以认出痣和黑素瘤的差异， 但可使用以下清单辅助。其已 知为 ABCD 清单。不对称性 - 普通的痣通常形状对称。黑素瘤很可能为不规则的或不对称 的。 边界 - 痣通常具有界限清晰的规则边界。 黑素瘤更可能具有锯齿状边缘的不规则边界。 颜色 - 痣通常为均匀棕色的。黑素瘤倾向于具有多于一种颜色。它们可以有不同的色调， 棕色混合有黑、 红、 粉、 白色或淡蓝色。直径 - 痣通常不大于铅笔的平端 ( 径向约 6mm)。黑 素瘤通常直径大于 7mm。通常痣可从皮肤凸起和 / 或可有毛。搔痒、 结痂或出血也可发生 于黑素瘤 - 这些是较少出现的迹象但不应忽视 (cancerbacup 互联网网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于 下列文献中所述的的鼠黑素瘤模型中评估 Hermans 等人， Cancer Res.63 ： 8408-13， 2003 ； Ramont 等 人， Exp.Cell.Res.29 ： 1-10， 2003 ； Safwat 等 人， J.Exp.Ther.Oncol.3 ： 161-8， 2003 ； 和 Fidler， Nat New Biol.242 ： 148-9， 1973。
     c. 肾细胞癌
     肾细胞癌为涉及肾小管细胞中的癌性变化的肾癌形式， 其为成人肾癌的最普遍形 式。细胞为什么会变为癌性还未知。吸烟史极大增加发生肾细胞癌的风险。一些人也可 能自遗传获得了发生肾细胞癌的增加的风险， 且家族肾癌病史增加该风险。患有希普尔病 ( 一种影响脑毛细血管的遗传疾病 ) 的人， 通常也发生肾细胞癌。 需要透析治疗的肾疾病也 增加发生肾细胞癌的风险。最初症状通常为尿血。有时两个肾都受累。该癌症容易转移或 扩散， 最经常转移或扩散至肺和其它器官， 且约三分之一的患者在诊断时已转移 (Medline Plus Medical Encyclopedia 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白 的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠肾细胞癌模型中 评估 ： Sayers 等人， Cancer Res.50 ： 5414-20， 1990 ； Salup 等人， Immunol.138 ： 641-7， 1987 ； 和 Luan 等人， Transplatation 73 ： 1565-72， 2002。
     d. 子宫颈癌
     子宫颈为通向阴道的子宫的颈部。 子宫颈癌， 也称为宫颈癌， 发生自子宫颈表面的 异常细胞。 子宫颈癌是影响女性的最常见癌症之一。 在子宫颈癌发生之前通常有发育异常， 子宫颈表面细胞的癌前变化。 这些异常细胞可发展为浸润性癌症。 一旦该癌症出现， 其可经 由四个阶段进展。这些阶段是根据癌症扩散的程度定义的。癌症扩散得越多， 治疗可能约 深切。 子宫颈癌有两种主要类型 ： (1) 鳞状类型 ( 表皮样癌 ) ： 这是最常见的类型， 占子宫颈 癌的约 80％至 85％。该癌症可由性传播疾病引起。一种这样的性病为人乳头状瘤病毒， 其引起尖锐湿疣。该癌症肿瘤在子宫颈上生长并进入子宫颈。该癌症通常起始于子宫颈表面 且可在早期通过巴氏涂片诊断。(2) 腺癌 ： 该类型的子宫颈癌发生于子宫颈管中的宫颈腺 的组织。早期子宫颈癌通常不引起症状。该癌症通常通过巴氏涂片和骨盆检查检测。这就 是为什么你一旦有性活动就应开始进行巴氏涂片和骨盆检查的原因。 从未有性活动的健康 年轻女性应在 18 岁之前进行首次每年的骨盆检查。晚期子宫颈癌引起异常阴道出血或在 预期外的时间 ( 如月经期之间， 性交后， 或绝经后 ) 排出血污。异常阴道排放可为混浊的或 带血的或可包含具有恶味的粘液。 癌症晚期可引起疼痛 (University of Michigan Health System 网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 对肿瘤响应的作用可在类似于下列文献中所述的鼠子宫颈癌模型中评估 ： Ahn 等人， Hum. Gene.Ther.14 ： 1389-99， 2003 ； Hussain 等人， Oncology 49 ： 237-40， 1992 ； 和 Sengupta 等 人， Oncology 48 ： 258-61， 1991。
     e. 头颈部肿瘤
     大多数头颈部癌症是称为 “癌” (carcinoma) 的类型 ( 特别是鳞状上皮细胞癌 )。 头颈部的癌起源于构成口、 鼻、 喉或耳的内层， 或覆盖舌的表面层的细胞。 然而， 头颈部癌症 可发生于其它类型的细胞。淋巴瘤发生于淋巴系统细胞。肉瘤发生于构成肌肉、 软骨或血 管的支持性细胞。黑素瘤起始于称为黑素细胞的细胞， 这类细胞给予眼和皮肤颜色。头颈 部的癌症的症状将取决于其位置 - 例如， 舌癌可引起一些语言迟钝。最通常的症状为发生 的头或颈的、 几周内不痊愈的溃疡或损伤区域 ； 吞咽困难， 或咀嚼或吞咽时疼痛 ； 呼吸或讲 话困难， 如持续性呼吸杂音， 语言迟钝或嘶哑 ； 口中麻木感觉 ； 持续鼻塞， 或鼻出血 ； 持续耳 痛， 耳鸣， 或听力困难 ； 口或颈肿胀或肿块 ； 面部或上颌疼痛 ； 在吸烟或咀嚼烟草的人群中， 癌前变化可发生于口的衬里， 或在舌上。 这些可显现为持续白斑 ( 粘膜白斑病 ) 或红斑 ( 粘 膜红斑病 )。它们通常不疼但有时会溃疡且可出血 (Cancerbacup 网站 )。包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下 列文献中所述的鼠头颈肿瘤模型中评估 ： Kuriakose 等人， Head Neck 22 ： 57-63， 2000 ； Cao 等人， Clin.Cancer Res.5 ： 1925-34， 1999 ； Hier 等人， Laryngoscope 105 ： 1077-80， 1995 ； Braakhuis 等人， Cancer Res.51 ： 211-4， 1991 ； Baker， Laryngoscope 95 ： 43-56， 1985 ； 和 Dong 等人， Cancer Gene.Ther.10 ： 96-104， 2003。
     f. 脑癌
     已知脑组织中产生的肿瘤称为脑的原发性肿瘤。 原发性脑肿瘤根据其发源的细胞 类型或其产生的脑的部位命名。最常见的原发性脑肿瘤为神经胶质瘤。它们产生于胶质细 胞。神经胶质瘤有许多类型。(1) 星形细胞瘤 - 该肿瘤产生自呈星形的胶质细胞， 称为星形 细胞。在成人中， 星形细胞瘤最经常产生自大脑。在儿童中， 它们发生于脑干、 大脑和小脑。 III 级星形细胞瘤有时称为间变性星形细胞瘤。IV 级星形细胞瘤通常称为多形性星形细胞 瘤。 (2) 脑干神经胶质瘤 - 该肿瘤发生于脑最下方的部分。 脑干神经胶质瘤最经常在幼儿和 中年成人中诊断出。 (3) 室管膜瘤 - 该肿瘤产生自脑室或脊髓中心管的衬底细胞。 它们最常 见于儿童和年轻成人。(4) 少突胶质细胞瘤 - 这种罕见的肿瘤是由生成覆盖和保护神经的 脂肪物质的细胞发生的。这些肿瘤通常发生于大脑中。它们生长缓慢且通常不扩散进入周 围脑组织。 它们在中年成人中最普遍。 脑肿瘤的症状取决于肿瘤尺寸、 类型和位置。 当肿瘤 压迫神经或损伤某一区域的脑时可引起症状。 当脑肿胀或液体在颅骨中累积时也可产生症状。这些是最常见的脑肿瘤症状 ： 头痛 ( 通常在早晨更严重 ) ； 恶心或呕吐 ； 语言、 视觉、 或 听觉的改变 ； 平衡或行走问题 ； 情绪、 个性、 或集中能力的改变 ； 记忆问题 ； 肌肉跳动或颤搐 ( 癫痫发作或惊厥 ) ； 和手臂或腿的麻木或麻刺感 (National Cancer Institute’ s 网站 )。 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作 用可在类似于下列文献中所述的神经胶质瘤动物模型中评估 ： Schueneman 等人， Cancer Res.63 ： 4009-16， 2003 ； Martinet 等 人， Eur.J.Surg.Oncol.29 ： 351-7， 2003 ； Bello 等 人， Clin.CancerRes.8 ： 3539-48， 2002 ； Ishikawa 等 人， Cancer Sci.95 ： 98-103， 2004 ； Degen 等 人， J.Neurosurg.99 ： 893-8， 2003 ； Engelhard 等 人， Neurosurgery 48 ： 616-24， 2001 ； Watanabe 等人， Neurol.Res.24 ： 485-90， 2002 ； 和 Lumniczky 等人， Cancer Gene Ther.9 ： 44-52， 2002。
     g. 甲状腺癌
     乳头状和滤泡状甲状腺癌占所有甲状腺癌的 80 至 90％。这两种类型都起始于甲 状腺的滤泡细胞。大多数乳头状和滤泡状甲状腺癌倾向于生长缓慢。如果早期检出， 大多 数可成功治疗。髓样甲状腺癌占甲状腺癌病例的 5 至 10％。它在 C 细胞而非滤泡细胞中 产生。如果在甲状腺髓样癌扩散至身体其它部分之前被发现和治疗， 其易于控制。甲状腺 未分化癌为最少见的一类甲状腺癌 ( 仅占病例的 1 至 2％ )。其在滤泡细胞中发生。该癌 细胞高度异常且难以识别。该类型的癌症通常非常难以控制， 因为癌细胞倾向于非常快速 生长和扩散。早期甲状腺癌经常不产生症状。但随着癌症生长， 症状可包括 ： 出现在颈前 部接近喉结的团块或结节 ； 声嘶或正常声音讲话困难 ； 淋巴结肿胀， 尤其在颈部 ； 吞咽或呼 吸困难 ； 或咽喉或颈疼痛 (National Cancer Institute 的网站 )。包含 VEGF-A 抗体 / 可 溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响应的作用可在类似于下述文 献的小鼠或大鼠甲状腺肿瘤模型中评估 ： Quidville 等人， Endocrinology 145 ： 2561-71， 2004( 小鼠模型 ) ； Cranston 等人， Cancer Res.63 ： 4777-80， 2003( 小鼠模型 ) ； Zhang 等 人， Clin Endocrinol(Oxf).52 ： 687-94， 2000( 大鼠模型 ) ； 和 Zhang 等人， Endocrinology 140 ： 2152-8， 1999( 大鼠模型 )。
     h. 肝癌
     有两种不同类型的原发性肝癌。最通常的种类称为肝癌或肝细胞癌 (HCC)， 源 自肝的主要细胞 ( 肝细胞 )。该类型通常限于肝， 尽管偶尔其延伸至其它器官。其经常 发生于患有一种称为肝硬化的肝病的人中。还有一种稀有的肝癌亚型， 称为纤维板层 (Fibrolamellar) 肝癌， 其可发生于年轻人中且与之前的肝疾病不相关。 另一类型的原发性 肝癌称为胆管癌或胆管癌症， 因为其起始于胆管衬底的细胞。大多数患有肝癌的人还通常 具有称为肝硬化的肝病。 肝硬化是由于多种原因， 包括感染和长期大量饮酒， 而在整个肝中 发生的细小的瘢痕形成。然而， 仅有小比例的肝硬化的人产生原发性肝癌。感染乙型肝炎 或丙型肝炎病毒可导致肝癌， 且也可为肝硬化的原因， 这增加产生肝癌的风险。 患有稀有症 状称为血色病 ( 其引起体内铁的过量沉积 ) 的人， 具有更高的发生肝癌的几率。因此， 本发 明的包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白可用于治疗 肝细胞癌、 预防肝细胞癌、 抑制肝细胞癌进展， 延迟肝细胞癌发生， 和 / 或减少与肝细胞癌 相关的至少一种症候或症状严重性或抑制与肝细胞癌相关的至少一种症候或症状。 肝细胞 癌可与肝炎 ( 例如， 甲型肝炎， 乙型肝炎， 丙型肝炎和丁型肝炎 ) 感染相关或不相关。包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤响 应的作用可在肝细胞癌转基因小鼠模型中评估， 其包括单独的转化生长因子 -α(TFG-α) 的过表达 (Jhappan 等人， Cell， 61 ： 1137-1146， 1990 ； Sandgren 等人， Mol.Cell.Biol.， 13 ： 320-330， 1993 ； Sandgren 等 人， Oncogene 4 ： 715-724， 1989 ； 和 Lee 等 人， CancerRes.52 ： 5162 ： 5170， 1992) 或 其 与 c-myc(Murakami 等 人， Cancer Res.， 53 ： 1719-1723， 1993)， 突 变 的 H-ras(Saitoh 等 人， Oncogene 5 ： 1195-2000， 1990)， 编 码 HbsAg 和 HBx 的 乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 (Toshkov 等 人， Hepatology 20 ： 1162-1172， 1994 ； Koike 等 人， Hepatology 19 ： 810-819， 1994)， SV40 大 T 抗 原 (Sepulveda 等 人， Cancer Res.49 ： 6108-6117， 1989 ； Schirmacher 等人， Am.J.Pathol.， 139 ： 231-241， 1991) 和 FGF19(Nicholes 等人， American Journal of Pathology， 160 ： 2295-2307， 2002) 的组合的过表达。
     i. 肺癌
     包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白对肿瘤 响应的作用可在人小细胞肺癌 / 非小细胞肺癌异种移植模型中评估。简言之， 将人肿瘤 移植至免疫缺陷小鼠， 然后用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白单独治疗或与其它可用于通过评估肿瘤生长证实治疗的功效的药物组合治 疗这些小鼠 (Nemati 等人， Clin Cancer Res.6 ： 2075-86， 2000 ； 和 Hu 等人， Clin.Cancer Res.10 ： 7662-70， 2004)。
     2. 实体瘤的终点和抗肿瘤活性
     尽管各种规程对肿瘤响应评估可能有不同的定义， 但 RECIST( 实体瘤的响应评 价标准 ) 标准目前被认为是国立癌症研究所用于评估肿瘤响应的推荐的指导方针 ( 参见 Therasse 等人， J.Natl.Cancer Inst.92 ： 205-216， 2000)。根据 RECIST 标准， 肿瘤响应是 指减少或消除所有可测的病变或转移。 在以下条件下， 疾病通常认为是可测量的 ： 疾病包含 可在至少一个维度上可以被准确测量为≥ 20mm( 用常规技术 ) 或≥ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的损伤， 且通过医学照相或 X- 射线、 计算机轴断层摄影术 (CT)、 磁共振成像 (MRI) 或临床检 测 ( 如果损伤是表面的 ) 可见具有清楚限定的边界。不可测量的疾病是指以下疾病， 其由 ＜ 20mm( 用常规技术 ) 或＜ 10mm( 用螺旋 CT 扫描 ) 的病变， 和确实不可测的病变 ( 太小而 不能准确测量 ) 构成。不可测量的疾病包括胸腔积液， 腹水， 和间接证据证明的疾病。
     规程需要目标状态的标准以评估实体瘤响应。代表性的标准包括以下 ： (1) 完全 响应 (CR)， 定义为所有可测量的疾病的完全消失 ； 无新的病变 ； 无疾病相关的症状 ； 无不可 测量的疾病的证据 ； (2) 部分响应 (PR)， 定义为靶病变的最长直径的总和降低 30％ ； (3) 进 行性疾病 (PD)， 定义为靶病变的最长直径的总和增加 20％或出现任何新病变 ； (4) 稳定或 无响应， 定义为未达到 CR、 PR、 或进行性疾病的标准者。( 参见 Therasse 等人， 上文 )。
     其他在肿瘤学领域中公认的终点包括总存活 (OS)， 无疾病存活 (D6FS)， 目标应答 率 (ORR)， 进展前时间 (TTP)， 和无进展存活 (PFS)( 参见 Guidance for Industry ： Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics， 2005 年 4 月， Center for Drug Evaluation and Research， FDA， Rockville， MD)。
     3. 组合癌症疗法
     如上讨论的， 在某些实施方案中， 将双特异性 VEGF-A 抗体 /FGFR 可溶受体组合与 治疗新生血管疾病的第二药剂组合使用。当用于治疗癌症时， 本发明的拮抗剂可用于与常规癌症治疗组合使用， 常规癌症治疗例如， 外科手术， 放疗， 化疗， 或其组合。 在某些方面， 其 它可用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行 组合癌症治疗的治疗剂包括其它抗血管发生剂。在一些其它方面， 其它用于与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白进行组合治疗的治疗剂包括针 对肿瘤生长中涉及的其它因素的拮抗剂， 所述的其它因素例如， EGFR， ErbB2(Her2)， ErbB3， ErbB4， 或 TNF。在一些方面， 将包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特 异性结合蛋白与细胞因子 ( 例如， 刺激对肿瘤的免疫应答的细胞因子 ) 共同施用。特别适 合用于治疗癌症的示例性组合治疗在以下更详细描述。
     a. 靶向肿瘤相关的抗原的抗体与包含双特异性抗体 / 可溶受体结合蛋白的双特 异性结合蛋白的组合
     抗体疗法在癌症治疗中已获得了特别的成功， 因为某些肿瘤显示唯一的抗原、 种 系特异性抗原、 或相对于正常细胞而言过量存在的抗原。与单克隆抗体治疗的抗肿瘤活性 相关的一种机理是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)。 在 ADCC 中， 单克隆抗体结合至靶细胞 ( 例 如， 癌细胞 )， 而表达所述单克隆抗体的受体的特异性效应细胞 ( 例如， NK 细胞， 单核细胞， 粒细胞 ) 结合至该单克隆抗体 / 靶细胞复合物， 导致靶细胞死亡。在本发明的某些变化形 式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白与针对肿瘤 相关的抗原的单克隆抗体共同施用。 单抗的剂量和时程基于所共同施用的特定抗体的药代 动力学和毒物代谢动力学特性， 且应优化这些效果， 同时最小化可与施用包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白相关的任何毒性。
     当第一线治疗 (first line treatment) 失败时， 可指示需要与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白和对肿瘤 - 相关的抗原的单克隆抗体 的组合治疗， 并可考虑将该组合治疗作为第二线治疗。本发明还提供， 对于新确诊的、 先前 未用抗癌剂治疗的患者群体 (“新患者” )， 和先前未接受任何单克隆抗体治疗的患者 (“首 次治疗患者” )， 使用该组合作为第一线治疗。
     双特异性结合蛋白也可用于在不存在任何直接的抗体介导的肿瘤细胞的 ADCC 情 况下与针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体组合治疗。例如， 在免疫系统中阻断抑制信号的抗 体可导致增强的免疫应答。实例包括 (1) 抗具有抑制功能的 B7R 家族的分子， 如， 细胞毒性 T 淋巴细胞 - 相关的抗原 4(CTLA-4)， 程序死亡 -1(PD-1)， B 和 T 淋巴细胞弱化子 (BTLA) 的 抗体 ； (2) 抗抑制性细胞因子如 IL-10、 TGFβ 的抗体 ； 和 (3) 消减或抑制遏制性细胞的功能 的抗体如抗 CD25 或 CTLA-4。 例如， 认为抗 CTLA4 单抗在小鼠和人中都抑制免疫抑制调节性 T 细胞 (Tregs) 的功能或抑制通过 T 细胞上 CTLA-4 与 APC 或肿瘤细胞上的 B7-1 或 B7-2 分 子的结合传递的抑制信号。
     表 8 是一些已经得到批准或正在接受测试的单克隆抗体的非排他性列表， 这些单 克隆抗体与包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的组 合治疗是可能的。
     表8： 用于与 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白组合使用的单克隆抗 体疗法
    49102448984 A CN 102449007 靶 TRAIL-R1 TRAIL-R2 CD40 HER2
     靶 EGF-R EGF-R EGF-R EGF-R α5β3 整联蛋白 CD152 CD49e MUC18(TIM- 状 ) TAG-72 粘蛋白 CD3 CD64(FcGR1) CEA EpCAM Lewis-Y-Ag
     药物名称 ABX-EGF EMD72000 MDX-214 爱必妥 (Erbitux) Vitaxin CTLA-4 整联蛋白 α5 ABX-MA1 Anatumomab Ecromeximab AntiCD64 CEA-Cide Panorex SGN15 药物名称 HGS-ETR1 HGS-ETR2 SGN40 赫赛汀说明书公司 HGS HGS46/82 页临床适应证 癌症 实体瘤 MM 乳腺癌Seattle Genetics Genentech临床适应证 CRC， NSCLC， RCC 实体瘤 EGF-R- 阳性肿瘤 CRC 银屑病， 前列腺癌 癌症 癌症 黑素瘤 癌症 黑素瘤 癌症 癌症 结肠直肠癌 癌症公司 Abgenix Merck Medarex Imclone AME/Lilly Medarex Protein Design LabsKyowa Hakko Medarex Immunomedics Centocor Seattle Geneticsb. 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白
     在一些实施方案中， 包含如本文所述的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合 蛋白的双特异性结合蛋白与酪氨酸激酶抑制剂组合使用。酪氨酸激酶是催化 γ 磷酸基团 从三磷酸腺苷转移至靶蛋白的酶。 酪氨酸激酶可分类为受体蛋白酪氨酸激酶和非受体蛋白 酪氨酸激酶。 它们在多种正常细胞过程中起关键作用， 包括通过生长受体的活化， 且影响多种细胞类型的增殖、 存活和生长。此外， 认为它们促进肿瘤细胞增殖， 诱导抗凋亡作用且促 进血管发生和转移。除了通过生长因子的活化， 通过体细胞突变的蛋白质激酶活化是肿瘤 发生的一种普遍机理。一些已鉴定的突变在 B-Raf 激酶， FLt3 激酶， BCR-ABL 激酶， c-KIT 激酶， 表皮生长因子 (EGFR) 和 PDGFR 途径中发生。Her2、 VEGFR 和 c-Met 是其他在癌症进 展和肿瘤发生涉及的重要的受体酪氨酸激酶 (RTK) 途径。因为大量细胞进程是由酪氨酸激 酶引发的， 它们已被确认为抑制剂的关键靶标。
     酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 是在细胞中起作用的小分子， 与三磷酸腺苷 (ATP) 竞争 对受体和非受体酪氨酸激酶两者的催化性酪氨酸激酶域的结合。 该竞争性结合阻断下游信 号传递的引发， 所述下游信号传递导致与这些信号事件相关的效应作用如生长、 存活和血 管发生。使用结构和计算手段， 从众多医药化学组合库鉴定出了大量抑制酪氨酸激酶的化 合物。
     认为大多数 TKI 通过直接抑制肿瘤细胞或通过抑制血管发生而抑制肿瘤生长。而 且， 某些 TKI， 包括索拉非尼和舒尼替尼， 通过 VEGF 家族受体影响信号传导。 在一些情况下， 已显示 TKI 可活化树突状细胞和其它天然免疫细胞， 如 NK 细胞的功能。这最近在动物模型 中对于伊马替尼进行了报道。伊马替尼是一种已被证明通过树突状细胞和 NK 细胞而增强 杀伤活性的 TKI( 综述参见 Smyth 等人， NEJM 354 ： 2282， 2006)。
     BAY 43-9006( 索 拉 非 尼， Nexavar ) 和 SU11248( 舒 尼 替 尼， Sutent ) 是 两 种 这 样 的 TKI， 它 们 最 近 获 准 用 于 转 移 性 肾 细 胞 癌 (RCC)。 许 多 其 它 TKI 处 于 晚 期 和 早 期 开 发 之 中， 用 于 治 疗 不 同 类 型 的 癌 症。 其 它 TKIs 包 括， 但不限于 ： 甲磺酸 伊 马 替 尼 (Gleevec Novartis) ； 吉 非 替 尼 (Iressa AstraZeneca) ； 埃罗替尼 盐 酸 盐 (Tarceva Genentech) ； 凡 德 他 尼 (Zactima AstraZeneca)，替 吡 法 尼 (Zarnestra Janssen-Cilag) ； 达 沙 替 尼 (Sprycel Bristol Myers Squibb) ； 洛那 法尼 (Sarasar Schering Plough) ； 瓦他拉尼琥珀酸盐 (Novartis， Schering AG) ； 拉 帕替尼 (Tykerb GlaxoSmithKline) ； 尼洛替尼 (Novartis) ； 来他替尼 (Cephalon) ； 帕 唑帕尼盐酸盐 (GlaxoSmithKline) ； 阿西替尼 (Pfizer) ； 卡奈替尼二盐酸盐 (Pfizer) ； 培 利 替 尼 (National Cancer Institute， Wyeth) ； 坦 度 替 尼 (Millennium) ； 博舒替 尼 (Wyeth) ； 司 马 沙 尼 (Sugen， Taiho) ； AZD-2171(AstraZeneca) ； VX-680(Merck， Vertex) ； EXEL-0999(Exelixis) ； ARRY-142886(Array BioPharma ，AstraZeneca) ； PD-0325901(Pfizer) ； AMG-706(Amgen) ； BIBF-1120(Boehringer Ingelheim) ； SU-6668(Taiho) ； CP-547632(OSI) ； (AEE-788(Novartis) ； BMS-582664(Bristol-Myers Squibb) ； JNK-401(Celgene) ； R-788(Rigel) ； AZD-1152HQPA(AstraZeneca) ； NM-3(Genzyme Oncology) ； CP-868596(Pfizer) ； BMS-599626(Bristol-Myers Squibb) ； PTC-299(PTC Therapeutics) ； ABT-869(Abbott) ； EXEL-2880(Exelixis) ； AG-024322(Pfizer) ； XL-820(Exelixis) ； OSI-930(OSI) ； XL-184(Exelixis) ； KRN-951(Kirin Brewery) ； CP-724714(OSI) ； E-7080(Eisai) ； HKI-272(Wyeth) ； CHIR-258(Chiron) ； ZK-304709(Schering A G) ； EXEL-7647(Exelixis) ； BAY-57-9352(Bayer) ； BIBW-2992(Boehringer Ingelheim) ； AV-412(AVEO) ； YN-968D1(Advenchen Laboratories) ；米 哚 妥 林 (Novartis) ；哌 立 福 辛 (AEterna Zentaris， Keryx， National Cancer Institute) ； AG-024322(Pfizer) ； AZD-1152(AstraZeneca) ；ON-01910Na(Onconova) ； 和 AZD-0530(AstraZeneca)。
     c. 化学治疗组合
     在某些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体的双特异性结合蛋白与一种 或多种化学治疗剂组合施用。化疗剂具有不同的作用方式， 例如， 通过影响 DNA 或 RNA 和 干扰细胞周期复制。以 DNA 水平或 RNA 水平作用化学治疗剂的实例为抗代谢物 ( 如硫唑 嘌呤， 阿糖胞苷， 磷酸氟达拉滨， 氟达拉滨， 吉西他滨， 阿糖胞苷， 克拉屈滨， 卡培他滨 6- 疏 基嘌呤， 6- 硫鸟嘌呤， 甲氨蝶呤， 5- 氟尿嘧啶和羟基脲 ) ； 烷化剂 ( 如美法仑， 白消安， 顺铂， 卡铂， 环磷酰胺， 异环磷酰胺， 达卡巴嗪， 丙卡巴肼， 苯丁酸氮芥， 塞替派， 洛莫司汀， 替莫唑 胺)； 抗有丝分裂剂 ( 如长春瑞滨， 长春新碱， 长春碱， 多西紫杉醇， 紫杉醇 ) ； 拓扑异构酶 抑制剂 ( 如多柔比星， 安吖啶， 伊立替康， 柔红霉素， 表柔比星， 丝裂霉素， 米托蒽醌， 伊达比 星， 替尼泊苷， 依托泊苷， 拓扑替康 ) ； 抗生素 ( 如放线菌素和博来霉素 ) ； 门冬酰胺酶 ； 蒽环 类抗生素或紫杉烷。
     d. 放射治疗组合
     在一些变化形式中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与放射治疗组合施用。某些肿瘤可用放射或放射性药物治疗。放射治疗通常用 于治疗不能切除的或不能手术的肿瘤和 / 或肿瘤转移物。放射治疗通常以三种方式递送。 外束放射在人体一定的距离之外给予， 包括 γ 射线 (60Co) 和 X- 射线。近程放疗使用与靶 137 192 组织一起或与靶组织接触的放射源， 例如 60Co， Cs， Ir， 或 125I。
     e. 激素药组合
     在一些实施方案中， 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异 性结合蛋白与激素或抗激素组合施用。 某些癌症与激素依赖相关， 包括， 例如， 卵巢癌， 乳腺 癌和前列腺癌。激素依赖性癌症的治疗可包括使用抗雄激素或抗雌激素化合物。用于癌症 治疗的激素和抗激素包括磷酸雌莫司汀， 磷酸聚雌二醇， 雌二醇， 阿那曲唑， 依西美坦， 来曲 唑， 他莫昔芬， 乙酸甲地孕酮， 醋酸甲羟孕酮， 奥曲肽， 乙酸环丙孕酮， 比卡鲁胺， 氟他胺， 曲 普瑞林， 亮丙瑞林， 布舍瑞林和戈舍瑞林。
     本发明进一步通过以下非限制性实例阐述。
     实施例 1 ： 筛选结合 VEGF-A 的抗体
     通 过 筛 选 Dyax Fab 310 噬 菌 体 文 库 (Dyax Corp.， Cambridge， MA) 来 鉴 别 结 合 VEGF-A 的抗体。选定的噬菌体 - 抗体文库选择和筛选方法使用抗原 (VEGF-A165， R&D Systems) 包被的聚苯乙烯免疫管 (NUNC， Denmark)。通过在少数轮的选择后增加严格性而 分离抗体。第一代抗体为 Fab 形式。通过 MluI(#R0198S， New England Biolabs， Beverly， MA) 酶消化产生可溶 Fab 抗体以去除 M13 噬菌体中的 geneIII 残株 (stump)。对 scFv 形式 的抗体使用了相同的选择、 筛选和裂解策略。
     实施例 2 ： 鉴别 VEGF-A 结合性 Fab 克隆
     通过基于平板的结合测定 (plate based binding assay) 来鉴别结合 VEGF-A 的 Fab 克隆。Costar(#9018)96- 孔板用 50μl VEGF-A(R&D Systems) 或 PDGF-D(SEQ ID NO ： 80) 同二聚体 (0.6μg/ml 在 0.1M NaHCO3， pH 9.6 中 )4 ℃包被过夜。第二天， 用 0.1 ％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。 各孔加入 100μl 2％牛乳 (#170-6404， Bio-Rad)/PBST， 室温封闭 1 小时。然后用 PBST 洗涤测试板三次。各孔加入 25ul 2％牛乳 /PBST， 然后添加25ul Fab 上清液。然后混合各孔， 在室温孵育 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。对于 Fab 检 测， 将 2％牛乳 /PBST 中的 50ul(1 ∶ 4000) 抗人 Fab 特异的 pAb-HRP(#31482， Pierce) 添 加至各孔， 室温保持 1 小时。然后用 PBST 洗涤板三次。将 50ul TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔， 显色 15 分钟， 然后添加 50ul 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以终止该反应。然后将平板在板读数器上以 450nm 读数。
     实施例 3 ： 将 VEGF-A 结合性 sFab 转化为 scFv
     对于一个第 2 轮， A 臂和 B 臂 VEGF-A 筛选的 Fab Dyax 噬菌体 DNA 池， 通过一套 3 步骤程序使用对各亚型的框架序列的引物扩增 λ、 κ 和重链可变区。第一轮 PCR 扩增各可 变框架区且添加合适的突出端以促进第 2 轮 PCR 反应。 第 2 轮 PCR 反应向正确的第 1 轮 PCR 产物的末端添加合适的 gly/ser 接头序列， 第 3 轮 PCR 反应将可变轻链 λ、 可变轻链 κ、 和 可变重链产物重叠以产生 LH 和 HL 两种取向的 scFv 产物， 然后其克隆至经 ApaLI/NotI- 消 化的 PIMD21 噬菌体展示载体。
     实施例 4 ： 抑制 VEGF 与 sVEGFR2 的结合的 sFab 和 scFv 的鉴别
     通过基于平板的中和测定筛选 VEGF-A Fab 和 scFv 克隆。 将 Costar(#9018)96- 孔 板用 100μl 抗人 IgG Fcγ- 特异抗体 (#109-005-098， Jackson Immunology)(1μg/ml， 在 0.1M NaHCO3 中， pH 9.6) 在 4℃包被过夜。第二天， 用 400ul 0.1％ Tween-20/PBS(PBST) 洗涤板三次。各孔加入 100μl 1％ BSA(#A3059-100G， ∑ )/PBST， 在室温 (RT) 阻断 1 小时。 用 PBST 洗涤板三次。将 100μl VEGFR2-Fc(SEQ ID NO ： 81)( 以 0.2μg/ml， 在 1 ％ BSA/ PBST 中 ) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。同时， 在一块单独的 96 孔板 (Costar 3357) 中， 将 65μl Fab 或 scFv 上清液添加至 65μl 生物素化 VEGF-A( 在 1％ BSA/PBST 中， 20ng/ml) 中， 在室温保持 1 小时。将经封闭的测定平板用 PBST 洗涤三次。各孔加入 100μl 上清液 / 生物素化 VEGF-A 复合物， 在室温保持 1 小时。用 PBST 洗涤板三次。将 100μl 1％ BSA/ PBST 中的 (1 ∶ 4000) 链亲和素 -HRP(#21124， Pierce) 添加至各孔， 在室温保持 1 小时。然 后用 PBST 洗涤板三次。将 100μl TMB(TMBW-1000-01， BioFX Laboratories) 添加至各孔 以显色 20 分钟， 然后添加 100μl 终止缓冲液 (STPR-1000-01， BioFX Laboratories) 以停 止反应。然后将板以 450nm 在板读数器上读数。
     实施例 5 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的 相互作用的解离速率常数
     对人 VEGF-A 拮抗剂评估其与人 VEGF-A 的结合亲和力。
     VEGF-A 根据其解离速率常数使用表面等离子共振。通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的解离速率常数。解离速率常数 (kd(s-1)) 是反映该 复合物稳定性的值。其与浓度不相关， 因此适合用于筛选和评定未知浓度的样品。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结合亲和力。在 TM Biacore T-100 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合动力学和亲和力研究。 使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程方法。使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 将人 VEGF-A 共价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到约 200RU 的密度。将 VEGF-A 仅固定至活性流动 室 (active flow cell)。固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室上的剩余活性位点。用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。活化参照室， 然后用乙醇胺封闭。
     将 VEGF-A 拮抗剂上清液 ( 选自 Dyax 噬菌体文库筛选 ) 在流动缓冲液中 1 ∶ 3 稀释， 注射在表面上， 容许其特异结合至传感器芯片上的 VEGF-A， 结合时间为 5 分钟， 离解时 间为 5 分钟。双重注射 100nM VEGFR-2-Fc5 和 100nM 抗 VEGF-A 单克隆抗体 (AvastinTM， Genentech) 用作阳性对照。使用 30ul/min 的流速进行动力结合研究。所有结合实验在 25℃于 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的流动缓冲液中进行。还进行缓冲液注射以允许减少仪器干扰和误差。在循环之 间， 流动室用 10mM 甘氨酸， pH 1.5 洗涤以从表面去除结合的 VEGF-A 拮抗剂。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射进行处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个系列的注射中提供了一 致的结合表面。因为 VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 所得结合曲线与计算解离速率常数 (kd(s-1)) 的 1 ∶ 1 解离结合模型完全拟合。
     结果 ： 测定 VEGF-A 拮抗剂对人 VEGF-A 的解离速率分析。 所得结合曲线与 1 ∶ 1 解 离模型良好吻合。VEGF-A 拮抗剂的起始浓度未知， 因此仅报道解离速率常数 (kd(s-1))， 因 为 kd 与浓度不相关。计算的解离速率常数从最慢至最快排列。在这些测试条件下， VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用显示大范围的解离速率常数 (1.E-5-2.E-2(s-1))( 参见表 5)。为了比较， VEGFR-2-Fc5-VEGF-A 相互作用的 kd 为约 2.E-4s-1， 抗 VEGF-A 单克隆抗体 AvastinTM Fab-VEGF-A 相互作用为约 8.E-5s-1。
     表5： VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A scFvs 和对照物的相互作用的解离速率常数
    实施例 6 ： 衍生自大肠杆菌周质级分的蛋白质的纯化
     在大肠杆菌细胞的周质空间中表达了 scFv、 串联 scFv 和 sFab 蛋白质。 发酵规模从 25mL 摇瓶培养到 2L 分批补料的系统不等。 大肠杆菌细胞使用离心机旋转沉降为离心沉淀。 以每克湿细胞重量 2mL 的比例将湿细胞离心沉淀完全重悬浮于周质缓冲液 [0.2M Tris， 20％ (w/v) 蔗糖， 完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 (Roche)pH 7.5]。 过程中可包括或不包 括溶菌酶 ( 促进细胞壁降解的酶 )。 为确定是否使用溶菌酶， 将 500uL 重悬浮的离心沉淀转 移至 Eppendorf 管， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将 悬浮液在室温孵育 5 分钟。孵育后， 通过翻转来检测溶液的粘度增加。如果溶液粘在管壁 上， 那么可能发生了过早的细胞裂解， 则在准备的溶液中不包含溶菌酶。 如果溶液不粘在管
     壁上， 则将溶菌酶包含在准备的溶液中。 如果使用溶菌酶， 每 uL 使用的周质缓冲液添加 30U Ready-Lyse 溶菌酶 (Epicentre)， 将悬浮液在室温孵育 4-6 分钟。 以每克初始湿细胞离心沉 淀重量 3mL 的比例添加冰冷的水， 并将溶液孵育至少 10 分钟但不长于 30 分钟。将剩余原 生质球在室温通过离心分离以 15,000xg( 或 10,000-20,000RPM， 以更快者为准 ) 离心沉淀 至少 15 分钟， 但不长于 45 分钟。将包含周质级分的上清液倒入新容器且使用称出的固体 调节至 25mM 咪唑， 500mMNaCl。 该溶液通过 0.22um 滤器过滤， 然后使用瓶顶滤器 (Nalgene) 纯化。
     固定的金属亲和色谱 (IMAC) 捕获
     常规上， 将 5mL HisTrap HP 柱 (GE Healthcare) 用于 IMAC 步骤， 然而， 柱的尺 寸可以按比例放大或缩小， 取决于通过分析 IMAC-SEC 测定法测得的周质部分中的 scFv 靶物的量。已显示该 IMAC 树脂的结合能力至少为 20mg/mL 填充床。如果使用尺寸大于 10mL 的柱， 优选内径为 2 和 5cm 的 Waters 玻璃柱 (Millipore)。使用合适的色谱工作站 (Akta Explorer， 使用 UNICORN 软件 4.1 和更高版本 [GE Healthcare]， 或 BioCAD Sprint， 700E， 或 Vision， 使用 Perfusion Chromatography 软件， 版本 3.00 或更高版本 [Applied Biosystems])， 将 IMAC 柱在 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 25mM 咪唑 pH 7.5 中平衡， 且周质级分 以不快于 190cm/hr 上柱直到耗尽。用平衡缓冲液洗涤柱子直到在不超过 190cm/hr 的流速 下在 UV A254nm 和 UV A280nm 的监测基线稳定至少 2 个 CV。使用 50mM NaPO4， 500mM NaCl， 400mM 咪唑， pH 7.5 以不快于 190cm/hr 竞争性洗脱结合的蛋白。 洗脱级分通过 UV@A280nm、 分析型大小排阻色谱、 和 SDS-PAGE 评估蛋白质含量。
     其它色谱技术
     通过 SDS-PAGE 凝胶和分析型大小排阻色谱 (SEC) 评估 IMAC 池 (pool) 的纯度。 如 果该池不适合通过 SEC 最终提纯， 则使用其它色谱技术以进一步纯化靶 scFv 蛋白质以去除 残余宿主细胞污染物和聚集体。这些常规技术包括阴离子交换、 阳离子交换和疏水相互作 用。也使用其它基于亲和力的方法， 包括， 但不限于使用 c- 端 myc 标签， 借助抗 myc 树脂或 使用共价偶合至刚性珠子的合适的配体的配体亲和力方法。 这些其它技术的用处依具体的 蛋白质而定。
     大小排阻色谱法 (SEC)
     通过 UV@A280nm 和分析型 SEC 方法评估的蛋白质的量确定了所用的凝胶过滤柱 的尺寸 ： ＜ 1mg ＝ 10/300Superdex 200GL 柱， 1-10mg ＝ 16/60Superdex 200， ＞ 10mg ＝ 26/60Superdex 200( 均获自 GE Healthcare)。 IMAC 洗脱池使用 10kD MWCO Ultracel 离心 浓缩机 (Millipore) 浓缩， 且最终浓缩物体积不大于使用的凝胶过滤柱的体积的 3％。将 浓缩物注射入柱， 等度洗脱蛋白质， 流速不超过 76cm/hr 且不慢于 34cm/hr。通过 SDS-PAGE 分析洗脱级分， 制成合适的池。
     内毒素去除
     关于内毒素水平的最终产物规格依据一个特定群集的状态来确定。使用 10kD MWCO Ultracel 离心浓缩机 (Millipore) 将 SEC 池浓缩至＞ 0.25mg/mL( 通过 UV@A280nm 测定 )。Mustang E 0.22um 滤器 (PALL) 用 SEC 流动相缓冲液预润湿， 通过手动注射递送系 统将 SEC 浓缩物通过该滤器过滤， 流速为～ 1mL/min。使用 PTS EndoSafe 系统 (Charles River) 测试最终过滤产物的内毒素， UV@A280nm 浓度， 等分储存。实施例 7 ： 利用 293/KDR/KZ136/c22VEGF-A- 诱导的基于细胞的荧光素酶测定法鉴 别中和性抗人 VEGF scFv
     为筛选候选分子 (scFv) 中和人 VEGF-A 的活性的能力， 进行基于细胞的荧光素酶 测定法。293/KDR/KZ136/c22 细胞于 100μl 完全培养基 (DMEM， 10 ％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中以 10,000 细胞 / 孔的接种密度铺板于 96 孔不 透明白色组织培养处理板 (Costar#3917)， 在 37℃湿润的 5％ CO2 培养箱中孵育 48 小时。 48 小时后， 通过真空抽吸去除完全培养基， 用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax(Invitrogen)) 替换， 孵育过夜。
     第二天， 将候选 VEGF-A 中和性分子 (scFv， Fab)， 阳性对照 ( 贝伐单抗 ( 抗 VEGF-A 单克隆抗体， Genentech)， ranibizumab( 抗 VEGF-A 亲和力成熟 Fab， Genentech) 和内部制 备的贝伐单抗 Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一起在无血清培养基中以 1 ∶ 5 稀释从 200nM 连续稀释至 12pM。向这些之中， 添加等体积的 0.54nM VEGF-A165， 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 地中和分子或阳性对照。将这些在 37℃培养 60 分钟。培养后， 将培养基从 血清饥饿细胞吸出， 添加 100μl 上述复合物， 并在 37℃培养 4 小时。
     4 小时孵育后， 使用荧光素酶测定系统 (Promega， E1501) 根据制造商的说明进行 荧光素酶测定。简言之， 吸出培养基且将 25μl 1X is 缓冲液 (Promega， E153A) 添加至各 孔。将平板在室温孵育 20-30 分钟以平衡。使用微板发光计 (Berthold Technologies)、 以 40μl 的底物注射量、 1 秒的积分时间测量荧光素酶活性。使用分析软件 (Spotfire) 分析 数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     VEGF-A165 与其受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱发一个信号级联， 使驱使 荧光素酶报道基因转录的 STAT( 转录的信号转导物和活化剂 ) 和 / 或 SRE( 血清 - 响应元 素 ) 活化。荧光素酶活性的降低表明该 VEGF-A 介导的信号传递被中和。
     结果 ： 针对下表 6 所列的 scFv 在荧光素酶测试中筛选中和 VEGF- 诱导的活性。若 干被筛选的 scFvs 显示了显著抑制 ( 在表 6 中报道为 IC50 值 )。 IC50 值表示为中和 VEGF- 活 性 达 50 ％ 所 需 的 scFv 的 nM 浓 度。 贝 伐 单 抗 (AvastinTM)， LucentisTM， 和 AvastinTM Fab( 内部制备 ) 用作活性的对照。
     表6： scFvs 和对照在基于细胞的荧光素酶测定中的活性
     IC50(nM)
     AvastinTM LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 0.1-0.4 0.1-0.5 2.9-6.45 0.95 0.16-0.3 0.07实施例 8 ： 用于测定 VEGFA scFv 对人 VEGF-A- 刺激的 HUVEC 细胞的中和活性的增殖测定 为筛选对 VEGF-A 具有适中亲和力的中和 VEGF-A scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组 人 VEGF-A165 以 2.6nM 用作阳性对照。含有 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。将人 VEGF-A scFv 在 SFM 中连续稀释为 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内 皮细胞 (HUVEC) 铺板于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 该 HUVEC 细胞在 37℃， 5％ CO2 下在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中铺板 2 天。细 胞用 SFM 血清饥饿培养 24h， 用 2.6nM 在有或没有连续稀释的 VEGF-A scFv 的情况下刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H- 胸苷 ( 其掺入增殖中的细胞 ) 冲激 24h( 均在 37℃， 5％ CO2)。收 集细胞且使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 如表 7 所示的低 nM IC50 值可见， 大量在该测定中筛选的 scFvs 显示人 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖的有效中和。
     表7： HUVEC 增殖测试中的抗 VEGF-A scFv 中和活性
    
