抗BLYS抗体.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103421113 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421113 A *CN103421113A* (21)申请号 201210160474.3 (22)申请日 2012.05.22 C07K 16/24(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 。

2、19/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (71)申请人 武汉华鑫康源生物医药有限公司 地址 430075 湖北省武汉市东湖开发区高新 大道 666 号武汉国家生物产业基地 B、 C、 D 区研发楼 B1 栋 (72)发明人 陈博 舒红兵 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 冯琼 (54) 发明名称 抗 BLyS 抗体 (57) 摘要 本发明属于生物医药领域， 公开了抗 BLyS 抗 体， 所述抗 BLyS 抗体特异性针对 BLyS， 能够与 B 淋巴细胞刺激因子结合并且能够抑制 B 淋巴。

3、细胞 刺激因子与其受体BR3-Fc结合。 本发明还提供了 所述抗BLyS抗体在制备预防和/或治疗如系统性 红斑狼疮等 B 细胞增殖过量引起的疾病的药物中 的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 11 页 序列表 17 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书11页 序列表17页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103421113 A CN 103421113 A *CN103421113A* 1/2 页 2 1. 抗 BLyS 抗体， 其轻链 CDR1、 CDR2 和 CDR3 以及重链 CDR1、 CDR2。

4、 和 CDR3 的氨基酸序 列选自以下各组中的一组 ： 2.根据权利要求1所述抗BLyS抗体， 其轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区的氨基 酸序列选自以下各组中的一组 ： a ： SEQ ID NO.31 和 SEQ ID NO.32 所示的氨基酸序列 ； b ： SEQ ID NO.33 和 SEQ ID NO.34 所示的氨基酸序列 ； c ： SEQ ID NO.35 和 SEQ ID NO.36 所示的氨基酸序列 ； d ： SEQ ID NO.37 和 SEQ ID NO.38 所示的氨基酸序列 ； e ： SEQ ID NO.39 和 SEQ ID NO.40 所示的氨基酸序列。 。

5、3.根据权利要求1所述抗BLyS抗体， 其轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区的氨基 酸序列选自以下各组中的一组 ： I ： SEQ ID NO.41 和 SEQ ID NO.42 所示的氨基酸序列 ； II ： SEQ ID NO.43 和 SEQ ID NO.44 所示的氨基酸序列 ； III ： SEQ ID NO.45 和 SEQ ID NO.46 所示的氨基酸序列 ； IV ： SEQ ID NO.47 和 SEQ ID NO.48 所示的氨基酸序列 ； 4. 根据权利要求 3 所述抗 BLyS 抗体， 其特征在于， 还含有人类轻链恒定区和重链恒定 区， 且所述轻链可变区及重链可变区分。

6、别连接至人类轻链恒定区和重链恒定区。 5. 根据权利要求 4 所述抗 BLyS 抗体， 其特征在于， 所述人类轻链恒定区为人类轻链 恒定区。 6. 根据权利要求 4 所述抗 BLyS 抗体， 其特征在于， 所述人类重链恒定区为人类重链 Fc 片段。 7. 编码权利要求 16 任意一项所述抗 BLyS 抗体的 DNA 分子。 8. 一种重组 DNA 载体， 其特征在于， 含有权利要求 7 所述 DNA 分子。 9. 一种宿主细胞， 其特征在于， 含有权利要求 8 所述重组 DNA 载体。 10.权利要求16任意一项所述抗BLyS抗体在制备预防和/或治疗B细胞增殖过量引 起的疾病的药物中的应用。 。

7、11.根据权利要求10所述应用， 其特征在于， 所述B细胞增殖过量引起的疾病为系统性 红斑狼疮、 类风湿性关节炎、 强制性关节炎或 B 细胞淋巴癌。 12. 一种药物组合物， 其特征在于， 由有效剂量的权利要求 16 任意一项所述抗体和药 权 利 要 求 书 CN 103421113 A 2 2/2 页 3 学上可接受的辅料组成。 权 利 要 求 书 CN 103421113 A 3 1/11 页 4 抗 BLyS 抗体 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及抗 BLyS 抗体及其应用， 所述抗 BLyS 抗体能够与 B 淋巴细胞刺激因子结合并且能够抑制 B 淋巴细胞刺激因子与其受。

