用于显像脂肪酸代谢和存储的 PET 放射性示踪剂 优先权声明
本申请要求 2009 年 5 月 4 日提交的美国临时申请 No.61/175,065 的权益和优先 权， 该申请的全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本工作至少部分由 NIH 拨款 HL69100 的支持。 在本发明中政府可能具有某些权利。
背景技术 本发明涉及可用于显像脂肪酸和脂肪酸甘油三酯分布和代谢的示踪剂领域。
脂肪酸， 包括脂肪酸 (FA) 与甘油三酯类的复合物， (FA-TG) 在各种组织， 例如心肌 组织中的分布具有非常重要的临床作用。
已经提出了多种探针和方法用于脂肪酸在受试者， 例如人体中的显像分布。 31 13
P 和 C 核磁共振光谱 (MRS) 已经被用于显像活体体外制备中的心肌基质代谢 1， 5-7。 然而， 由于核磁共振方法固有的低信噪比、 有限的空间分辨率、 异常信号污染和长的采
集时间， 活体心肌代谢的评价仅限于前心肌组织。
在使用单正电子发射计算机断层成像术 (SPECT)8-11 中， 放射性标记的 15-(P- 碘苯 基 )- 十五酸 (IPPA) 已经被用作放射性示踪剂用于显像 FA 代谢。然而， SPECT 系统不具有 使 IPPA 快速转换优势的时间分辨率以得到高质量的显像和 FA 代谢的量化。 2-14
已经提出了 IPPA 的支链类似物， 例如 BMIPP， 用于 FA 代谢的示踪剂 10， 。然而， 由于 SPECT 具有相对低的时间和空间分辨率和对于正电子衰减不正确的修正， 和相对于使 用的 FA 未标记的 BMIPP 的不完全代谢， 心肌基质难于或不能量化使用。 11
C- 棕榈酸酯已经用作用于心脏中 FA 代谢的 PET 显像的放射性示踪剂 2。然而， 显像质量一般较低。另外， 经常需要反射性标记的代谢物修正。最后， 碳 -11 放射性同位素 的短半衰期 ( ～ 20min) 使其必须快速接近来源， 如回旋加速器和放射性药物产生装置。 18
14-(R， S)- F- 氟 -6- 硫代十七酸 (FTHA) 已经用作用于 FA 代谢的 PET 显像的放 15， 16 18 射性示踪剂 。然而， F-FTHA 的吸收和保留对于缺氧导致的 β- 氧化抑制不敏感 17。 18
F- 氟 - 硫 - 棕榈酸酯 (FTP) 是代谢俘获作用的 PET 显像探针 17。FTP 的沉积与 正常充氧和缺氧条件下的 β- 氧化成比例。然而， FTP 不区分心肌 FA 的吸收和氧化 18。而 且， 这些过程的量化需要修正 FTP 和未标记的 FA18 在动力学上的内在不同。
已经描述了反 -9(RS)-[F-18]- 氟 -3， 4(RS， RS) 亚甲基十七酸 (18F-FCPHA) 具有包 括在 C3-C4 具有环丙基和在 C9 具有烷基氟的结构 19。然而， 血浆基质、 工作负荷和血液流 量的改变对心肌动力学的影响还是未知的。
因此， 存在可以提供精确和全面的测量心肌 FA 代谢的放射性示踪剂的需要。
发明概述
在本发明教导的各方面， 本发明人提出了具有下列结构的脂肪酸类似物 (FAA) 化 合物和其盐， 例如
在各种结构中， n 可以为从 10 到 24 的整数，m 可以为从 1 到 10 的整数， 并且 X 可以为卤素。在有些结构中， 本发明的脂肪酸类似物或其 盐可以具有结构
本发明的脂肪酸类似物或其盐可以包括至少一种放射性同位素。在有些结构中， 放射性同位素可以为正电子 - 发射放射性同位素。在有些结构中， n 可以为 14 ； 独立地， m 18 可以为 2， 并且独立地， X 可以为氟原子例如 F 放射性同位素。在有些结构中， n ＝ 14， m＝ 18 2 并且 X 为 F。
在各个方面， 本发明的化合物或其盐可以用作用于在受试者， 例如哺乳动物中， 包 括人类的脂肪酸分布的探针。受试者哺乳动物例如人类的接下来的管理， 本发明放射性示 踪剂的分布可以由本领域技术人员公知的方法确定， 例如正电子发射断层成像术 (PET) 扫 描或单电子发射计算机断层成像术。在有些结构中， 本发明的脂肪酸类似物或其盐可以提 11 供高度模拟 C- 棕榈酸酯的心肌动力学。在各个方面， 本发明还包括脂肪酸类似物 - 甘油三酯 (FAA-TG) 和其盐。在有些结 构中， FAA-TG 可以为脂肪酸类似物 - 极低密度脂蛋白甘油三酯 (FAA-VLDL)。在有些结构 中， FAA-TG 或 FAA-VLDL 可以包括放射性同位素例如 18F。因此， 本发明包括有些各种结构 18 18 的 F- 脂肪酸类似物 - 极低密度脂蛋白甘油三酯例如 F-FAA-TG’ s 和 18F-FAA-VLDL’ s。在 18 18 有些实施方案中， 本发明的 F-FAA-TG 或 F-FAA-VLDL 或其盐可
以具有结构其中 R 可以为
其中 n 为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。在本发明教导的各个方面， 本发明人公开了合成脂肪酸类似物的方法， 和用于合 成脂肪酸类似的各种中间体。
在一些方面， 发明人公开了合成 Br-(CH2)n-COOCH32 的方法。这些方法可以包括使 Br-(CH2)n-COOH1 与三甲硅基重氮甲烷、 THF、 己烷接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。在有 些结构中， n 可以为 14。
在一些方面， 发明人公开了合成
的方法。 这些方法可以包括使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4， 、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触， 其中 n 可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在一些方面， 发明人公开了合成
的 方 法。 这 些 方 法 可 以 包 括 使与 Pd/c、 EtOAc、 H2 接触， 其中 n可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在一些方面， 发明人公开了合成
的方法。这些方法
可以包括使
与 乙 烷 -1-2- 二 基 双 (4- 甲 苯 磺 酸酯 )、 K2CO3、 CH3CN 接触， 其中 n 可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在一些方面， 发明人公开了合成的 方 法。 这 些 方 法 可 以包括使与 [18F]KF/K2.2.2/然后与 NaOH 接触， 其中 n 可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n K2CO3/CH3CN 接触、 可以为 14。K2.2.2 为 4， 7， 13， 16， 21， 24- 六氧杂 -1， 10- 二氮杂双环 [8.8.8]- 二十六烷 (Kryptofix222 ， AcrosOrganicsN.V.， 新泽西州费尔劳恩 )。 在有些结构中， 这些方法可以进一步包括使 a)Br-(CH2)n-COOH1 与三甲硅基重氮 甲烷和 THF 接触以产生 Br-(CH2)n-COOCH32 ； b) 使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼 酸、 Pd(OAc)2、 [Hp(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以得到
c) 使与 Pd/c 和 EtOAc 接触