     scFvs 和对照 AvastinTM
     LucentisTM AvastinTM Fab c1094.1_1 c870.1_1 c1039.1_1 c870e6
     0.3-0.8 14-17 1.00 0.8-2 0.7 1.6-4 IC50(nM) 0.3-0.6实施例 9 ： VEGF-A 拮抗剂的表位分拣 (Epitope Binning)
     进行表位分拣实验以测定哪种 VEGF-A 拮抗剂能同时结合至人 VEGF-A。竞争抗原 上的相同或重叠的结合位点 ( 表位 ) 的 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合， 在功能上分组到同一 家族或 “表位仓” (Epitope Bin) 中。不竞争抗原上的相同结合位点的 VEGF-A 拮抗剂能同 时结合， 被分组到不同的家族或表位仓中。 实验使用 Biacore T100TM 仪器进行。 Biacore 仅 仅是通常用于将抗体片段和单克隆抗体组 (panels) 分配至表位仓的多种测试形式中的一 种。许多文献 ( 例如， The Epitope Mapping Protocols， Methods in Molecular Biology， Volume 6， 6 Glenn E.Morris ed.) 描述了备选方法， 其可用于 “储藏” 抗体片段且预期能提 供关于 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合特征的参照数据。表位分拣实验使用可溶的天然 人 VEGF-A 作为抗原进行。材料和方法 ： 在 BIACORE T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行两 个单独的表位分拣实验。在两个实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂使用胺偶联化学 (EDC:NHS) 共 价固定在 CM5 传感器芯片上， 达到密度约 800-1000RU。 固定化过程后， 用乙醇胺封闭流动室 上的剩余活性位点。通过用 50mM NaOH 洗涤去除非特异结合的蛋白质。参照室也被活化， 然后用乙醇胺在没有 VEGF-A 拮抗剂的条件下封闭。
     在第一组实验中， 将第二 VEGF-A 拮抗剂和 VEGF-A 抗原稀释至 100nM。 注射 VEGF-A 抗原且使其特异结合于固定在传感器芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。VEGF-A 是二聚物， 因此对 每个 VEGF-A 拮抗剂而言存在两个潜在的结合位点。为保证所有结合位点被占据， 将先前固 定的第一 VEGF-A 拮抗剂注射在 VEGF-A 上。该步骤后， 注射第二 VEGF-A 拮抗剂以观察与 VEGF-A 的同时结合。
     在第二组分拣实验中， 第一 VEGF-A 拮抗剂再次共价固定至 BIACORECM5 传感器芯 片的单独的流动细胞。 然而， 在该实验中， 将 10nM VEGF-A 抗原与 1mM 第二 VEGF-A 拮抗剂预 混合， 然后以竞争形式注射在固定的第一 VEGF-A 拮抗剂上。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的缓 冲液中进行。还进行了缓冲液注射以减少仪器干扰和误差。在循环之间， 在每次注射循环 后通过注射 60 秒 10mM 甘氨酸 (pH 1.5， 50ul/min) 来再生俘获表面。这样做从该表面上去 除了结合的 VEGF-A。数据使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑。
     两组实验结果都由如下解释。如果第二 VEGF-A 拮抗剂不能与第一拮抗剂同时结 合至 VEGF-A 抗原， 则将其功能性归类到单一的家族或表位仓中。然而， 如果第二 VEGF-A 拮 抗剂能与第一拮抗剂同时结合至抗原 ( 通过显示芯片表面的质量增加 )， 则其归类到不同 的家族或表位仓中。 将各 VEGF-A 拮抗剂本身作为阴性对照进行测试以建立背景 ( 无结合 ) 信号水平。
     结果 ： 使用上述两组实验的结合数据， 将纯化的 VEGF-A 拮抗剂分配至表位仓中。 TM BIACORE 报道的信号 (RU， 应答单元 ) 与传感器芯片表面上的质量直接相关。一旦建立了 阴性对照相关的本底信号 (RU) 的水平 ( 相同 VEGF-A 拮抗剂用作第一和第二拮抗剂 )， 则 分拣结果报道为阳性或阴性结合。阳性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂能同时结合抗原。 阴性结合表明两个不同 VEGF-A 拮抗剂不能同时结合抗原。
     利用这些实验中阳性响应值和阴性响应值之间的差异将 VEGF-A 拮抗剂指配到三 个家族或表位仓中 ( 参见表 8)。第一表位仓以克隆 c636 产生的 VEGF-A 拮抗剂代表。第二 表位仓以 VEGF-A 拮抗剂 c868、 c1039 和 c1081 代表。值得注意的是， 当 c636 先与 VEGF-A 相互作用时， c868 和 c1039 都显示同时结合。当 c868 或 c1039 先与 VEGF-A 相互作用时， c636 不显示任何结合， 因此 c868 和 c1039 重叠了 c636 的表位。此外， VEGF-A 拮抗剂 c870 重叠了仓 #1 和仓 #2。第三表位仓由 VEGF-A 拮抗剂 c820 和阳性对照 VEGF-A 抗体 ( 小鼠抗 VEGF-A 单克隆抗体， R&D Systems) 代表。这些 VEGF-A 拮抗剂在所有其它 VEGF-A 拮抗剂的 存在下都显示同时结合。所有分拣实验中测试的拮抗剂都显示一定程度地中和 VEGF-A 促 分裂原活性。
     表8： 中和性 VEGF-A 拮抗剂的表位仓指配
    58102448984 A CN 102449007 表位仓 # 仓 #1 ： 仓 #2 ： 仓 #1/2 ： 仓 #3 ：
    说明书VEGF-A 拮抗剂 c636 c868， c1039， c1081 c870 c82055/82 页实施例 10 ： 通过表面等离子共振 (Biacore) 测量人 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的结 合亲和力
     使用表面等离子共振评估克隆 c870 和 c1039 产生的一价人 VEGF-A 拮抗剂与人 VEGF-A 的结合亲和力。 通过表面等离子共振测量 VEGF-A 拮抗剂与 VEGF-A 的相互作用的亲 和力决定动力学速率常数和平衡解离常数用。 结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 是反映抗原 - 拮抗 剂复合物形成的速率的值。解离速率常数 (kd(s-1)) 为反映复合物稳定性的值。将结合速 率常数除以解离速率常数 (ka/kd) 得到平衡结合常数 (KA(M-1))。用解离速率常数除以结 合速率常数 (kd/ka) 得到平衡解离常数 (KD(M))。该值描述了相互作用的结合亲和力。KD 相同的相互作用可具有广泛变化的结合和解离速率常数。因此， 同时测量 ka 和 kd 有助于更 独特地描述相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 进行一系列实验以测量克隆 c870 和 c1039 产生的纯化的 VEGF-A 拮 抗剂的结合亲和力。在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行结合 动力学和亲和力研究。方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 1.1.1 编程。制备带有 His6/Myc 表位标签的 VEGF-A 拮抗剂。亲和力分析通过使用固定在 CM5 芯片上的抗 His6/ Myc 抗体俘获 VEGF-A 拮抗剂而进行。以 1 ∶ 1 摩尔比混合抗 His6 和抗 Myc 抗体， 并利用胺 偶联化学将它们共价固定至 CM5 传感器芯片， 达到为约 7500RU 的密度。 以 10ul/min 将 10nM VEGF-A 拮抗剂注射到单独的流动室上， 保持 1 分钟， 然后是 1 分钟稳定化时间。将 VEGF-A 连续的 1 ∶ 3 稀释物 (33.3nM-0.14nM) 注射在该表面上， 使之特异结合于被俘获在传感器 芯片上的 VEGF-A 拮抗剂。进行每个浓度的 VEGF-A 的双重注射， 结合时间为 5 分钟， 离解 时间为 10 分钟。以 30μL/min 的流速进行动力学结合研究。所有结合实验在 25℃在 10mM HEPES， 500mM NaCl， 3mM EDTA 0.05％表面活性剂 P20， 0.1mg/ml 牛血清白蛋白， pH 7.4 的 缓冲液中进行。在循环之间， 用 50mM H3PO4 洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤将被俘获 的 VEGF-A 拮抗剂从固定化的抗体表面上去除， 且容许之后下一样品的结合。
     使用 Biacore T100TM 评价软件 ( 版本 1.1.1) 编辑数据。数据通过减去参照流动 室和空白注射处理。 评估基线稳定性以保证该再生步骤在整个注射的顺序中提供一致的结 合表面。检查重复注射曲线的再现性。由于 VEGF-A 抗原形成二聚物， 将所得结合曲线整体 拟合于二价分析物相互作用模型。
     结果 ： 表征了两种 VEGFA 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力 ( 结果示于表 9)。 测量这 些人 VEGF-A 拮抗剂的结合速率常数 (ka(M-1s-1)) 和解离速率常数 (kd(s-1))。由 ka 和 kd 值计 算 KD 和 KA。该数据与二价分析物模型良好拟合。该模型测量 ka(ka1 和 ka2) 和 kd(kd1 和 kd2) 的两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的单价动力学， 其报道于表 9。这些样品报道的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1。由 ka 和 kd 值计算出 KD 和 KA。所有三种 VEGF-A 拮抗剂显示对 VEGF-A 抗原类似的亲和力 (KD ＝ 0.7-1.0E-9M)， 且这些结果在两次独立运行 中一致。
     表9： VEGF-A 拮抗剂对 VEGF-A 的结合亲和力的表征
    实施例 11 ： 抗 VEGF-A 抗体的表位作图
     使 用 JPT VEGF-A RepliTopeTM 载 玻 片 对 克 隆 c870 和 c1039 产 生 的 单 克 隆 人 VEGF-A 抗体评价其与人 VEGF-A 的肽结合。
     材料和方法 ： 各 JPT 载玻片由一式三份如下所述的阵列组成。每个阵列的组成如 下： 连续的、 重叠的 VEGF-A 的 13aa 片段 ( 点 1-78)， 接着是连续、 重叠的 VEGF-A 的 20aa 片段 ( 点 85-115)。 此外， 各种测试抗体和小鼠和人 IgG 的对照点分布于各阵列的顶侧、 底侧和侧 面。 进行了一系列实验以测定 scFv c870 和 c1039 相对于人 VEGF-A 蛋白质的合成的直链肽 的结合能力。用 His/Myc 表位标签标记抗人 VEGF-A scFv。将 10-100μg/ml 的抗体溶液施 加至肽载玻片。然后将抗 His 和 / 或抗 Myc 抗体施加至载玻片。根据试剂盒描述的方法用 生物素化酪胺 (Tyramide) 扩增信号 (Renaissance TSATM Biotin System， PerkinElmer， #NEL700A)。结合的抗体使用链亲和素碱性磷酸酶和 DAKO Permanent Red 染料显色。
     数据使用自制显微镜载玻片扫描仪编辑， 其由 Nikon Eclipse TE2000U 倒置显微 镜， ASI MS-2000 电动台， Photometrics Cascade II 512 相机和 X-cite 120 荧光照明系统 组成。信号强度使用 MetaMorph v7.1 成像软件分析。
     结果 ： 结合肽的位置和序列示于下表 10。数字代表相对总体信号强度的肽的百分 比信号强度。
     表 10
    