8、体 BR3-Fc 结合。进一步 涉及与 MHC II 因子亲和力低的人源化抗 BLyS 抗体及其应用。 背景技术 0002 系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus， SLE） 是一种累及全身多个系 统如皮肤、 关节、 心脏、 肺、 肾、 血液以及大脑的弥慢性进行性、 常以缓解和复发交替出现的 自身免疫性疾病。系统性红斑狼疮主要影响非洲 - 加勒比人、 亚洲人和西班牙裔人， 而高加 索人 ( 白种人 ) 受其影响的程度则较小。美国狼疮基金会认为， 保守预测系统性红斑狼疮 在美国影响到 30 万人。而 Datamonitor 公司估计， 仅在中国、 印度和墨西哥。

9、三国就有 220 万系统性红斑狼疮患者， 其中中国系统性红斑狼疮患者超过 100 万， 为全球之最。由于系统 性红斑狼疮初期症状比较隐蔽， 因此实际病患人数可能远大于目前估计。由此可见临床在 系统性红斑狼疮的诊断和治疗方面均存在极大的客观需求。 0003 系统性红斑狼疮的成因复杂且不明确， 并非单一因素引起， 可能与遗传、 环境、 性 激素及免疫等多种因素有关。目前， 世界科学界公认的系统性红斑狼疮的病因是由于在细 胞水平上， 自反应 B 细胞在外周组织中存在时间过长， 产生人体自身抗原而造成自身免疫。 所以如果可以抑制早期 B 细胞的生长增殖， 则可以治疗红斑狼疮疾病。 0004 B 淋 巴。

10、 细 胞 刺 激 因 子 （B Lymphocyte Stimulator， BLyS） , 又 称 Tall-1(TNF and Apol related leukocyte expressed ligand 1)、 BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)、 THANK(TNF homologues that activate apoptosis,NF-B and JNK)， 属肿瘤坏死因子 （TNF） 家族， 是由舒红兵等人于 1999 年首先 发现并克隆的一种新的细胞因子。 BLyS作为一种B淋巴细胞的共刺激因。

11、子， 在anti-IgM和 IL-4 存在下， 它可以专一刺激 B 细胞增殖和分化， 在体液免疫中起着极其重要作用 ； 而其在 体内的过量表达又与自身免疫性疾病密切相关。 0005 体外实验表明， 在用 IgM 预活化 B 细胞后， BLyS 能诱导其大量增殖并分泌大量 IgM 和 IgA， 但是， 对于静息期间 B 细胞， 这种刺激作用却不明显 (3)。进一步的研究表明， BLyS 主要作用于前B淋巴细胞、 未成熟B淋巴细胞、 激活淋巴细胞， 而对浆细胞、 淋巴多功能干细 胞没有作用。同大多数细胞因子相同， BLyS 主要是通过 B 细胞表面受体而刺激下游信号传 导。多个研究小组证实与 BL。

12、yS 结合的受体是 ： B 细胞活化因子受体 （BR3、 BLyS receptor3 或 BAFF-R） 、 穿膜蛋白活化物 （transmembrane activator-1 and calcium modulator and cyclophilin ligand-interactor， TACI)和B细胞成熟抗原 （B cell maturation Antigen， BCMA） 。这种特异性决定了 BLyS 是针对 B 细胞抗体介导的自身免疫疾病和淋巴癌中一个很 好的标靶。 0006 抗 BLyS 的治疗性抗体在体内和体外已经被证明可以有效抑制 B 细胞生 长、 IgA 和 IgM 。

13、分 泌 从 而 达 到 治 疗 系 统 性 红 斑 狼 疮 的 效 果 (Edwards BM 等， The 说 明 书 CN 103421113 A 4 2/11 页 5 remarkable flexibility of the human antibody repertoire;isolation of over one thousand different antibodies to a single protein,BLyS.J Mol Biol.2003Nov14;334(1):103-18 ； Baker KP 等， Generation and characterization。

