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1、(10)申请公布号 CN 103451284 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451284 A *CN103451284A* (21)申请号 201310370253.3 (22)申请日 2013.08.22 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/12(2006.01) (71)申请人 中国科学院生物物理研究所 地址 100101 北京市朝阳区大屯路 15 号 (72)发明人 刘光慧 顾颖 胡安卡洛斯伊斯毕华贝尔蒙特 曲静 杨济平 张维琦 任若通 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代。
2、理人 关畅 (54) 发明名称 一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应 用 (57) 摘要 本发明公开了一组人类心肌细胞的新型分子 标记物及其应用。 该组标记物由如下29种基因组 成 ： POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。本发。
3、明的标记物在心肌细胞 的筛选和鉴定上具有重要作用， 并且在人类心脏 早期发育研究、 心脏疾病模型构建、 心脏疾病的治 疗以及心脏疾病药物靶点的开发或药物研发中都 具有潜在的作用与极大的意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书12页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103451284 A CN 103451284 A *CN103451284A* 1/2 页 2 1. 一组用于鉴定或辅助鉴定人类心肌细胞的标记物， 由如下 29 种基因组成 ： POPDC2、 ALPK。
4、2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2 ； 所述 29 种基因满足如下条件 ： 与人类胚胎多能干细胞和 / 或人类神经干细胞相比， 在 人类心肌细胞中该29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平均显著降低、 且在人类心肌细胞 中该 29 种基因的 mRNA 表。
5、达量均显著提高。 2. 根据权利要求 1 所述的标记物， 其特征在于 ： 所述该 29 种基因的启动子区 CpG 岛甲 基化水平均显著降低是指在人类心肌细胞中每种基因的启动子区 CpG 岛甲基化的量均比 人类胚胎多能干细胞和/或人类神经干细胞中相同基因的启动子区CpG岛甲基化的量降低 5% 以上 ； 所述该 29 种基因的 mRNA 表达量均显著提高是指在人类心肌细胞中每种基因的 mRNA 表达量均是人类胚胎多能干细胞和 / 或人类神经干细胞中相同基因 mRNA 表达量的 2 倍以 上。 3. 权利要求 1 或 2 所述标记物在鉴定人心肌细胞中的应用， 所述应用为非疾病治疗或 诊断方法 ； 或。
6、， 权利要求 1 或 2 所述标记物在制备、 开发或设计鉴定人心肌细胞的产品中的应用。 4. 权利要求 1 或 2 所述标记物在从人心肌细胞、 人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中 鉴定出人心肌细胞中的应用 ； 或， 权利要求 1 或 2 所述标记物在从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌 细胞中的应用。 5. 权利要求 1 或 2 所述标记物在制备、 开发或设计具有如下功能的产品中的应用 ： 从 人心肌细胞、 人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞 ； 或， 权利要求 1 或 2 所述标记物在制备、 开发或设计具有如下功能的产品中的应用 ： 从 人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定。
7、出人心肌细胞。 6. 根据权利要求 3-5 任一所述的应用， 其特征在于 ： 所述人心肌细胞是由所述人胚胎 多能干细胞分化而来的 ； 所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。 7. 检测 29 种基因的启动子区 CpG 岛甲基化水平的物质和检测 29 种基因的 mRNA 表达 量的物质在制备鉴定人类心肌细胞的试剂盒中的应用 ； 所述 29 种基因为 POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2。