    “β7 后” 区域是 VEGF 分子的肝素结合域。
     所有抗体均显示在 α2-β2 区周围有特异性结合位点。该数据表明被测抗体可分 为两类 ： 抗体 c870 优选 VEGF 的 c- 端侧， 而抗体 c1039 对蛋白质的 n- 端侧具有更强的结 合。抗体 c870 具有最少的结合肽而抗体 c1039 具有最分散的结合模式。各抗体的前两个 结合位点列于下表。
    
    
     结合等级 A2131/c1039 A2128/c870*表 1161102448984 A CN 102449007 1 2
    说明书α2-β2 α158/82 页β7 后 α2-β2实施例 12 ： 使用 VEGFR2 磷酸化测定法测试 VEGF-A 结合性 scFv 与抗鼠 VEGF-A 的 双特异性抗体的交叉反应性
     为筛选候选分子 (scFv， Fab 和双特异物 ) 中和鼠 VEGF-A 的活性的能力， 进行了 一项基于细胞的发光测定， 其测量 VEGFR2(KDR/Flk-1) 磷酸化。因为 mVEGF-A164 将与人 VEGFR2 交叉反应， 可使用基于人 VEGFR2 的报道物体系。将 293/KDR/KZ136/c22 细胞以 20,000 细胞 / 孔的密度在 100μl 完全培养基 (DMEM， 10％胎牛血清 (FBS)， 1X 丙酮酸钠、 1X GlutaMax(Invitrogen)) 中铺板于透明 96- 孔组织培养板， 且使之贴壁过夜。第二天， 通过 真空抽吸去除完全培养基， 并用 100μl 无血清培养基 (DMEM， 1X 丙酮酸钠， 1X GlutaMax) 替 换。将细胞温育过夜。
     第二天， 将候选的 VEGF-A 中和分子 (scFv， Fab) 与非中和剂 ( 仅培养基 ) 一道在 无血清培养基中以 1 ∶ 5 的稀释度从 200nM 连续稀释至 12pM。VEGFR2-Fc 用作中和的阳性 对照。向这些中添加等体积的 0.54nM 的 mVEGF-A164(493-MV-005， R&D Systems)， 以达到 终浓度为 0.26nM VEGF-A 和 100nM 至 6pM 的中和分子或阳性对照。将这些在 37℃孵育 60 分钟。
     孵育后， 通过真空抽吸从血清饥饿细胞去除培养基， 并用 100μl 上述复合物替 换。将细胞在 37℃孵育 10 分钟。孵育后， 通过真空抽吸去除培养基， 并轻柔地用 100μl 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS， Invitrogen) 洗涤细胞。通过真空抽吸去除 PBS， 将细胞在 25μl NP-40 溶解缓冲液 (Invitrogen Cat.#FNN0021) 中溶解， 该溶解缓冲液每 10mL 包含 1mM PMSF(Sigma， P-2714， 溶于 DMSO) 和 1 片 Complete Mini 片剂 (Roche， 11836153001)。 将溶解产物在 4℃在平台振荡器上孵育 20 分钟， 然后 4℃ 3000rpm 离心 10 分钟以使溶解产 物澄清。将溶解产物转移至新的 96- 孔微量滴定板上， -20℃放置直到测定。
     对于 VEGFR2 磷酸化发光测定， 根据制造商的说明使用细胞内蛋白质缓冲液试剂 盒 (Invitrogen LHB0002) 和 VEGFR2[pY1059] 抗体珠子试剂盒 (Invitrogen LHO0601)。 将 溶解产物解冻， 以 1 ∶ 5 与 80μl 测定稀释剂混合。将发光真空过滤板的孔用 200μl 工 作洗涤溶液预先润湿。以每孔 25μl 添加经稀释的珠子， 并用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 2 次。 洗涤后， 将 50μl 稀释的溶解产物和 50μl 稀释的检测抗体添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 室温 (RT) 孵育 3 小时。孵育后， 用 200μl 工作洗涤溶液洗涤珠 子 2X， 然后将 100μl 稀释的抗兔 IgG-RPE 添加至各孔， 将板用箔覆盖， 在平台振荡器上以 500rpm 在室温孵育 30 分钟。孵育后， 将珠子用 200μl 工作洗涤溶液洗涤 3X， 且重悬浮于 125μl 工作洗涤溶液。将珠子在平台振荡器上以 500rpm 重悬浮 30 秒， 用发光 -100 仪器 (BioRad) 读数。使用分析软件 (Spotfire) 分析数据， 并计算各候选物和对照物的 IC50 值。
     结果 ： mVEGF-A164 对人受体 VEGF-R2(KDR/Flk-1) 的结合作用诱导该受体的磷酸 化。该基于发光的测定将总 VEGF-R2 结合于与抗 VEGFR2 抗体缀合的、 荧光标记的珠子。利 用检测 [pY1059] 的磷酸化的第二抗体来检测有多少 VEGFR2 已被磷酸化。如下表 12 所示， 许多中和了人 VEGF-A 活性的 scFv 也在该测定抑制了小鼠 VEGF 活性。包含相同这些 scFv 的双特异性抗体也中和了小鼠 VEGF-A 活性。表 12 ： VEGF-A 特异 scFv 和双特异性抗体中和小鼠 VEGF-A 活性scFv c870 c1039 c1094 IC50(nM) 0.16 无活性 0.55实施例 13 ： 用于测定 scFvs 对小鼠 VEGFA(VEGF-A164) 刺激的 HUVEC 细胞的中和 活性的增殖测定
     为筛选中和小鼠 VEGF-A 的 scFv， 进行 3H- 胸苷测定。重组小鼠 VEGF-A164 以 2.6nM 用作阳性对照。含 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒的 DMEM-F12(1 ∶ 1) 培养基 ( 无血清 培养基， SFM ； Invitrogen， Carlsbad， CA) 用作阴性对照。scFv 分子在 SFM 中连续稀释至 500nM， 50nM， 5nM， 0.5nM， 0.05nM， 0.005nM， 和 0.0005nM。 将人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 铺板 于 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 900-1000 细胞 / 孔。 将 HUVEC 细胞在完全 EGM-2MV 培养基 (Lonza， Walkersville， MD) 中在 37℃， 5％ CO2 下铺板 2 天。将细胞用血清饥饿培养
    24h， 在或有或没有连续稀释的 VEGF-AscFv 的条件下用 2.6nM 刺激 24h， 且每孔用 1μCi 3H 胸苷脉冲 24h， 该胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并使用 Topcount 仪 (Hewlett Packard) 计数。
     结果 ： 从如下表 13 所示低 nM IC50 值可见， 该测定中被筛选的多种 scFv 显示有效 地中和小鼠 VEGF- 诱导的 HUVEC 增殖。
     表 13 ： 通过 VEGF-A- 特异性 scFv 中和小鼠 VEGF-A 诱导的 HUVEC 增殖
     scFv c870 c1094 c1039
     IC50(nM) 0.36 2.84 无活性实施例 14 ： 构建可溶 FGFR3IIIc C-term Fc5 表达质粒以表达第一、 第二和第三细 胞外 Ig 样域或包括第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式
     生成了包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式的一系列表达构建体。这些人 FGFR3IIIc 序列 段与下游 C- 端 Fc5 序列融合。该系列中的构建体包括上述的序列区和一个点突变， 该点突 变分别在 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 262 处和 SEQ ID NO ： 10 的残基 142 处产生色氨酸残 基 ( 突变的 249 位以天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列为参照 ) 代替该位置上的丝氨酸。该突变 记录为 S249W。这些构建体通过 PCR 和同源重组使用编码上述 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段、 Fc5 片段和表达载体 pZMP31 产生。为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体指定的 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)， 产生了三个 PCR 片段且将它们一起通过酵母重组引入 pZMP31 载体。第一 片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列的 5’ 重叠， 后面是编码 S249W 点突变 的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列的 3’ 重叠。对于该片段， PCR 扩增反应 使用 5’ 寡核苷酸 zc62552((SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 起始于 SEQ ID NO ： 2 的 E36))。片段将克隆为 pZMP31， 使用 opTPA 前 导序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 1-35)。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反 向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与在 5’ 端 嵌套 Rec 序列的正向引物一起使用 )， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。
     第二片段呈现 ： 与上游人 FGFR3IIIc 序列的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的 人 FGFR3IIIc 的序列和与 Fc5 序列 (SEQ ID NO ： 2 的残基 389-620) 的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62556(SEQ ID NO ： 82)( 正向引物， 用于以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 sol.Rec 序列的 3’ 端的反向引 物一起使用 )。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62553(SEQ ID NO ： 6) ： ( 反向引物， 以使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375。片段将具有重叠的 Fc5 序列 ) 进行， 且使用 clonetrack ID#102551 人 FGFR3IIIc 作为模板。
     第三片段包含 Fc5 序列且呈现与人 FGFR3IIIc 的 5’ 重叠和与 pZMP31 载体序列的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62554(SEQ ID NO ： 7)。( 正向引物， 用 于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 sol.FGFR3IIIc 的序列至 G 375)。 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62555(SEQ ID NO ： 8)( 反向引物， 用于使用 Fc5 作为模板产生 PCR 片段。片段将具有重叠的 pZMP31 的序列 ) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1699， IL17REFc5 作 为模板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应条件如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 1 分 30 秒 ； 1 个循环， 72℃， 7 分钟。PCR 反应混合 物 1％琼脂糖凝胶上运行， 并使用 QIAquickTM 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从 凝胶提取对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 pZMP31 为哺乳动物表达载体， 其包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表 达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动 物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启动子， 增强子和复制起点， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及在酿酒酵母中的选择和复制所需的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     之前， 用 BglII 消化该质粒 pZMP31， 然后与下列上文提到过的凝胶提取的 PCR 片段 在酵母中重组。将 50μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 3μl 各个 PCR 片段插入 DNA 和约 50ng BglII 消化的 pZMP31 载体混合。将该混合物转移至 0.2cm 电穿孔小杯。使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF， 对酵母 / DNA 混合物进行电脉冲。 将 300μl 1.2M 山梨醇添加至小杯， 将酵母以 75μl 和 200μl 的等 分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。约 72 小时后， 将来自一块板的 Ura+ 酵母转化体 重悬于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062MTris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymo 裂合酶 /100ul 的 100ul Qiagen小提试剂盒缓冲液 P1。然后将该混合物在 37℃孵育约 15 分钟， 小提试剂盒的余下操作根 据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 酵母 DNA 制备物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。细胞以 1.75kV， 25μF、 400 欧姆电脉冲。电穿孔后， 添加 .5ml LB， 然后 将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼 脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择包含正确序列的一个克隆。使用可商购的试 剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明分离大规模质粒 DNA。
     使用相同的方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 其称为 MPET 构 建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)。 第一片段呈现 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序 列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列和与下游人 FGFR3IIIc 序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560((SEQ ID NO ： 11) ( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 Ig D2D3 形式。截 短的 FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 2 的 D156， Ig D2 的上游。将利用 opTPA 前导序 列克隆至 pZMP31 中的片段 ))。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc62557(SEQ ID NO ： 4)( 反向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。片段将产生 S249W 突变。与嵌套在 Rec 序列 的 5’ 端的正向引物一起使用 )) 进行， 且使用 clonetrackID #102551 人 FGFR3IIIc 作为模 板。片段使用如前文所述的相同 PCR 热循环制备， 并将该片段与上述第二和第三片段一起 引入 BglII 消化的 pzMP31 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。
     使用 Qiagen 大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。对于全 长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5， 和截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体， 分别称为 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2) 和 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)， 将 200μg 的每种 表达构建体大提质粒用约 240 单位的 BstB1 限制酶在 37℃消化 2 小时， 用苯酚 / 氯仿 / 异 戊醇洗涤， 然后用氯仿 / 异戊醇洗涤， 然后用乙醇沉淀过夜， 且在 1.5mL 微量离心机管离心。 倾出上清液， 用 1mL 70％乙醇洗涤离心沉淀， 在室温孵育 5 分钟。将管在微量离心机中以 14,000RPM 旋转 10 分钟， 且倾去离心沉淀的上清液。 在组织培养罩的无菌环境中， 将离心沉 淀在空气中干燥约 5 分钟， 然后重悬浮于 0.4ml 37℃预热的 CHO 细胞组织培养基中， 且使之 在 37℃孵育 10 分钟。 对 DNA 离心沉淀被溶解时， 对各个待电穿孔的载体， 将约 9x 106CHO 细 胞离心沉淀后重悬于 4ml CHO 细胞组织培养基中， 并与重悬的质粒 DNA 混合， 达到最终体积 为 800ul。将 DNA/ 细胞混合物置于 0.4cm 缝隙小杯中， 使用以下参数电穿孔 ； 950μF， 高电 容， 300V。然后， 对于每个质粒电穿孔组， 移出试管的内含物， 汇总， 用 CHO 细胞组织培养基 稀释至 25mL， 置于 125mL 摇瓶中。将瓶置于培养箱中振荡器上， 37℃， 5％ CO2120RPM 摇动。
     CHO 细胞用 500nM 甲氨蝶呤 (MTX) 进行营养物选择和扩增。选出的 CHO 细胞系称 为 MECL 1334(solFGFR3IIIc(23375)(S249W)Fc5) 和 MECL 1337(solFGFR3IIIc(143_375) (S249W)Fc5)。
     为测试表达， 使用电穿孔后汇集物第 3 代建立培养。将细胞离心后 .5e6c/ml 重悬 浮于 50ml 体积新鲜培养基 ( 无选择 )， 且使之如上所述进行 96 小时。通过蛋白质印迹证实 蛋白质表达。启动大型转瓶以产生用于纯化的蛋白质。利用第 6 代的转染后 CHO 细胞池 MECL 1334 和 MECL 1337， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 且添加 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来 自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070) 和 500nM 甲氨蝶呤， 开始生成 200ml 接种培 养物。将瓶在 37℃ 120rpm 和 6％ CO2 下培养。6 天后， 将每个 CHO 池瓶接种至一个 3L 转 瓶中， 使用 ZM2 培养基 (SAFC Biosciences Ex-CELL 目录号 68041)， 加有 5mM L- 谷氨酰胺 ( 来自 200mM L- 谷氨酰胺， Gibco 目录号 25030-081)， 1mM 丙酮酸钠 ( 来自 100mM 丙酮酸钠， Gibco 目录号 11360-070)， 无选择， 达到 1L 工作体积， .5e6c/ml。将旋转瓶在 37℃， 95rpm 和 6％ CO2 培养。接种后约 24 小时后， 将另外 .5L 培养基添加至各个转瓶中以达到最终体 积为 1.5L， 继续培养。接种后约 8 天， 收集条件化培养基， 0.2μM 过滤后， 用于蛋白质纯化。
     用类似方法产生 FGFR3 Fc5 区的另外的构建体， 包括可溶全长和截短的形式， 没有 点突变， 或在序列中具有使得 SEQ ID NO ： 15 的 263 位和 SEQ ID NO ： 22 的 143 位的脯氨酸 残基改变为精氨酸 ( 标注为 P250R) 的突变 ( 突变的 250 位是参照天然 FGFR3IIIc 氨基酸 序列 )。该寡核苷酸和所得的构建体用相应的序列标识符标示于下。
     表 14
     pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1917(SEQ ID NOS ： 1 和 2)
    