14、 of LymphoStat-B,a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator.Arthritis Rheum.2003Nov;48(11):3253-65)。美国人类 基因组公司开发的抗 BLyS 抗体 Benlysta 成为过去 60 年来世界首个治疗红斑狼疮的新型 药物。Benlysta 只针对 BLyS 刺激的 B 细胞， 与化疗药物相比， 大大降低了治疗过程中的 副作用， 因此为系统性红斑狼疮患者提供了一个安全有效的治疗方法。近年来针对 BLyS 的靶。

15、向治疗研究与临床应用迅速发展， 除美国人类基因组公司外， 其他公司均是采用在 BLyS 或其受体基础上改造的融合蛋白。美国基因泰克 (Genentech) 公司开发了 BR3-FC 药 物、 Zymogenetics 公司开发了 TACI-FC 药物、 安晋 (AMGEN) 公司开发了多肽 -FC 药物。与 Benlysta相比， 它们的特异性差， 结合力弱， 疗效相对较差， 毒性较强。 这三种药物均停止或 终止在临床实验二期。所以， 抗 BLyS 的抗体药物才是针对此靶点的有效药物方法。 发明内容 0007 有鉴于此， 本发明的目的在于提供抗 BLyS 抗体， 所述抗体能够与 B 淋巴细胞刺。

16、激 因子结合并且能够抑制 B 淋巴细胞刺激因子与其受体 BR3-Fc 的结合。 0008 为实现本发明的目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0009 本发明通过基因工程技术， 提取人外周血 RNA， 以人外周血 RNA 外周血 RNA 为模板 反转录获得人 BLyS 的 cDNA， 然后以人 BLyS 的 cDNA 为模板分别扩增获得人的 BLyS 基因片 段， 克隆到真核表达系统中转染宿主细胞表 达并纯化获得人的 BLyS 纯化蛋白。 0010 以人的 BLyS 纯化蛋白为抗原免疫小鼠获得 2000 株不同单克隆杂交瘤细胞， 通过 酶标反应， 共选出 211 株分泌的抗体可结合 BLyS 蛋。

17、白的克隆。在这 211 株杂交瘤细胞中， 通过检测与 BJAB 上 BLyS 受体结合能力获得 5 株分泌的抗体可以不同能力的抑制生物素标 记的 BLyS 与 BJAB 上 BLyS 受体结合的单克隆杂交瘤细胞， 分别命名为 1D12、 2B10、 2G3、 5A5 和 13G8。 0011 用ELISA对所获得的5个单克隆杂交瘤细胞株分泌的抗体进行免疫学特性进行鉴 定， 结果显示本发明筛选得到的克隆杂交瘤细胞株分泌的抗体均特异性针对 BLyS， 而对其 他 TNF 家族抗原如 TNF-、 TNF-， 则没有反应性。 0012 进一步的， 本发明提取各杂交瘤细胞 RNA 反转录获得 cDNA，。

18、 然后以 cDNA 为模板 扩增各杂交瘤细胞所对应的可变区 DNA 序列， 测序后利用 www.expasy.ch 对所得的序列进 行系列分析， 根据推导的氨基酸序列进行 Kabat 分类分析， 确定各杂交瘤细胞分泌的抗体 的轻链和重链的 FR 区和 CDR 区。其中， 其轻链 CDR1、 CDR2 和 CDR3 以及重链 CDR1、 CDR2 和 CDR3 的氨基酸序列选自以下各组中的一组 ： 0013 说 明 书 CN 103421113 A 5 3/11 页 6 0014 其中， 在一个实施方案中， 所述单克隆杂交瘤细胞 1D12 分泌的抗 BLyS 抗体， 含有 SEQ ID NO.3。

19、1 所示氨基酸序列的轻链可变区和 SEQ ID NO.32 所示的氨基酸序列重链可变 区， 命名为单克隆抗体 1D12。 0015 在一个实施方案中， 所述单克隆杂交瘤细胞2B10分泌的抗BLyS抗体， 含有SEQ ID NO.33 所示氨基酸序列的轻链可变区和 SEQ ID NO.34 所示的氨基酸序列重链可变区， 命名 为单克隆抗体 2B10。 0016 在一个实施方案中， 所述单克隆杂交瘤细胞 2G3 分泌的抗 BLyS 抗体， 含有 SEQ ID NO.35所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO.36所示的氨 基酸序列重链可变区， 命名 为单克隆抗体 2G3。 0017 在一个。