8、L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。 8. 检测 29 种基因的启动子区 CpG 岛甲基化水平的物质和检测 29 种基因的 mRNA 表达 量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用 ： 从人心肌细胞、 人胚胎多能干细胞和人 神经干细胞中鉴定出人心肌细胞 ； 所述 29 种基因为 POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN。
9、、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。 9. 检测 29 种基因的启动子区 CpG 岛甲基化水平的物质和检测 29 种基因的 mRNA 表达 权 利 要 求 书 CN 103451284 A 2 2/2 页 3 量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用 ： 从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴 定出人心肌细胞 ； 所述 29 种基因为 POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 。
10、HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。 10. 根据权利要求 7-9 任一所述的应用， 其特征在于 ： 所述人心肌细胞是由所述人胚胎 多能干细胞分化而来的 ； 所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。 权 利 要 求 书 CN 103451284 A 3 1/12 页 4 一组人类心肌细胞的。
11、新型分子标记物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应用。 背景技术 0002 心脏病是威胁人类健康的杀手， 每年都有上千万人因罹患各类心脏疾病失去生 命， 给家庭和公共卫生事业带来了极大的压力和负担。 无论在发达国家还是发展中国家， 心 脏病的发病率和病死率都居高不下， 然而面对如此严峻的考验， 目前心脏疾病的治疗却不 容乐观， 药物治疗停留在缓解症状的阶段， 手术治疗如搭桥手术等开支较大且存在一定的 风险和可能的副作用， 介入治疗也仍处于探索阶段， 鲜有标本兼治的治疗方法问世。 究其原 因， 很大一方面是人类对心脏以及心脏疾病认识的不足。心脏疾病的病因。
12、追根溯源是心肌 细胞的缺失或功能的紊乱。 因而未来根治心脏疾病的一个思路便是研究心脏病的分子致病 机理， 寻找影响心脏纤维化或者心肌细胞增殖的决定性因子， 实现对紊乱的心肌细胞进行 人为调控使其恢复正常功能的目的 （1） 。 0003 近年来， 随着诱导型多能干细胞 （induced Pluripotency Stem Cells， iPSCs） 技 术的产生， 人们能够在体外获得 iPSCs 并分化为病人特异的心肌细胞， 通过基因矫正或其 他手段得到 “健康” 的病人来源的心肌细胞 （1） ； 利用转分化 （transdifferentiation） 技术 可以不经过 iPSCs 过程由其他。
13、便于获得的细胞类型直接获得心肌细胞 （2） ， 这些技术的发 展为将来实现在病人体内的细胞移植治疗提供了可能。 0004 1.Mordwinkin NM,Burridge PW,Wu JC.2013.A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery,cardiotoxicity screening,and publication standards.Journal of cardiovascular translational research6:2。
14、2-30. 0005 2.Wada R,Muraoka N,Inagawa K,Yamakawa H,Miyamoto K,Sadahiro T,Umei T,Kaneda R,Suzuki T,Kamiya K,Tohyama S,Yuasa S,Kokaji K,Aeba R,Yozu R,Yamagishi H,Kitamura T,Fukuda K,Ieda M.2013.Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.Proceedings of the National 。
15、Academy of Sciences110 ： 12667-12672. 发明内容 0006 本发明的目的是提供一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应用。 0007 本发明提供的一组用于鉴定或辅助鉴定人类心肌细胞的标记物， 由如下 29 种基 因组成 ： POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 。