    
    
    表 15 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(S249W)Fc5， 构建体 #1920(SEQ ID NOS ： 9 和 10)
    
    
    表 16 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)Fc5， 构建体 #1916(SEQ ID NOS ： 12 和 13)
    
    
    表 17 pZMP31solFGFR3IIIc(23_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1918(SEQ ID NOS ： 14 和 15)
    
    
    表 18 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)Fc5， 构建体 #1919(SEQ ID NOS ： 18 和 19)
    
    
    表 19 pZMP31solFGFR3IIIc(143_375)(P250R)Fc5， 构建体 #1921(SEQ ID NOS ： 21 和 22)使用了类似方法产生 FGFR2αIIIc Fc5 的可溶形式的构建体区域， 包括可溶全长 和截短的形式， 没有点突变或在序列中具有使 SEQ ID NO ： 29 的 266 位和 SEQ ID NO ： 40 的 143 位的丝氨酸残基改变为标注为 S252W 的色氨酸， 或 SEQ ID NO ： 33 的 267 位和 SEQ ID NO ： 42 的 144 位的脯氨酸残基改变为精氨酸 ( 标注为 P253R) 的突变 ( 突变的位置是参照 天然 FGFR2αIIIc 氨基酸序列 )。
     表 20
     pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)Fc5， 构建体 #1945(SEQ ID NOS ： 23 和 24)
    
    
    
    表 21 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(S252W)Fc5， 构 建 体 #1946(SEQ ID NOS ： 28 和29)
    
    表 22 pZMP31solFGFR2αIIIc(22_377)(P253R)Fc5， 构 建 体 #1947(SEQ ID NOS ： 32 和33)
    
    
    表 23 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)Fc5， 构建体 #1948(SEQ ID NOS ： 36 和 37)
    
    表 24 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(S252W)Fc5， 构建体 #1949(SEQ ID NOS ： 39 和40
    
    表 25 pZMP31solFGFR2αIIIc(145_377)(P253R)Fc5， 构建体 #1950(SEQ ID NOS ： 41 和42)
    实施例 15 ： 多特异性、 可溶 FGFR3IIIc Fc5 VEGFA scFv 表达质粒的构建
     生成一系列表达构建体， 其包含人 FGFR3IIIc 的第一、 第二和第三细胞外 Ig 样域或 具有人 FGFR3IIIc 的第二和第三细胞外 Ig 样域的截短的形式。这些人 FGFR3IIIc 序列区段 与下游 C- 端 Fc5、 接头、 下游 c- 端用于特异结合至 VEGF-A 的 scFv 序列融合。该系列中的 构建体包括上述的人 FGFR3IIIc 序列段和一个点突变 ( 其在 SEQ ID NO ： 64 的氨基酸 162 位 和 SEQ ID NO ： 62 的 142 位产生色氨酸残基以代替丝氨酸 )。该突变记录为 S249W。( 突变 的位置参考天然 FGFR3IIIc 氨基酸序列 )。这些构建体通过使用 PCR 和同源重组 ( 利用编码 FGFR3IIIc 域的 DNA 片段与 Fc5 序列和包含 VEGF-A scFv 序列 870e6 和 1094.1 的表达载体 pZMP31 进行 ) 而产生。
     为产生全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5c870e6 和全长可溶人 FGFR3IIIc(S249W) Fc5c1094.1 构建体， 产生 PCR 片段且通过酵母重组将其引入基于 pZMP31 的载体， 其中基 于 pZMP31 的载体包含接头和下游 VEGFAscFv 序列 870e6 或 1094.1( 称为 MVC 709-SEQ ID NO ： 43 和 44 ； 以及 MVC 710-SEQ ID NO ： 45 和 46)。该 PCR 片段包含 ： 与基于 pZMP31 的载体 序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序 列， Fc5 序列、 以及与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62552(SEQ ID NO ： 3)( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片段。FGFR3IIIc 序列起始于 Ig D1 上游的 E23。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 使用 MPET 构建体 #1917(SEQ ID NO ： 1) 作为模 板。
     产生上述三个片段的 PCR 扩增反应如下 ： 1 个循环， 95℃， 5 分钟 ； 25 个循环， 95℃， 30 秒， 然后 55℃， 30 秒， 然后 68℃， 2 分钟 ； 1 循环， 72℃， 7 分钟。在 1％琼脂糖凝胶上运行 TM PCR 反应混合物， 且使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Cat.No.28704) 从凝胶提取 对应于预期大小的 DNA 片段。
     质粒 MVC 709 和 MVC 710 是基于 pZMP31 的哺乳动物表达载体， 其包含鼠 Fc2、 接 头、 和 870e6(SEQ ID NO ： 43) 或 1094.1scFv(SEQ ID NO ： 45) 的下游序列、 VEGF-A 结合序列。 这些载体包含具有嵌合 CMV 增强子 /MPSV 启动子的表达框， 用于在酵母重组之前线性化的 Fse1、 Nar1 和 BglII 位点， 大肠杆菌复制起点 ； 哺乳动物选择标记表达单位， 其包含 SV40 启 动子， 增强子和复制起始区， DHFR 基因， 和 SV40 终止子 ； 以及酿酒酵母中的选择和复制所需 的 URA3 和 CEN-ARS 序列。
     将质粒 MVC 709 和 MVC 710 用 BglII 限制酶消化， 然后与下列上文提到的凝胶提
     取的 PCR 片段在酵母中重组。将 60μl 感受态酵母 ( 酿酒酵母 ) 细胞与 5μl 的各个 PCR 片段插入的 DNA 和约 50ng BglII 消化的 MVC 709 和 MVC 710 载体混合。将该混合物转移 至 0.2cm 电穿孔小杯。对酵母 /DNA 混合物电冲激， 使用的电源 (BioRad Laboratories， Hercules， CA) 设置为 0.75kV(5kV/cm)， ∞欧姆， 和 25μF。 将 400μl 1.2M 山梨醇添加至小 杯， 然后将酵母以 75μl 和 200μl 等分铺板于两块 URA-DS 板上， 在 30℃孵育。 约 72 小时后， + 将来自一块板的 Ura 酵母转化体重悬浮于 100ul 酵母溶解缓冲液 ( 自制 ： .1M NaCL， .0062M Tris HCL， .0038M Tris 碱， .001M EDTA， 2％ (v/v) 聚山梨酯 20， 1％ (w/v)SDS) 和含 10U Zymolyase/100ul 的 100ul Qiagen MiniPrep 试剂盒缓冲液 P1。 然后将该混合物在 37℃孵 育约 15 分钟， Qiagen 小提试剂盒方案的其余步骤根据制造商的说明进行。
     电感受态大肠杆菌宿主细胞 (DH12S) 的转化使用 4μl 提取的酵母质粒 DNA 制备 物和 50μl 大肠杆菌细胞进行。以 1.75kV、 25μF、 400 欧姆对细胞电冲激。电穿孔后， 添 加 .5ml LB， 然后将细胞以 10μl 和 30μl 等分铺板于两块 LB AMP 板上 (LB 肉汤 (Lennox)， 1.8％ BactoTM 琼脂 (Difco)， 100mg/L 氨苄青霉素 )。
     对插入 DNA 克隆进行序列分析。选择一个包含正确序列的克隆。大规模质粒 DNA 使用可商购的试剂盒 (QIAGEN 质粒大提试剂盒， Qiagen， Valencia， CA) 根据制造商的说明 分离。
     利用相同方法制备截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5 构建体。一个片段包含 ： 与 pZMP31 载体序列中优化的 TPA 前导序列重叠的 5’ 重叠， 然后是编码 S249W 点突变的人 FGFR3IIIc 的序列， Fc5 序列和与接头序列重叠的 3’ 重叠。对该片段， PCR 扩增反应使用 5’ 寡核苷酸 zc62560(SEQ ID NO ： 20)。( 正向引物， 用于使用 FGFR3IIIc 作为模板产生 PCR 片 段。片段将产生 Ig D2D3 形式。FGFR3IIIc 的序列起始于 SEQ ID NO ： 60 的 D156， Ig D2 的上 游。片段将使用 opTPA 前导序列克隆到 pZMP31 中 )。该 PCR 使用 3’ 寡核苷酸 zc60566(SEQ ID NO ： 82) 进行， 且使用 MPET 构建体 #1920 作为模板 (SEQ ID NO ： 9)。
     使用与上述相同的 PCR 热循环产生该片段， 并引入 BglII 消化的 MVC709 和 MVC 710 载体以产生截短的可溶人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接头和下游 c- 端对 VEGFA 构建体结 合特异的 scFv 序列， 如上所述。
     编 码 全 长 的 或 截 短 的 可 溶 人 FGFR3IIIc(S249W)Fc5、 接 头 和 下 游 c- 端 对 结 合 VEGF-A 特异的 scFv 序列的质粒命名为 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 781)， 如 SEQ ID NOS ： 57 和 58 所示， FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(MVC 782)， 如 SEQ ID NOS ： 59 和 60 所 示， FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 783)， 如 SEQ ID NOS ： 61 和 62 所示， 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c870e6pZMP31(MVC 784)， 如 SEQ ID NOS ： 63 和 64 所示。将这些质粒在 293F 细胞中瞬时表达 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#R790-07)。使用 QIAGEN 质粒大提试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 制备各质粒的大提 DNA。 将 293F 悬浮细胞在 293Freestyle 培养基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#12338-018) 中在 37 ℃， 6 ％ CO2 下在 3L 转瓶中 95RPM 培养。在即将转染之前添加新鲜培养基以得 到 1.5 升工作体积， 最终密度为 1x10E6 细胞 /mL。对于每个转瓶， 将 2mLLipofectAMINE 2000(Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#11668-019) 添 加 至 20mL Opti-MEM 培 养 基 (Invitrogen， Carlsbad， CA Cat#31985-070) 中， 且在另一试管中将 1.5mg 总质粒 DNA 在 20mL Opti-MEM 中稀释。各试管单独在在室温孵育 5 分钟， 然后混合 (combined) 且一起在室温下再孵育 30 分钟， 不时轻微混合。将脂质 -DNA 混合物添加至 293F 细胞的各转瓶， 然 后恢复至 37℃， 6％ CO2、 75RPM。 约 96 小时后， 收集该条件化培养基， 0.2μM 过滤， 用于蛋白 质纯化。
     实施例 16 ： 纯化方法
     将条件化培养基作为包含 0.02％叠氮化钠的 0.2μ 无菌过滤可输送物输送至纯 化。在将该培养基装载至亲和力俘获柱之前不进行其他调节。
     对于大规模纯化， ～ 10 升可输送物， 采用 POROS A50( 蛋白 A 亲和树脂 ) 的 87mL 柱床 2 厘米直径的柱子用于俘获过程的目的。对于小规模纯化 ( ～ 1-1.5 升可输送物 )， 使 用 4mL 柱床的 POROS Mab MabCapture 灌注色谱树脂。
     加载样品之前， 该柱用 20 柱体积的缓冲液 A(10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬 酸， 250mM[NH4]2S04， pH 7.3， 包含 0.02％叠氮化钠 (W/v)) 平衡。一旦平衡后， 以 20mL/ 分 钟 ( 对于大规模方法 )， 或 10mL/ 分钟 ( 对于小规模方法 ) 加载条件化培养基。当方法的装 载阶段完成时， 用 10-20 柱体积的平衡缓冲液从柱洗出未结合的蛋白质级分。结合的蛋白 质的洗脱通过下降的 pH 梯度完成， 该梯度是在平衡缓冲液 A 和具有以下组成的洗脱缓冲液 B 之间形成的 ： 10mM 磷酸二氢钠， 10mM 一水合柠檬酸， 250mM[NH4]2S04， pH 3.0， 包含 0.02％ 叠氮化钠 (w/v)。大规模方法的洗脱流速为 30mL/ 分钟， 同时在缓冲液 A 和缓冲液 B 之间形 成 3 个柱体积的梯度。用 0.5mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (10mL)， 立即混合内含 物。小规模方法的洗脱使用相同缓冲液和 4 柱体积的梯度 ( 从缓冲液 A 至缓冲液 B)， 且流 速为 5mL/ 分钟。用 0.25mL 2M Tris pH 8.0 缓冲液收集级分 (4mL)。立即混合所有洗脱液 级分以保证快速 pH 中和。
     将所有在 280 纳米波长具有正吸收的级分汇集， 进一步进行大小排阻色谱法步 骤。将汇集的蛋白质浓缩至 7ml( 大规模方法 ) 或 1.5mL( 小规模方法 ) 用于大小排阻色谱 法 (SEC)。 采用 SEC 色谱法的目的是缓冲液交换， 以及将少量多聚体或聚集物质与最终产物 区分开来。用于 SEC 和最终蛋白制剂的流动相为 35mM 磷酸钠， 120mM 氯化钠， pH 7.3。大规 模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (26/60 规格， 具有 321mL 柱床体积 ) 上 进行。小规模 SEC 在 Pharmacia Superdex 200 制备级 SEC 柱 (16/60 规格， 具有 120mL 柱 床体积 ) 上进行。根据方法规模， SEC 步骤的流速对大规模或小规模分别为 2.5mL/ 分钟或 1.5mL/ 分钟。汇集在主要对称的峰下的级分， 重点是从最终产物中排除任何少量的高分子 量材料。最终汇集物以 0.2μ 无菌过滤， 制备等分试样且储存于 -80℃。该相同方法用于处 理所有 FGFR 受体和可溶 FGF 受体 (FGFR) 和 VEGF-A 抗体的双特异性结合组合物。 3
     实施例 17 ： H- 胸苷增殖测定以测定可溶 FGF 受体对 FGF- 刺激的 HUVEC 细胞的中 和活性
     为筛选抑制多种 FGF 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人脐带内皮细胞 (HUVEC) 进行 3H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF1， 2， 4 和 6(R&D Systems， Inc.) 以 10ng/ml 在测定介质 (RPMI-1640， 1％ FBS， 1 单位 /ml 肝素和丙酮酸盐 ) 中使用。然后从 0.5-4ug/ ml( 取决于受体 ) 滴定的可溶人 FGFR(R&D Systems 和 ZymoGenetics)， 并在测定介质中 连续稀释至 32-4ng/ml。即 HUVEC 铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2000 细胞 / 孔。HUVEC 增殖测定体系在 37℃， 5％ CO2 培养 2 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸 苷 (Amersham， TRK120) 冲激 HUVEC18 小时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％CO2)。收集细胞， 在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结果 ： 所 有 测 定 的 FGFR 均 如 预 期 的 那 样 以 类 似 的 活 性 中 和 FGF1。FGFR1 和 FGFR2(R&D Systems) 强 力 地 中 和 所 有 FGF。 而 FGFR3 和 FGFR4(R&D Systems) 对 FGF2， 4 和 6 活 性 的 抑 制 弱 一 些。FGFR3A2258F(143_375， S249W)(SEQ ID NO ： 10) 和 FGFR3 A2256F(22_375， S249W)(SEQ ID NO ： 2) 强力地中和 FGF1， 2， 4 和 6， 且 IC50 值与 FGFR1 相 似。
     表 26
    实施例 18 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 LNCap 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 LNCap 细胞进行 3 了 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 以 200 至 1000ng/ml 在测定介 质 (RPMI-1640， 1％ BSA， ITS[ 胰岛素 - 转铁蛋白和硒 ]， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 [ 均获自 Invitrogen]) 中使用。然后从 1-2ug/ml 滴定 R&D Systems 的可溶人 FGFR(R1-R4)、 以及 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 31-15ng/ml。将 LNCap 细胞铺板 于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 2500 细胞 / 孔。将该 LNCap 增殖测定在 3 37℃， 5％ CO2 培养 3 天。然后每孔用 1μCi H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将 LNCap 冲激 8 小
    时， 该 3H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     结 果： R&D System 的 FGFRs R2-R4 中 和 FGF8b， 但 R1 则 否。 全 长 FGFR2A2556F(22_377)SEQ ID NO ： 24 ， A2557F(22_377)(S252W)SEQ ID NO ： 29 ， 和 A2558F(22_377)(P253R)SEQ ID NO ： 33 不中和 FGF8b。而截短的 FGFR2A2559F(145_377)SEQ ID NO ： 37， A2560F(145_377)(S252W)SEQ ID NO ： 40， 和 A2561F(145_377)(P253F)SEQ ID NO ： 42 确实中和 FGF8b， 类似于 R&D Systems FGFR2。FGFR3A2519F(143_375)(P250R) SEQ ID NO ： 22， A2256F(23_375)(S249W)SEQ ID NO ： 2 和 A2258F(143_375)(S249W)SEQ ID NO ： 10 中和 FGF8b， 但 A2518F(143_375)SEQ ID NO ： 19， A2257F(23_375)SEQ ID NO ： 13， 和 A2259F(23_375)(P250R)SEQ ID NO ： 15 则否。
     表 27
    ND， 未测定。
     实施例 19 ： 用于测定可溶 FGF 受体对 FGF8b 刺激的 MCF-7 细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为筛选抑制 FGF8b 的活性的中和性可溶 FGF 受体 (FGFR)， 使用人 MCF-7 细胞进行 3 H- 胸苷增殖测定。重组人 FGF8b(R&D Systems， Inc.) 在测定介质 (RPMI-1640， 5％ FBS， L- 谷氨酸盐和丙酮酸盐 ) 中为 100ng/ml。从 10ug/ml 滴定来自 R&D Systems 的可溶人 FGFR-Fc(R1-R4) 和 ZymoGenetics 的 FGFR 3 和 2， 并在测定介质中连续稀释至 78ng/ml。 将 MCF-7 细胞铺板于 96- 孔平底板 (Costar)， 体积为 100μL， 密度为 1250 细胞 / 孔。将该
     MCF-7 增殖测定系统在 37℃， 5％ CO2 下培养 4 天。然后每孔用 1μCi3H- 胸苷 (Amersham， TRK120) 将细胞冲激 8 小时， 该 3H- 胸苷掺入中的增殖细胞 ( 均在 37℃， 5％ CO2)。收集细 胞且在 Packard TopCount NXT 板读数器上计数。
     实施例 20 ： 用于测定 sFGFR-Fc 对 FGF-9 刺激的 HCO 成骨细胞的中和活性的 3H- 胸 苷增殖测定
     为测定 sFGFR-Fc 构建体对 FGF-9- 刺激的成骨细胞增殖的中和作用， 进行 3H- 胸 苷测定。用人 FGF-9 刺激人成骨细胞生长。以 0.02nM 至 6nM 的浓度将 FGFR-Fc 蛋白质添 加至测定介质。观察到成骨细胞增殖的显著抑制， 并对各蛋白质计算 IC50。
     研究设计 ： 以 1.2nM 人 FGF-9(R&D Systems， Minneapolis， MN) 刺 激 人 颅 盖 成 骨 细 胞 (HCO ； ScienCell， Carlsbad， CA)。ObM 测 定 介 质 [ 成 骨 细 胞 基 础 培 养 基 (ObM， ScienCell)， 含有 0.5 ％胎牛血清 (FBS)， 2mM GlutaMax(Invitrogen， Carlsbad， CA)， 1mM 丙酮酸钠， 和 1x 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 (Invitrogen)] 用作阴性对照。将人 FGFR1-Fc， FGFR2-Fc， FGFR3-Fc， 和 FGFR4-Fc(R&D Systems) 在 ObM 测定介质中连续稀释到 6nM， 2nM， 0.67nM， 0.22nM， 0.07nM， 和 0.02nM。对 FGFR3-Fc 突变体 (ZymoGenetics， Seattle， WA) 也 类似进行稀释。将 HCO 细胞在补充有 5％ FBS 和成骨细胞生长补充剂 (ObGS， ScienCell) 的 ObM 中铺板于在 96- 孔平底板， 体积为 100μL， 密度为 1000 细胞 / 孔。将各板在 37℃， 5％ CO2 孵育过夜。细胞用 ObM 测定介质血清饥饿 24h， 在有或无连续稀释的 FGFR-Fc 的条件下 3 用 1.2nM FGF-9 刺激 24h， 用 1μCi 每孔的 H- 胸苷冲激 24h(GE Healthcare Biosciences， 3 Piscataway， NJ)， 该 H- 胸苷掺入增殖中的细胞 ( 均在 37 ℃， 5 ％ CO2)。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果证实该突变体 FGFR3-Fc 构建体显著抑制人成骨细胞增殖， 且其 IC50 在 R&D Systems 的 FGFR3-Fc 的 3 倍范围内， 如图 3 所示， 图 2 显示全长 FGFR3-Fc 野生型和突变体 构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     表 28 ： 成骨细胞增殖测定中的 FGFR-Fc IC50.
    实施例 21 ： FGFR-Fc 野生型和突变体构建体与 FGF-8b 和 FGF-17 的结合
     为测定 FGFR-Fc 与其各自配体的结合能力， 进行 ELISA。 在室温在摇动下将重组人 FGF-8b 或 FGF-17(R&D Systems) 以 100nM 铺板于 Nunc Maxisorp 96- 孔板上保持 1h。各 板在室温用 BLOTTO(Thermo Fisher Scientific， Rockford， IL) 封闭 1h， 然后用 ELISA C 缓冲液 (137mM NaCl， 2.7mM KCl， 7.2mM Na2HPO4， 1.5mM KH2PO4， 0.05％ (v/w) 聚山梨酯 20， pH 7.2) 洗涤 5 次。FGFR-Fcs 用 PBS/0.1x BLOTTO/10ug/ml 猪肝素 (Sigma， St.Louis， MO) 稀释至 100nM， 然后制备 1 ∶ 2 连续稀释物， 到 0.10nM 为止。将 100μL FGFR-Fc 铺板且在 4℃培养过夜。 次日， 将各板用 ELISA C 洗涤 5 次， 然后在室温在摇动下用 2.5μg/mL 辣根过 氧化物酶缀合的抗人 Fc 抗体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories， West Grove， PA) 孵育 1h。用 ELISAC 洗涤 5 次后， 添加柠檬酸盐缓冲液中的 100μL OPD(5mg 邻苯二胺， 于 63mM 柠檬酸钠， 37mM 柠檬酸， pH 5.0， 0.03％ H2O2 中 ) 以进行检测。2-5 分钟后， 用 1N H2SO4 停止反应。各板使用 SoftMaxPro 软件在 490nm 读数。
     结果 ： 尽管野生型和突变体 FGFR2-Fcs 不显著结合至 FGF-8b 或 -17， 但有一些突 变体 FGFR3-Fc 构建体以大于野生型 FGFR3-Fc 的程度结合至 FGF-8b 和 FGF-17 两者， 如图 5A， 5B， 6A， 6B 和 7 所示。
     表 29 ： 野生型和突变体 FGFR3-Fc 构建体结合 FGF-8b 和 FGF-17.
    
