一种食用组合物及其制备方法与应用 技术领域 本发明涉及一种食用组合物及其制备方法与应用， 尤其涉及一种含有蔓越莓、 黑 醋栗和蓝莓的具有一定抗氧化、 清除自由基作用的食品组合物。
背景技术 人类衰老的原因是多方面的， 包括自由基说， 生理功能、 代谢失调说， 生物钟理论 等。其中， 自由基的氧化破坏是造成机体早衰及某些慢性疾病的主要原因， 被普遍认可。英 国 Harman 于 1956 年率先提出， 认为引起人体衰老的主要原因是人体细胞代谢过程中不断 产生的自由基。自由基 (Free radical) 是指含有孤立的不成对价电子的原子或原子基团， 是具有高度破坏能力的分子， 性质活泼， 有极强的氧化能力， 能通过氧化反应来攻击他们遇 到的任何分子。
人类在吸收氧气、 消耗热量或者分解葡萄糖时， 都会产生自由基 ； 既然生命能力历 经 35 亿年沧桑而延续至今， 就说明生命本身具有平衡自由基或者说清除多余自由基的能 力。然而， 随着人类文明的飞速发展， 特别是最近一百年来， 在科学技术给人类创造了巨大 生产力的同时也带来了大量的副产品， 其中就有与日俱增的自由基。 化学品的大量使用、 汽 车尾气和工业生产废气的增加、 还有各种辐射， 使生活环境充斥大量自由基 ； 另外， 工作压 力大、 精神紧张、 忧郁、 不良的饮食习惯、 生活不规律等也会刺激体内自由基的加倍产生。 骤 然增加的自由基， 早已超过了人以及生命所能正常保持平衡的标准， 这些过量的自由基， 很 容易失去控制， 会乱跑乱窜， 去攻击细胞膜， 去与血清抗蛋白酶发生反应， 甚至去跟基因抢 电子， 对我们的身体造成各种各样的伤害， 产生各种各样的疑难杂症。越来越多的证据显 示， 体内自由基含量越高， 寿命越短。
自由基可以摧毁细胞膜， 导致细胞膜发生病变， 使得细胞不能从外部吸收营养， 也 排泄不出细胞体内的代谢废物， 形成色素沉积、 产生黄褐斑、 蝴蝶斑、 老年斑等 ； 并能使细胞 丧失对细菌和病毒的防御能力， 从而使人体免疫力下降， 疲劳和器官病变。 如自由基攻击正 在复制中的基因， 造成基因突变， 则会诱发癌症发生 ； 自由基作用于人体内分泌系统， 导致 胶原蛋白酶和硬弹性蛋白酶的释放， 这些酶作用于皮肤中的胶原蛋白和硬弹性蛋白， 使这 两种蛋白产生过度交联并降解， 结果使皮肤失去弹性， 出现皱纹及囊泡……
生理特点决定了女性相对于男性， 身体要脆弱的多， 更容易受到自由基过剩带来 的伤害。
日常饮食中的一些蔬菜水果具有一定的抗氧化作用， 但这已经远远不能满足当前 身体对抗自由基的需要， 必须依靠额外补充具有高效抗氧化作用的食品， 来维持体内自由 基的平衡， 延缓衰老、 预防疾病。
市场上的抗氧化产品， 多是以化学方法得到的 VC 和 / 或 VE 为主要原料的制剂， 不 仅作用单一， 还需要严格控制摄入量避免中毒等不良反应 ； 更是缺少针对女性身体特点的 具有多重功效的功能性食品。为了延长人们健康、 年青的状态， 提高人们的生活质量， 减轻 社会负担， 特别是针对更需要关注的广大女性人群， 开发出一种纯天然、 具有良好清除自由
基、 抗氧化等多种功能于一身的食品十分必要。 发明内容 为了弥补现有抗氧化产品作用单一、 可能存在安全隐患且缺乏女性专用产品等不 足， 发明人经过大量的理论研究及科学试验， 旨在提供一种全天然的具有抗氧化、 清除自由 基等多种功能且食用方便、 口感好的食用组合物及其制备方法， 以达到人们， 特别是女性人 群保持健康、 延缓衰老的目的。
为达到本发明的目的、 解决目前存在的技术问题， 本发明所采用的技术方案为 ：
本发明提供了一种食用组合物， 该食用组合物含有， 蔓越莓 251 份、 黑醋栗 30 ～ 70 份、 蓝莓 10 ～ 30 份， 以上份为重量份。
上述组分中， 所述的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓为各浆果的干燥粉末， 或称原料粉末， 即 蔓越莓的粉末、 黑醋栗的粉末和蓝莓的粉末。蔓越莓、 黑醋栗和蓝莓的原料粉末可以直接 购买得到， 如天津尖峰公司 ( 商品名称 ： 蔓越莓果粉、 黑醋栗提取物、 高浓度蓝莓果汁浓缩 粉)； 也可以将原材料干燥后直接粉碎得到， 干燥方式可选用本领域技术人员公知的冻干、 低温风干、 阴干等方式实现 ； 还可以是原材料的水提取物的干燥粉末， 即蔓越莓、 黑醋栗和 蓝莓经过常规的水提取， 例如水煎煮， 得到的水提取物的干燥后的粉末 ； 或是将新鲜原料压 榨取汁、 浓缩后冷冻干燥的粉末。
所述的蔓越莓 (Oxycoccos) 为杜鹃花科 (Ericaceae) 越橘属 (Vaccinium) 红莓苔 子亚属 (Oxycoccos) 的成熟果实， 又名蔓越橘、 小红莓、 鹤莓。蔓越莓是北美的传统水果之 一， 含有丰富的槲皮素、 原花青素等黄酮类化合物、 浓缩单宁酸等有机酸及维生素 C、 β2 胡 萝卜素、 硒等微量元素和矿物质成分， 具有一定的抗氧化、 清除自由基、 防止细菌粘附人体 组织器官腔壁的作用。