16、MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。 0008 所述 29 种基因满足如下条件 ： 与人类胚胎多能干细胞和 / 或人类神经干细胞相 比， 在人类心肌细胞中该 29 种基因的启动子区 CpG 岛甲基化水平均显著降低、 且在人类心 说 明 书 CN 103451284 A 4 2/12 页 5 肌细胞中该 29 种基因的 mRNA 表达量均显著提高。 0009 上述标记物中， 所述该29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平均显著降低是指在 人类心肌细胞中每种基因的启动子区CpG岛甲基化的量均比人类胚胎多能干细胞和/或人 类神经干细胞中相同基因的启动子区 CpG 岛甲基化。
17、的量降低 5% 以上。 0010 所述该 29 种基因的 mRNA 表达量均显著提高是指在人类心肌细胞中每种基因的 mRNA 表达量均是人类胚胎多能干细胞和 / 或人类神经干细胞中相同基因 mRNA 表达量的 2 倍以上。 0011 上述任一所述标记物在鉴定人心肌细胞中的应用也属于本发明的保护范围。 0012 上述应用中， 所述应用为非疾病治疗或诊断方法。 0013 上述任一所述标记物在制备、 开发或设计鉴定人心肌细胞的产品中的应用也属于 本发明的保护范围。 0014 上述任一所述标记物在从人心肌细胞、 人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定 出人心肌细胞中的应用也属于本发明的保护范围。 001。
18、5 上述任一所述标记物在从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞 中的应用也属于本发明的保护范围。 0016 上述任一所述标记物在制备、 开发或设计具有如下功能的产品中的应用也属于本 发明的保护范围 ： 从人心肌细胞、 人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞。 0017 上述任一所述标记物在制备、 开发或设计具有如下功能的产品中的应用也属于本 发明的保护范围 ： 从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞。 0018 上述任一所述的应用中， 所述人心肌细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来 的 ； 所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。 0019 检测 29。
19、 种基因的启动子区 CpG 岛甲基化水平的物质和检测 29 种基因的 mRNA 表 达量的物质在制备鉴定人类心肌细胞的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。 0020 所述 29 种基因为 POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。 。
20、0021 检测 29 种基因的启动子区 CpG 岛甲基化水平的物质和检测 29 种基因的 mRNA 表 达量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围 ： 从人心肌细 胞、 人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞。 0022 所述 29 种基因为 POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKRD1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf5。
21、2、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。 0023 检测 29 种基因的启动子区 CpG 岛甲基化水平的物质和检测 29 种基因的 mRNA 表 达量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围 ： 从人心肌细 胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞。 0024 所述 29 种基因为 POPDC2、 ALPK2、 TRIM55、 ASPH、 FILIP1、 HSPB7、 NPPA、 KBTBD10、 MYL4、 CRYAB、 LRRN4、 MYOZ2、 OBSCN、 SMPX、 NRK、 ABLIM1、 SYNPO2L、 ANKR。