以得到并且 d) 使和乙烷 -1-2- 二基双 (4- 甲苯磺酸酯 )、 K2CO3 和 CH3CN 接触得到
在一些方面， 发明人公开了合成
的方法。在各种结构中， 这些方法可以包括使
与 1- 溴 -2- 氟乙烷、 K2CO3、 丙酮接触 ； 然后与 NaOH、 MeOH、 CHCl2、 水接触， 其中 n 可以为从 10到 24 的整数， 并且 m 为从 1 到 10 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在有些结构中， 这些方法可能进一步包括 a) 使 Br-(CH2)n-COOH1 与三甲硅基重氮 甲烷和 THF 接触以产生 Br-(CH2)n-COOCH32 ； b) 使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼 酸、 Pd(OAc)2、 [Hp(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以得到
c) 使与 Pd/c 和 EtOAc 接触以得到
在有些结构中， 本发明包括合成
的方法。 在各种结构中， 这些方法可以包括使 Br-(CH2)14-COOH1 与三甲硅基重氮甲烷和 THF 接触以得到 Br-(CH2)n-COOCH32 ； 使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以得到
并且使与 Pd/c、 EtOAc、 H2 接触以得到其中 n 可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在一些方面， 本发明人公开了合成
的方法。在各种结构中， 这些方法可以包括
与 使 [18F]KF/K2.2.2/然后与 NaOH 接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 K2CO3/CH3CN 接触， 14。另外， 在有些结构中， 这些方法可以进一步包括使 Br-(CH2)14-COOH1 与三甲硅基重氮甲 烷和 THF 接触以得到 Br-(CH2)n-COOCH32 ； 使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以得到
使与 Pd/c、 EtOAc、 H2 接触以得到并且使与 1- 溴 -2- 氟乙烷、 K2CO3、 丙酮接触 ； 然后与 NaOH、 MeOH、 CHCl2、 水接触以得到
在各个方面， 本发明包括合成
的方法。在各种结构中， 这些方法可以包括使 Br-(CH2)n-COOH1 与 并且使 n 为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在各个方面， 本发明包括 与接触以得到 接触， 其中
合成的方法。在各种结构中， 这些方法可以包括使 Br-(CH2)n-COOH1 与 NaN3 接触以形成 N3(CH2)nCOOCH3 8 ； 并且可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在各个方面， 本发明包括1， 2-Pal-[18F]5 合成的方法。在各种结构中， 这些方法可以包括使与 TMS-Cl 和 CH2Cl2 接触以形成
使与 NaOH 和乙醇接触以形成
使与DCC/CH2Cl2 接触以形成并且
使与 TBAF 接触， 然后与 Tf2O/CH2Cl2 接触， 然后标记， 其中 n 可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在各个方面， 本发明包括
合成的方法。在各种结构中， 这些方法可以包括使与接触， 其中 n 为从 10到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在各个方面， 本发明包括
合成的方法， 在各种结构中， 这些方法可以包括使与接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。
在本发明的有些方面， “点击 (click)” 类似物可以如图 1 概括的方法制备。 在有些 结构中， IPPA 的 4- 碘苯环可以由相应的由 “点击 “或 “反点击” 标记方法产生的 1， 2， 3- 三 唑部分取代。本文中公开了该用于标记的目标化合物和前体的合成。
在本发明的有些方面， 发明人公开了确定哺乳动物中脂肪酸分布的方法， 例如实 验室动物、 伴生动物、 牲畜或人。在各种结构中， 这些方法可以包括 ： 将哺乳动物用选自
的脂肪酸类似物或其盐进行放射性标记 ； 并且使哺乳动物进行本领域技术人员公知的正电子发射断层成像术 (PET) 或其它正电子检 测方法， 例如 SPECT 的检测。在有些结构中， m 可以为 2。在有些结构中， n 可以为 14。在各 种结构中， 扫描得到的显像数据可以记录在数字计算机中并用本领域技术人员公知的方法 分析。例如使用众所周知的算法分析。在有些结构中， 可以通过数字计算机的帮助完成算 法分析。在有些实施方案中， 这些方法可以进一步包括以在计算机显示器上显示在受试者 哺乳动物中的脂肪酸分布图像。
在一些方面， 本发明包括在哺乳动物中脂肪酸甘油三酯的显像分布方法。在 各 种 结 构 中， 这些方法可以包括将哺乳动物用脂肪酸甘油三酯类似物或其盐例如
进行放射性标记 ； 并且使哺乳动物经受本领域技术人员公知的正电子发射断层成像术 (PET) 或其它正电子检测方法， 例如 SPECT 的检 测测， 其中 n 可以为从 10 到 24 的整数。在有些结构中， n 可以为 14。在有些结构中， 扫描 得到的显像数据可以存储在数字计算机中。在有些实施方案中， 这些方法可以进一步包括 使用本领域技术人员公知的方法分析显像数据。在有些结构中， 算法可以存储在数字计算 机中。在有些结构中， 这些方法可以进一步包括在计算机显示器上显示在受验哺乳动物中 的脂肪酸分布。
方面
本发明人公开了包括如下方面。
1. 具有如下结构的脂肪酸类似物或其盐
其中 n 为从 10 到 24 的整数， m 为从 1 到 10 的整数， 并且 X 为卤素。 2. 根据方面 1 所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中脂肪酸类似物为
3. 根据方面 1 或 2 所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 X 为氟。4. 根据方面 1-3 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中至少一个原子为放射性 同位素。
5. 根据方面 1-3 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中至少一个原子为正电 子 - 发射放射性同位素。
6. 根据方面 1-3 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐其中 X 为 18F。
7. 根据方面 1-6 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 m ＝ 2。
8. 根据方面 1-7 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 n ＝ 14。
9. 根据方面 1 所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 n ＝ 14、 m ＝ 2 并且 X 为 18F。
10. 选自
的脂肪酸类似物或其盐， 其中 n 为从 10 到 24的整数， m 为从 1 到 10 的整数， 并且 X 为卤素。