所述的黑醋栗为茶藨子科 (Grossulariaceae) 茶藨子属黑穗醋栗 (Ribes nigrum L.) 的黑色小浆果， 又名黑加仑， 黑豆果， 学名黑穗醋栗 (Ribes nigrum L.)， 含有丰富的维 生素 C、 维生素 E、 维生素 P、 钾、 钙、 花色素甙、 可溶性纤维、 有机酸等活性物质， 被世界多个 国家作为营养食品、 药品的原料广泛应用于延缓衰老、 保护视力、 消炎等方面。
所述的蓝莓学名越桔， 为杜鹃花科 (Ericaceae) 越橘属 (Vaccinium) 植物的蓝色 浆果， 富含花青素、 维生素 E、 维生素 A、 维生素 B、 SOD( 超氧化物歧化酶 )、 食用纤维及铁、 锌 等矿物质， 具有营养视网膜、 缓解视疲劳等功效。
发明人经过大量的理论研究及科学实验， 发现将蔓越莓、 黑醋栗及蓝莓相互配合 食用， 其抗氧化、 清除自由基的作用远胜过各自单独食用的效果， 特别是当其用量 ( 重量 份 ) 分别为 251 份、 30 ～ 70 份、 10 ～ 30 份时， 不但具有显著的抗氧化、 清除自由基的功能， 同时还有良好的预防泌尿道感染、 抑制幽门杆菌保护胃黏膜、 改善视力预防多种眼疾等功 效。 该组合物组分简单、 配比合理、 及多重营养保健功能于一身， 食用安全、 方便， 且口感佳， 可以满足人们在快节奏生活中摄取营养、 强健身体的需求。
本发明的上述食用组合物优选含有蔓越莓 251 份、 黑醋栗 40 ～ 60 份、 蓝莓 15 ～ 25 份， 以上份为重量份。
在优选实施方案中， 上述食用组合物的组分用量 ( 重量份 ) 更优选为 ： 蔓越莓 251 份、 黑醋栗 45 ～ 55 份、 蓝莓 18 ～ 22 份。
为了方便食用， 本发明所述的食用组合物可以是任何一种可供食用的形式， 例如， 可以采用与药物制剂相类似的片、 胶囊、 颗粒、 散、 丸或液体的食品形式， 所述食品形式还可 称为食用形式， 当本发明的食用组合物采用上述任一种食品形式时， 为了制成该食品的需 要， 该食用组合物中还含有本领域公知的常规辅料。此时， 本发明食用组合物的制备方法， 包含如下步骤 ：
(1) 所述的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓制成 60 ～ 100 目的干燥粉末 ；
(2) 将步骤 (1) 得到的干燥粉末混合 ；
(3) 在步骤 (2) 得到混合粉末中加入食品级的常规辅料， 通过常规工艺， 得到片、 胶囊、 散、 颗粒、 丸或液体的食品形式的食用组合物。
步骤 (1) 中所述蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓的干燥粉末为蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓的浆果 干燥后粉碎得到的粉末， 或是蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓的浆果的水提取物的干燥粉末， 或是新 鲜的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓的浆果经压榨取汁、 浓缩、 干燥后的粉末。
本文所说的常规辅料是指食用级的辅助性材料或食材。
本发明食用组合物， 当其食品形式为固体形式时， 所述的常规辅料是预胶化淀粉、 羟甲基淀粉钠、 木糖醇、 微晶纤维素、 乳糖、 甘露醇、 海藻酸钠、 聚维酮 k30、 硬脂酸镁、 微粉硅 胶中任一种或任意组合， 其比例为常规辅料 ： 原料为 1 ～ 2.5 ∶ 1， 优选常规辅料 ： 原料为 1.8 ～ 2.2 ∶ 1。
当其食品形式为液体形式， 则所述的常规辅料是水、 蜂蜜、 甜菊甙、 麦芽糖、 防腐剂 等， 其中蜂蜜、 蔗糖或麦芽糖等加量为成品总量的 5 ～ 60％。
按照上述方法制得的食用组合物， 其在具有适宜的甚至是良好的食用口感的基础 上， 该组合物不但保留了原料食材具有的增加维生素、 膳食纤维等作用， 大量的试验数据验 证， 经过本发明的合理配比组合， 该组合物还大大强化了各原料食材本身具有抗氧化、 清除 自由基的作用效果， 此外还兼具有良好的的类似功能性食品、 保健食品等的预防泌尿道感 染、 保护胃黏膜、 改善视力预防多种眼疾、 抗辐射的功能。
食用组合物是食品级的组合物， 也可直接称其为食品， 或者是具有某些功能的功 能性食品， 其优选为片的食品形式， 特别是食用更为方便， 口感更好的咀嚼片的形式， 常规 辅料是木糖醇、 微晶纤维素、 乳糖、 甘露醇、 海藻酸钠、 聚维酮 k30、 硬脂酸镁、 微粉硅胶中任 一种或其任意组合。
本发明还提供了上述食用组合物在制备具有抗氧化、 清除自由基作用的食品中的 应用。
本发明的发明点和创造性在于 ： 将蔓越莓、 黑醋栗和蓝莓三种植物食材按照特定 用量配比组合， 在保留原料具有的增加维生素、 膳食纤维等作用的同时， 还大大强化了各原 料食材本身具有抗氧化、 清除自由基的作用效果， 此外还兼具有良好的预防泌尿道感染、 保 护胃黏膜、 改善视力预防多种眼疾、 抗辐射的功能 ； 食用方便、 可口， 安全、 无副作用， 不会因 耐受性而效果渐弱， 可以满足快节奏生活中的人们随时摄取营养、 强健身体的需求。 本发明 食用组合物针对女性身体体质特点设计， 为女性人群提供全面保养， 填补了市场空缺。