22、D1、 TNNI1、 MYH6、 ABRA、 TPM1、 C15orf52、 MYOM1、 MASP1、 MYBPC3、 TNS1、 FLNC、 F2RL2。 0025 上述任一所述应用中， 所述人心肌细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的 ； 说 明 书 CN 103451284 A 5 3/12 页 6 所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。 0026 上述任一所述应用中， 所述由人胚胎多能干细胞分化而来的人心肌细胞中和所述 由人胚胎多能干细胞分化而来的人神经干细胞中， 所述人胚胎多能干细胞为同一株系的人 胚胎多能干细胞。 0027 由于 H9-ESC， H9-NSC 及 H。
23、9-CM 具有完全相同的基因型与遗传背景， 将 H9-ESC 或 H9-NSC 作为对照， 进行转录组及全基因组 DNA 甲基化分析具有严格的无偏见性。通过大规 模比较 H9-ESC， H9-NSC 及 H9-CM 的基因表达谱和全基因组 DNA 甲基化谱， 筛选出 29 种新型 分子标记物。本发明涉及的新型分子标记物在心肌细胞的筛选和鉴定上具有重要作用， 并 且在心脏疾病模型构建、 心脏疾病的治疗以及心脏疾病药物靶点开发或药物研发中都具有 潜在的作用与极大的意义。 附图说明 0028 图 1 为人类心肌细胞的鉴定。 0029 图 2 为人类胚胎多能干细胞、 人类神经干细胞和人类心肌细胞基因表。
24、达热图以及 qPCR 验证。 0030 图 3 为人类胚胎多能干细胞、 人类神经干细胞和人类心肌细胞中全基因组启动子 区 CpG 岛甲基化水平热图。 0031 图4为编码心肌结构蛋白与心脏转录因子的基因的DNA去甲基化与基因表达水平 正相关性分析。 0032 图 5 为双核心稳定调控网络。 0033 图 6 为功能相关性网络分析。 0034 图 7 为基因 - 疾病网络分析。 具体实施方式 0035 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0036 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0037 人类胚胎多能干细胞系 H9 购自美国 Wi。
25、Cell Research Institute， 货号为 WA09(H9)-DL-7 ； 0038 丝裂霉素购自美国 Sigma 公司， 货号为 M0503 ； 0039 小鼠胚胎成纤维细胞购自美国 Millipore 公司， 货号为 PMEF-CFL ； 0040 细胞外基质 (qualified-Matrigel) 购自美国 BD Biosciences， 货号为 354277 ； 0041 DMEM/F12 培养基购自 Invitrogen 公司， 货号为 11320-033 ； 0042 CDF12 培养基配方如下 ： 0043 DMEM/F12( 购 自 Invitrogen， 货 。
26、号 为 11320-033)、 0.1mM 非 必 需 氨 基 酸 ( 购 自 Invitrogen， 货 号 为 11140-050)、 1mM GlutaMAXTM 二 肽 ( 购 自 Invitrogen， 货 号 为 35050-061)、 20%Knockout血清替代物(购自Invitrogen， 货号为N10828-028)、 1%青霉素/ 链霉素 ( 购自 Invitrogen， 货号为 15070-063)、 55M- 巯基乙醇 ( 购自 Invitrogen， 货 号为 21985-023) 和 10ng/ml Human FGF2( 购自 Joint Protein Ce。
27、ntral) ； 0044 RPMI1640 培养基购自 Invitrogen 公司， 货号为 11875119 ； 说 明 书 CN 103451284 A 6 4/12 页 7 0045 B27 添加剂购自 Invitrogen 公司， 货号为 0080085SA ； 0046 B27（不含 Insulin） 添加剂购自 Invitrogen 公司， 货号为 0050129SA ； 0047 mTeSR 培养基购自美国 StemCell Technologies ； 0048 ROCK 抑制剂 Y-27632 购自 Sigma-Aldrich， 货号为 Y0503 ； 0049 CHIR9。
28、9021 购自 Selleck ； 0050 Wnt 抑制剂 IWP4 购自 Stemgent ； 0051 Triton X-100 购自 Sigma， 货号 T-8787 ； 0052 鼠抗 cTnT 购自 Lab Vision ； 0053 鼠抗 MF20 购自 Developmental Studies Hybridoma Bank ； 0054 兔抗 MLC2v 购自 ProteinTech Group ； 0055 鼠抗 -Actinin 购自 Sigma-Aldrich ； 0056 二抗 Alex Fluor488goat anti-mouse IgG 购自 Life Tech。