11. 根据方面 10 所述的脂肪酸类似物或其盐， 其结构为
12. 根据方面 10 所述的脂肪酸类似物或其盐， 其结构为13. 根据方面 10-12 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 X 为氟原子。
14. 根据方面 10-13 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中至少一个原子为放 射性同位素。
15. 根据方面 10-13 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中至少一个原子为正 电子 - 发射放射性核素。
16. 根据方面 10-15 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 X 为 18F。
17. 根据方面 10-16 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 m ＝ 2。
18. 根据方面 10-17 任一项所述的脂肪酸类似物或其盐， 其中 n ＝ 14。
19. 根据方面 11 所述的具有如下结构的脂肪酸类似物或其盐，
其中 n ＝ 14 并且 m ＝ 2。
20. 根据方面 12 所述的脂肪酸类似物或其盐， 其结构为
其中 n ＝ 14 并且 m ＝ 2。
21.18F- 脂 肪 酸 类 似 物 - 极 低 密 度 脂 蛋 白 甘 油 三 酯 (18F-FAA-VLDL)，具 有 结 构其 中 R 选 自或其盐， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
22. 根据方面 21 所述的 18F-FAA-VLDL 或其盐， 其中 n ＝ 14。
23. 合成 Br-(CH2)n-COOCH32 的方法， 包括 Br-(CH2)n-COOH1 与三甲硅基重氮甲烷、 THF、 己烷接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
24. 根据方面 23 所述的合成 Br-(CH2)n-COOCH32 的方法， 其中 n ＝ 14。
25. 合成
的方法， 包括使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
26. 根据方面 25 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
27. 合成的方法， 包括使
与 Pd/c、 EtOAc、 H2 接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
28. 根据方面 27 所述的方法， 其中 n ＝ 14。29. 合成
的方法， 包括
使与乙烷 -1-2- 二基双 (4- 甲苯磺酸酯 )、 K2CO3、 CH3CN 接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
30. 根据方面 29 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
31. 合成
的方法， 包括
使与 [18F]KF/K2.2.2/K2CO3/CH3CN 接触， 然后与 NaOH 接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
32. 根据方面 31 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
33. 根据方面 31 或 32 所述的方法， 进一步包括 ：
a) 使 Br-(CH2)n-COOH1 与 三 甲 硅 基 重 氮 甲 烷 和 THF 接 触 以 得 到 Br-(CH2)33102421454 A CN 102421466n说明书19/41 页-COOCH32 ；
b) 使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼酸、 Pd(OAc)2、 [Hp(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以得到
c) 使与 Pd/c 和 EtOAc接触以产生
d) 使与乙烷 -1-2- 二基双 (4- 甲苯磺酸酯 )， K2CO3 和 CH3CN 接触以产生
34. 合成
的方法， 包括
使与 1- 溴 -2- 氟乙烷、 K2CO3、 丙酮接触 ； 然后与 NaOH、 MeOH、 CHCl2、 水接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数， 并且 m 为从 1 到 10 的整数。
35. 根据方面 34 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
36. 根据方面 34 或 35 所述的方法， 进一步包括
a) 使 Br-(CH2)n-COOH1 与 三 甲 硅 基 重 氮 甲 烷 和 THF 接 触 以 产 生 Br-(CH2) n-COOCH32 ；
b) 使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄基氧基苯基硼酸、 Pd(OAc)2、 [Hp(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以产生
c) 使与 Pd/c 和 EtOAc 接触以得到
37. 合成的方法， 包括 ：
使 Br-(CH2)14-COOH1 与三甲硅基重氮甲烷和 THF 接触以得到 Br-(CH2)n-COOCH32 ；
使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄 基 氧 基 苯 基 硼 酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以得到
并且
使与 Pd/c、 EtOAc、 H2 接触以得到其中 n 为从 10 到 24 的整数。
38. 如方面 37 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
39. 合成
的方法， 包括 ：
使与 [18F]KF/K2.2.2/K2CO3/CH3CN 接触， 然后与 NaOH 接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
40. 如方面 39 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
41. 如方面 39 或 40 所述的方法， 其进一步包括
使 Br-(CH2)14-COOH1 与三甲硅基重氮甲烷和 THF 接触以得到 Br-(CH2)n-COOCH32 ；使 Br-(CH2)n-COOCH32 与 4- 苄 基 氧 基 苯 基 硼 酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu 和 t- 戊醇接触以得到并且
使与 Pd/c、 EtOAc、 H2 接触以得到
使与 1- 溴 -2- 氟乙烷、 K2CO3、 丙酮接触 ； 然后与 NaOH、 MeOH、 CHCl2、 水接触以得到
42. 合成
的方法， 包括 ：
使 Br-(CH2)n-COOH1 与 使 与接触以形成 接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
43. 根据方面 42 所述的方法， 其中 n ＝ 14。 44. 合成