    实施例 22 ： 通过表面等离子体共振测量 FGF 受体对 FGF 配体的结合亲和力
     通过表面等离子体共振测量可溶 FGF 受体 (FGFR) 与 FGF 配体的相互作用的动力 学速率常数、 平衡结合常数和平衡解离常数。 在该研究中检查多种形式的 FGFR3。 制备了有 两个或三个 Ig 样域， 且具有两个可能的点突变 (S249W 或 P250R) 的 FGFR3。FGFR3 都制备 为二聚体 Fc- 融合蛋白。对于这些研究， 利用 Fc 标签将 FGFR 分子俘获在先前用蛋白 A 固 定的 Biacore 芯片上。使 FGF 配体在含肝素的缓冲液中在该表面上流过。尽管 FGF 配体为 单体， 但认为它们在肝素的存在下结合为二聚物。 因此确定， 二价分析物模型是适合用于这
     些相互作用的。
     亲和力测定 ： 表征了 FGF 受体的对 FGF 配体的结合亲和力。对各相互作用测量结 -1 -1 合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s-1))。结合速率常数为反映配体 - 受体复合 物形成速率的值。解离速率常数为反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常表示为 平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是通过将解离速率常数除以结合速率 常数 (kd/ka) 获得的， 而 KA 是通过将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 获得的。具有类 似的 KD( 或类似的 KA) 的分子可能具有可广泛变化的结合和解离速率常数。 因此， 测量 ka 和 kd 以及 KA 或 KD 有助于更加独特地描述配体 - 受体相互作用的亲和力。
     材料和方法 ： 结合动力学和亲和力研究在 Biacore T100TM 系统 (GE Healthcare， Piscataway， NJ) 上进行。 Biacore T100TM 的方法使用 Biacore T100TM Control 软件， v 2.0 编程。因为各 FGF 受体分子包含人 Fc 域， 将生物素化蛋白 A(Thermo Fisher Scientific Inc， Rockford， IL) 用作俘获试剂用于这些研究。 将生物素化蛋白 A 在 HBS-EP 缓冲液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 3mM EDTA， 0.05％表面活性剂 P20 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中 稀释至 50μg/mL 浓度， 然后俘获至 SA( 链亲和素 ) 传感器芯片的所有四个流动室上。每个 流动室获得约 1100RU 的密度。随后通过蛋白质 -A 以 150-250RU 的近似密度将各 FGF 受体 分子俘获至 SA 芯片的单独的流动室上。 Biacore 仪器测量结合于传感器芯片表面的蛋白质 的质量， 因此， 验证了各循环中受体的俘获。
     对于动力结合研究， 制备了 FGF 配体的从 200nM-0.06nM 的连续 1 ∶ 5 稀释物。将 这些样品注射在表面上， 并允许它们特异结合至传感器芯片俘获的 FGF 受体。以结合时间 为 7 分钟， 离解时间为 15 分钟进行各配体浓度的注射。以 50μL/min 的流速进行动力结合 研究。所有结合实验在 25℃在含 50μg/mL 肝素 (Calbiochem， La Jolla， Ca) 的 HBS-P 缓冲 液 (10mM HEPES， 150mM NaCl， 0.05％表面活性剂 P20， pH 7.4 ； GE Healthcare， Piscataway， NJ) 中进行。
     在循环之间， 用 20mM 盐酸洗涤流动室以再生表面。该洗涤步骤从蛋白 A 表面去 除俘获的 FGF 受体和任何结合的 FGF 配体， 便于接下来后一个测定样品的结合。数据使用 TM Biacore T100 评价软件 ( 版本 2.0) 编辑。数据通过减去参照流动室和空白注射处理。评 价基线稳定性以保证在整个注射顺序过程中再生步骤提供了一致的结合表面。 检查重复注 射曲线的再现性。将结合曲线整体拟合于二价分析物模型。
     结果 ： 确定了该二价分析物模型对这些相互作用而言是最适合的。 该模型对 ka(ka1 和 ka2) 以及 kd(kd1 和 kd2) 两者都测量两个值。第一组值 (ka1 和 kd1) 描述相互作用的一价动 力学。这些样品报告的亲和力是从这些值导出的， 命名为 KD1 和 KA1。第二组值 (ka2 和 kd2) 是指相互作用的亲合力， 没有报告。 尽管在残差中有一些趋向性 (trending)， 但与模型的拟 合对评估结合亲和力而言是令人满意的。表 30 详细列出了多种 FGFR3 分子与 FGF6 的结合 相互作用的动力学。全长 FGFR 分子 (23_375) 的亲和力类似于二域 FGFR 分子 (143_375) 的亲和力。该点突变增加对 FGF6 的亲和力， 且 S249W 的亲和力＞ P250R 的亲和力＞野生型 的亲和力。通常， 该亲和力的增加主要是由于较慢的解离速率常数导致的。
     表 30 ： FGF6 的结合亲和力
    实施例 23 ： 用于测定 FGFR-Fc 对肿瘤细胞的增殖的抑制的 3H- 胸苷增殖测定
     为测定 FGFR-Fc 抑制肿瘤细胞增殖的能力， 进行 3H- 胸苷测定。 将 Caki-1 和 DU145 肿瘤细胞以 2000 细胞 / 孔的密度铺板于 96- 孔平底板， 并在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。次 日， 将 FGFR-Fc 构建体在 RPMI 1640( 具有 0.5％ FBS， 1mM 丙酮酸钠， 和 2mM GlutaMAX) 中 以 20， 10， 和 5μg/mL 连续稀释， 并在 37 ℃， 5 ％ CO2 下铺板于孔保持 3 天。将细胞用每孔 3 1μCi H- 胸苷 (GE Healthcare Biosciences， Piscataway， NJ) 冲激 24h， 该 3H- 胸苷掺入 增殖中的细胞。收集细胞并在 Packard TopCount NXT 上计数。
     结果 ： 在 20μg/mL， 截短的 FGFR3-FC S249W 突变体抑制 Caki-1 和 DU145 细胞二 者， 其抑制程度稍微大于野生型 FGFR2-Fc 或 FGFR3-Fc。图 8A 演示 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细 胞生长， 图 8B 演示 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞生长。
     表 31 ： 增殖的百分比抑制
    