29、nologies ； 0057 二抗 Alex Fluor568goat anti-rabbit IgG 购自 Life Technologies ； 0058 人类胚胎多能干细胞系 H9 来源的神经干细胞 （hNSCs） 及分化方案在文献 “Liu GH,Qu J,Suzuki K,Nivet E,Li M,Montserrat N,Yi F,Xu X,Ruiz S,Zhang W,Wagner U,Kim A,Ren B,Li Y,Goebl A,Kim J,Soligalla RD,Dubova I,Thompson J,Yates J,3rd,Esteban CR,Sancho-Mar。
30、tinez I,Izpisua Belmonte JC.2012.Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature491:603-607.” 中公开过， 公众可从中国科学院生物物理研究所获得人类胚胎多能 干细胞来源的神经干细胞 （hNSCs） ； 0059 RNeasy Mini Kit 购自 QIAGEN ； 0060 AffymetrixGeneChipPrimeView Human Gene Expression Arrays 购自 Affymetrix， 货号为 。
31、901837。 0061 实施例 1、 人类胚胎多能干细胞的培养 0062 将人类胚胎多能干细胞系 H9 利用如下方法进行培养 ： 0063 一、 将 H9 细胞接种至预先培养了经过丝裂霉素灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的培 养板中， 使用人类多能干细胞培养基 (CDF12 培养基 ) 与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养。 0064 二、 用DMEM/F12培养基将细胞外基质稀释至体积分数为1%的浓度， 并用稀释后的 细胞外基质包被培养板。 0065 三、 将步骤一培养的 H9 细胞接种至预先用体积分数为 1% 的细胞外基质包被的培 养板中， 使用 mTeSR 培养基培养。 0066 实施例 2、 人类胚。
32、胎多能干细胞向人类心肌细胞分化 0067 人类胚胎多能干细胞系 H9 向人类心肌细胞分化方案基于 Palecek 方案 （Lian X,Hsiao C,Wilson G,Zhu K,Hazeltine LB,Azarin SM,Raval KK,Zhang J,Kamp TJ,Palecek SP.2012.Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the Nat。
33、ional Academy of Sciences of the United States of America109:E1848-1857.） 进行改进， 改进后的方案进一步提高了人类心肌细胞的纯度 , 该方案的具体步骤如下 ： 说 明 书 CN 103451284 A 7 5/12 页 8 0068 一、 用DMEM/F12培养基将细胞外基质稀释至体积分数为1%的浓度， 用稀释后的细 胞外基质包被培养板。 0069 二、 将人类胚胎多能干细胞系 H9 消化为单细胞悬液， 以 105个细胞 /cm2的密度接 种到经体积分数为1%的细胞外基质包被的培养板中， 添加含有10M ROCK抑制剂Y。
34、-27632 的 mTeSR 培养基。37、 5% 二氧化碳条件下培养 24 小时， 然后改用 mTeSR 培养基继续培养 48 小时。 0070 三、 起始心肌细胞的分化。 0071 （一） 在第 1 天换用含有 12M CHIR99021 的 RPMI/B27-insulin 培养基培养 24 小 时， 24 小时后更换为 RPMI/B27-insulin 培养基继续培养。 0072 （二） 第3天换用含有5M Wnt抑制剂IWP4的RPMI/B27-insulin培养基培养48h， 期间不换液。 0073 （三） 从第 5 天起每隔 2-3 天更换 RPMI/B27 培养基继续培养。 0。
35、074 （四） 第 15 天， 将肉眼可见的可自主收缩的人类心肌细胞薄片或团块通过机器分选 或人工挑取进行收集。 0075 （五） 将收集的细胞重新接种到经体积分数为 1% 的细胞外基质包被的培养板中， 用 RPMI/B27 培养基进行培养。 0076 实施例 3、 人类心肌细胞的鉴定 0077 人类胚胎多能干细胞来源的人类心肌细胞不仅在形态上表现出心肌细胞特有的 收缩功能， 并且可以进一步通过免疫荧光及流式细胞术对心肌细胞特异性的生物学标记进 行鉴定。 0078 一、 免疫荧光鉴定 0079 （一） 将实施例 2 得到的人类心肌细胞分为四组， 各组分别经 4% 多聚甲醛固定， 0.3%Tri。