的方法， 包括 ：
使 Br-(CH2)n-COOH1 与 NaN3 接触以形成 N3(CH2)nCOOCH38 ； 并且 使 N3(CH2)nCOOCH38 与 45. 根据方面 44 所述的方法， 其中 n ＝ 14。 46. 合成 接触， 其中 n 为从 10 到 24的整数。
的方法， 包括 ：
使与 TMS-Cl 和 CH2Cl2 接触以形成
使与 NaOH 和乙醇接触以形成
使与和DCC/CH2Cl2 接触以形成
并且
使与 TBAF 接触， 然后与 Tf2O/CH2Cl2 接触， 然后标记， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
47. 根据方面 46 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
48. 合成
的方法， 包括 ：
使与接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
49. 根据方面 48 所述的方法， 其中 n ＝ 14。 50. 合成
的 方 法， 包括使与接触， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
51. 根据方面 50 所述的方法， 其中 n ＝ 14。 52. 确定哺乳动物中脂肪酸分布的方法， 包括 ： 将选自的放射性标记脂肪酸类似物或其盐施用至哺乳动物 ； 并且使受验哺乳动物进行正电子发射断层成像术 (PET) 的扫描， 其中 n 为从 10 到 24 的整数并且 m 为从 1 到 10 的整数。
53. 根据方面 52 所述的方法， 其中 m ＝ 2。
54. 根据方面 52 或 53 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
55. 根据方面 52-54 任一项所述的方法， 进一步包括通过在数字计算机中的算法 分析显像数据。
56. 根据方面 51-55 任一项所述的方法， 进一步包括在计算机显示器上显示脂肪 酸分布的图像。
57. 显像在哺乳动物中脂肪酸甘油三酯分布的方法， 包括 ：
将选自
的放射性标记的脂肪酸甘油三酯类似物或其盐施用至哺乳动物 ； 使受验哺乳动物进行正电 子发射断层成像术 (PET) 的扫描， 其中 n 为从 10 到 24 的整数。
58. 根据方面 57 所述的方法， 其中 n ＝ 14。
59. 根据方面 57 或 58 所述的方法， 进一步包括 ：
通过在数字计算机中的算法使显像数据进行分析。
60. 根据 57-59 任一项所述的方法， 进一步包括在计算机显示器上显示脂肪酸甘 油三酯的分布。
附图简要说明
图 1 示出基于 p-IPPA 的 18F 标记的脂肪酸类似物的设计策略。
图 2 示出
的 合 成 路 线。 试 剂 ： a： 三 甲 硅 基 重 氮 甲 烷、 THF、 己 烷， 2hr ； b： 4- 苄 基 氧 基 苯 基 硼 酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu、 t- 戊醇、 氩气、 RT、 24hr ； c： Pd/c、 EtOAc、 H2、 6psi、 5hr ； d： 1- 溴 -2- 氟乙烷、 K2CO3、 丙酮 ； e： NaOH、 MeOH、 CHCl2、 水； f： 乙烷 -1， 2- 二基双 (4- 甲苯磺 18 酸酯 )、 K2CO3， 、 CH3CN 回流 3hr ； g： [ F]KF/K2.2.2/K2CO3/CH3CN， 然后 NaOH。
图 3 示出本发明中的有些 18F-FAA 化合物制备中使用的 “传统的” ( 上部 ) 和 “反” ( 底部 ) 点击化学。
图 4 示出由用 11C- 棕榈酸酯 ( 顶部 ) 和化合物 [18F]5( 底部 ) 研究的料饲鼠得到 的心肌 microPET 显像。以横轴显示显像。给出了复合显像、 和各个 RGB 颜色通道的显像。 图 5 示出对于 11C- 棕榈酸酯 ( 顶部 ) 和 18F-FAA( 底部 ) 血液 ( 输入 ) 和心肌时 间 - 活性曲线 (TAC)( 前部和侧向的 )。
图 6 示出有些 18F- 标记的甘油三酯类似物的结构。
图 7 示出用于 18F- 标记的 FA 类似物 12 和 13 的合成图， 每一个均包括苯基残基。
图 8 示出用于 18F- 标记的甘油三酯类似物 14 和 15 的合成图， 每一个均包括苯基 残基。
图 9 示出用于 18F- 标记的甘油三酯类似物 1， 2-Pal-[18F]9 和 1， 2-Pal-[18F]10， 每 一个均包括三唑部分。
发明详述
心肌脂肪酸 (FA) 氧化被认为是心脏最重要的能量来源。然而， 其它基质例如葡萄 糖和乳酸盐， 对总氧化代谢的比例贡献也非常重要， 并且变化很大， 并依赖于各种因素例如 血浆基质环境、 神经介质的内部环境和心脏工作的水平。 因此， 使用的心肌基质的塑性对心 脏健康特别重要。 在一种介质的近排他使用中导致的塑性损失对在各种心脏疾病过程中引 发的心室功能紊乱具有影响。
心肌 FA 代谢被认为依赖于 FA 的血浆传递， 以 FA 结合于白蛋白 (FA-ALB) 或以甘油 三酯 (FA-TG)( 以 chlyomicrons(FA-CM) 或极低密度脂蛋白 (FA-VLDL) 形式 ) 形式， 并且随 后通过位于内皮毛细管的脂蛋白脂肪酶 (LPL) 释放出 FA。而且， 给出了加速脂肪酸氧化或 脂肪过度堆积的潜在不良效应， 本发明人发现了可以追踪源自 FA-TG 的 TA 的 PET 放射性示 踪剂的需要。 在有些实施方案中， 发明人公开了与未标记的棕榈酸酯动力学类似的 18F-FAA， 并且进一步公开了与 1- 位的甘油三酯相结合的 18F-FAA。
本发明人已经提出的显像方法， 在有些实施方案中， 进一步扩展了我们更好的勾 划在心脏疾病中心肌 FA 代谢改变的病因学和分歧的能力。发明人已经提出了可以评价心 肌 FA 代谢多个方面的放射性示踪剂。例如， 发明人已经意识到目前还没有提供非侵入行 的方法用于测量源自 TG 的 FA 的贡献， 因此他们提出了， 在有些实施方案中， 用在 R1 位置
44102421454 A CN 10242146618说明书30/41 页F-FAA(18F-FAA-VLDL) 放射性标记的 VLDL。 他们进一步公开了其在心脏显像中的应用和在 具有或不具有异常的心肌 FA 代谢中鼠模型系统中的动力学特性。他们进一步公开了使用 这些化合物以测量在血液和心肌组织中放射性标记代谢物的产生， 并且确定了其全身生物 分布。
因此发明人公开了包括正电子发射体例如 18F 的脂肪酸类似物或包括正电子发射 体例如 18F 的放射性标记的极低密度脂蛋白甘油三酯 (VLDL) 的放射性标记的示踪剂。
在本发明的一些方面包括用 2- 氟乙氧基取代 IPPA 的碘 - 基团。在有些结构中， 2- 氟乙氧基取代基也可以表示用于在 p-IPPA 中碘基团等比容的基团。用于合成有些用于 IPPA( 图 1) 的 2- 氟乙氧类似物的合成策略如图 2 所示。在本发明的有些结构中， 相应的 18F- 标记的类似物例如可以从相应的甲苯磺酰前体以高的放射化学产率 ( 接近 85％ ) 合成。