    实施例 24 ： sFGFR-VEGF scFv 蛋白质抑制内皮细胞萌芽
     为测定包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 的功效， 如 (Darland et al， Dev Biol 264(2003)， 275) 所述建立内皮细胞和周皮细胞的体 外共培养系统。 在该共培养中， 将包被在 Cytodex 珠上的 HUVEC 与人间充质干细胞 (Lonzo) 在 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞条件化培养基的存在下在纤维蛋白凝胶中共培养。 在实验开始时或在实验第 7 天， 将 0.04-50nM 对照拮抗剂、 VEGF-A 拮抗剂或包含 VEGF-A 抗 体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白添加至培养物。在添加拮抗剂后 的第 8 天使用 PFA 固定细胞。然后使用抗平滑肌细胞肌动蛋白 (aSMA) 或抗 PECAM 抗体通 过 IHC 染色细胞以分别识别周皮细胞和内皮细胞。在使用对照拮抗剂处理的孔中， 这些细
     胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。在用抗 VEGF-A、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受 体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明 拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     研究设计 ： 在第 1 天， Cytodex-3 珠用 HUVECs 包被， 在 37℃， 5％ CO2 培养过夜。在 第 2 天， 在 24 孔板的孔中将 HUVEC 珠 (200 珠 / 孔 ) 与人间充质干细胞 (hMSC)(40,000 细 胞 / 孔 ) 一起包埋到纤维蛋白凝胶中。将 EGM-2 完全培养基和 D551 成纤维细胞培养基的 1 ∶ 1 混合物与 2ng/mL HGF 一起添加至这些细胞。每两天替换培养基直到实验结束。在第 2 天 ( 从共培养开始起 ) 或第 7 天 ( 共培养形成后 ) 将拮抗剂添加至培养物。添加拮抗剂 后将细胞在 4％ PFA 中固定过夜。用抗 PECAM 或抗 SMA 抗体染色细胞， 然后用第二抗体 ( 缀 合有荧光剂 ) 染色。然后通过显微镜观察细胞， 对 10 珠 / 孔的代表组手动计数芽的数量和 长度。然后计算孔的平均值。
     结果 ： 在用对照拮抗剂处理的孔中， 细胞形成被周皮细胞覆盖保护的内皮细胞芽。 在用抗 VEGF-A 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白 处理的细胞中， 芽的数量和芽的长度减少， 表明拮抗剂在该体外共培养模型中显示功效。
     实施例 25 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白质预防性处理在 Nu/Nu 小鼠中抑制 A549 肺癌细胞生 长
     为测定 sFGFR 蛋白质是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 在第 0 天对多组小鼠皮下 注射 A549 肺癌肿瘤。然后多组小鼠 (n ＝ 10/gp) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周历时 4 周， 起始于肿瘤接种 1 天后。3X/ 周监测肿瘤体积 4 周。与 注射对照试剂的小鼠相比， 注射 sFGFR 蛋白质的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生 长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 6 用 2x 10 个 A549 细胞在右胁腹皮下注射。从第 1 天开始， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内 注射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白质 2-3X/ 周， 注射 4 周。使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。 肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤并用于组织学。 将将肿瘤固 定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密 度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 26 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白治疗处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞生长
     为测定是否 sFGFR 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 几组小鼠在第 0 天皮下注射 3 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm ， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试 剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3， 几组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹 膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 保持 4 周。使用测径 器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 保持 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且肿瘤称重。肿瘤也交付进行组织学分析 用于微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 27 ： 使用 sFGFR-Fc 蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测试 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。然后对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试 剂， sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 自肿瘤接种 1 天后开始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历 时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿 瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤 固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管 密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 28 ： 用 sFGFR-Fc 蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌细 胞的生长
     为测定 sFGFR 蛋白是否对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 3 DU145 前列腺癌肿瘤。当肿瘤达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/ Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比 注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-Fc 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑 制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或 sFGFR-Fc 蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测 径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在 研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析 以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR 蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗 剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 29 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。对多组小鼠(n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂， sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后起。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂 的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小 鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106A549 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射浓 度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 的对照试剂或 sFGFR-VEGFscFv 融合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 使 用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。 在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿 瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血 管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射 sFGFR-VEGF scFv 融合蛋白的小鼠肿瘤显 著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 30 ： 以双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 A549 肺癌细胞 的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 A549 肺癌肿瘤。当肿瘤达到 3 尺寸 200mm ， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。监测肿 瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天 在右胁腹皮下注射 2x 106 个 A549 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异 性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用 后 24 小时 )， 处死小鼠并称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 31 ： 用双特异性结合蛋白的预防性处理抑制 Nu/Nu 小鼠中 DU145 前列腺癌 细胞的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。对多 组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 然后注射 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂、 包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周， 从肿瘤接种 1 天后开 始。监测肿瘤体积， 3X/ 周， 历时 4 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对 肿瘤生长抑制的功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。从第 1 天开始， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注 射浓度为 0.01mg/Kg 至 10mg/Kg 对照试剂或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周历 时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠， 称重肿瘤， 并进行组织学分析。将肿瘤固定于 NBF 中， 然后使用对小鼠内 皮细胞特异的 MECA-32 抗体通过免疫组织化学测定血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     实施例 32 ： 使用双特异性结合蛋白的治疗性处理抑制 DU145 前列腺癌细胞在 Nu/ Nu 小鼠中的生长
     为测定是否包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合 蛋白对小鼠肿瘤生长具有活性， 对多组小鼠在第 0 天皮下注射 DU145 前列腺癌肿瘤。 当肿瘤 3 达到尺寸 200mm 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。 监测肿瘤体积， 3X/ 周。相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双 特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的 功效。
     研究设计 ： 8-10 周龄雌性 Nu/Nu 小鼠 (Charles River Laboratories) 在第 0 天在 右胁腹皮下注射 2x 106DU145 细胞。当肿瘤达到尺寸 200mm3 时， 对多组小鼠 (n ＝ 10/ 组 ) 腹膜内注射 0.01mg/Kg-10mg/Kg 对照试剂， 或包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结 合蛋白的双特异性结合蛋白， 2-3X/ 周， 历时 4 周。使用测径器测量监测肿瘤生长， 3X/ 周， 历时 4 周。肿瘤体积使用下式计算 ： 1/2*(B)2*L(mm3)。在研究结束时 ( 最后一次施用后 24 小时 )， 处死小鼠且称重肿瘤。还对肿瘤进行组织学分析以测定微血管密度。
     结果 ： 相比注射对照试剂的小鼠， 注射包含 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性 结合蛋白的双特异性结合蛋白的小鼠肿瘤显著较小， 表明拮抗剂对肿瘤生长抑制的功效。
     根据上述， 应理解， 尽管为了说明的目的在此描述了本发明的具体实施方案， 但在 不偏离本发明的精神和范围的前提下可作出各种变化。因此， 本发明除了由所附权利要求 限定外不受限制。所有在此引用的公开物、 专利和专利申请以其整体通过提述并入本文用 于一切目的。86102448984 A CN 102449007
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     图 2 描述了四价、 双特异性抗体 / 可溶受体组合， 其对两个不同的靶 ( 在此称为 αVEGF-A 和 FGFR 的配体结合域 ) 具有特异性。
     图 3 描 述 显 示 对 FGF-9- 刺 激 的 成 骨 细 胞 增 殖 的 可 变 抑 制 的 FGFR-Fc(R&D Systems)。
     图 4A 描 述 FGFR-Fc 构 建 体 (ZymoGenetics) 抑 制 FGF-9- 刺 激 的 增 殖。 全 长 FGFR3-Fc 野生型和突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50 ； 图 4B 描述截短的 FGFR3-Fc 突变体构建体 (ZymoGenetics) 具有类似的 IC50。
     图 5A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-8b 的直接结合， 图 5B 描述 FGFR-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-8b 的直接结合。
     图 6A 描述 FGFR-Fc(R&D Systems) 对 FGF-17 的直接结合， 图 6B 描述 FGFR2-Fc 构 建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 7 描述 FGFR3-Fc 构建体 (ZymoGenetics) 对 FGF-17 的直接结合。
     图 8A 描述 FGFR-Fc 抑制 Caki-1 细胞的生长， 图 8B 描述 FGFR-Fc 抑制 DU145 细胞 的生长。
     图 9 描述 FGF 受体家族的第二和第三 Ig 样域。
     发明描述
     I. 概述
     本发明通过提供新蛋白质， 即多特异性结合蛋白， 特别是双特异性结合蛋白， 解决 了本领域对于提供更多治疗剂以治疗癌症， 特别是实体瘤的需求。所述蛋白质包含与抗体 部分融合的可溶受体部分。如本文所述， 术语 “双特异性结合蛋白” 是指能通过至少两种具 有不同结合特异性的结合部分特异结合至少两种不同的靶分子的蛋白质。 该结合部分可以 是例如蛋白质 ( 例如， 抗体或可溶受体 ) 或小分子。 双特异性结合蛋白的结合部分可以是物 理连接的。如本文所述的本发明提供包含可溶受体部分和抗体部分的双特异性结合蛋白。
     在本发明中， 可溶的受体部分包含可溶的 FGF 受体或其部分， 而抗体部分包含 VEGF-A 抗体或其部分， 如本文所述。在某些实施方案中， 双特异性结合蛋白的两个或多个 不同的部分通过接头连接以形成多聚物 ( 例如， 二聚物 )。例如， 在包含至少两个多肽部分 ( 例如， 可溶 FGF 受体和 VEGF-A 抗体 ) 的融合的双特异性结合蛋白的情况下， 可利用肽接头 序列来分隔， 例如， 多肽组分， 将它们分隔成足以保证各多肽折叠为其二级和三级结构的距 离。
     在某些实施方案中， 本发明的双特异性结合蛋白减少 FGF 和 VEGF-A 两者的生物活 性。具体地， 本发明提供 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂， 特别是中和性抗 VEGF-A 抗体与 FGF 可溶受体的组合， 其减少通过 VEGF-A 受体和 FGF 受体的信号传递。使用这样的拮抗剂减少经由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可用于治疗多种具有至少部分以新血管形成为特征的病 理的疾病。例如， 在肿瘤中和肿瘤周围抑制藉由 VEGF-A 和 / 或 FGF 的血管生成信号可减少 肿瘤形成血管、 生长和转移的能力。
     FGF 受体的活化可活化多种信号转导途径， 包括磷脂酶 C、 磷脂酰肌醇 3- 激酶、 促分裂原活化的蛋白质激酶、 以及转录的信号转导物和活化剂 (STAT) 途径， 这些途径都 在前列腺癌进展中起作用。FGF 信号传导增加的净结果包括增强的增殖、 对细胞死亡的抗 性、 增加的活动力和侵袭力、 增加的血管发生、 增强的转移、 对化疗和放射的抗性和雄激素 非依赖性等， 这些都可增强肿瘤进展和临床侵占性。FGF 受体和 / 或 FGF 信号传导可直 接影响肿瘤细胞， 也可影响肿瘤血管发生 (Kwabi-Addo 等人， Endocrine-Related Cancer 11(4)709-724， 2004)。
     本发明提供减少 VEGF-A 和 FGF 两者的生物活性的 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂。该 FGF- 结合部分为可溶 FGF 受体 (FGFR) 且 VEGF-A- 结合部分为 VEGF-A 抗体。根据本发明， 该 VEGF-A 和 FGF 拮抗剂为特异结合且减少 VEGF-A 和 FGF 活性的双特异性抗体 / 可溶受体 结合蛋白。本发明的双特异性结合蛋白在此详细描述。
     II.FGF 受体， 抗 VEGF-A 抗体， 和相关双特异性结合组合物
     A.FGF 受体
     该分子的 FGFR 部分为可溶受体。该 FGFR 包含三个 Ig 样域， 称为 D1， D2 和 D3。该 受体可包含 FGF 受体的 D1， D2， D3， 或可包含 D2， D3 而没有 D1。而且， 该受体可为天然受体 或在 D2-D3 区具有突变。该 FGFR 家族和域 D2 和 D3 示于图 1。
     已证实 D1 的截短可增加受体的亲和力和增强受体 / 配体相互作用 (Olsen 等人 PNAS 101 ： 935-940， 2004)。已知 FGFR1-3 由于在 D3 的羧基端的可变剪接而具有多个同种 型。从该知识出发， 本发明者制成了多种具有三个或两个 Ig 样域的变体可溶 FGF 受体， 且 表征了它们对 FGF 配体的结合亲和力。该 FGFR3 和 FGFR2 同种型 IIIc 是特别令人感兴趣 的， 因为它们比相应的 IIb 同种型对 FGF 2， 6， 8b， 9 和 17 具有更高的亲和力。
     FGF 受体可以基于它们对 FGF 配体的结合亲和力来定性。对给定的相互作用， 测 -1 -1 -1 量结合速率常数 (ka(M s )) 和解离速率常数 (kd(s ))。结合速率常数是反映配体 - 受体 复合物形成速率的值。解离速率常数是反映该复合物稳定性的值。平衡结合亲和力通常 表示为平衡解离常数 (KD(M)) 或平衡结合常数 (KA(M-1))。KD 是将解离速率常数除以结合速 率常数 (kd/ka) 而获得， 而 KA 是将结合速率常数除解离速率常数 (ka/kd) 而获得。具有类似 KD( 或类似 KA) 的分子可具有在广范围内可变的结合和解离速率常数。当在标准体外测试 如 BIACORE 结合分析中测量时， 对本发明双特异性结合蛋白的结合亲和力将在 100nM 或更 少， 优选 10nM 或更少， 且更优选 1nM 或更少的范围。
     在某些实施方案中， FGFR 为 FGFR3IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 2 的第 262 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 9 的第 142 号氨基酸从 S 突变为 W。其它具 体实施方案包括 FGFR3IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 15 的第 263 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 22 的第 143 号氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR3IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 10， 19 和 22 所示。
     在其它某些实施方案中， FGFR 为 FGFR2IIIc， 其它具体实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 29 的氨基酸数 X 或 SEQ ID NO ： 40 的氨基酸数 Xa 从 S 突变为 W。其它具体 实施方案包括 FGFR2IIIc， 其中 SEQ ID NO ： 33 的第 Y 号氨基酸或 SEQ ID NO ： 42 的第 Ya 号 氨基酸从 P 突变为 R。在其它实施方案中， FGFR2IIIc 可在 N- 端截短， 如 SEQ ID NOS ： 37 和 42 所示。
     B.VEGF-A 抗体
     用于本发明的 VEGF-A 拮抗剂包括这样的分子， 它们结合至 VEGF-A 或 VEGF-A 受 体， 从而诱导 VEGF-A 对表达该受体， 例如， VEGFR-1， VEGFR-2， 神经纤毛蛋白 -1， 和 / 或神 经纤毛蛋白 -2 的细胞的活性。特别是， VEGF-A 拮抗剂包括抗 VEGF-A 抗体。其它合适的 VEGF-A 拮抗剂包括包含 VEGFR 细胞外域的可溶 VEGF-A 受体， 以及能抑制 VEGF-A 与其受体 的相互作用或能以其他方式抑制 VEGF-A 诱导的通过 VEGF-A 受体的细胞内信号传导的小分 子拮抗剂。此外， 可使用基于非抗体支架的结合蛋白质。( 参见， 例如， Koide 等人， J.Mol. Biol.284 ： 1141-1151， 1998 ； Hosse 等人蛋白质 Sci.15 ： 14-27， 2006， 以及其中的文献 )。 本 发明使用的优选的 VEGF-A 拮抗剂包括特异结合至 VEGF-A 的抗体， 包括也包含对 FGF 的结 合位点的双特异性抗体。对 VEGF-A 特异的抗体至少结合 VEGF-A 的可溶分泌形式， 且优选 还结合关联于细胞表面的形式。
     抗体在以下情况下被认为是特异结合的， 如果 (1) 它们显示结合活性的阈水平， 和 (2) 它们不显著与对照多肽分子交叉反应。例如， 如果抗 VEGF-A 抗体结合至 VEGF-A 多 肽、 肽或表位的亲和力为与对照 ( 非 VEGF-A) 多肽的结合亲和力的至少 10 倍， 则确定结合 6 -1 阈水平。 优选的是， 本发明中使用的抗体具有的结合亲和力 (Ka) 为 10 M 或更大， 优选 107M-1 或更大， 更优选 108M-1 或更大， 最优选 109M-1 或更大。抗体的结合亲和力可由本领域技术人 员容易地确定， 通常使用自动设备通过表面等离子共振测定。 其它方法是本领域已知的， 例 如 Scatchard 分析 (Scatchard， Ann.NY Acad.Sci.51 ： 660-672， 1949)。
     本发明的抗体包含保持抗原 - 结合特异性的完整抗体的部分或由其组成。合适的 抗体包括， 例如， 完全的人抗体 ； 人源化抗体 ； 嵌合抗体 ； 抗体片段例如 Fab， Fab’ ， F(ab)2， F(ab’ )2 和 Fv 抗体片段 ； 单链抗体 ； 和抗体重链或轻链的单体或二聚物或其混合物。本发 明的优选抗体为单克隆抗体。包含轻链的抗体可包含 κ 或 λ 轻链。
     在某些实施方案中， 本发明的抗体包括任何同种型的完整免疫球蛋白， 包括 IgA， IgG， IgE， IgD， 或 IgM( 包括其亚型 )。根据本发明的完整免疫球蛋白优选包括完整 IgG( 例 如， 完整 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 或 IgA2)。
     制备和分离多克隆抗体、 单克隆抗体和其抗原 - 结合抗体片段的方法是本领域已 知的。参见， 例如， Current Protocols in Immunology， (Cooligan 等人 eds.， John Wiley and Sons， Inc.2006) ； Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor， NY， 2nd ed.1989) ； 和 Monoclonal Hybridoma Antibodies ： Techn iques and Applications(Hurrell ed.， CRC Press， Inc.， Boca Raton， FL， 1982)。抗原结合片 段， 包括 scFv， 可根据本领域已知方法使用噬菌体展示文库制备。噬菌体展示也可用于基 于非抗体支架制备结合蛋白质 (Koide 等人， 上文 .)。制备重组人多克隆抗体的方法公开 于 Wiberg 等 人， Biotechnol Bioeng.94 ： 396-405， 2006 ； Meijer 等 人， J.Mol.Biol.358 ： 764-772， 2006 ； Haurum 等人， 美国专利申请公开 No.2002/0009453 ； 和 Haurum 等人， 美国专 利申请公开 No.2005/0180967。对本领域技术人员显而易见的是， 用于本发明的多克隆抗体可通过用免疫源性多 肽或多肽片段接种多种温血动物如马， 牛， 山羊， 绵羊， 狗， 鸡， 兔， 小鼠， 和大鼠的任一种而 产生。免疫原性多肽的免疫原性可通过使用佐剂， 如明矾 ( 氢氧化铝 ) 或弗氏完全或不完 全佐剂来增加。用于免疫的多肽还包括融合多肽， 如 VEGF-A 或其部分与免疫球蛋白多肽或 与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可为全长分子或其部分。如果多肽部分为半抗原 状， 其可有利地结合或连接至大分子载体 ( 如钥孔虫戚血兰素 (KLH)， 牛血清白蛋白 (BSA) 或破伤风类毒素 ) 以用于免疫。
     此外， 抗体可相对于与抗体靶 ( 例如， 直向同源物， 横向同源物 (paralogs))， 或其 序列变体相关的已知多肽进行筛选， 例如， 以分离对于结合靶蛋白或多肽而言高度特异的 抗体群体。这样的高特异性群体包括， 例如， 结合至人 VEGF-A 但不结合至小鼠 VEGF-A 的抗 体。 这种与相关多肽分子的交叉反应性的缺失通过， 例如， 使用标准蛋白质印迹分析通过检 测 VEGF-A 多肽而不检测已知的相关多肽的抗体显示 (Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人 eds.， Green and Wiley and Sons， NY 1993)) 或 ELISA( 酶免疫 测定 )(Immunoassay， A Practical Guide(Chan ed.， Academic Press， Inc.1987))。在 另一实例中， 针对 VEGF-A 多肽产生的抗体吸附到粘附在不可溶基质上的相关多肽上， 对 VEGF-A 多肽高度特异的抗体将在适当的缓冲条件下流过基质。筛选使得分离与已知的密 切相关的多肽无交叉反应性的多克隆和单克隆抗体成为可能 (Antibody ： A Laboratory Manual(Harlow and Lane eds.， Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988) ； Current Protocols in Immunology(Cooligan 等人 eds.， National Institutes of Health， John Wiley and Sons， Inc.1995)。特异抗体的筛选和分离是本领域已知的。参见 Fundamental Immunology(Paul ed.， Raven Press 1993) ； Getzoff 等 人， Adv.in Immunol.43 ： 1-98， 1988 ； Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice(Goding ed.， Academic Press Ltd.1996) ； Benjamin 等人， Ann.Rev.Immunol.2 ： 67-101， 1984。
     天然单克隆抗体 (“mAbs” ) 可通过， 例如， 用纯化的免疫原性蛋白或其片段免疫 受试者动物 ( 例如， 大鼠或小鼠 ) 而制备。在典型的程序中， 首先分别对动物给予腹腔内 (IP) 注射纯化的蛋白质或其片段， 通常与佐剂 ( 例如， 完全弗氏佐剂或 RIBI 佐剂 ( 获自 Sigma-Aldrich， St.Louis， MO)) 组合， 然后以例如两周的间隔加强 IP 注射纯化蛋白质。给 予第三加强注射后 7-10 天， 对动物放血并收集血清。视需要可以给予更多次的加强接种。 使用常规方法从高效价动物收集脾细胞和淋巴节细胞， 并使其融合至骨髓瘤细胞 ( 例如， 小鼠 SP2/0 或 Ag8 细胞 )。然后将该融合混合物在胸腺细胞的滋养层上培养或用合适的 培养基补充物培养 ( 包括可商购的补充物如杂交瘤融合和克隆补剂 ； Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)。融合后约 10 天， 使用标准测试 ( 例如 ELISA) 鉴别特异的产生抗体的 杂交瘤群。对于阳性池可进一步分析其阻断或减少靶蛋白的活性的能力。通过限制稀释克 隆阳性池。