发明人进一步通过具体试验来验证本发明的预期功能性效果。
再次重申 ： 以下实验只是本发明研制过程中众多试验中的例举性试验， 并未涵盖 和穷尽了发明人为本发明所做的所有试验， 目的仅仅在于用那些数据来阐述本发明的有益效果。 一、 本发明食用组合物在抗氧化、 清除自由基方面的作用
1、 试验材料
本发明食用组合物， 北京同仁堂国药公司科研所提供。
ICR 小鼠， 北京大学医学院实验动物部提供， 合格证号 ： SCXK 京 2008-0003， 清洁 级， 雌性， 其中自然衰老小鼠鼠龄 9 个月， 体重 45 ～ 53g ； 辐照小鼠体重 19g ～ 21g， 实验时 按体重随机分组。
试剂盒， 购自南京建成生物工程研究所。
2、 指标介绍
MDA( 丙二醛 ) 是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的氧化终产物， 会引 起蛋白质、 核酸等生命大分子的交联聚合， 且具有细胞毒性。
SOD( 超氧化物歧化酶 ) 是一种源于生命体的活性物质， 是一种主要的抗氧化酶， 能清除超氧化物自由基。
GSH-Px( 谷胱甘肽过氧化物酶 ) 是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解 酶， 是机体抗过氧化能力指标之一。
3、 试验方法
3.1 衰老模型实验
试验设三个剂量组及空白对照组。低、 中、 高三个剂量分别为 0.5、 1.0、 3.0g/kg 体 重， 实验时以蒸馏水为溶媒。试验前取尾血， 用试剂盒测 MDA、 SOD 及 GSH-Px 的值。实验时 按 MDA 水平随机分组。各剂量组通过灌胃服用， 容量按 0.1ml/10g 体重计， 每天 1 次， 连续 30 天。第 31 天内眦静脉采血， 测定红细胞中 SOD 活力、 MDA 含量和全血中 GSH-Px 的活力。
3.2 辐照模型实验
试验设空白对照组、 蒸馏水对照组和三个剂量组。低、 中、 高三个剂量分别为 0.5、 1.0、 3.0g/kg 体重， 实验时以蒸馏水为溶媒， 各剂量组通过灌胃服用， 容量按 0.1ml/10g 体 重计， 每天 1 次， 连续 30 天 ； 蒸馏水对照组给蒸馏水， 处理同前。 第 31 天内眦静脉采血， 测定 60 红细胞中 SOD 活力、 MDA 含量和全血中 GSH-Px 的活力。 除空白对照外， 各组给予 8Gy C0γ 射 线全身一次性照射， 各组动物照射后第 4 天处死， 取肝组织测 SOD 活力、 MDA 含量和 GSH-Px 活力。
4、 数据处理采用 SPSS 11.5 软件包统计。
5、 试验结果
5.1 对小鼠体重的影响
衰老模型实验， 与空白对照组比较， 各剂量组小鼠实验前后体重均无明显变化， 差 异均无统计学显著性 (P ＞ 0.05)。
辐照模型实验， 与蒸馏水对照组比较， 各剂量组小鼠实验前后体重均无明显变化， 差异均无统计学显著性 (P ＞ 0.05)。
5.2 对小鼠体内 MDA 含量的影响
自然衰老模型实验， 与空白对照组比较， 中、 高剂量组小鼠实验后红细胞 MDA 含量 明显降低， 差异均有统计学显著性 (P ＜ 0.05)， 结果见表 1。
辐照模型实验， 与蒸馏水对照组比较， 三剂量组小鼠实验后肝组织中 MDA 含量明
显降低， 差异均有显著性 (P ＜ 0.05)， 结果见表 1。
表 1 本发明食用组合物对小鼠 MDA 含量的影响 (X±SD)
*与试验前比较 ； # 与空白对照组比较， P ＜ 0.05 ； ## 与蒸馏水对照组比较， P＜ 0.05。
5.3 对小鼠 SOD 活力的影响
自然衰老模型实验， 与空白对照组比较， 高剂量组小鼠实验后红细胞 SOD 活力明 显增高， 差异有统计学显著性 (P ＜ 0.05)。
辐照模型实验， 辐照前， 和蒸馏水对照组比较， 红细胞 SOD 活力差异无统计学显著 性 (P ＞ 0.05) ； 辐照后， 与蒸馏水对照组比较， 中、 高剂量组小鼠肝组织 SOD 活力明显增高， 差异均有统计学显著性 (P ＜ 0.05)， 见表 2。
表 2 受试物对小鼠 SOD 活力的影响 (X±SD)
# 与空白对照组比较， P ＜ 0.05 ； ## 与蒸馏水对照组比较， P ＜ 0.05。
5.4 对小鼠 GSH-Px 活性的影晌
衰老模型实验， 与空白对照组比较， 高剂量组小鼠实验后全血中 GSH-Px 的活力明 显增高， 差异有统计学显著性 (P ＜ 0.05)。
辐照模型实验， 与蒸馏水对照组比较， 高剂量组小鼠实验后肝组织 GSH-Px 的活力 明显增高， 差异有统计学显著性 (P ＜ 0.05)， 见表 3。
表 3 受试物对小鼠 GSH-Px 的活性的影响 (X±SD)
# 与空白对照组比较， P ＜ 0.05 ； ## 与蒸馏水对照组比较， P ＜ 0.05。
6、 结论
以上试验结果为， 三个剂量的本发明食用组合物， 在不影响受试动物的生长的同 时， 相对于空白对照组或蒸馏水对照组， 都有增高衰老试验、 辐照试验小鼠体内的 SOD 及 GSH-Px 的活力、 并使衰老试验、 辐照试验小鼠体内的 MDA 降低的作用， 特别是高剂量组， 作 用效果更为显著， 该试验结果表明本发明食用组合物可有效维持抗氧化物质的活性， 抑制 氧化产物等有害物质生成， 起到良好的抗氧化、 清楚自由基的作用。