20、实施方案中， 所述单克隆杂交瘤细胞 5A5 分泌的抗 BLyS 抗体， 含有 SEQ ID NO.37 所示氨基酸序列的轻链可变区和 SEQ ID NO.38 所示的氨基酸序列重链可变区， 命名 为单克隆抗体 5A5。 0018 在另一个实施方案中， 所述单克隆杂交瘤细胞 13G8 分泌的抗 BLyS 抗体， 含有 SEQ ID NO.39所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列重链可变区， 命 名为单克隆抗体 13G8。 0019 当然， 在不影响抗体活性的前提下， 本领域技术人员根据上述SEQ ID NO.3140所 示的氨基酸序列进行各种取代、 添加和 / 或。

21、一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸 序列， 它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进 行替换。 0020 然而， 给予治疗性抗体的最大隐患是人体对外源抗体蛋白所引起的免疫应答， 而 产生抗抗体反应 （AAR） 。 鼠源抗体作为外源蛋白， 反复刺激人体， 可引起超敏反应， 被称为人 抗鼠抗体反应 （HAMA） 。 因此鼠源抗体在体内可能被抗抗体中和， 进而被快速清除， 甚至导致 严重的过敏反应而致死。另外鼠源单克隆抗体缺乏人抗体具有的免疫效应功能， 如 ADCC 和 CDC 作用， 而使疗效不佳。因此为了进一步减低免疫原性， 本发明将制备得到的鼠源抗体人 源。

22、化， 获得人源化抗 BLyS 抗体， 其轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区的氨基酸序列选 自以下各组中的一组 ： 0021 I ： SEQ ID NO.41 和 SEQ ID NO.42 所示的氨基酸序列 ； 说 明 书 CN 103421113 A 6 4/11 页 7 0022 II ： SEQ ID NO.43 和 SEQ ID NO.44 所示的氨基酸序列 ； 0023 III ： SEQ ID NO.45 和 SEQ ID NO.46 所示的氨基酸序列 ； 0024 IV ： SEQ ID NO.47 和 SEQ ID NO.48 所示的氨基酸序列 ； 0025 本发明所述人源化抗 。

23、BLyS 抗体不仅能够与 B 淋巴细胞刺激因子结合抑制 B 淋巴 细胞刺激因子与其受体BR3-Fc的结合， 而且与MHC II因子亲和力低， 从而在保证亲和力的 前提下， 使免疫应答减低到最小。 0026 本发明所述人源化抗 BLyS 抗体还含有人类轻链恒定区和重链恒定区， 且所述轻 链可变区及重链可变区分别连接至人类轻链恒定区和重链恒定区。即所述人源化抗 BLyS 抗体含有完整的轻链和完整的重链， 其中所述完整的轻链由抗 BLyS 抗体所含有的轻链可 变区与人类轻链恒定区连接而成， 所述完整的重链由抗 BLyS 抗体所含有的重链可变区与 人类重链恒定区连接而成。 0027 优选的， 所述人类。

24、轻链恒定区为人类轻链 恒定区。 0028 优选的， 所述人类重链恒定区为人类重链 Fc 片段。 0029 其中， 所述人类轻链 恒定区和人类重链 Fc 片段， 均来源于健康人 B 淋 巴细胞。 通过基因工程技术， 重叠延伸PCR连接可变区和恒定区得到完整的人源化抗BLyS抗体的轻 链和重链。 0030 本发明还提供了编码本发明所述抗 BLyS 抗体或人源化抗 BLyS 抗体的 DNA 分子。 由于密码子的简并性， 可以存在很多种能够编码本发明所述的抗体的 DNA 分子。 0031 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列的轻 链可变区的 DNA 分子， 。

25、其核苷酸序列如 SEQ ID NO.49。 0032 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列的重 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.50。 0033 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列的轻 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.51。 0034 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列的重 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.52。 0035 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有S。

26、EQ ID NO.35所示的氨基酸序列的轻 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.53。 0036 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列的重 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.54。 0037 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列的轻 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.55。 0038 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列的重 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ 。