     在某些方面， 本发明还包括多种单克隆抗体的用途， 所述多种单克隆抗体对单一 靶分子上对不同表位特异。组合使用这样的多种抗体可减少单一抗体所见的载体效应 (carrier effect)， 且还可通过 Fc 受体增加清除率和改善 ADCC。可组合使用两种、 三种或 多种单克隆抗体。
     天然抗体的氨基酸序列可通过使用重组 DNA 技术改变。因此， 抗体可进行重新设计以得到所需特征。相对其非修饰的形式， 修饰的抗体可提供例如改善的稳定性和 / 或治 疗功效。可能的变化有很多， 范围可以从改变仅一个或一些氨基酸到对例如可变区或恒定 区的完全重新设计。 制造恒定区的变化的目的通常是改善或改变特征， 如补体结合、 与膜的 相互作用和其它效应物作用。 通常， 制造可变区的变化以改善抗原结合特征， 改善可变区稳 定性， 或减少免疫原性的风险。噬菌体展示技术也可使用。参见， 例如， Huse 等人， Science 246 ： 1275-1281， 1989 ； Ladner 等人， 美国专利号 5,571,698。
     对 于 用 于 人 体 的 治 疗 用 抗 体， 通常需要根据已知方法将抗体的非人区人源 化。制备人源化抗体的方法公开于， 例如， 美国专利 5,530,101 ； 5,821,337 ； 5,585,089 ； 5,693,762 ； 和 6,180,370。通常， 人源化抗 VEGF-A 抗体包含小鼠供免者疫球蛋白的互补决 定区 (CDR) 和人受者免疫球蛋白的重链和轻链框架。 通常， 人框架区中的框架残基将被 CDR 供者抗体的相应残基取代， 以改变 ( 优选改善 ) 抗原结合。通过本领域众所周知的方法辨 别这些框架取代， 例如， 通过模仿 CDR 和框架残基的相互作用以鉴别对抗原结合重要的框 架残基和序列比较以鉴别在特定位置的一般的框架残基。( 参见， 例如， Queen 等人， 美国专 利号 5,585,089 ； Riechmann 等人， Nature 332 ： 323， 1988)。
     非人源化嵌合抗体也可治疗性地使用 ( 例如， 在免疫抑制患者中 )。因此， 在一 些变化中， 根据本发明的抗体是从例如非人抗 VEGF-A 抗体衍生的嵌合抗体。优选地， 嵌合 抗体包含衍生自小鼠或大鼠抗体的可变区和衍生自人的恒定区， 以使该嵌合抗体当给予人 受试者时具有较长的半衰期和较低的免疫原性。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。 ( 参见例如， Morrison， Science 229 ： 1202， 1985 ； Oi 等人， BioTechniques 4 ： 214， 1986 ； Gillies 等人， J.Immunol.Methods 125 ： 191-202， 1989 ； 美国专利 5,807,715 ； 4,816,567 ； 和 4,816,397)。
     本发明还包括完全的人抗体， 如衍生自卵巢， 乳腺， 肾， 结肠直肠， 肺， 子宫内膜， 或 脑癌患者的外周血单核细胞的。该细胞可与骨髓瘤细胞融合， 例如， 以形成产生抗 VEGF-A 的完全的人抗体的杂交瘤细胞。人抗体也可以在转基因非人动物 ( 通常为小鼠 ) 中制备。 参见， 例如， Tomizuka 等人， 美国专利 No.7,041,870。通常， 非人哺乳动物就人重链基因座 和人轻链基因座而言是转基因的， 且相应的内源性免疫球蛋白基因座被失活。
     本发明的抗体可用它们所识别或特异结合的 VEGF-A 多肽的表位或部分来特指。 表位或多肽部分可例如， 用 SEQ ID NO ： 72 所示的 VEGF-A 多肽的表位或其它部分的 N- 端和 C- 端位置来特指。
     本发明的抗体具有这样的结合亲和力， 其包括的小于 5x 10-2M， 小于 10-2M， 小于 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x -10 -10 -11 -11 -12 -12 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x 10-13M， 小 -13 -14 -14 -15 -15 于 10 M， 小于 5x 10 M， 小于 10 M， 小于 5x10 M， 或小于 10 M 解离常数 (Kd)。
     本发明的抗体进一步包括修饰的衍生物， 修饰的方式例如， 通过对抗体的任何类 型的分子共价连接， 以使共价连接不阻止抗体结合至其表位。合适的修饰包括， 例如， 岩藻 糖基化， 糖基化， 乙酰化， 聚乙二醇化， 磷酸化和酰胺化。 该抗体及其衍生物本身可通过已知 的保护基 / 封闭基、 蛋白酶剪切、 与细胞配体或其它蛋白质的连接等而衍生化。在本发明一 些实施方案中， 抗体的至少一个重链被岩藻糖基化。 在具体的变化形式中， 该岩藻糖基化是N- 连接的。在某些优选的实施方案中， 抗体的至少一个重链包含岩藻糖基化、 N- 连接的寡 糖。
     本发明的抗体可单独使用或作为与细胞毒素剂的免疫缀合物使用。在一些实施 方案中， 该试剂为化学治疗剂。在其它实施方案中， 该试剂为放射性同位素， 例如， 铅 -212， 铋 -212， 砹 -211， 碘 -131， 钪 -47， 铼 -186， 铼 -188， 钇 -90， 碘 -123， 碘 -125， 溴 -77， 铟 -111， 或可裂变核素如硼 -10 或锕系元素。在其它实施方案中， 该试剂为毒素或细胞毒素药物， 例 如蓖麻毒蛋白、 修饰的假单胞菌肠毒素 A、 加利车霉素 (calicheamicin)、 阿霉素、 5- 氟尿嘧 啶、 auristatin( 例如， auristatin E)、 美登木素 (maytansin)、 等。抗体和抗体片段与该试 剂的缀合方法是本领域已知的。
     本发明的抗体包括相对参照抗体 ( 例如， 具有表 2 或表 3 所示 VL 和 / 或 VH 序列 的参照抗体 ) 具有单个或多个氨基酸取代， 缺失， 添加， 或置换的变体， 以使该变体保持参 照抗体的一种或多种生物特性 ( 例如， 阻断 VEGF-A 与其各自的对应结构 (VEGF-A 受体 ) 的 结合， 阻断 VEGF-A 的生物活性， 结合亲和力 )。 本领域技术人员可制备具有单一或多重氨基 酸取代、 缺失、 加成或置换的变体。这些变体可包括， 例如 ： (a) 其中一个或多个氨基酸残基 被保守或非保守氨基酸置换的变体， (b) 其中一个或多个氨基酸被添加至多肽或从多肽被 删除的变体， (c) 其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体， 和 (d) 其中多肽与可赋予多肽 有用的特性的另一肽或多肽融合的变体， 所说的另一肽或多肽如融合配偶体、 蛋白标记物 或其它化学部分， 例如抗体的表位、 多组氨酸序列、 生物素部分等。本发明的抗体可包括以 下变体， 其中一个物种的氨基酸残基代替另一物种中的对应残基， 代替可发生在保守的或 非保守的位置。在另一实施方案中， 非保守的位置的氨基酸残基被保守的或非保守的残基 代替。 获得这些变体的技术， 包括遗传的 ( 抑制、 缺失、 突变等 )、 化学的和酶学的技术， 是本 领域技术人员已知的。
     结合至 VEGF-A 的示例性抗体已通过筛选噬菌体展示文库得以鉴定。通过噬菌 体展示的筛选方法详细描述于标准参考文章， 如 Babas， Phage Display ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab Press ， 2001) 和 Lo ， Benny K.C. ， A. ， Antibody Engineering(2004)。该噬菌体展示文库可用于将表达的蛋白质展示在细胞或其它物质的 表面， 以使互补的结合实体可以被功能性分离 (functionally isolated)。在一种这样的 噬菌体展示文库中， 将抗体轻链可变区和部分重链可变区与编码人抗体序列的合成 DNA 组 合， 然后它们在噬菌体和噬菌粒文库上作为 Fab 抗体片段被展示 (Dyax Human Antibody Libraries， Dyax Corp.， Cambridge， MA.)。因此， 抗体的可变轻链和重链片段可以以 Fab 形式被分离。然后可处理这些可变区以产生抗体， 包括抗原 - 结合片段， 如 scFv， 双特异性 scFv， 以及针对 VEGF-A 的多特异性、 多功能拮抗剂。
     使用该技术， 示例性 Fabs 的可变区已在本文所述得测试中因其结合和 / 或中和 VEGF-A 的特征而被鉴定出来。( 参见下文实施例 )。处理这些可变区以产生多种结合实体， 包括结合和 / 或中和 VEGF-A 的 scFv。下表 2 显示因其结合和中和 VEGF-A 的能力而被鉴定 出的抗 VEGF-A 抗体簇的核苷酸和氨基酸 SEQ ID NO. 标号， 而表 3 列出了对应于表 2 所列 的抗 VEGF-A 抗体的框架和 CDR 区的氨基酸残基位置。
    在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF-A 抗体包含表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的一 个或多个 CDR( 相应 CDR 区的边界分别示于表 3)。 例如， 在某些变化中， 该抗体包含表 2 所列
     的抗体的重链 CDR(HCDR1， HCDR2 和 HCDR3 区中的至少一个 ) 和 / 或相应的轻链 CDR(LCDR1， LCDR2， 和 LCDR3 区中的至少一个 )。在典型实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有表 2 所列的 抗体的两个或三个重链 CDR 和 / 或两个或三个轻链 CDR。在一些变化中， 其中抗 VEGF-A 抗 体具有表 2 所列的抗体的至少一个重链 CDR， 该抗体进一步包含至少一个相应的轻链 CDR。
     在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A 抗体包括重和 / 或轻链可变域， 该重链或轻链可 变域具有 (a) 对应于表 2 所列的抗体所示的重链或轻链 CDR 的一组三个 CDR， 和 (b) 一组四 个框架区。例如， 抗 VEGF-A 抗体可包含重和 / 或轻链可变域， 其中该重链或轻链可变域具 有 (a) 一组三个 CDR， 其中该组 CDR 源自表 2 所列的抗体， 和 (b) 一组四个框架区， 其中该组 框架区与表 2 所列的相同抗体的那组框架区相同或不同。
     在具体实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体包含与表 2 所列的抗体的重和 / 或轻链可变区 基本上相同的重链可变区和 / 或轻链可变区。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， LCDR1 具有 SEQ ID NO ： 66 的 残基 24-34 所示的氨基酸序列 ； LCDR2 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 50-56 所示的氨基酸序 列； LCDR3 具有 SEQ ID NO ： 66 的残基 89-97 所示的氨基酸序列 ； HCDR1 具有抗体 c1039 的 HCDR1 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 31-35) ； HCDR2 具有抗体 c1039 的 HCDR2 氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 68 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自 SEQ ID NOs ： 68 的氨基酸序列。
     在根据本发明的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， LCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 23-35) ； LCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR2 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 51-57) ； LCDR3 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 LCDR3 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 90-100) ； HCDR1 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR1 氨基酸序列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 31-35) ； HCDR2 具有选自 c870 和 c1094 的抗体的 HCDR2 氨基酸序 列 ( 分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 50-66) ； 且 HCDR3 具有选自分别为 SEQ ID NOS ： 48 和 54 的残基 99-102 的氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870， c1039 和 c1094 的抗体的 CDR LCDR1， LCDR2， LCDR3， HCDR1， HCDR2 和 HCDR3。例如， 在 具体实施方案中， 该抗 VEGF-A 抗体具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的抗体的轻链和重链可 变域 (VL 和 VH)。
     在其它实施方案中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体包括含 CDR LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3 的 VL 域和含 CDR HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 的 VH 域， 其中该组 VL 和 VH CDR 相对第二组 CDR 具有 3 个或更少个氨基酸取代， 其中所述第二组 CDR 具有选自 c870、 c1039 和 c1094 的 抗体的 LCDR1、 LCDR2、 LCDR3、 HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3 氨基酸序列。在具体的变化形式中， 该 抗体在所述组的 CDR 中包含 0、 1 或 2 个氨基酸取代。
     本发明的抗 VEGF-A 抗体识别的表位通常包含人 VEGF-A165 的 5 个或更多个氨基酸 (SEQ ID NO ： 72 的残基 27-191)。优选的表位包含至少一个包含在一个或多个以下 VEGF-A 的多肽区内的氨基酸 ： HEVVKFMDVYQRSYCHPIETL(SEQ ID NO ： 72 的 氨 基 酸 残 基 38-58)， EYIFKPSCVPLMRCG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84)， EESNITMQIMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 98-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。 在某些实施方案中， 该 表位包含至少 2 个、 至少 3 个、 至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 或至少 7 个源自 SEQ ID NO ： 72 的残基 38-58、 70-84、 98-114、 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的氨基酸。 在一些变化形式中， 该 VEGF-A 表位是通过使用重叠 VEGF-A 肽 )( 例如 13- 聚肽， 其中在每对 依次的肽之间有例如 2 个氨基酸移位 ) 的肽微阵列表位作图而确定的表位。
     在上述抗 VEGF-A 抗体的具体变化形式中， 该抗 VEGF-A 表位包含包括在一个或多 个以下的 VEGF-A 多肽区内的至少一个氨基酸 ： KFMDVYQRSYC(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 42-52)， IFKPSCVPLMR(SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 72-82)， IMRIKPHQG(SEQ ID NO ： 72 的 氨基酸残基 106-114)， 和 PCGPCSERRKHLF( 氨基酸残基 142-154)。在某些实施方案中， 该表 位包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 42-52， 72-82， 106-114， 和 142-154 所示的一个或多个 VEGF-A 多肽区的至少两个， 至少 3 个， 至少 4 个， 至少 5 个， 至少 6 个， 或至少 7 个氨基酸。
     在一些相关的变化形式中， 根据本发明的抗 VEGF-A 抗体结合至如下所述的表位， 该表位包含 (a) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 38-58 或 42-52 所示的第一 VEGF-A 多肽区 内包含的一个或多个氨基酸， 和 (b) 如 SEQ ID NO ： 72 的氨基酸残基 70-84 或 72-82 所示的 第二 VEGF-A 多肽区内包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的某些实施方案中， 该表位 不包含 SEQ ID NO ： 72 的残基 90 至 132 所示的 VEGF-A 的多肽区内包含的氨基酸 (EGLECVP TEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRP)。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它实施方案中， 该表位 进一步包含 (c) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 96-114 或 106-114 所示的第三 VEGF-A 多肽区内 包含的一个或多个氨基酸。
     在结合至包含上述 (a)、 (b) 和 (c) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的一些实施方案中， 该 抗体不以彼此的 10 倍以内的 Kd 值结合人和小鼠 VEGF-A。
     在结合至包含上述 (a) 和 (b) 的表位的抗 VEGF-A 抗体的其它变化形式中， 该表位 进一步包含 (d) 如 SEQ ID NO ： 72 的残基 142-154 所示的第四 VEGF-A 多肽区内包含的一个 或多个氨基酸。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 抗 VEGF-A 抗 体 为 抗 体 片 段， 例 如 Fv、 Fab、 Fab’ 、 F(ab)2、 F(ab’ )2、 scFv、 或双特异性抗体。在一些优选的实施方案中， 抗 VEGF-A 抗体为 scFv。结合 VEGF-A 的 scFv 实体可具有这样的取向， 其中轻链可变 (VL) 区位于重链可变 (VH) 区的氨基 端或者羧基端。在一些变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 X 所列的抗 VEGF-A 抗体的 CDR。 在具体的变化形式中， 抗 VEGF-A scFv 具有表 2 所列的抗 VEGF-A 抗体的 VL 和 VH 域。 在某些 实施方案中， 抗 VEGF-A scFv 的 CDR 或 VL 和 VH 域为选自 c870 c1039 和 c1094 的抗 VEGF-A 抗体的 CDR 或 VL 和 VH 域。在抗 VEGF-A scFv 的具体变化形式中， 该 scFv 包含如 SEQ ID NO ： 70(c1039scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 69 所示 ) ； SEQ ID NO ： 44(c870.1e6scFv ； 核 苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) ； 或 SEQ ID NO ： 46(c1094.1scFv ； 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 43 所示 ) 所述的氨基酸序列。此外， scFvs 可以多种双特异性抗体形式的任一种提供， 例如， 串联 scFv(tascFv)、 双 - 单链 Fv(biscFv)、 和具有融合至羧基端的单链 Fv(scFv) 的 完整单克隆抗体 (biAb)( 参见上文 )。
     C. 使用 Fc 蛋白质缀合的双特异性抗体 / 可溶受体组合
     双特异性结合蛋白通过免疫球蛋白重链的 Fc 区结合本发明的结合蛋白， 如图 2 所 例示的。该 Fc- 融合蛋白包含 IgG 分子的 Fc 区。在另一实施方案中， 该 Fc 区来自人 IgG1 分子。在一些实施方案中， 该免疫球蛋白融合物包括 IgG1 分子的铰链、 CH2 和 CH3 区， 或铰链、 CH1、 CH2 和 CH3 区。
     免 疫 球 蛋 白 融 合 物 的 制 备 也 参 见 美 国 专 利 No.5,428,130， 美国专利 No.5,843,725， 美国专利号 6,018,026， 和 Chamow 等人， TIBTECH， 14 ： 52-60(1996)。
     最简单和最直接的 Fc- 融合蛋白设计通常藉由免疫球蛋白重链的 Fc 区联合本发 明的拮抗剂多肽的结合域。在本发明的 Fc- 融合蛋白中， 编码结合组分的核酸融合至编码 免疫球蛋白恒定域序列的 N- 端的核酸的 C 端， 但是 N- 端融合物也是可能的。
     典型地， 这样的融合物中， 编码的嵌合多肽将至少保持免疫球蛋白重链的恒定区 的功能活性铰链、 CH2 和 CH3 域。还在恒定域的 Fc 部分的 C- 端， 或直接在重链的 CH1 或轻 链的对应区域的 N 端进行融合。 进行融合的精确位点不是关键的 ； 具体位点是公知的， 且可 加以选择以优化 Fc- 融合蛋白的生物活性、 分泌或结合特征。
     在一个优选的实施方案中， 该结合域序列融合至免疫球蛋白 G1(IgG1) 的 Fc 区的 N- 端。可以融合整个重链恒定区与结合域序列。然而， 更优选地， 融合中使用这样的序列， 其起始于化学限定 IgG Fc 的木瓜蛋白酶切割位点 ( 即残基 216， 将重链恒定区的第一残基 作为 114) 或其它免疫球蛋白中的类似位点紧邻上游的铰链区。在特别优选的实施方案中， 该结合域氨基酸序列融合至 (a) 铰链区和 CH2 和 CH3 或 (b)IgG 重链的 CH1、 铰链、 CH2 和 CH3 域。
     对于双特异性 Fc- 融合蛋白， Fc- 融合蛋白被组装为多聚体， 特别是异源二聚体或 异源四聚体。通常， 这些组装的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。一种基本的四链结构 单位是存在于 IgG、 IgD 和 IgE 中的形式。四链单位在高分子量免疫球蛋白中重复 ； IgM 通 常以通过二硫键保持在一起的四个基本单位的五聚体存在。IgA 球蛋白， 偶尔还有 IgG 球 蛋白， 也可在血清中以多聚体形式存在。 在多聚体的情况下， 四个单位的每一个可相同或不 同。
     或者， 可将 Fc 序列插入免疫球蛋白的重链和轻链序列之间， 而得到包含嵌合重链 的免疫球蛋白。在该实施方案中， 在免疫球蛋白的每条臂中 Fc 序列融合至免疫球蛋白重 链的 3 ′端， 或是在铰链和 CH2 域之间， 或是在 CH2 和 CH3 域之间。类似构建体已报道于 Hoogenboom 等人， Mol.Immunol.， 28 ： 1027-1037(1991)。
     尽管在本发明的 Fc- 融合蛋白中不需要免疫球蛋白轻链的存在， 但免疫球蛋白轻 链可共价连接于结合域 - 免疫球蛋白重链融合多肽， 或直接融合于结合域。在前者的情况 下， 通常将编码免疫球蛋白轻链的 DNA 与编码结合域免疫球蛋白重链融合蛋白的 DNA 共表 达。 当分泌时， 杂合的重链和轻链将被共价连接， 而提供一种包含两个由二硫键连接的免疫 球蛋白重链 - 轻链对的免疫球蛋白状结构。适合制备该结构的方法例如公开于美国专利 No.4,816,567。
     Fc- 融合蛋白最方便地通过将编码结合域部分的 cDNA 序列合框地融合于免疫球 蛋白 cDNA 序列而构建。 然而， 也可使用与基因组免疫球蛋白片段的融合 ( 参见， 例如 Aruffo 等人， Cell， 61 ： 1303-1313(1990) ； 和 Stamenkovic 等人， Cell， 66 ： 1133-1144(1991))。后 一类型的融合需要存在 Ig 调节序列以用于表达。基于自脾或外周血淋巴细胞衍生的 cDNA 库中公开的序列， 可以通过杂交或聚合酶链反应 (PCR) 技术来分离编码 IgG 重链恒定区的 cDNA。将编码 Fc- 融合蛋白的结合域和免疫球蛋白部分的 cDNA 串联地插入指导在所选的 宿主细胞中的高效表达的质粒载体中。已进行了特殊的修饰以制备用于产生本发明使用的 Fc 融合分子的 Fc 序列。具体 地， 产生 6 个版本的修饰的人 IgG1 Fc 用于生成 Fc 融合蛋白且命名为 Fc-488(SEQ ID NO ： 76)， 以及 Fc4(SEQ ID NO ： 77)、 Fc5(SEQ ID NO ： 74)、 Fc6(SEQ ID NO ： 78)、 和 Fc7(SEQ ID NO ： 79)。Fc4， Fc5 和 Fc6 包含突变以通过减少 FcγRI 结合和补体 C1q 结合而减少 Fc 介导 的效应物作用。Fc4 包含引入 Fc-488 的相同氨基酸置换。还引入了另外的氨基酸置换以减 少潜在的 Fc 介导的效应物作用。具体地说， 引入三个氨基酸置换以减少 FcγRI 结合。它 们是在 EU 索引位置 234、 235 和 237 的置换。已显示这些位置上的置换可减少与 FcγRI 的 结合 (Duncan 等人， Nature 332 ： 563(1988))。这些氨基酸置换还可减少 FcγRIIa 结合， 以 及 FcγRIII 结合 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000) ； Wines 等人， J.Immunol.164 ： 5313(2000))。
     数 个 研 究 组 描 述 了 EU 索 引 位 置 330 和 331 在 补 体 C1q 结 合 和 后 续 补 体 固 定 (complement fixation) 中的重要性 (Canfield 和 Morrison， J.Exp.Med.173 ： 1483(1991) ； Tao 等人， J.Exp.Med.178 ： 661(1993))。在 Fc4 的这些位置上引入氨基酸置换， 以减少补体 固定。Fc4 的 CH3 域与对应野生型多肽中的 CH3 域相同， 只是终止密码子从 TGA 变为 TAA， 以 便消除克隆的 DNA 在 dam+ 大肠杆菌菌株中生长时潜在的 dam 甲基化位点。 在 Fc5 中， 在 EU 索引位置 218 的精氨酸残基突变回至赖氨酸， 因为在包含该特定 Fc 的融合蛋白中没有使用 BglII 克隆方案。 Fc5 序列的其余部分与上文对 Fc4 的描述相符。
     Fc6 与 Fc5 相同， 只是羧基末端赖氨酸密码子已被消除。成熟免疫球蛋白的 C- 端 赖氨酸经常在翻译后从 B- 细胞分泌之前从成熟免疫球蛋白被去除， 或在血清循环过程中 被去除。因此， 在循环抗体上通常找不到 C- 端赖氨酸残基。像上述 Fc4 和 Fc5 一样， Fc6 序 列中的终止密码子变为 TAA。
     Fc7 与野生型 γ1 Fc 相同， 除了位于 CH2 域中的 EU 索引位置 297 处的氨基酸置换 之外。EU 索引位置 Asn-297 是一个 N- 连接型碳水化合物搭接的位点。由于碳水化合物结 构中可能的批次间差异， N- 连接的碳水化合物向重组表达的蛋白质中导入了潜在的变异性 来源。在一个消除这种潜在的变异性的尝试中， 将 Asn-297 突变为谷氨酰胺残基以防止在 该残基位置上的 N- 连接型碳水化合物的搭接。Fc 对于 FcRIII 的结合也涉及残基 297 处的 碳水化合物 (Sondermann 等人， Nature 406 ： 267(2000))。因此， 去除碳水化合物应该会一 般性地减少包含重组 Fc7 的融合蛋白与 FcγR 的结合。与上面一样， Fc7 序列中的终止密 码子突变为 TAA。
     本发明也考虑这些分子的亮氨酸拉链形式。″亮氨酸拉链″是本领域的术语， 用来表示一种富含亮氨酸的序列， 其增强、 促进、 或驱动其融合配偶体 ( 例如， 亮氨酸拉链 与之融合或连接的序列或分子 ) 的二聚化或三聚化。现有技术已描述了多种亮氨酸拉链 多 肽。 参 见， 例 如， Landschulz 等 人， Science， 240 ： 1759(1988) ； 美 国 专 利 5,716,805 ； WO 94/10308 ； Hoppe 等人， FEBS Letters， 344 ： 1991(1994) ； Maniatis 等人， Nature， 341 ： 24(1989)。本领域技术人员将理解亮氨酸拉链序列可融合于本发明多肽的 5′或 3′端。
     融合蛋白的制备通常可使用标准技术， 包括化学缀合。融合蛋白也可在表达体系 中通过标准技术表达为重组蛋白质。合适的接头进一步在下文描述。
     接头可为天然存在的， 合成的， 或两者的组合。例如， 合成的接头可为随机化的接 头， 例如， 序列和尺寸都随机化。 在一方面， 随机化的接头可包含完全随机化的序列， 或任选
     地， 随机化的接头可基于天然接头序列。接头可包含， 例如， 非多肽部分 ( 例如多核苷酸 )、 多肽、 等。
     接头可为刚性的， 或者柔性的， 或两者的组合。 接头的柔性可以是接头和与接头相 互作用的亚单位两者的组成的函数。接头将两个选定的结合实体 ( 例如， 两个单独的多肽 或蛋白质， 如两个不同的抗体 ) 联接到一起， 并保持各实体为各别且离散的。该接头可允许 单独的、 离散的域的协作， 且保持各别的特性， 如对于多聚物中同一靶标的多个各别的结合 位点， 或者， 例如， 对于多聚物中不同靶标的多个各别的结合位点。 在一些情况下， 在两个连 接的结合实体之间， 或在接头和结合实体之间存在二硫桥。
     对于具体的要连接两个或多个结合实体的情况， 合适的接头的选择可取决于多个 参数， 包括例如结合实体的性质、 双特异性组合物结合的靶标的结构和性质、 和 / 或接头 ( 例如， 肽接头 ) 对蛋白水解和氧化的稳定性。
     特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸 (Gly)、 丝氨酸 (Ser)、 丙氨酸 (Ala) 和 苏氨酸 (Thr) 的氨基酸残基。例如， 肽接头可包含至少 75％ ( 基于肽接头中存在的残基总 数计算 )、 如至少 80％、 至少 85％、 或至少 90％的选自 Gly、 Ser、 Ala 和 Thr 的氨基酸残基。 该肽接头也可仅由 Gly、 Ser， Ala 和 / 或 Thr 残基组成。该接头多肽具有的长度应足以连 接两个结合实体， 使得它们采取相对彼此的正确构象以使它们保持所需的活性， 如结合靶 分子以及可其它能与这样的靶结合相关的活性 ( 例如， 对于给定生物分子的激动或拮抗活 性 )。
     适于该目的的合适长度是例如至少 1 个且通常少于约 50 个氨基酸残基的长度， 如 2-25 个氨基酸残基， 5-20 个氨基酸残基， 5-15 个氨基酸残基， 8-12 个氨基酸残基或 11 个残 基。其它合适的多肽接头尺寸可包括， 例如， 约 2 至约 15 个氨基酸， 约 3 至约 15 个、 约4至 约 12 个、 约 10 个、 约 8 个、 或约 6 个氨基酸。选择纳入接头多肽的氨基酸残基应显示以下 特性， 其不显著干扰多肽多聚物的活性或功能。 因此， 该肽接头从整体上说应不具有与多聚 物的活性或功能不一致的电荷， 不干扰内部折叠， 也不与一个或多个域中的氨基酸残基形 成会严重阻碍多聚物与所关注靶点的结合的键或其它相互作用。
     天然存在的以及人造的肽接头用于连接多肽成为新的连接的融合多肽的用途是 本 领 域 众 所 周 知 的 ( 参 见， 例 如， Hallewell 等 人， J.Biol.Chem.264， 5260-5268， 1989 ； Alfthan 等 人， Protein Eng.8， 725-731， 1995 ； Robinson and Sauer， Biochemistry 35， 109-116， 1996 ； Khandekar 等 人， J.Biol.Chem.272， 32190-32197， 1997 ； Fares 等 人， Endocrinology 139， 2459-2464， 1998 ； Smallshaw 等 人， Protein Eng.12， 623-630， 1999 ； 美国专利号 5,856,456)。