二、 本发明食用组合物对胃黏膜保护的试验
1、 试验材料
本发明食用组合物， 北京同仁堂国药公司科研所研制提供。
SD 大鼠， 北京大学医学院实验动物部提供， 合格证号 ： SCXK 京 2008-0003， 清洁级， 雄性， 体重 180 ～ 220g， 实验时按体重随机分组。
2、 试验方法
本试验采用急性酒精损伤模型法， 设对照组 ( 蒸馏水 ) 和 3 个剂量组， 各组灌胃服 用， 每日 1 次， 连续 30 天。低、 中、 高 3 个剂量分别为 0.5、 1.0、 3.0g/kg 体重， 以蒸馏水为溶 媒。解剖前动物禁食 24h， 自由摄水， 解剖前 2h 各组再次灌胃相应供试物一次， 1h 后， 再分 别灌无水乙醇 1.0ml/ 只， 1h 后处死动物， 取胃， 于 10％甲醛溶液中固定 20min 后， 置解剖镜 下观察胃粘膜的损伤情况， 并用游标卡尺测量胃粘膜的损伤程度。
游标卡尺测定胃粘膜的损伤程度的方法 ： 将固定后的胃沿大弯剪开， 洗净胃内容 物， 将胃粘膜展开， 用游标卡尺测量出腺胃区充血或弥漫性出血条带的面积。 以充血带和弥 漫性出血的总面积作为损伤程度的评价指标。
3、 数据处理采用 SPSS13.0 软件包统计， 各组原始数据均符合方差齐性要求 (P ＞ 0.05)。
4、 试验结果
与对照组相比， 中、 高剂量组的大鼠胃粘膜损伤面积明显降低， 结果见表 4。 差异有 统计学意义 (q 检验 P ＜ 0.05)。
表 4 本发明食用组合物对大鼠胃粘膜损伤面积的影响
组别 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 F P
动物数 / 只 10 10 10 10 胃粘膜损伤面积 (mm2) 136.88±56.05 101.62±52.34 95.69±45.43# 91.34±41.41# 6.122 0.025 抑制率 (％ ) / 25.76 30.09 33.27q 检验 ： 与对照组比较 #P ＜ 0.05。
计算公式 ：
抑制率＝ ( 对照组胃粘膜损伤面积 - 剂量组胃粘膜损伤面积 )×100/ 对照组胃粘 膜损伤面积
5、 结论
胃黏膜保护试验中， 无水乙醇进入胃后， 可直接损伤胃黏膜细胞， 乙醇被吸收后， 可灭活环氧化酶， 阻碍前列腺素出现， 使胃内白三烯类物质生成增多， 促进炎症反应 ； 还可 使胃蛋白酶增加， 这些增强了胃内的攻击因子， 使胃黏膜的防御能力减弱。同时， 乙醇在损 伤胃黏膜过程中， 自由基生成增加、 堆积， 破坏了胃黏膜的完整性， 出现胃黏膜肿胀， 黏膜小 动脉及毛细血管扩张， 通透性增加， 发生组织充血、 水肿、 出血、 糜烂和溃疡， 导致组织损伤。
以上试验结果， 中、 高剂量组相对于对照组， 大鼠胃粘膜损伤面积明显降低， 差异 有统计学意义 (q 检验 P ＜ 0105)， 该结果表明， 本发明组合物具有良好的胃黏膜保护功能。
三、 本发明食用组合物对幽门螺旋菌的影响
幽门螺杆菌 (H.pylori.) 是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因， 与胃癌 的发生也密切相关。根除 H.pylori. 感染有助于消化性溃疡和胃黏膜炎症的愈合， 所有 H.pylori. 感染相关的消化性溃疡患者均有根除 H.pylori. 的指征。目前常用的根除 H.pylori. 感染的方法主要是含两种抗生素的三联和四联疗法。药物治疗虽然可取得较 好的疗效， 但药物副作用和耐药菌株的出现等问题也可能影响疗效。本研究证明采用本 发明食用组合物， 即可有效清除感染 H.pylori. 模型小鼠体内的 H.pylori.( 清除率高达 80％ )， 又无副作用、 不会产生耐药性。
1、 试验材料
本发明食用组合物， 北京同仁堂国药公司科研所研制提供。
C57BL/6 小鼠， 北京大学医学院实验动物部提供， 合格证号 ： SCXK 京 2010-0006， SPF 级 ( 无特殊病原菌级 )， 雌性， 6-8 周龄， 体重 18 ～ 20g， 共 80 只， 试验时按体重随机分组。
悉尼株 1(Sydney strain 1， SS1)H.， pylori， 购自澳大利亚新南威尔士大学微生物学院。 2、 试验方法
2.1 菌株和培养
悉尼株 1(Sydney strain 1， SS1)H.， pylori 经液体培养扩增后， 5000r/min、 10min 离心收集细菌。
将菌体悬于改良布氏肉汤中， 用分光光度计测定细菌浓度， 当光密度 (OD)660nm ＝ 1 8 时， 细菌浓度为 1×10 菌落形成单位 (CFU/ml)， 将细菌浓度调整至 1×109CFU/ml， 每次取 0.1ml 经口灌胃接种于小鼠。
2.2 实验步骤
以 1×109CFU/ml H.pylori 经口灌胃， 感染 80 只 C57BL/6 小鼠， 隔日 1 次， 共 3 次， 最后 1 次灌胃后 2 周， 将小鼠随机分为 4 组， 每组 20 只。