27、ID NO.56。 0039 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.39所示的氨基酸序列的轻 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.57。 0040 在一个实施方案中， 本发明提供了编码具有SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列的重 链可变区的 DNA 分子， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.58。 0041 进一步的， 本领域技术人员可以将编码本发明所述抗BLyS抗体的DNA分子克隆到 说 明 书 CN 103421113 A 7 5/11 页 8 载体中， 进而转化宿主细胞。因此， 本发明还提供了一种重组 DNA 载体， 其含有编码本发。

28、明 所述抗 BLyS 抗体的 DNA 分子。 0042 优选的， 所述重组DNA载体是一种表达载体， 本领域技术人员将所述抗体的DNA分 子克隆到表达载体中， 转化宿主细胞， 通过诱导表达获得单链抗体。 0043 在一个实施方案中， 本发明所述重组 DNA 载体含有编码本发明所述人源化抗 BLyS 抗体的DNA分子。 编码的人源化抗BLyS抗体的DNA分子可被重组构建用于哺乳动物转录表 达的载体， 本发明的表达载体含有编码的人源 抗 BLyS 单克隆抗体的重链和轻链可变区和 恒定区的 DNA 序列。然而， 也可有分别构建两种表达载体， 一种含有重量可变区和恒定区， 另一种是含有轻链可变区和恒定。

29、区的， 一同转染哺乳动物。 0044 表达载体进一步含有启动子和编码分泌信号肽的 DNA 序列， 以及至少一种用于筛 选的抗药基因。所用方法包括 DNA 合成技术和体外重组技术。 0045 本发明还提供了一种宿主细胞， 其含有本发明所述的重组 DNA 载体。本发明所述 宿主细胞可以为其为原核宿主细胞、 真核宿主细胞或噬菌体。 0046 其中， 所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、 枯草杆菌、 链霉菌或奇异变形菌等。所 述真核宿主细胞， 可以为如巴斯德毕赤酵母、 酿酒酵母、 裂殖酵母、 木霉等真菌， 如草地粘虫 等昆虫细胞， 如烟草等植物细胞， 如BHK细胞、 CHO细胞、 COS细胞、 骨髓瘤细胞。

30、等哺乳动物细 胞。 0047 在一些实施方案中， 本发明所述宿主优选为哺乳动物细胞， 更优选的是 BHK 细胞、 CHO 细胞、 NSO 细胞或 COS 细胞。 0048 采用体外细胞学实验测定了本发明所述人源化抗 BLyS 抗体的免疫中和活性， 结 果显示本发明所述人源化抗BLyS抗体可以不同程度的抑制B细胞增殖， 因此本发明还提供 了所述抗 BLyS 抗体或人源化抗 BLyS 抗体在制备预防和 / 或治疗 B 细胞增殖过量引起的疾 病的药物中的应用。所述 B 细胞增殖过量引起的疾病为系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎、 强制性关节炎或 B 细胞淋巴癌。 0049 本发明还提供了一种药物制剂，。

31、 由有效剂量的本发明所述任意一种抗 BLyS 抗体 或人源化抗 BLyS 抗体和药学上可接受的辅料组成。所述药物制剂可以通过常规方法用本 发明所述抗BLyS抗体或人源化抗BLyS抗体中的任意一种与一种或多种药学上可接受的辅 料混合制成药物制剂。 其中 “药学上可接受的辅料” 是指一种或多种本领域技术人员公知的 有机或无机、 天然或合成的、 与抗体联合可促进其稳定和临床应用的载体。 合适的载体包括 本领域技术人员已知到药学上可接受的无菌盐水及含水或无水等渗无菌液和无菌混悬液。 0050 本发明所述有效剂量和使用方法取决于诸多因素， 包括患者的年龄、 体重、 性别、 自然健康状况、 营养状况、 化。

32、合物的活性强度、 给药时间、 代谢速率、 病程严重程度以及诊治 医师的主观判断。 本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定有效剂量和使用方法。 附图说明 0051 图 1 示实施例 1SDS-PAGE 检测图， 其中泳道 A 为本发明所述重组质粒 表达的蛋 白， 泳道 B 空白载体重组质粒， 泳道 C 为蛋白分子量 Marker ； 0052 图 2 示实施例 2 不同浓度生物素标记 his-hBLyS 重组蛋白与 BJAB 细胞结合的流 式细胞图， 其中线条1为200ng/mL生物素标记his-hBLyS重组蛋白组， 、 线条2为100ng/mL 说 明 书 CN 103421113 A 。