36、ton X-100/PBS 通透。然后四组分别与四种一抗 （鼠抗 cTnT, 鼠抗 MF20, 兔抗 MLC2v, 鼠抗 -Actinin） 4孵育过夜。将一抗清洗后于室温进行二抗孵育 1 小时， 其 中第一组使用的二抗为 Alex Fluor488goat anti-mouse IgG， 第二组使用的二抗为 Alex Fluor488goat anti-mouse IgG， 第三组同时使用二抗Alex Fluor488goat anti-mouse IgG 和二抗 Alex Fluor568goat anti-rabbit IgG 进行孵育。 0080 （二） 细胞核用 DAPI 进行负染。。
37、激光共聚焦显微镜采集图像进行分析。 0081 cTnT 为心肌肌钙蛋白 T（cardiac troponin T） ； 0082 MF20 为肌球蛋白重链 ； 0083 MLC2v 为肌球蛋白轻链 2v(myosin light chain2V) ； 0084 -Actinin 为肌动蛋白。 0085 结果如图 1A 所示。 0086 图 1A 中， 1（a-c） 表示 cTnT 在不同放大倍率下的染色结果， 2（a-c） 表示 MF20 在 不同放大倍率下的染色结果， 3a 表示 -Actinin 的染色结果， 3b 表示 MCL2v 的染色结果， 3c 为 3a 和 3b 重叠的结果。 0。
38、087 结果表明， 人类胚胎多能干细胞来源的人类心肌细胞能够表达心肌特异的标记物 心肌肌钙蛋白 T（cardiac troponin T） 和肌球蛋白， 通过对肌球蛋白和肌动蛋白的免疫荧 光染色可观察到心肌纤维结构。 说 明 书 CN 103451284 A 8 6/12 页 9 0088 二、 流式细胞术鉴定 0089 结果如图 1B 所示。 0090 图 1B 表明， 分化得到的人类心肌细胞群中大约 96% 是 cTnT 阳性细胞， 大约 91% 是 MF20 阳性的细胞。 0091 实施例 4、 转录组分析 0092 一、 设置三组样品 ： 人类胚胎多能干细胞 （hESCs） H9（以下。
39、简称为 H9-ESC） ， 人类胚 胎多能干细胞系 H9 来源的神经干细胞 （hNSCs） （以下简称为 H9-NSC） 以及实施例 3 鉴定出 的人类胚胎多能干细胞系 H9 来源的人类心肌细胞 （hCMs）（以下简称为 H9-CM） ， 每组细胞样 品共设三个平行。 0093 二、 使用Trizol法提取各组细胞各样品的总RNA， 并使用RNeasy Mini Kit进一步 纯化。 0094 三、将 三 组 细 胞 的 样 品 用 “AffymetrixGeneChipPrimeView Human Gene Expression Arrays” 基因芯片处理。 0095 四、 表达差异比较。
40、 0096 分析比较各组细胞中不同基因在 H9-ESC、 H9-NSC 及 H9-CM 中的表达情况。由 AffymetrixGeneChip Scanner30007G 采集基因芯片的表达信号。利用 R/Bioconductor 处 理表达信号， 根据 RMA 算法归一化后转换为对应的基因表达值， 并绘制 H9-ESC、 H9-NSC 和 H9-CM 三种细胞各 3 份样品的表达热图 （heatmap） ， 结果如图 2A 所示。 0097 图 2A 中， 0098 hESC 1、 hESC 2 和 hESC 3 分别为 H9-ESC 的三个平行样品 ； 0099 hNSC 1、 hNSC 。
41、2 和 hNSC 3 分别为 H9-NSC 的三个平行样品 ； 0100 hCM 1、 hCM 2 和 hCM 3 分别为 H9-CM 的三个平行样品 ； 0101 1/4x 表示基因的表达水平下调到 4 倍 ； 0102 1/2x 表示基因的表达水平下调到 2 倍 ； 0103 1x 表示基因的表达水平无显著变化 ； 0104 2x 表示基因的表达水平上调到 2 倍 ； 0105 4x 表示基因的表达水平上调到 4 倍。 0106 图中是以人胚胎干细胞 H9-ESC 作为基因上调和下调的标准。 0107 经过分析， 与基因在 H9-ESC 和 H9-NSC 中的表达量相比， 共有 695 个。
42、基因在 H9-CM 中的表达量同时是 H9-ESC 和 H9-NSC 中的表达量的 2 倍以上， 共有 401 个基因在 H9-CM 中 的表达量均不足 H9-ESC 和 H9-NSC 中的表达量的一半。 0108 五、 实时荧光定量 PCR 验证关键基因的表达结果， 表 1 为各关键基因的引物。其中 部分结果如图 2B 所示， 验证结果与芯片分析得到的结果一致。 0109 表 1 验证引物 0110 基因正向引物序列 (5 -3 )反向引物序列 (5 -3 ) ACTA2GTGTTGCCCCTGAAGAGCATGCTGGGACATTGAAAGTCTCA 说 明 书 CN 103451284 。