A组： 灌胃予本发明食用组合物水混悬液 (1g/ml， 0.5ml/ 只， 1 次 / 天 )30 天 ；
B组： 三联疗法 ( 阿莫西林 50mg/kg、 构椽酸秘 6.15mg/kg 和甲硝锉 22.5mg/kg， 1 次 / 天 )， 共 14 天 ；
C组： 按照 A 组方法和 B 组方法同时进行 ；
对照组 ： H.pylori 感染后不予任何治疗。
各组分别于试验结束后的 24h 和 4 周时分别处死 10 只小鼠， 用快速尿素酶试验、 细菌培养和组织病理学方法检测 H.pylori 感染情况。
2.3H.pylori 感染的检测
将试验小鼠的胃沿大弯纵向切成同样大小的 2 份， 1 份直接进行快速尿素酶试验 ； 另 1 份放入无菌生理盐水中， 用于细菌培养 ； 。
2.3.1 快速尿素酶试验
将胃黏膜标本放入快速尿素酶检测试剂中， 37℃放置 24h， 离心， 收集上清液， 测定 OD550nm。
2.3.2 细菌培养
将 1 份胃黏膜标本的黏膜面朝下， 均匀涂布于血琼脂平板上， 37℃微需氧环境中 培养 5-7 天， 经涂片革兰染色、 尿素酶、 触酶、 氧化酶试验确定是否有 H.pylori。
2.3.3 判断标准
符合下列 3 项者为 H.pylori 阴性 ：
①快速尿素酶试验 OD550nm ＜未感染 H.pylori 小鼠 OD550nm 的 X±2s ；
②细菌培养阴性 ；
③组织病理学检查未见细菌。
3、 数据处理
分别采用双尾 Fisher’ s， 精确概率检验、 t 检验和方差分析进行统计学处理， P ＜ 0.05 为差异有显著性。
4、 结果
4.1 清除率
试验结束后 24h， A、 B、 C 组的 H.pylori 清除率分别为 80％、 100％和 90％， 均显著 高于对照组， 而细菌定植数量均显著低于对照组， C 组并不能提高 H.pylori 的清除率。结 果见表 5。
表 5 试验结束后 24h 小鼠感染 H.pylori 情况
a b c 与对照组比较， P ＝ 0.000714 ； P ＝ 0.0000108 ； P ＝ 0.000119( 双尾 Fisher’ s * ** 精确概率检验 )，P ＝ 0.0005(t 检验 )， P ＝ 0.0001( 方差分析 )。
4.2 根除率
试验结束后 4 周， A 组的 H.pylori 根除率为 20％， 与对照组比较无显著差异， 但细 菌定植数量显著下降 ； B 组和 C 组的 H.pylori 根除率为 80％， 均显著高于对照组， 而细菌定 植数量均显著低于对照组。见表 6。
表 6 试验结束后 4 周小鼠 H.pylori 感染情况
a b c 与对照组比较， P ＝ 0.474 ； P ＝ 0.000714 ； P ＝ 0.000714( 双尾 Fisher’ s 精确 * ** 概率检验 )，P ＝ 0.0024(t 检验 )， P ＝ 0.0001( 方差分析 )。
5、 结论
本试验中， 对感染 H.pylori 的小鼠经口灌胃予本发明食用组合物 30 天， 清除率高 达 80％， 效果显著高于对照组， 接近三联疗法 ； 而根除率仅 20％， 效果略高于对照组， 明显 低于三联疗法。该结果说明本发明食用组合物是通过与 H.pylori 相互作用， 产生黏附作 用， 从而有效抑制 H.pylori 对粘膜侵袭， 达到保护胃黏膜的能力。
四、 本发明食用组合物在抑制泌尿系感染方面的作用
P 菌毛阳性大肠埃希菌与上行性泌尿道感染密切相关， 故称为致肾盂肾炎大肠埃 希菌。 目前， 大肠埃希菌耐药菌株比较多见， 给相关的泌尿道感染防治带来了较大的困难和 挑战。
研究表明， 人 P 血型红细胞膜表面也具有类似的 α-gal-β-gal 受体， 因此 P 菌毛 阳性大肠埃希菌可与人 P 血型红细胞结合， 引起血球凝集现象。
蔓越莓提取物中原花青素 (PCA) 可以与 P 菌毛阳性大肠埃希菌的 P 菌毛结合， 阻 止后者与泌尿道上皮细胞膜上的 α-gal-β-gal 受体结合， 从而抑制了细菌的黏附定居， 影响细菌的致病性。
本实验以 P 菌毛阳性大肠埃希菌与人 P 血型血红细胞结合引起血凝现象为基础， 分别检测水溶液和二甲基亚砜 (DMSO) 溶液中 3 个供试物导致的血凝抑制现象， 以判断本发 明组合物在体外抑制 P 菌毛阳性大肠埃希菌对泌尿道上皮细胞的黏附定居作用。
考虑到蔓越莓等天然原料成分复杂， 某些有机物可能在水中不易溶解但仍然可被 身体吸收， 故本研究将供试物溶解在 DMSO 中， 以便检测其中不溶于水的部分， 观察其是否 具有抑制 P 菌毛阳性大肠杆菌黏附红细胞的作用。
1、 试验材料
供试物 1 ： 蔓越莓果粉 ；
供试物 2 ： 本发明食用组合物 ( 蔓越莓果粉 78.2 ％、 蓝莓粉 15.6 ％、 黑醋栗粉 6.2％ ( 重量比 )， 混合而成 ) ； 供试物 3 ： 蓝醋混合粉 ( 蓝莓粉、 黑醋栗粉 1 ∶ 1 混合而成， 重量比 ) ；
供试物 1-3 均由北京同仁堂国药公司科研所研制提供。
大肠埃希菌 ( 甘露糖抗性血凝试验阴性对照株 )， 编号 44102.3a1， 购自中国药品 生物制品检定所 ；