33、8 6/11 页 9 生物素标记 his-hBLyS 重组蛋白组， 线条 3 为 50ng/mL 生物素标记 his-hBLyS 重组蛋白组， 线条4为25ng/mL生物素标记his-hBLyS重组蛋白组， 线条5为不含生物素标记his-hBLyS 重组蛋白仅含有 SA-APC 组 ； 0053 图 3 示实施例 3 免疫小鼠的血清与 BJAB 细胞结合的流式细胞图 ； 0054 图 4 示实施例 4 单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体与 BJAB 细胞上 BLyS 受体结合的流 式细胞图， 其中线条 1 为负对照 IgG 组， 线条 1 为不含生物素标记 his-hBLyS 重组蛋白仅含 有 SA-。

34、APC 组， 线条 3 为单克隆杂交瘤细胞 3H9， 线条 4 为单克隆杂交瘤细胞 13G8 ； 0055 图 5 示实施例 4 单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体与 BJAB 细胞上 BLyS 受体结合的流 式细胞图， 其中线条 1 为负对照 IgG 组， 线条 2 为单克隆杂交瘤细胞 1D12 组， 线条 3 为单克 隆杂交瘤细胞 2B10， 线条 4 为单克隆杂交瘤细胞 2G3 ； 0056 图 6 示实施例 4 单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体与 BJAB 细胞上 BLyS 受体结合的流 式细胞图， 其中线条 1 为负对照 IgG 组， 线条 2 为单克隆杂交瘤细胞 5A5 组， 线条 3 为单克 。

35、隆杂交瘤细胞 1D7 组， 线条 4 为单克隆杂交瘤细胞 4D3 组 ； 0057 图 7 示实施例 4 单克隆杂交瘤细胞 1D12、 2B10、 2G3、 5A5 和 13G8 分泌的抗体与 his-hBLyS 重组蛋白和肿瘤坏死因子 （TNF） 家族蛋白酶联免疫吸附试验结果图 ； 0058 图 8 示实施例 9 人源化抗 BLyS 抗体体外抑制 B 细胞增殖结果图， 其中横坐标为人 源化抗 BLyS 抗体浓度， 纵坐标为荧光值。 具体实施方式 0059 本发明实施例公开了抗 BLyS 抗体及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和。

36、改动对本领域技术人员来 说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了 描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法进行改动或 适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0060 为了进一步理解本发明， 下面结合实施例对本发明提供进行详细说明。 0061 实施例 1 ： 人 BLyS 基因的克隆与表达 0062 分离健康人外周血， 以商用 RNA 试剂盒 （Qiagen 公司） 提取总 RNA 并纯化。以纯化 的总 RNA 为模板， 进行逆转录合成 cDNA 第一链 cDNA 反应体系如下 ： 0063 0064 加入灭菌蒸馏水补。

37、足体系总量 20L。 0065 反应条件为 ： 3010min， 4230min， 995min， 45min。 反应结束后冰浴5min。 0066 根据人的 BLyS 的全长 DNA 序列， 设计合成克隆分泌型 BLyS 引物 P1 和 P2， 以逆转 说 明 书 CN 103421113 A 9 7/11 页 10 录合成的 cDNA 为模板， 以上游引物 P1 和下游引物 P2 进行 PCR 扩增。其中 P1 和 P2 为的核 苷酸序列如下 ： 0067 P1 ： 5 tacgaagctt gcatcatcat catcatcatg gcggcggctc cggcggcggc tcccc。

38、gttca gggtccagaa gaa ； 0068 P2 ： 5 cgacgtcgac tcacagcagt ttcaatgcac caaaaaatgt gacatc。 0069 PCR 扩增反应体系为 ： 0070 0071 加入灭菌蒸馏水补足体系总量 50L。 0072 PCR 反应程序为 ： 0073 0074 将 PCR 扩增产物凝胶电泳回收， 用 Sal I 和 Hind III 双酶切， 克隆到 pCDNA3.1 真核表达质粒系统， 以空白载体转化质粒作对照， 转染 293T 细胞 （中国典型培养物保藏中 心） 3 天后， 收集培养基上清液， 所得上清通过 His 亲和层析纯化。