     广泛使用肽接头的一个实例是用于制备单链抗体， 其中轻链 (VL) 和重链 (VH) 的 可变区通过人造接头连接。在这个领域有大量的公开文献。一种广泛使用的肽接头是由 三个重复的 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 氨基酸序列 ((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO ： 73) 组成的 15 聚 物。 也已使用了其它接头， 还使用了噬菌体展示技术， 以及选择性传染噬菌体技术来多样化 和选择合适的接头序列 (Tang 等人， J.Biol.Chem.271， 15682-15686， 1996 ； Hennecke 等人， Protein Eng.11， 405-410， 1998)。肽接头已用于连接异源和同源二聚蛋白质 ( 如 T- 细胞 受体、 λCro 阻抑物、 P22 噬菌体 Arc 阻抑物、 IL-12、 TSH、 FSH、 IL-5 和干扰素 -γ) 中的各 个链。肽接头也已用于产生融合多肽。已使用多种接头， 在 Arc 阻抑物的情况下， 噬菌体展示已用于优化接头长度和组成以增加单链蛋白质的稳定性 ( 参见 Robinson 和 Sauer， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95， 5929-5934， 1998)。
     另 一 种 获 得 合 适 的 接 头 的 途 径 是 通 过 随 机 诱 变 来 优 化 简 单 的 接 头 ( 例 如， (Gly4Ser)n)。
     如上文讨论的， 通常优选肽接头具有至少一些柔性。因此， 在一些变化形式中， 肽 接头包含 1-25 个甘氨酸残基， 5-20 个甘氨酸残基， 5-15 个甘氨酸残基， 或 8-12 个甘氨酸残 基。特别合适的肽接头通常包含至少 50％的甘氨酸残基， 如至少 75％的甘氨酸残基。在一 些实施方案中， 肽接头仅包含甘氨酸残基。 在某些变化中， 该肽接头还包含甘氨酸之外的其 它残基。甘氨酸之外的优选残基包括 Ser， Ala 和 Thr， 特别是 Ser。
     在一些情况下， 向肽接头提供一些刚性是理想的或者是必须的。这可通过在肽接 头的氨基酸序列中包含脯氨酸残基而实现。 因此， 在另一实施方案中， 肽接头在肽接头的氨 基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如， 肽接头可具有这样的氨基酸序列， 其中至少 25％ ( 例如， 至少 50％或至少 75％ ) 的氨基酸残基为脯氨酸残基。在本发明一个具体的实 施方案中， 肽接头仅包含脯氨酸残基。
     在一些实施方案中， 修饰肽接头而引入包含供非多肽部分搭接的基团的氨基酸残 基。此类氨基酸残基的实例可为半胱氨酸或赖氨酸残基 ( 随后非多肽部分搭接于其上 )。 另一种备选方案是包括具有体内 N- 糖基化位点的氨基酸序列 ( 从而将糖部分 ( 体内 ) 连 接于肽接头 )。另一种选择是利用进化的 tRNAs 和 tRNA 合成酶 ( 参见， 例如， 美国专利申请 公开 2003/0082575) 遗传性地将非天然氨基酸掺入多肽结合实体或肽接头。例如， 酮-酪 氨酸的插入允许针对表达的多肽的位点特异性偶联。
     在某些变化形式中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基， 如一个半胱氨酸残基。 例 如， 在一些实施方案中， 肽接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自 Gly， Ser， Ala 和 Thr 的 氨基酸残基。 在某些此类实施方案中， 肽接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基， 如仅有甘氨 酸残基和半胱氨酸残基。通常， 每个肽接头将仅包含一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残 基的具体肽接头的一个实例包括具有氨基酸序列 Glyn-Cys-Glym 的肽接头， 其中 n 和 m 各为 1-12 的整数， 例如， 3-9、 4-8、 或 4-7。
     如上所述， 本发明包括双特异性结合蛋白， 其包含 FGFR 和抗 VEGF-A 抗体的双特异 性抗体 / 可溶受体组合。在某些此类实施方案中， FGFR 和抗 VEGF-A 抗体共价连接 ( 例如， 通过肽接头 ) 以形成双特异性结合蛋白。在一些变化形式中， 该双特异性结合蛋白包含免 疫球蛋白重链恒定区， 例如， Fc 片段。特别合适的 Fc 片段包括， 例如， 包含修饰的 Fc 区以 减少或消除一种或多种效应物作用的 Fc 片段 ( 例如， Fc5， 具有 SEQ ID NO ： 74 所示的氨基 酸序列 )。
     例如， 在一些实施方案中， 根据本发明的减少 VEGF-A 和 FGF 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白包含如本文所述的抗 VEGF-A 抗体部分的结合区和 如本文所述的 FGFR3 的 FGF 结合部分。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为本文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 该 FGF 结合部分为 FGF 受体部分， 且可为 FGFR3， 尤其是本 文所述的 FGFR3IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体蛋白质包含 FGF 受体部 分和 VEGF-A 抗体部分的组合， 其中 FGF 受体部分为选自下组的 FGFR3 ： 如 SEQ ID NO ： 13 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)， 如 SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ：19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， 如 SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， 如 SEQ ID NO ： 15 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， 和如 SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375) (P250R) ； 所 述 VEGF-A 抗 体 部 分 选 自 下 组 ： 如 SEQ ID NO ： 44 所 示 的 c870.1e6scFV， 如 SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， 如 SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和如 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合 部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR3 ： SEQ ID NO ： 13 所示的 FGFR3IIIc(23-375)， SEQ ID NO ： 2 所示的 FGFR3IIIc(23-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)， SEQ ID NO ： 10 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(S249W)， SEQ ID NO ： 15 所 示的 FGFR3IIIc(23-375)(P250R)， SEQ ID NO ： 22 所示的 FGFR3IIIc(143-375)(P250R)， 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 包 括 选 自 下 组 的 FGFR3 部 分 和 VEGF-A 抗 体 部 分 ： FGFR3(143-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 58) ； FGFR3(23-375)(S249W)Fc5c1094.1pZMP31(SEQ ID NO ： 60) ； FGFR3(143-375)(S249W) Fc5c870e6pZMP31(SEQ ID NO ： 62) ； 和 FGFR3(23-375)(S249W)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO ： 64)。
     在 其 它 实 施 方 案 中， 该 FGF 结 合 部 分 为 FGFR2。 在 某 些 实 施 方 案 中， 该 FGFR2 包含 FGFR2IIIc。在某些实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分 和 VEGF-A 结 合 部 分， 所 述 FGF 结 合 部 分 为 选 自 下 组 的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所 示 的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示 的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所 示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所 述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 44 所示的 c870.1e6scFV， SEQ ID NO ： 46 所示的 c1094.1scFV， SEQ ID NO ： 52 所示的 c870scFV， 和 SEQ ID NO ： 70 所示的 c1039scFV。在其 它实施方案中， 双特异性抗体 / 可溶受体组合包含 FGF 结合部分和 VEGF-A 结合部分， 所述 FGF 结合部分为选自下组的 FGFR2 ： SEQ ID NO ： 24 所示的 FGFR2IIIc(22-377)， SEQ ID NO ： 29 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(S252W)， SEQ ID NO ： 33 所示的 FGFR2IIIc(22-377)(P253R)， SEQ ID NO ： 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)， SEQ ID NO ： 40 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(S252W)， 和 SEQ ID NO ： 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377)(P253R) ； 所述 VEGF-A 结合部分选自下组 ： SEQ ID NO ： 48 所示的 c870VL 和 SEQ ID NO ： 50 所示的 VH， SEQ ID NO ： 54 所示的 c1094VL 和 SEQ ID NO ： 56 所示的 VH， 以及 SEQ ID NO ： 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO ： 68 所示的 VH。
     III. 核酸， 宿主细胞， 和制备 VEGF-A 和 FGF 双特异性抗体 / 可溶受体组合蛋白的 方法
     本发明的可溶 FGFR 多肽可通过表达编码细胞外域或其部分的 DNA 制备。例如， 编 码包含 SEQ ID NO ： 13 的残基 36-388 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 FGFR3IIIc。 N- 端截 短的 FGFR3IIIc 可使用编码 SEQ ID NO ： 19 的残基 36-268 的多核苷酸。为制备 FGFR2IIIc， 可 使用编码 SEQ ID NO ： 24 的残基 36-391 的多核苷酸。在另一实例中， 编码包含 SEQ ID NO ： 37 的残基 36-268 的多肽的多核苷酸序列可用于制备 N- 端截短的 FGFR2IIIc。优选该细胞外域多肽制备为基本上无跨膜和细胞内多肽区段的形式。为引导受体域从宿主细胞输出， 该 受体 DNA 连接至编码分泌肽的第二 DNA 片段， 如受体的天然信号序列。其它可使用的信号 序列包括 tPA 信号序列 ( 在以下实施例描述 )， CD33 信号序列或人生长激素信号序列。为 促进分泌的受体域的纯化， 可将 C- 端延伸物， 如多组氨酸标签、 物质 P、 FlagTM 肽 (Hopp 等 人， Biotechnology 6 ： 1204-1210， 1988 ； 获自 Eastman Kodak Co.， New Haven， CT) 或另一 有可用的抗体或特异性结合剂的多肽或蛋白质， 融合至受体多肽。
     本发明还包括编码本发明的抗体的重链和 / 或轻链的核酸。本发明的核酸包括这 样的核酸， 其具有与如上表 2 所列的编码 VL 和 / 或 VH 的多核苷酸基本相同的区域。本发明 的核酸还包括互补核酸。 在一些情况下， 当形成比对时， 各序列将是完全互补的 ( 无错配 )。 在其它情况下， 序列中可存在至多约 20％错配。 在本发明一些实施方案中， 提供了编码本发 明抗体的重链和轻链两者的核酸。 本文提供的核酸序列可使用密码子优化、 简并序列、 沉默 突变和其它 DNA 技术优化在特定宿主中表达后加以利用， 本发明涵盖这样的序列修饰。
     因此， 在一些方面， 本发明提供编码本文所述 FGFR 和 / 或 VEGF-A 抗体的一种或多 种多核苷酸 ( 例如， DNA 或 RNA)。在一些变化形式中， 本发明的多核苷酸编码结合并减少 FGF 和 VEGF-A 两者的活性的 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白。本领域技术 人员将容易理解， 考虑到遗传密码的简并， 在这些多核苷酸分子中可能有大量的序列变化。
     本发明的核酸可克隆至载体中， 载体例如质粒， 粘粒， 杆粒 (bacmid)， 噬菌体， 人造 染色体 (BAC， YAC) 或病毒， 可向其中插入另一遗传序列或元件 (DNA 或 RNA) 以实现连接的 序列或原件的复制。在一些实施方案中， 该表达载体包含组成型活性启动子区段 ( 例如但 不限于 CMV， SV40， 延伸因子或 LTR 序列 ) 或诱导型启动子序列， 如类固醇可诱导的 pIND 载 体 (Invitrogen)， 在那里核酸的表达可被调节。 本发明的表达载体可进一步包括调节序列， 例如， 内部核糖体进入位点。该表达载体可通过例如转染被引入细胞。
     因此， 用于本发明中的蛋白质可根据常规技术在遗传工程化的宿主细胞中产生。 合适的宿主细胞为可用外源性 DNA 转化或转染且生长在培养物中的细胞类型， 包括细菌， 真菌细胞， 和培养的高等真核细胞 ( 包括培养的多细胞有机体的细胞 )， 特别是培养的哺乳 动物细胞。处理克隆 DNA 分子和向多种宿主细胞引入外源 DNA 的技术公开于 Sambrook 等 人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989)， 和 Ausubel 等人， 上文。
     通常， 在表达载体内， 编码感兴趣蛋白质的 DNA 序列可操作连接于其表达所需的 其它遗传元件， 通常包括转录启动子和终止子。该载体通常还包含一个或多个选择标记和 一个或多个复制起点， 不过， 本领域技术人员知道在某些体系内选择标记可提供在另外的 载体上， 且外源 DNA 的复制可通过整合至宿主细胞基因组中而提供。启动子、 终止子、 选择 标记、 载体和其它元件的选择是本领域常规技术的水平内的常规设计。许多这样的元件描 述于文献中且可获自商业供应者。
     为将重组蛋白质导向至宿主细胞的分泌途径， 在表达载体中提供分泌信号序列 ( 也称为前导序列， 前原序列或前序列 )。该分泌信号序列可为重组蛋白质的天然形式的， 或可衍生自另一分泌的蛋白质 ( 例如， t-PA ； 参见美国专利号 5,641,655) 或从头合成。该 分泌信号序列可操作连接至编码蛋白质的 DNA 序列， 即， 该两个序列在正确的读框中连接 并定位以将新合成的多肽引导至宿主细胞的分泌途径。 分泌信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的 DNA 序列的 5’ ， 但某些信号序列可位于感兴趣的 DNA 序列中的其它位置 ( 参见， 例 如， Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； Holland 等人， 美国专利号 5,143,830)。在具体的 变化形式中， 根据本发明使用的分泌信号序列具有选自下组的氨基酸序列 ： SEQ ID NOS ： 2， 10， 13， 15， 19， 22， 24， 29， 33， 37， 40， 42， 58， 60， 62 和 64 的残基 1-35。
     培养的哺乳动物细胞为制备用于本发明的重组蛋白质的合适的宿主。向哺乳动 物宿主细胞引入外源 DNA 的方法包括磷酸钙 - 介导的转染 (Wigler 等人， Cell 14 ： 725， 1978 ； Corsaro 和 Pearson， Somatic Cell Genetics 7 ： 603， 1981 ： Graham 和 Van der Eb， Virology 52 ： 456， 1973)， 电穿孔 (Neumann 等人， EMBO J.1 ： 841-845， 1982)， DEAE- 葡聚糖 介导的转染 (Ausubel 等人， 上文 )， 和脂质体介导的转染 (Hawley-Nelson 等人， Focus 15 ： 73， 1993 ； Ciccarone 等人， Focus 15 ： 80， 1993)。 重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的制备 公开于， 例如， Levinson 等人， 美国专利号 4,713,339 ； Hagen 等人， 美国专利号 4,784,950 ； Palmiter 等人， 美国专利号 4,579,821 ； 和 Ringold， 美国专利号 4,656,134。合适的哺乳动 物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞 (Vero ； ATCC CRL 1587)， 人胚胎肾细胞 (293-HEK ； ATCC CRL 1573)， 幼仓鼠肾细胞 (BHK-21， BHK-570 ； ATCC CRL 8544， ATCC CRL 10314)， 犬肾细胞 (MDCK ； ATCC CCL 34)， 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-K1 ； ATCC CCL61 ； CHO DG44 ； CHO DXB11(Hyclone， Logan， UT) ； 另参见， 例如， Chasin 等人， Som.Cell.Molec.Genet.12 ： 555， 1986))， 大鼠垂体细胞 (GH1 ； ATCC CCL82)， HeLa S3 细胞 (ATCC CCL2.2)， 大鼠肝癌细胞 (H-4-II-E ； ATCC CRL 1548)SV40- 转化的猴肾细胞 (COS-1 ； ATCC CRL 1650) 和鼠胚胎细胞 (NIH-3T3 ； ATCC CRL 1658)。 其他合适的细胞系是本领域已知的， 并且可以从公共保藏机构 如 American Type Culture Collection， Manassas， Virginia 获得。可使用强的转录启动 子， 如 SV-40 或巨细胞病毒的启动子。参见， 例如， 美国专利号 4,956,288。其它合适的启动 子包括来自金属硫蛋白基因的启动子 ( 美国专利 4,579,821 和 4,601,978) 和腺病毒主要 晚期启动子。
     药物选择通常用于选出已插入外源 DNA 的培养的哺乳动物细胞。这样的细胞通常 称为 “转染子” 。 在选择性试剂的存在下培养且能将感兴趣的的基因传至其后代的细胞称为 “稳定的转染子” 。示例性的选择标记包括编码对抗生素新霉素的抗性的基因， 其允许在新 霉素型药物如 G-418 等的存在下进行选择 ； 黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的 gpt 基因， 其允许宿主细胞在霉酚酸 / 黄嘌呤的存在下生长 ； 和提供对 zeocin， 博来霉素， 杀稻瘟素 (blastocidin)， 和潮霉素的抗性的标记 ( 参见， 例如， Gatignol 等人， Mol.Gen.Genet.207 ： 342， 1987 ； Drocourt 等人， Nucl.Acids Res.18 ： 4009， 1990)。选择系统也可用于增加感兴 。 扩增通过以下方式进行， 在低水平的选择剂的存在 趣基因的表达水平， 该过程称为 “扩增” 下培养转染子， 然后增加选择剂的量以选择出产生高水平的引入的基因的产物的细胞。可 扩增的选择标记的实例为二氢叶酸还原酶， 其赋予对甲氨蝶呤的抗性。其它药物抗性基因 ( 例如， 潮霉素抗性， 多药抗性， 嘌呤霉素乙酰基转移酶 ) 也可使用。
     其它高等真核细胞也可用作宿主， 包括昆虫细胞、 植物细胞和禽类细胞。 毛根土壤 杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 在植物细胞中作为用于表达基因的载体的用途已描述 于 Sinkar 等人， J.Biosci.(Bangalore)11 ： 47-58， 1987。昆虫细胞的转化和其中外源多肽 的产生公开于 Guarino 等人， 美国专利号 5,162,222 和 WIpO 公开 WO 94/06463。
     昆 虫 细 胞 可 被 通 常 衍 生 自 苜 蓿 丫 纹 夜 蛾 (Autographa californica) 核 型多 角 体 病 毒 (AcNPV) 的 重 组 杆 状 病 毒 感 染。 参 见 King 和 Possee， The Baculovirus Expression System ： A Laboratory Guide(Chapman & Hall， London) ； O’ Reilly 等 人， Baculovirus Expression Vectors ： A Laboratory Manual(Oxford University Press.， New York 1994) ； 和 Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology(Richardson ed.， Humana Press， Totowa， NJ， 1995)。重组杆状病毒也可通过使 用描述于 Luckow 等人 (J.Virol.67 ： 4566-4579， 1993) 的基于转座子的体系制备。这种 系统使用转移载体， 可以试剂盒的形式商购 (BAC-TO-BAC 试剂盒 ； Life Technologies， Gaithersburg， MD)。转移载体 ( 例如， PFASTBAC1 ； Life Technologies) 包含 Tn7 转座子， 以将编码感兴趣蛋白质的 DNA 移至作为大质粒 ( 称为 “杆粒” ) 保持在大肠杆菌中的杆状 病毒基因组中。参见 Hill-Perkins 和 Possee， J.Gen.Virol.71 ： 971-976， 1990 ； Bonning 等人， J.Gen.Virol.75 ： 1551-1556， 1994 ； 和 Chazenbalk 和 Rapoport， J.Biol.Chem.270 ： 1543-1549， 1995。此外， 转移载体可包括与上述编码多肽延伸物或亲和标签的 DNA 的合框 融合。使用本领域已知的技术， 将包含编码蛋白质的 DNA 序列的转移载体转化到大肠杆菌 宿主细胞中， 并从细胞中筛选包含断裂的 lacZ 基因 ( 其是重组杆状病毒的指示 ) 的杆粒。 使用一般技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒 DNA， 并用其转染草地贪夜蛾细胞， 如 Sf9 细胞。随后制备表达感兴趣蛋白质的重组病毒。重组病毒株通过本领域通常使用的方 法制备。 对 于 蛋 白 质 制 备， 重 组 病 毒 用 于 感 染 宿 主 细 胞， 通常为衍生自草地贪夜蛾 (Spodoptera fugiperda) 的 细 胞 系 ( 例 如， Sf9 或 Sf21 细 胞 ) 或 衍 生 自 粉 纹 夜 蛾 (Trichoplusia ni) 的细胞系 ( 例如， HIGH FIVE 细胞 ； Invitrogen， Carlsbad， CA)。一般 参 见 Glick 和 Pasternak， Molecular Biotechnology， Principles & Applications of Recombinant DNA(ASM Press， Washington， D.C.， 1994)。 也参见美国专利号 5,300,435。 无 血清培养基用于培养和保持细胞。合适的培养基制剂是本领域已知的且可获自供应商。细 胞从约 2-5x 105 细胞的接种密度生长至 1-2x 106 细胞的密度， 此时添加重组病毒株， 其感 染复数 (MOI) 为 0.1 至 10， 更典型接近 3。使用的步骤通常描述于可用的实验室手册 ( 参 见， 例如， King 和 Possee， 上文 ； O’ Reilly 等人， 上文 ； Richardson， 上文 )。
     真菌细胞， 包括酵母细胞， 也可用于本发明。 在这方面感兴趣的酵母物种包括酿酒 酵母， 毕赤酵母 (Pichia pastoris)， 和甲醇毕赤酵母。用外源 DNA 转化酿酒酵母细胞和由 此制备重组多肽的方法公开于， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kawasaki 等人， 美 国专利号 4,931,373 ； Brake， 美国专利号 4,870,008 ； Welch 等人， 美国专利号 5,037,743 ； 通常是药物抗 和 Murray 等人， 美国专利号 4,845,075。依据由选择标记所确定的表型， 性、 或在特定营养素 ( 例如， 亮氨酸 ) 不存在的情况下生长的能力， 来选择转化的细胞。用 于酿酒酵母的载体系统的实例为 Kawasaki 等人 ( 美国专利号 4,931,373) 公开的 POT1 载体系统， 其允许通过含葡萄糖的培养基中培养来选择转化的细胞。用于酵母的合适的 启动子和终止子包括源自糖酵解酶基因 ( 参见， 例如， Kawasaki， 美国专利号 4,599,311 ； Kingsman 等人， 美国专利号 4,615,974 ； 和 Bitter， 美国专利号 4,977,092) 和醇脱氢酶基 因的那些。另参见美国专利号 4,990,446 ； 5,063,154 ； 5,139,936 ； 和 4,661,454。其它酵 母的转化体系， 包括多形汉逊酵母， 粟酒裂殖酵母， 乳酸克鲁维酵母， 脆壁克鲁维酵母， 玉米 黑粉菌 (Ustilago maydis)， 巴斯德毕赤酵母， 甲醇毕赤酵母， 季也蒙毕赤酵母， 和麦芽糖
     假丝酵母是本领域已知的。参见， 例如， Gleeson 等人， J.Gen.Microbiol.132 ： 3459-3465， 1986 ； Cregg， 美国专利号 4,882,279 ； 和 Raymond 等人， Yeast 14 ： 11-23， 1998。曲霉细胞 可根据 McKnight 等人， 美国专利号 4,935,349 的方法使用。转化产黄顶孢霉 (Acremonium chrysogenum) 的方法公开于 Sumino 等人， 美国专利号 5,162,228。转化链孢霉的方法公开 于 Lambowitz， 美国专利号 4,486,533。在甲醇毕赤酵母中制备重组蛋白质公开于美国专利 5,716,808 ； 5,736,383 ； 5,854,039 ； 和 5,888,768。
     原核宿主细胞， 包括细菌大肠杆菌、 芽孢杆菌属、 和其它属也是本发明中可用的宿 主细胞。转化这些宿主和表达其中克隆的外源 DNA 序列的技术是本领域已知的 ( 参见， 例 如， Sambrook 等人， 上文 )。当在细菌如大肠杆菌中表达重组蛋白质时， 该蛋白质可保持在 细胞质中， 通常作为不可溶颗粒， 或可通过细菌分泌序列导至周质空间。在前一情形， 将细 胞溶解， 回收颗粒并使用例如胍异硫氰酸酯或脲使其变性。然后变性的蛋白质可通过稀释 变性剂 ( 例如， 通过对脲与还原型和氧化型的谷胱甘肽的组合的溶液透析， 然后对缓冲盐 水溶液透析 ) 而重折叠和二聚化。或者， 该蛋白质可以可溶形式从细胞质回收， 并在不使 用变性剂的情况下分离。蛋白质作为水提取物 ( 例如磷酸盐缓冲盐水中的水提取物 ) 从 细胞回收。为了捕捉感兴趣的蛋白质， 将提取物直接施加至色谱介质， 如固定的抗体或肝 素 -Sepharose 柱。分泌的蛋白质可以以可溶的、 有功能的形式从周质空间回收， 方法是破 裂细胞 ( 通过， 例如， 超声处理或渗透压冲击 ) 以释放周质空间的内含物和回收蛋白质， 从 而无需变性和重折叠。 抗体， 包括单链抗体， 可在细菌宿主细胞中根据已知方法制备。 参见， 例如， Bird 等人， Science 242 ： 423-426， 1988 ； Huston 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5879-5883， 1988 ； 和 Pantoliano 等人， Biochem.30 ： 10117-10125， 1991。
     转化或转染的宿主细胞根据常规步骤在含营养素和所选宿主细胞的生长所需的 其它组分培养基中培养。 多种合适的培养基， 包括确定成分培养基和复合培养基， 是本领域 已知的， 且通常包括碳源、 氮源， 必需氨基酸， 维生素和矿物质。 培养基可按需要包含生长因 子或血清之类的成分。生长培养基通常会选择包含外源添加的 DNA 的细胞， 例如通过药物 选择或必须营养素的缺乏， 该必须营养素通过表达载体携带的或者共转染到宿主细胞中的 选择标记补充。
     包 含 VEGF-A 抗 体 / 可 溶 FGF 受 体 双 特 异 性 结 合 蛋 白 的 双 特 异 性 结 合 蛋 白 通 过 常 规 蛋 白 质 纯 化 方 法 纯 化， 通 常 通 过 色 谱 技 术 的 组 合 纯 化。 一 般 参 见 Affinity Chromatography ： Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology， Uppsala ，Sweden ， 1988) ； Scopes ，Protein Purification ： Principles and Practice(Springer-Verlag， New York 1994)。包含免疫球蛋白重链多肽的蛋白质可通过 亲和色谱法在固定的蛋白质 A 上纯化。可采用进一步的纯化步骤， 如凝胶过滤， 来获得所需 水平的纯度或提供脱盐， 缓冲液交换等。
     抗体可从细胞培养基通过已知方法， 如亲和色谱法使用常规柱和其它设备纯化。 在典型的程序中， 收集条件化培养基， 且可将其在 4℃储存至多 5 天。 为避免污染， 通常添加 抑菌剂 ( 例如， 叠氮化钠 )。降低培养基的 pH( 通常至 Ph ～ 5.5)， 如通过滴加冰醋酸。较 低的 pH 提供通过蛋白 G 树脂的最佳的 IgG 俘获。该蛋白质 G 柱的尺寸基于条件化培养基 的体积确定。用合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2 中和填充好的柱子。然 后使培养基通过中和的蛋白质 g 树脂， 流速由培养基体积和柱尺寸确定。保留穿透液以备可能的再次过柱。然后将具有俘获的抗体的树脂冲洗成中和缓冲液。使用酸性洗脱缓冲 液， 如 0.1M 甘氨酸， pH 2.7 或等价物将柱子洗脱为级分。中和各级分， 例如使用 2M tris， pH 8.0， 以 tris ∶甘氨酸的 1 ∶ 20 比例。汇集包含蛋白质的级分 ( 例如， 基于 A280)。汇集 的级分使用脱盐柱缓冲液交换至合适的缓冲液， 如 35mM NaPO4， 120mM NaCl pH 7.2。通过 A280 使用消光系数 1.44 测定浓度。内毒素水平可通过 LAL 测定法确定。纯化蛋白质可冷冻 储存， 通常在 -80℃。
     表达功能性 VEGF-A 抗体 / 可溶 FGF 受体双特异性结合蛋白的细胞在筛选测定中 使用。多种合适的测定是本领域已知的。这些测定基于对靶细胞中生物响应的检测。一 种这样的测试为细胞增殖测试。在存在或不存在测试化合物的情况下培养细胞255