人 P 型血单克隆抗体， 购自欧盟公司 pelikloon anti-P1(1gM)monoclonal ；
两者均在 LB 细菌培养基或 CFA 培养基中培养增菌。
将上述供试物分别溶于无菌的去离子水和 DMSO 溶液中， 配置成浓度为 150g/L 的 供试物水制剂和 136.36g/L 的供试物 DMSO 制剂 (30g 供试物干粉， 10％ DMSO)， 共计 6 组样 品。
2、 试验方法
2.1 红细胞采集
采集正常人的血液标本， 用抗人 P 型血单克隆抗体筛选出 P1 血型阳性的红细胞， EDTA 抗凝后 4℃保存备用。
2.2 供试物对红细胞的影响
为排除供试物本身影响红细胞的稳定性， 本试验对水溶液组的 3 个不同供试物分 别进行过滤， 并调节酸碱度至实验所需的范围。 DMSO 组的 3 个不同供试物直接调节 pH 值后 供实验使用。分别将 6 组样品倍比稀释， 水制剂为 150、 75、 37.5、 18.75、 9.38、 4.69、 2.34、 1.17、 0.59、 0.29、 0.15g/L 共 11 个稀释度 ； DMSO 制剂为 136.36、 68.18、 34.09、 17.05、 8.52、 4.26、 2.13、 1.07、 0.53、 0.27、 0.13g/L 共 11 个稀释度。在 96 孔板上， 每个稀释度的供试物 取 60μl， 加入 2％红细胞悬液 20μl(0.05mol/L PBS， pH7.4)， 用 PBS 补足 100μl 反应体 系。同时， 设立 2 个溶剂对照组， 一组为 PBS 配制的红细胞悬液， 另一组为 10％ DMSO 配制 的红细胞悬液， 排除不同溶剂对红细胞稳定性的影响。每个浓度重复 4 孔， 每组实验重复 3 次， 混匀后显微镜高倍镜下观察。判断不同稀释度的供试物对红细胞稳定性的影响。
2.3P 菌毛阳性大肠埃希菌对甘露糖抗性的血凝试验
本试验用倍比稀释法分别筛选出红细胞悬液 (1％甘露糖 -0.05mol/L PBSpH7.4) 和 P 菌毛阳性大肠埃希菌悬液的最佳反应浓度， 并设甘露糖抗性血凝试验阴性的大肠埃希 菌对照组。每一稀释度重复 4 孔， 每组实验重复 3 次， 以出现 2+ 以上血凝现象者为血凝实 验阳性。
2.4 供试物的血凝抑制实验
在 96 孔血凝板中将供试物的水制剂或 DMSO 制剂倍比稀释 11 个稀释度， 每孔 60μL。按 2.3 中所述方法分别再加入 2 ％的红细胞 20μl(1 ％甘露糖 -0.05mol/LPBS pH7.4) 和 2×109/mL 的细菌悬液 20μl， 室温震荡混匀 20 ～ 30min， 倒置显微镜镜下观察， 拍照记录结果。同时设凝集对照组， 即 PBS 配制的红细胞与 P 菌毛阳性大肠埃希菌凝集组， 和 10％ DMSO 配制的红细胞与 P 菌毛阳性大肠埃希菌凝集组， 用于受试物血凝抑制实验结果 的判别。以能抑制红细胞与大肠埃希菌血凝现象的最高稀释度， 作为判断受试物血凝抑制 作用的最低有效浓度。每一稀释度重复 4 孔， 每组实验重复 3 次。
2.5 镜下观察受试物的血凝抑制作用
从本发明组合物水制剂中选两个稀释度， 一个为能有效抑制 P 菌毛阳性大肠埃希 菌血凝作用的浓度 (11.25g/L)， 另一为不能抑制细菌血凝作用的浓度 (1.41g/L)， 并设血 凝反应阳性和阴性对照， 按 2.4 中所述实验方法操作。每组取反应体系溶液 12μl， 加入干 净的载玻片上， 在湿片的情况下加入 30μl 的固定液， 风干、 过火固定后， 用 5％石炭酸复红 染液染色 3 ～ 5min， 冲洗干燥后， 显微镜油镜下观察染色标本中 2 种受试物对 P 菌毛阳性大 肠埃希菌血凝的影响， 拍照记录结果。
3、 试验结果
3.1 受试物剂对红细胞形态和凝集现象的影响
溶剂对照组的红细胞在 PBS 和 10％ DMSO 中， 均不发生凝集。6 组供试物不引起人 P 血型红细胞聚集的最高浓度， 详见表 7， 而 6 组供试物在高于表 7 中所列浓度时， 各组均可 引起红细胞相互聚集， 同时对红细胞的完整性有不同程度影响。其结果与 P 阳性大肠埃希 菌和人 P 血型红细胞发生的血凝现象相似， 干扰结果观察， 故实验时应避免高浓度受试物 对血凝现象的干扰作用。
表 7 不引起红细胞聚集现象的受试物的最高浓度
水制剂 蔓越莓果粉组 本发明食用组合物 蓝醋混合粉组
最高浓度 (g/L) 45.00 22.50 11.25 DMSO 制剂 蔓越莓果粉组 本发明食用组合物 蓝醋混合粉组 最高浓度 (g/L) 40.91 40.91 20.45上述各孔水制剂终浓度的计算方法 ： 150g/L× 稀释度 × 受试物在总反应体系中占的比例 (60/100) ； DMSO 制剂终浓度的计算方法 ： 136.36g/L× 稀释度 × 受试物在总反应体系中占的比例 (60/100)。3.2 血凝试验
P 菌毛阳性大肠埃希菌与人 P 血型红细胞在体外能发生血凝反应， 其中细菌最佳 9 反应浓度为 2×10 /mL， 红细胞悬液的最佳反应浓度为 2％， 总反应体系为 100μl。而阴性 对照菌株在甘露糖抗性血凝试验中为阴性。
3.3 供试物的血凝抑制作用