本文描述的方法使用本领域技术人员公知的实验室技术， 并且可以在实验室手 册和教科书中找到指南， 例如 Sambrook， J.， et al.， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 2001 ； Spector ， D.L.et al. ， Cells ： A Laboratory Manual ， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1998 ； and Harlow， E.， Using Antibodies ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1999 ； Hedrickson et al.， Organic Chemistry 3rd edition， McGraw Hill， New York， 1970 ； Carruthers， W.and Coldham， I.Modern Methods of Organic Synthesis(4th Edition) ， Cambridge University Press ， Cambridge ， U.K. ， 2004 ； Curati ， W.L. ， Imaging in Oncology， Cambridge University Press， Cambridge， U.K.， 1998 ； Welch， M.J.and Redvanly， C.S.eds.Handbook of Radiopharmaceuticals ： Radiochemistry and Applications， J.Wiley New York， 2003.
在本文描述的试验中， 所有的试剂都从商业提供商购得并且除非另有描述未经进 一步纯化。所有的反应都可以在本领域技术人员公知的标准条件下实施， 例如用干燥溶剂 的惰性氩气环境的标准的无空气和无湿度的技术。
在本发明的各种实施方案中， 合成基于 IPPA 的 18F- 标记的脂肪酸方法可以包括如 图 1 给出的。这种方法可以包括用 2- 氟乙氧基取代 IPPA 的碘 - 基团。在一些方面， 2- 氟 乙氧基取代基也可以表示用于在 p-IPPA 中碘基团等比容的基团。IPPA2- 氟乙氧类似物的 的合成如图 1 所示。并且相应的 18F- 标记的类似物、 [18F]5 可以由相应的甲苯磺酰前体以 18 高的辐射化学产率 (85％ ) 合成。在各个方面， F 可以通过与化合物 [18F] 氟化物 / 碳酸钾 反应和 4， 7， 13， 16， 21， 24- 六氧杂 -1， 10- 二氮杂双环 [8.8.8]- 二十六烷 (Kryptofix222 ，AcrosOrganicsN.V.， 新泽西州费尔劳恩 ) 反应结合在化合物上。反应条件为本领域技术人 员所公知。在有些结构中， 反应条件可以包括使用乙脲 (MeCN) 作为溶剂， 110℃ /5-10min。
在其它实施方案中， 两种 “点击” 类似物可以如图 3 所概括的合成。在这些合成中， IPPA 的 4- 碘苯环可以由相应的产生于 “点击” 和 “反点击” 标记的方法的 1， 2， 3- 三唑部分 18 替代。在各种结构中， 点击可以使用中间体， 例如 [ F]2- 氟 -1- 叠氮乙烷给与 [18F]9。在 其它结构中， “反点击” 方法可以包括改变的点击反应， 其中 18F- 放射性标记可以与乙炔前 体结合， 并且用于 1， 3- 极性环加成反应的叠氮残基可以与脂肪酸基团结合以给与化合物， 18 例如 [ F]10。
合成和组装放射性标记的甘油三酯。特定的实施方案包括放射性标记的可以与 VLDL-TG 结合的 TG。这些实施方案可以包括上述的 18F-FAA 与 1- 位的甘油三酯结合。目标 TG 的结构实施方案如图 6 所示。在有些结构中， 用于目标化合物合成的起始物质可以为商 业提供的 1， 2- 双棕榈甘油。使用如图 7 和图 8 所述的反应顺序可以完成 1， 2- 双棕榈甘油 到 TG 类似物的转变。
本 发 明 包 括 实 施 方 案， 其 中 FAA- 甘 油 三 酯 类 似 物 例 如 1， 2-pal-[18F]5， 1， 18 18 2-pal-[ F]9 和 1， 2-pal-[ F]10 可以以对映异构体混合物合成或评价， 因为在有些结构中 的 2- 位的 TG 可以是手性中心的。因此， 在有些结构中， 消旋混合物可以用本领域技术人员 公知的标准方法， 例如手性 HPLC， 分离为 (+)- 和 (-)- 异构体。 实施例 除非结果用过去式表示， 否则试验的给出并不表示记录或试验已经或未曾实施。 任何实施例都不应认为是对公开范围的限制。
实施例 1 ： 小动物显像。
动物制备。 所有的动物过程都遵守由华盛顿大学动物研究委员会制定的护理和使 用指南实施。动物制备如前所述的方法实施 24-26。鼠放置在代谢笼中并且通过在诱导室中 吸入 2％ -2.5％的异荧烷醚麻醉。通过定制的鼻锥通入 1％ -1.5％的异荧烷醚， 在整个显 像过程维持麻醉。静脉通路经由外咽静脉。使用循环水包层和加热灯维持体温。监控整个 过程的心跳和呼吸速率。
PET 采集。动物们可以确保在定制的丙烯酸抑制装置中并且放置在小动物显像 PET 扫描器的视野范围内。经由右颈静脉导管推注示踪剂 5s 后开始显像采集。显像方案 包括 11C- 棕榈酸酯 (5-7mCI) 和随后的 18F-FAA 或单独的 18F-VLDL(5-7mCi) 的 microPET 显 像动态采集。11C- 棕榈酸酯中的动态图像采集或 18F-FAA 或 18F-FAA-VLDL 可以分别地为 30 和 60min。显像部分的总时间可以为～ 3hrs。通过研究可以收集到 3 个总的血动脉样品， 以研究测量总血液葡萄糖 (5μL)、 自由脂肪酸 (20μL 和胰岛素 (5μL) 水平以便确认动物 的代谢状态。
显像过程 / 分析。使用心脏上的 2.5 倍变焦的过滤反向投影和每显像部分 40 帧 可以重建动态显像。 通过使用如前所述的混合显像 - 血液 - 样品算法可以重建输入函数 25。 放置感兴趣的心肌区域以产生心肌时间 - 活性曲线 (TAC)。为了定义特性 ( 例如高度和形 18 状 ) 和基于指数曲线拟合算法， F-FAA 和 18F-FAA-VLDL 血液和心肌 TAC 可以与 11C- 棕榈酸 酯 TAC 比较。
实施例 2 ： 大动物显像。
动物制备。特地育成的～ 6-10kg 的雄性比格犬空腹、 麻醉并且如前所述的装配仪 3， 4 器 。将导管插入一个股静脉以进行加药。对于动脉样品， 导管通过股动脉放置在胸主动 脉中并且监测动脉血压。为了得到静脉血压样品， 在如前所述的荧光引导下通过右外部颈 28 静脉可以放置冠状窦插管 。ECG， 动脉血压合心跳速率可以全程检测。所有的测量都可以 在 microPET Focus 220 上实施。所有的过程遵守护理合使用研究动物指南实施。
PET 显像方案。可以使用两种显像方案。
方案 1。 最初使用透射扫描以修正正电子衰减。 透射扫描后， 进行 5-7mCi 的 15O- 水 的静脉推注， 和即时激发的动态数据的 5min。15O- 水衰减后， 5-7mCi 的 11C- 棕榈酸酯可以 11 加入静脉然后进行 60min 的数据收集。 C- 棕榈酸酯衰减后， 加入 5-7mCi 的 FA 类似物然后 11 进行 60min 的数据收集。 C- 棕榈酸酯加入的同时， 可以开始定量 (0.1umol/kg/min) 的输 13 入 C- 棕榈酸酯并且持续到标记甘油三酯池过程的结束。然后通过 ACS 血液的配对样品检 11 测 11C- 棕榈酸酯、 CO2、 和 18F- 代谢物。血浆胰岛素和基质可以以预设的间隔检测。因此， 可以在休眠的状态下也可以在空腹的状态下研究狗 ( 中速 FA 吸收和低存储氧化 ； n ＝ 5)， 在高胰岛素 - 正葡萄糖钳夹中 ( 低吸收和较高比例存储氧化 ； n ＝ 5) 或在多巴酚丁胺进行 中 (10μg/kg/min ； 高吸收和具有低存储的氧化 ； n ＝ 5)， 共 15 条狗。所有的介入按常规进 22， 27 行并且在基质环境中显示了必要的稳定性并且心脏工作以实行多示踪剂的研究 21， 。心 21， 22 肌组织也可以通过我们前述的方法得到 。显像方案完成后， 通过左开胸术切口， 胸可以 被打开。可以打开心包并露出心脏。在左前降支动脉的主对角支的每一侧上都有近 4-5cm 的平行切口。切口之间的心肌可以取出并用在液体 N2 中冷却的铝冷冻夹并在 -80℃保存。