39、得到 his-hBLyS 纯化蛋白， SDS-PAGE 检测， 结果见图 1。 0075 由图 1 结果可见， 本发明所述重组质粒有蛋白表达， 但是空白载体重组质粒却没 有明显蛋白表达条带。 本发明所述重组质粒蛋白大小约为23Kb， 与根据人BLyS氨基酸序列 推断的分子量 23Kb 接近。 0076 实施例 2 ： 检测与 BJAB 细胞上受体结合的能力 0077 1、 生物素标记 his-hBLyS 重组蛋白 0078 将实施例 1 纯化得到 his-hBLyS 重组蛋白与溶解于 DMSO 中的生物素 -xx-NHS 按 ng/mL计以14的重量体积比混合， 室温放置1小时， 将反应混合物。

40、通过凝胶柱， 分离生物 素标记的 his-hBLyS 和游离生物素。 0079 2、 生物素标记 his-hBLyS 重组蛋白与 BJAB 细胞结合 0080 将分离得到的生物素标记的 his-hBLyS 重组蛋白分为 25ng/mL、 50ng/mL、 100ng/ mL 和 200ng/mL 四个不同浓度组， 分别与 1106的伯基特淋巴瘤细胞 （BJAB） 细胞混合， 在 4 摄氏度孵育 15 分钟， PBS 洗涤 3 次， 加入 straptavidin allophycocyanin(SA-APC) 使其 终浓度为 0.2g/mL， 在 4孵育 20 分钟。以 PBS 洗涤 3 次后。

41、上细胞流式仪检测， 检测结果 说 明 书 CN 103421113 A 10 8/11 页 11 见图 2。 0081 由图 2 结果可见， 生物素标记的重组人 BLyS 蛋白在不同浓度下均可以和 BJAB 细 胞结合。 0082 实施例 3 ： 免疫小鼠 0083 将实施例 1 纯化得到 his-hBLyS 重组蛋白作为抗原与等量免疫佐剂 （福氏佐剂） 混 合， 取 4 只 6 周大雌性 FVB 小鼠， 其中 3 只进行免疫， 另一只进行对照模拟实验。在初次免 疫以后， 每一周进行一次加强免疫。在最后一针加强免疫前， 从免疫的小鼠心脏取血， 将其 血清中与生物素标记的 his-hBLyS 重。

42、组蛋白 （浓度 50ng/mL） 混合并在室温孵育 20 分钟。 然后将混合物与 BJAB 细胞在 4孵育 15 分钟， 以生理盐水洗脱 3 次后， 加入 0.2g/mL 的 straptavidin allophycocyanin 并在 4孵育 15 分钟。以生理盐水洗脱 3 次后， 将样品上 流式细胞仪检测所免疫小鼠的血清其是否可以抑制 BLyS 和其受体 BR3-Fc 结合， 结果见图 3。 0084 由图 3 结果可见三只免疫小鼠中小鼠 1 所取得血清可有效抑制生物素标记的 his-hBLyS重组蛋白与BJAB细胞结合， 所以选取小鼠1作为后续实验个体， 进行下一步融合 实验。 008。

43、5 实施例 4 ： 细胞融合与单克隆杂交瘤细胞筛选 0086 在最后一针加强免疫后， 取小鼠大腿根处淋巴结， 在生理盐水中碾磨后取富含 B 细胞的悬浮液， 按常规方法电转与骨髓瘤细胞 SP2/0 融合。将融合细胞分配于 96 孔盘， 在 含有HAT的RPMI-1640完全培养基中置于5%CO2、 37条件下培养。 在不同单克隆杂交瘤细 胞中， 通过酶标反应， 筛选出 211 个分泌的抗体可结合 BLyS 蛋白的克隆。 0087 将可结合 BLyS 蛋白的 211 个克隆产生的抗体分别与生物素标记的 his-hBLyS 重 组蛋白混合室温孵育 20 分钟。然后将混合物与 BJAB 细胞在 4孵育。