镜下观察、 综合判断不同的受试物抑制 P 菌毛阳性大肠埃希菌引起红细胞血凝作 用的最低有效浓度， 见表 8。血凝对照组显示， 红细胞与 P 菌毛阳性大肠埃希菌无论在 PBS 中， 还是在 10％ DMSO 中均能发生凝集。
表 8 受试物抑制血凝作用的最低有效浓度 (g/L)
水制剂和 DMSO 制剂受试物的终浓度计算方法 ： 原浓度 × 稀释度 × 蔓越莓制剂在 总反应体系中所占的比例 (60/100) ； “-” 为检测不到受试物抑制细菌引起的血凝反应。
3.4 镜下观察受试物的血凝抑制作用
人 P 血型红细胞膜周围黏附集聚了大量染成红色的杆菌， 即大肠埃希菌。血细胞 借助 P 菌毛阳性大肠埃希菌相互凝集重叠形成大片的红细胞凝集块， 而在凝集块之间背景 中被染成红色的大肠埃希菌数量较少， 表明此浓度的受试物不能抑制 P 菌毛阳性大肠埃希 菌引起的血凝作用。 而在镜下， 红细胞和大肠埃希菌彼此独立的分散在视野中， 未出现红细 胞黏附凝集的现象。 此外， 背景中可见大量散在红色杆菌， 表明此浓度受试物抑制了血凝作 用。
4、 结论
本研究检测的标本中， 蓝醋混合粉组水制剂与 DMSO 制剂在体外实验中均未见血 凝抑制作用， 本发明食用组合物组与蔓越莓果粉组均有不同程度抑制致肾盂肾炎大肠埃希 菌对红细胞黏附的作用。本发明食用组合物水制剂具有良好的抑制 P 菌毛阳性大肠埃希菌
引起的细胞黏附作用， 说明本发明食用组合物对维持泌尿道上皮细胞的健康状态具有重要 作用。
除了上述试验， 发明人还参照 《免疫毒理学实验技术》 进行了免疫调节试验， 结果 表明， 本发明食用组合物能明显提高巨噬细胞的吞噬能力， 具有体液免疫功能， 能增强机体 免疫机能， 由于篇幅所限， 该试验的方法及相关数据在此不再赘述。
上述试验所使用的本发明食用组合物， 均为实施例 1 配方中原料部分的混合粉 末。 为了验证本发明食用组合物的功能性效果， 发明人进行了大量重复性的实验， 与上述实 验不同的是， 一些是供试品组合物中原料的制备方法不同 ( 包括实施例 2-6 工 2 艺中所述 的方法 ) ； 另一些是供试品组合物的三个组分的比例不同 ( 包括实施例 2-7 的配方中原料 部分所述的比例 )， 试验所用组合物的组分配比大致在蔓越莓 251 份、 黑醋栗 30 ～ 70 份、 蓝 莓 10 ～ 30 份 ( 以上份为重量份 ) 之间 ； 此外， 还将按照实施例 1 处方、 工艺制备的咀嚼片 也进行了上述试验， 结果表明， 是否添加常规辅料对本发明食用组合物各方面的作用没有 任何影响。
试验结果证明以下几点 ：
1、 本发明的食用组合物不仅有抗氧化、 清除自由基的作用， 还可以防止细菌粘附 人体组织器官腔壁、 提高机体免疫力 ； 2、 是否添加常规辅料， 对本发明食用组合物各方面的作用没有任何影响 ；
3、 本发明的食用组合物的重量份配比在蔓越莓 251 份、 黑醋栗 30 ～ 70 份、 蓝莓 10 ～ 30 份之间时， 组合物均具有一定的抗氧化、 清除自由基、 保护胃黏膜的作用效果， 该食 用组合物优选组分重量份配比为蔓越莓 251 份、 黑醋栗 40 ～ 60 份、 蓝莓 15 ～ 25 份， 更优 选为蔓越莓 251 份、 黑醋栗 45 ～ 55 份、 蓝莓 18 ～ 22 份。
由于篇幅所限， 上述试验尤其是筛选最优化配比的试验方法、 步骤以及相关数据 在此不再赘述。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例 1 ： 配方 (1000 片 ) ：
原料 ： 蔓越莓 251g， 黑醋栗 50g， 蓝莓 20g ；
辅料 ： 木糖醇 251g、 甘露醇 153g、 微晶纤维素 150g、 乳糖 120g、 硬脂酸镁 5g。
工艺 ：
1) 将采购的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓粉末， 分别粉碎至 100 目 ；
2) 将木糖醇、 甘露醇、 乳糖粉碎至 60 目 ；
3) 称取配方量的各原、 辅料， 混合均匀， 选用桃心形状的模具压片， 得到咀嚼片形 式的本发明食用组合物。
食用方法 ： 每次食用 1 片， 每天食用 2 ～ 3 次。
实施例 2 ： 配方 (1000 片 ) ：
原料 ： 蔓越莓 260g， 黑醋栗 55g， 蓝莓 18g ；
辅料 ： 木糖醇 251g、 甘露醇 251g、 微晶纤维素 172g、 硬脂酸镁 5g。
工艺 ：1) 将新鲜的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓果实冻干后粉碎至 100 目 ； 2) 将木糖醇、 甘露醇粉碎至 80 目 ； 3) 称取配方量的各原、 辅料， 混合均匀， 直接压片， 得到咀嚼片形式的本发明食用组合物。 食用方法 ： 每次食用 1 片， 每天食用 2 ～ 3 次
实施例 3 ： 配方 (1000 袋 ) ：
原料 ： 蔓越莓 251g， 黑醋栗 45g， 蓝莓 22g ；
辅料 ： 甘露醇 420g、 乳糖 254g、 微粉硅胶 5g、 聚维酮 k30 3g。
工艺 ：