方案 2 ： 除了用 18F-FAA 取代外， 显像方案和介入与方案 1 相同， 加入 5-7mCi 的 FTP 15 11 然后进行 60min 的动态显像。如方案 1 相同， O- 水和 C- 棕榈酸酯可以在显像时加入。可 以进行使用 13C- 棕榈酸酯的稳定的同位素测量。 用于放射性标记代谢物的血液样品和未标 记的基质和胰岛素也可以进行。心肌组织可以在过程的最终得到。
实施例 3
这个实施例示出我们策略的灵活性， 开始将用于 IPPA 的 2- 氟乙氧类似物的 60min 11 动力学与在同样动物中 ( 图 4) 的 C- 棕榈酸酯 ( 图 4) 的动力学比较。两种放射性示踪剂 的显像都为 60min。用 11C- 棕榈酸酯 ( 顶部 ) 和用 18F-FAA 标记的新的脂肪酸类似物 ( 底 部 ) 研究的料饲鼠得到了复合心肌 microPET 图像。图像从横轴显示并且给出示踪剂注射 20-30min 后得到的数据。18F-FAA 图像比 11C- 棕榈酸酯图像显示了优异的质量和较高的示 踪剂活性。图 4 给出了各个 microPET 图像。顶部行 (18-13330 和 19-12011) 为 11C- 棕榈 酸酯图像并且顶部行 (18-22135 和 19-21952) 为 18F-FAA 图像。不断增加的信号强度以绿 到黄到红 ( 最高 ) 表示。注意到了相对相似的示踪剂动力学 ( 图 5)。
实施例 4
这个实施例示出用于 11C- 棕榈酸酯 ( 顶部 ) 和 18F-FAA( 底部 ) 的血液 ( 输入 ) 和 心肌时间 - 活性曲线 (TAC)( 前部和侧向的 )。心肌 TAC’ s 代表由三个连续的 ROI( 图 5) 得到的平均的示踪剂活性。为了在视觉上提高在心肌动力学中的不同， 对于 Y- 轴使用对数 比例。
尽管可以观察到有些不同， 放射性示踪剂既显示了显著的示踪剂吸收又具有快速18 的双相洗出。例如， 当与 11C- 棕榈酸酯相比时， F-FAA 显示了较早的平台和随后较慢较早 的示踪剂清除 (0.17±0.01vs.0.30±0.02， P ＜ 0.0001) ； 并且显著地较高地延迟清除 (0. 18 0.0030±0.0005vs.0.0006±0.00013， P ＜ 0.01)。在 F-FAA 中示踪剂注入 60min 后， 示踪 11 剂清除还很盛行， 但在 C- 棕榈酸酯中却不这样， 其中在示踪剂注入 25mins 后， 示踪剂在血 液和心肌组织两者中均增加。 这些数据验证了在各个实施方案中这些化合物的性质和它们 在评价心肌 FA 代谢中的应用。
实施例 5
这个实施例示出放射性标记的脂肪酸类似物的制备， 在有些实施例中其行为类似 11 11 活体中的 C- 棕榈酸酯， 但是包含比 C 半衰期长的正电子发射放射性核素。 先前的研究已 123 11 经表明 I-IPPA 显示的组织 - 时间活性曲线 (TAC) 类似于 C- 棕榈酸酯。也就是说， 两种 放射性示踪剂显示了心脏的双相洗出动力学， 其代表氧化 ( 快速洗出相 ) 和存储 ( 慢速洗 出相 )。因此， 已经提出了包括用正电子发射放射性核素， 氟 -18 取代 123I 放射性标记的策 略。一个用于制备 p-IPPA18F- 标记的类似物的策略为用 [18F]2- 氟乙氧基 ([18F]5) 取代碘 原子。 这种策略已经用于合成受体 - 基放射性示踪剂并且在活体中脱氟时预期 2- 氟乙氧基 是稳定的。如方案 1( 图 2) 所示， 已经以高收率 ( ～ 85％ ) 和高比活性 ( ～ 6,000Ci/mmol 18 合成末期 ) 合成了 [ F]5。在方案 1 中， 合成步骤为 a) 三甲硅基重氮甲烷、 THF、 己烷、 2hr ； b)4- 苄基氧基苯基硼酸、 Pd(OAc)2、 [HP(t-Bu)2Me]BF4、 KOt-Bu、 t- 戊醇、 氩气， RT、 24hr ； c) Pd/c、 EtOAc、 H2、 6psi、 5hr ； d)1- 溴 -2- 氟乙烷、 K2CO3、 丙酮 ； e)NaOH、 MeOH、 CHCl2、 水； f) 乙 18 烷 -1， 2- 二基双 (4- 甲苯磺酸酯 )、 K2CO3、 CH3CN 回流 3hr ； g)[ F]KF/K2.2.2/K2CO3/CH3CN、 然后 NaOH， 其中 K2.2.2 是 4， 7， 13， 16， 21， 24- 六氧杂 -1， 10- 二氮杂双环 [8.8.8]- 二十六 烷 (Kryptofix222 ， AcrosOrganicsN.V.， 新泽西州费尔劳恩 )。在有些实施方案中， 发明 人公开了如图 3 所示的合成 “点击” 和 “反” 点击类似物。在有些结构中， 点击和反点击反 18 应的反射化学产率基于起始 [ F] 氟化物可以超过 80％。
实施例 6
这个实施例示出使用 “点击化学 (click chemistry)” 方法用于标记的图 3)。 首先 18 18 的策略包括使用中间体的 “传统的” 点击化学反应， [ F]2- 氟 -1- 叠氮乙烷以给与 [ F]9。 29 18 第二个方法包括 “修改的” 点击反应， 其中 F- 放射性标记可以与乙炔前体结合。1， 3- 极 18 性加环反应所需的叠氮残基可以附加在脂肪酸基团上， 以给与 [ F]10。
实施例 7
这个实施例示出可以结合于 VLDL-TG 的放射性标记的 TG 的制备。该策略包括将 18 F-FAA 结合于 1- 位的甘油三酯。目标 TG 的示例结构如图 6 所示。用于合成目标化合物 的起始物质可以为商业上提供的 1， 2- 双棕榈甘油。使用如图 7、 图 8 和图 9 所示的反应顺 序可以完成 1， 2- 双 - 棕榈甘油到 TG 类似物的转换。应当指出 2- 位的 TG 为手性中心， 1， 18 18 18 2-pal-[ F]5、 1， 2-pal-[ F]9 和 1， 2-pal-[ F]10 的类似物可以初步合成并且以对映异构 体混合物评价。可以使用常规的方法， 例如手性 HPLC， 将 TG 分离为其 (+)- 和 (-)- 异构体。
实施例 8
这个实施例说明放射性标记的甘油三酯的封装。在有些结构中， 放射性标记的 TG 可以用本领域技术人员公知的方法用于外活体的 “封装” ， 例如由 Gormsen 等描述的方法 20。 在有些结构中， 使用无菌技术， 从供体鼠和狗可以分别得到血液 (3-5mL) 和 (20-30mL)。在有些结构中， 通过超离心 (Beckham(Instruments， 加州帕洛· 阿尔托市 ) 可以分离出极低密 度脂蛋白 (VLDL)。 使用修改的 Pasteur 移液管可以除去 VLDL 的上清液， 通过 MilliporeR 过 18 滤器 ( 孔径 0.22mm)， 并在 4℃保存 1wk。 使用时， 通过在 37℃水浴中超声 30min， F-FAA-TG 可以结合在 VLDL 复合物中。得到的溶液推注前重新经过 0.22μm 的过滤器。在一些方面， 可以测试代表性的样品以确认切实可行。在一些方面， 可以实施另外的可控实验以表明在 电泳性质、 胆固醇 -TG 比、 载脂蛋白 B-100(apoB-100) 浓度和在排阻 HPLC 的迁移率方面外 活体 - 标记的 VLDL-TG 可以不显著的区别于天然的 VLDL。除了从较大体积的血液 ( 例如， 50-60mL) 分离的 VLDL 可以使用占有所有的示踪剂外， 在有些结构中， 可以使用比较方法制 13 备 C-VLDL。