43、A 9 7/12 页 10 CASQ2GGCAGAAGAGGGGCTTAATTTGAAGACACCGGCTCATGGTAG CREMACACCACCTAGTATTGCTACCAGGATTGTTCCACCTTGGGCTAT CSRP3CCTGTGAAAAGACCGTCTACCGTCGTGCTGTCAAGAGCCT DTNATACCCACGGAAGTTTTGGAGGGGATCTGACATAAGCGTGTCC EYA4CTTCTTGCAGTCAAAACAGAGCGTGGATAGGGCTTGGAAGGAT FBXO32GCCTTTGTGCCTACAACTGAACTGCCCTTTGTCTGACAGAAT。
44、 GATA4CGACACCCCAATCTCGATATGGTTGCACAGATAGTGACCCGT GATA5CTTCGTGTCCGACTTCTTGGACCGAGGCATTCCTTGTGGA GATA6CTCAGTTCCTACGCTTCGCATGTCGAGGTCAGTGAACAGCA HAND2CGCCGACACCAAACTCTCCTCGCCATTCTGGTCGTCCT HECW2AAATCCCCAGATGCGGTACACCGGCTCTCAGAAGTCACCA ISL1GCGGAGTGTAATCAGTATTTGGAGCATTTGATCCCGTACAACCT KCNA5CGCGTCCACATCAA。
45、CATCTCGGTAGAAGCGTATCTCGTCCG LBHGCCCCGACTATCTGAGATCGGCGGTCAAAATCTGACGGGT LDB3CTATCTCCCGGATCACACCAGGTGAGGCTCAAGTTGTAGCTG LEFTY2TGGACCTCAGGGACTATGGAGCCGAGGCGATACACTGTCG MARCH11CCGGGGAGAGTCTTCCACAGCCTCATCCGATTGAACAGGT MEF2AACTACAGACCTCACAGTGCCAGCCTAAGCTATTTGCACCAGT MEF2CCCAACTTCGAGATGCCAGTCTGTCGATGTGTTA。
46、CACCAGGAG 0111 MIR21CTGCCTGACTGTCTGCTTGTTTAGATTCAACAGTCAACATCAGTCTGA MITFCAGTCCGAATCGGGGATCGTGCTCTTCAGCGGTTGACTTT MYBPC3CCATGACGCTGAGGTCAAATGGCTTGGCACCGATGGACTC MYOCDACGGATGCTTTTGCCTTTGAAAACCTGTCGAAGGGGTATCTG 说 明 书 CN 103451284 A 10 8/12 页 11 MYOZ2CCAGGCTATTTAAGATGCGTCACCTTCCAAGTTACTTCCATCCAC NEXNAC。
47、TGTGAAGGGTAGATTTGCTGTTCTGCGTTTTCGTTCCTCCT NKX2CCAAGGACCCTAGAGCCGAAATAGGCGGGGTAGGCGTTAT NPPACAACGCAGACCTGATGGATTTAGCCCCCGCTTCTTCATTC NPPBTGGAAACGTCCGGGTTACAGCTGATCCGGTCCATCTTCCT PCGF5AGCCAACAACAGTGACGGAATTGAACTTGGTTGCCACACCTT PLNACCTCACTCGCTCAGCTATAACATCACGATGATACAGATCAGCA PPAPDC3AGCTGAACCCCTCCTTCAAG。
48、CCGATGACAAAGCCGGAGA PPARGC1ATCTGAGTCTGTATGGAGTGACATCCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA PRICKLE1TTTGCTTGCTTACCAGAGGAAAACTGGCAATACCGTACCTCAT RARBTCCGAAAAGCTCACCAGGAAAGGCCAGTTCACTGAATTTGTCC SMAD6GCTACCAACTCCCTCATCACTCGTACACCGCATAGAGGCG SMAD7TTCCTCCGCTGAAACAGGGCCTCCCAGTATGCCACCAC SNTA1TGCTCCTCTACTTGTCTCTCCTCTGCATCG。
49、TAGGGCACTGA STAT4TGTTGGCCCAATGGATTGAAAGGAAACACGACCTAACTGTTCAT TBX2GCTGACGATTGCCGCTATAAGGGCTGTCTGGGTGGATGTA TCEA3AAGAGCACGGACATGAAGTACCCTCTGCCGTCATCTTGGCTA TNNT2GGAGGAGTCCAAACCAAAGCCTCAAAGTCCACTCTCTCTCCATC TRIM63CTTCCAGGCTGCAAATCCCTAACACTCCGTGACGATCCATGA TTNCCCCATCGCCCATAAGACACCCACGTAGCCCTCTTGCTTC XPO4ATTTCAGCGTTACCTTGCACTCAGCACATTTTGCGAGGAT。