1) 将新鲜的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓果实榨汁， 果汁减玉干燥后粉碎至 120 目 ；
2) 称取配方量的聚维酮 k30， 溶于浓度为 90％ (v/v) 的乙醇溶液中， 制成浓度为 5％ (v/v) 的聚维酮 k30 乙醇溶液 ；
3) 称取配方量的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓、 甘露醇、 乳糖， 混合均匀 ；
4) 将步骤 2) 得到的聚维酮 k30 乙醇溶液加入步骤 3) 的混合物中制软材、 制颗粒， 干燥颗粒 ；
5) 向步骤 4) 得到的颗粒中加入配方量的微粉硅胶， 混合， 分装， 得到颗粒形式的 本发明食用组合物。
食用方法 ： 每次食用 1 袋， 每天食用 2 ～ 3 次。
实施例 4 ： 配方 (1000 粒 ) ：
原料 ： 蔓越莓 150g， 黑醋栗 36g， 蓝莓 10g ；
辅料 ： 微晶纤维素 250、 预胶化淀粉 45g、 硬脂酸镁 6g、 聚维酮 k30 3g。
工艺 ：
1) 将干燥的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓果实粉碎至 80 目 ；
2) 称取配方量的聚维酮 k30， 溶于浓度为 85％ (v/v) 的乙醇溶液中， 制成浓度为 8％ (v/v) 的聚维酮 k30 乙醇溶液 ；
3) 称取配方量的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓、 微晶纤维素、 预胶化淀粉， 混匀 ；
4) 将步骤 2) 得到的聚维酮 k30 乙醇溶液加入步骤 3) 的混合物中制软材、 制颗粒， 颗粒干燥 ；
5) 向步骤 4) 得到的颗粒中加入配方量的微粉硅胶， 混合， 装胶囊， 得到胶囊形式 的本发明食用组合物。
食用方法 ： 每次食用 2 粒， 每天食用 2 次。
实施例 5 ： 配方 (1000 瓶 ) ：
原料 ： 蔓越莓 280g， 黑醋栗 45g， 蓝莓 28g ；
辅料 ： 蜂蜜 100g、 甜菊甙 10g、 山梨酸 20g。
工艺 ：
1) 称取处方量的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓干燥果实， 打碎， 加水煎煮两次， 第一次加 8 倍量水浸泡 30 分钟后煎煮 1 小时， 第二次加 6 倍量水煎煮 30 分钟， 两次煎液合并， 浓缩至 相对密度为 1.1 左右 (50℃ ) ；
2) 称取配方量的蜂蜜、 甜菊甙和山梨酸， 加入步骤 1) 得到的浓缩液中， 搅拌溶解，
混匀 ； 3) 向将步骤 2) 得到的溶液中加纯净水至 10L， 混匀， 分装， 得到口服液形式的本发 明食用组合物。
食用方法 ： 每次食用 1 瓶， 每天食用 2 ～ 3 次。
实施例 6 ： 配方 (1000 片 ) ：
原料 ： 蔓越莓 220g， 黑醋栗 62g， 蓝莓 26g ；
辅料 ： 木糖醇 300g、 甘露醇 200g、 乳糖 185、 硬脂酸镁 7g。
工艺 ：
1) 将采购的蔓越莓、 黑醋栗及蓝莓的粉末， 分别粉碎至 100 目 ；
2) 将木糖醇、 甘露醇、 乳糖粉碎至 60 目 ；
3) 称取配方量的各原、 辅料， 混合均匀， 压片， 得到咀嚼片形式的本发明食用组合 物。
食用方法 ： 每次食用 1 片， 每天食用 2 ～ 3 次。
实施例 7 ： 配方 (1000 片 ) ：
原料 ： 蔓越莓 250g， 黑醋栗 30g， 蓝莓 30g ；
辅料 ： 乳糖 250g、 微晶纤维素 250g、 木糖醇 100g、 羧甲基淀粉钠 40g、 海藻酸钠 47g、 硬脂酸镁 3g。
工艺 ：
1) 将蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓干燥果实， 粉碎至 60 目 ；
2) 将乳糖、 微晶纤维素、 木糖醇粉碎至 60 目 ；
3) 按配方量称取除硬脂酸镁以外的各原、 辅料混合均匀， 加适量 85％ (v/v) 的乙 醇溶液， 制软材、 制颗粒， 颗粒干燥 ；
4) 向步骤 3) 得到的颗粒中加入配方量的硬脂酸镁， 混合， 压片， 得到片形式的本 发明食用组合物。
食用方法 ： 每次食用 1 片， 每天食用 2 ～ 3 次。
实施例 8 ： 配方 (1000 个单位 ) ：
原料 ： 蔓越莓 251 份， 黑醋栗 50 份， 蓝莓 20 份 ；
辅料 ： 木糖醇 251 份、 甘露醇 153 份、 微晶纤维素 150 份、 乳糖 120 份、 硬脂酸镁 5 份。
上述份为重量份， 单位可以是 mg、 g、 kg 等。
工艺 ：
1) 将采购的蔓越莓、 黑醋栗、 蓝莓粉末， 分别粉碎至 100 目 ；
2) 将木糖醇、 甘露醇、 乳糖粉碎至 60 目 ；
3) 称取配方量的各原、 辅料， 混合均匀， 直接压片， 得到咀嚼片形式的本发明食用 组合物。
本发明不局限于上述实施方式， 任何人在本发明的启示下得出的其他任何与本发 明相同或相近似的产品， 均落在本发明的保护范围之内。
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