实施例 9
这个实施例说明显像过程和分析。在这个实施例中， 使用心脏上的 2.5 倍变焦 的过滤反向投影和每显像部分 20-40 帧可以重建动态显像。数据重建 ( 显像的过滤分辨 率为 10mm) 可以通过在 SiliconGraphics 计算机系统中实现并且通过 Ethernet 传送到 SunUltra10 工作站用显像 - 分析软件包显像分析。心肌显像可以重建为正交平面， 其中可 以得到示踪剂动力学和灌注及代谢的局部值。另外， 可以得到灌注和 FA 代谢的前外侧节段 值， 然后为了关联甘油三酯的组织测量平均以得到每只狗的值。局部值可以用于评价在参 数估算中的局部多样性和偏差。
实施例 10
这个实施例示出局部灌注和代谢的测量。心肌灌注的测量为用于测量 FA 代谢的 30-32 房室模型的必要组成， 并且用于计算基质使用的 Fick 测量。使用 15O- 水动力学 23， 的验 证效果好的模拟方法可以实现测量。
实施例 11
这个实施例示出用于 F-18 放射性标记的示踪剂的分析和动力学模型。在有些实 施例中， 这些 18F-FAA 放射性示踪剂的分析可以遵循如下 2 步骤 ：
步骤 1. 鼠中的 microPET 显像和动力学定性和半定量分析。分析策略包括 1) 图 像质量可视化以评价在心肌示踪剂分布， 例如示踪剂主要分布在心肌 vs. 同时分布在心肌 和血液中 ； 2) 血液和心肌 TAC’ s 的相似 / 不同的可视化和 ； 3)“曲线带” ， 其中心肌曲线可 以多指数拟合以评价在吸收和清除示踪剂速率中的总相似 / 不同的不同。
步骤 2. 在好控制的犬模型中提出和验证 18F-FAA PET 动力学的房室模型。在该过 22， 28 程中使用了大量可以用于验证 PET 代谢示踪剂的方法 21， 。首先， 可以使用 ACS 数据 a) 18 18 识别血液和心肌 F 代谢物 b) 量化他们对于研究的 F-FAA 心肌代谢的贡献并且 c) 比较这 些 18F 代谢物与其它， 例如 11C- 棕榈酸酯代谢物在血液中和 13C- 棕榈酸酯代谢物在组织中 和 13C-VLDL 在血液和组织中的代谢物。其次， 在这些观察的基础上， 设计并完成基本模型， 18 并且测试大范围的代谢和心脏工作状态研究。然后 PET 血液 ( 为 F- 代谢物修正的 ) 和心 肌 TAC 可以与研究的模型拟合以估算模型传递速率 (kn， min-1)。此时， 可以使用大量的数 18 学工具以评价完成的模型是否是 F-FFA 示踪剂动力学的忠实表达。这些数学工具包括吻 合度分析以评价建立的心肌 TAC 与 PET TAC 的怎样好的匹配性， 和参数敏感分析以评价示 踪剂代谢的改变可以怎样好的通过模型参数追踪。基于这些标准， 可以重建或接受这些模 型。 如果接受， 由模型传递速率计算的部分、 或由代谢部分产物和心肌血液流量计算的通量(mL/g/min)、 或由代谢通量产物和血液 FA 水平计算的总代谢速率 (nmol/g/min) 的代谢测 量可以与 ACS 测量比较。最后通过比较衍生自评价 FA 代谢的模型与适宜的公知标准 ( 例 11 如， C- 棕榈酸酯和 13C-VLDL) 可以实现模型的生物验证。
实施例 12
这个实施例示出 FA 吸收与 FTP 的量化。由于 FTP 与组织的结合本质上是不可逆 18 的， 可以使用 Patlak 图形分析以计算前述的心肌 FA 吸收 17， 。 血浆放射性标记的代谢物存 17， 18 在时可以修正动脉输入函数 。基于 FTP 的部分吸入与用 ACS 实现的由 Fick 方法测量的 11 C- 棕榈酸酯的不同可以计算 LC 值。值得注意的是， 上述的房室模型方法也可以用于研究 确定 FA 吸收和用这些示踪剂可以分离的氧化。
实施例 13
与 PET 显像分开， 为了确认光学显像特性并得到实现建立用于放射性药物最终提 出为人类需要的剂量学的需要， 可以实施信息生物分布研究。除去感兴趣的器官并且在伽 玛计数器中计数。可以由伽玛计数的计数 vs nCi( 即计数 /nCi 放射活性 ) 标准曲线面积 计算％ I.D./ 器官和％ I.D./g 组织。动物们使用前述的异荧烷麻醉。放射性示踪剂 ( 相 对氟 -18， 50-100μCi) 通过尾静脉注射进行。可以在注射放射性示踪剂后 10、 30、 60、 和 240min 的时间点通过过量麻醉将动物安乐死。
实施例 14
这个实施例说明血浆分析。在这些试验中， 血液样品收集在干燥的注射器中并且 加入到 EDTA- 包覆的采血管中， 充分混合并在准备用于前述的含量测定 ( 尽可能短的时间 ) 33 前在冰中储存 。在 5℃下以 3000rpm 离心 5min 后， 0.5mL 的血浆加入到玻璃测试管中用 于萃取标记的脂肪部分。 加入萃取溶剂 (1NHCl-n- 庚烷 - 异丙醇 1/10/40v/v)， 漩涡搅拌试 管， 然后加入水 /n- 庚烷并且离心 (4000rpm， 4min) 以分离水和有机层。两相都可以用于放 射活性的计数。非 - 酯化 FA、 TG 和磷脂存在时可以分析样品。方法包括使用 SPE、 各种来 源提供的氨丙基结合相 (SPE-NH2 柱 )， Bond Elut 为其中一种。使用位于商业提供的真空 架上的含 300-500mg 树脂的柱子可以首先完成该工作。底部的测试管可以根据需要改变以 收集不同部分， 然后可以蒸发这些选择的部分并重建成小容积以通过 HPLC 分析作为验证 步骤的部分， 或随后验证， 直接在伽玛 - 计数器上计数以量化放射活性。
不同脂肪部分的萃取 ： 然后上面的有机层部分可以通过先前用庚烷填充的 SPE-NH2 柱。随后用庚烷 - 异丙醇 (1 ∶ 2v/v)(TG 和其它中性脂肪 )、 2％乙酸的二乙醚 ( 自 由 FA) 溶液和甲醇 ( 磷脂 ) 洗脱可以实现 TG、 自由 FA 和磷脂的分离。根据建议指令可以 改变每个试管架。溶剂组合物和体积可以基于样品尺寸、 树脂量和总放射活性注射优化。 SPE-NH2 可以用于将第一萃取部分的中性成分分离成 TG、 胆固醇、 二 - 和单 - 甘油酯。对于 自由 FA 和磷脂， 使用乙脲 -THF- 水 - 醋酸溶剂混合物通过特制柱 ( 水 FA 分析柱 ) 可以实 现 HPLC 的验证。对于 TG 的 HPLC 分析， 使用二氯甲烷 / 乙脲或丙酮 / 乙脲与 RI 探测器我 34 们可以测试 C-18 分析柱 。为了每种部分可以以可靠的标准最好的分离可以优化 HPLC 柱 子。还可以研究商业提供的试剂盒用于提出特别目标脂肪的方法， 例如由 ZorbaxKit 提供 的 SB-C18/SB-CN/SB- 苯基 5μm4.6x150mmHPLC 柱， 以显著地降低短寿命的 C-11 代谢物的 停留时间。
实施例 15这个实施例说明心脏组织的分析。可以实施这些试验以确定放射性标记的 FA 化 合物和它们的代谢物在心脏组织中的分布。 代谢物分析可以用 Degrado 等描述的 Folch- 型 17 萃取过程实现 。上述生物分布研究的同时可以切除鼠心脏。它们在 0℃下在 7mL 的氯仿 / 甲醇 (2 ∶ 1) 中超声粉碎 (20s) 充分均化。 加入尿素 (40％， 1.75mL) 和 5％的硫酸 (1.75mL) 并且混合物另外超声 20s。离心 10min 后， 水、 有机物和蛋白质中间相部分可以分离并且计 数。对于上述的放射性标记的甘油二酯、 FA、 TG 和胆固醇酯， 有机相可以用硅 - 凝胶 TLC 进 17 一步分析。 TLC 组织分析得到的结果的验证也可以用前面提出的 HPLC 方法完成。
实施例 16