44、 15 分钟， 以生理盐水 洗脱 3 次后， 加入 0.2g/mL 的 straptavidin allophycocyanin 并在 4孵育 15 分钟。以 生理盐水洗脱 3 次后， 将样品上流式细胞仪检测以筛选可以抑制生物素标记的 his-hBLyS 重组蛋白和 BJAB 细胞结合的单克隆杂交瘤细胞。结果共有 11 个单克隆杂交瘤细胞分泌的 抗体可以不同程度的抑制生物素标记的 his-hBLyS 重组蛋白与 BJAB 上 BLyS 受体结合， 如 表1所示， 其中命名为1D12、 2B10、 2G3、 5A5和13G8的单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体比3H9， 1D7， 4D3 的单克隆杂交瘤。

45、细胞分泌的抗体有更强的抑制力。1D12、 2B10、 2G3、 5A5 和 13G8 的 检测结果见图 4-6。 0088 表 1 抑制生物素标记的 his-hBLyS 重组蛋白 0089 与 BJAB 上 BLyS 受体结合的细胞分泌的抗体亚型 0090 克隆 亚型 1 1D12 IgG2b/kappa 2 2B10 IgG2b/kappa 3 2G3 IgG2a/kappa 4 5A5 IgG3/kappa 5 13G8 IgG2a/kappa 6 1D7 IgG2a/kappa 7 2A9 IgG1/kappa 8 4D3 IgG2a/kappa 说 明 书 CN 103421113 A。

46、 11 9/11 页 12 9 5E5 IgG3/kappa 10 5F4 IgG1/kappa 11 5H5 IgG2b/kappa 0091 实施例 5 ： 检验与其它肿瘤坏死因子 （TNF） 家族蛋白的结合 0092 为进一步检验候选抗体的结合特异性， 分别在 96 孔酶标板加入上 1g/mL 的 his-hBLyS 重组蛋白、 肿瘤坏死因子 - （TNF-） 、 肿瘤坏死因子 （TNF-） 和 BSA， 在 0.05M PH9.0 的碳酸盐包被缓冲液中， 4静置过夜。次日， 弃去孔内溶液， 用洗涤缓冲液洗 3 次。 然后加入含有 3%BSA 的 PBS 溶液封闭 20 分钟。用洗涤缓冲。

47、液洗 3 次后加入 100L 稀 释后的 1D12、 2B10、 2G3、 5A5 和 13G8 单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体， 室温孵育 1 小时后用 洗涤缓冲液冲洗 3 次， 用洗涤缓冲液以 1 10000 倍稀释辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,HRP）交联羊抗小鼠抗体， 室温孵育 1 小时， 经洗涤缓冲液冲洗 3 次后， 加入 50L 3,3 ,5,5 - 四甲基联苯胺 （3,3 ,5,5 -Tetramethylbenzidine， TMB） 底物溶 液显色， 室温反应 10 分钟后， 以 25L 0.5M 的硫酸溶液终止反应并在 450nm 处读出吸光 。

48、度， 统计结果见图 7。 0093 由图 7 结果可见， 1D12、 2B10、 2G3、 5A5 和 13G8 单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体均识 别结合 BLyS， 但它们均不识别 TNF- 或者 TNF-。 0094 实施例 6 ： 单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体可变区序列的确定 0095 将筛选获得的单克隆杂交瘤细胞 1D12、 2B10、 2G3、 5A5 和 13G8 进行培养， 1000rpm 离心收集细胞， 按实施例 1 所述方法提取的各杂交瘤细胞 RNA 反转录合成 cDNA 第一链。以 合成 cDNA 第一链为模板扩增杂交瘤细胞所对应的可变区 DNA 序列。扩增反应中所使用的 引物。

49、序列如下 ： 0096 重链扩增所需引物 ： 0097 引物 1 ： 5 atg g(ag)a tg(cg)agctg(tg)gt(ca)at(cg)ctc tt ； 0098 引物 2 ： 5 ggg gatatc cacc atg(ag)ac ttc ggg(tc)tg agc t(tg)g gtt tt ； 0099 引物 3 ： 5 ggg tatatc cacc atg gct gtc ttg gggctg ctcttct ； 0100 轻链扩增所需引物 ： 0101 引物 1 ： 5 atg gag aca gac aca ctcctgctat ； 0102 引物 2 ： 5 atg gattttcaa gtg c。