这个实施例说明血浆 13C- 棕榈酸酯或 13C-VLDL 富集的测量。对于 13C- 棕榈酸酯 或 13C-VLDL 富集的测量， 可以通过离心分离血浆， 在 60℃加热≥ 15min 以破坏脂蛋白脂肪 13 酶的活性， 并且在随后的分析前在 80℃保存。 C- 棕榈酸酯的富集可以使用上述的甲基酯 衍生物通过气相质谱 (GCMS ； AgilentTechnologies5973N， 美国加州圣克拉拉 ) 测量。首先 如 Patterson 等所述的通过超离心从其它脂肪类分离 VLDL 甘油三酯后， 可以相似地确定 35 13 C-VLDL 的富集 36。
实施例 17
这个实施例说明血液 13CO2 富集和含量的测量。在这些试验中， 血液 13CO2 富集可 以通过用 0.5mL 的 6N 将 0.5mL 的血液脱蛋白化测量并且用传统的同位素比率质谱 (IRMS ； FinniganMATDelta+XL， ThermoFisherScientific， 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 ) 分析顶空气 体。血液 CO2 含量可以由血浆 pCO2、 pH、 温度和血红蛋白浓度的测量来计算 37。然后可以计 算作为 13CO2 富集产物和 CO2 含量的总血液 13CO2 含量。
实施例 18
这个实施例说明组织 13C- 甘油三酯和 13C- 磷脂富集和含量的测量 ： 为了确定 13 13 C- 棕榈酸酯或 C-VLDL 与心肌 TG 或磷脂存储的结合， 在液体 N2 中将冷冻组织样品粉 末环， 用氯仿∶甲醇 (2 ∶ 1) 萃取， 然后在分析前在 80 ℃保存。使用商业提供的试剂盒 (L-Type 甘油三酯 H 和磷脂 C 试剂盒， WakoChemicalsUSA， 美国弗吉尼亚州里士满 )， 少量 粗脂肪提取物可以用于测量总甘油三酯和磷脂含量。残液可以用固体相萃取来纯化并且 在甘油三酯和磷脂部分中的 13C ∶ 12C 比率可以用气相燃烧 IRMS(FinniganMATDelta+XL， ThermoFisherScientific， 马萨诸塞州沃尔瑟姆 ) 确定。然后在甘油三酯或磷脂中的 13C 棕 榈酸酯总含量可以用组织含量 ( 以 μmol/g 为单位 ) 乘以相应的的富集 ( 示踪剂 ： 追踪剂 13 13 比 )。然后这些数据和前体 ( 即， C- 棕榈酸酯或 C-VLDL) 富集和示踪剂灌注的持续时间 一起来计算甘油三酯或磷脂合成 ( 以 μmol/g/min 为单位 ) 的试剂速率。
实施例 19
这个实施例说明血浆基质和胰岛素的测量。在这些试验中， 血浆葡萄糖和乳 酸盐水平可以用 2300STATPlusAnalyzer 酶法测定。血浆自由 FA 水平可以用酶比色法 (WakoNEFACkit， WakoChemicalsUSA， 美国弗吉尼亚州里士满 ) 测量。血浆胰岛素可以用放 射免疫测定 (LincoResearchCo.， 美国密苏里州圣查尔斯 ) 来测量。
实施例 20
这个实施例说明显像方案。方案 1 ： 在这些试验中， 所有的显像研究都可以在 microFocus220 上进行。 可以连续检测心电图、 动脉血压和血液气体值。 可以首先进行透射扫描以修正正电子衰减。透射扫描后， 5-7mCi 的 15O- 水可以进行静脉推注， 同时及时启动 15 11 动态数据收集 5min。 O- 水衰减后， 5-7mCi 的 C- 棕榈酸酯可以进入静脉， 然后进行 60min 11 的数据收集。 C- 棕榈酸酯衰减后、 5-7mCi 的 FA 类似物可以进入， 然后进行 60min 的数据 11 收集。 C- 棕榈酸酯进入的同时， 开始持续灌注 (0.1umol/kg/min) 的 13C- 棕榈酸酯并且持 11 续到标记甘油三酯池研究的结束。11C- 棕榈酸酯、 CO2、 和 18F- 代谢物可以用 ACS 血液配对 样品测定。血浆胰岛素和基质可以以预设的间隔测定。这里的目标是关于在基本 TG 存储 ( 并且达到较低程度的磷脂和中性脂肪 ) 和 β- 氧化得到宽范围的心肌 FA 使用速率和萃取 FA 的代谢速率。 因此， 可以在休眠的状态下也可以在空腹的状态下研究狗 ( 中速 FA 吸收和 低存储氧化 ； n ＝ 5)， 在高胰岛素 - 正葡萄糖钳夹中 ( 低吸收和较高比例存储氧化 ； n ＝ 5) 或在多巴酚丁胺进行中 (10μg/kg/min ； 高吸收和具有低存储的氧化 ； n ＝ 5)， 共 15 条狗。 21， 22 然后心肌组织也可以通过我们前述的方法得到 。显像方案完成后， 通过左开胸术切口， 胸可以被打开。可以打开心包并露出心脏。在左前降支动脉的主对角支的每一侧上都有近 4-5cm 的平行切口。切口之间的心肌可以取出并用在液体 N2 中冷却的铝冷冻夹并在 -80℃ 保存。整个过程允许在冷却前组织的连续灌注以确保稳定的糖元存储。可以用过量的硫喷 妥钠 ( 至少 60mg/kg) 和随后通过左心房或左心室导管注入 1-2 分钟的 60mL 的饱和 KCl， 将 动物们安乐死。
方案 2 ： 除了用 18F-FAA5-7mCi 代替 FTP， 其随后进行 60min 的动态显像。同方案 1 15 11 一样， O- 水和 C- 棕榈酸酯可以用显像进行。使用 13C- 棕榈酸酯可以进行稳定同位素测 量。用于放射性标记的代谢物和未标记的基质和胰岛素的血液样品也可以进行。在过程的 最终可以得到心肌组织。
实施例 21
这个实施例说明数据分析。
在提出我们的 11C- 葡萄糖和 L-3-11C- 乳酸盐模型中， 使用 20 和 23 只狗的样品量 22， 28 。对于方案 1， 可以进行单因素分析确定是否用于心肌吸收的 Fick- 导出值和其 18F-FAA 追踪的心肌清除 ( 以氧化测量 ) 随基质和激素可用性改变。用后 -hocScheffé 测试分析 变量比较组数据间的不同。如果这样， 然后这些值可以与相似测量的 11C- 棕榈酸酯吸收和 11 CO2 产物关联。吸收值的比较也可以帮助确定时候 LC 包括在用 18F-FAA 确定心肌 FA 吸收 中。然后， 使用上述的一般模型范例， 可以建立基于 18F-FAA 心肌动力学的房室模型。可以 进行各种模型参数， 单因素分析以确定时候随质和激素可用性改变。 采用标准回归分析， 使 18 11 用 F-FAA( 作为因变量 ) 的 FA 吸收、 氧化和存储的断层估算可以与用 C- 棕榈酸酯 ( 作为 自变量 ) 的 PET 导出值比较。而且， FA 存储的测量速率可以与向 TG 和磷脂结合 13C- 棕榈 酸酯的直接确定速率相关联。
对于方案 2， 可以进行单因素分析以确定是否 Patlak- 导出的 FA 吸收 FTP 速率 随基质和激素可用性改变。采用标准回归分析， 用 FTP( 作为因变量 ) 断层估算可以与用 11 C- 棕榈酸酯 ( 作为自变量 ) 吸收的 Fick- 导出测量比较。另外， LC 值可以计算 3 介入以 11 确定其在这些条件下的稳定。用 CO2 产物的 FA 吸收侧 FTP 导出测量也可以进行比较以 确定时候用 FTP 测量的吸收参数比氧化更直接。而且， 可以比较用于 FA 吸收的 ( 用 FTP) 8 11 PET- 导出值和 FA 吸收 ( 用 F-FAA ； 来自方案 1) 与用 C- 棕榈酸酯的 Fick- 导出值的关联 18 以确定是否在所研究的条件下 F-FAA 提供了更精确的 FA 吸收测量。如上所述， 还可以研究前潜在的用 FTP 的房室模型。FA 吸收、 氧化和尽管不相同的存储的值可以与用 11C- 棕榈 酸酯的 Fick- 导出值和 13C- 棕榈酸酯的组织测量分别比较。
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