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1、(10)申请公布号 CN 103468641 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103468641 A *CN103468641A* (21)申请号 201310452172.8 (22)申请日 2013.09.28 C12N 5/0783(2010.01) (71)申请人 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 地址 266111 山东省青岛市青岛高新技术产 业开发区锦业路 1 号中小企业孵化器 A5 三层 305-306 (72)发明人 徐矫健 孙威 (54) 发明名称 一种癌性胸腹水来源的 TIL 细胞的高效扩增 方法 (57) 摘要 本发明目的是提供一种癌性胸腹水来源的 TIL。
2、 细胞的高效扩增方法， 本发明所制备出的 TIL 细胞具有增殖速度快、 细胞数量大、 细胞活性高 等特点。本发明的主要特点是 ： 利用层粘连蛋白 和纤维连接蛋白包被的培养瓶对 TIL 进行培养， 这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状 态， 从而利于细胞接受各种因子的刺激， 并且这两 种蛋白本身就有对 TIL 细胞增殖的促进作用 ； 而 抗 OX-40 单克隆抗体的使用可以刺激 TIL 细胞中 CD3+CD8+T 细胞亚群的共刺激信号， 促进细胞的活 化， 提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达， 增强其杀伤 能力。到目前为止， 仍未见有将层粘连蛋白、 纤维 连接蛋白和抗 OX-40 单克隆抗体联合应。
3、用于 TIL 细胞制备的研究报道， 本发明首次提供出一种在 TIL 细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞 数量和杀伤活性的方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103468641 A CN 103468641 A *CN103468641A* 1/1 页 2 1. 一种 TIL 细胞的培养方法， 包括如下的步骤 ： 1) 将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后， 加入到细胞培养瓶中包被 ； 2) 将从胸腹水分离得到的 TIL 细胞用培养液重悬后， 接种。
4、到包被后的培养瓶中 ； 添加 IL-2 刺激 ； 3)培养4天后， 将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养， 并添加抗OX-40单克 隆抗体 ； 4) 持续扩大培养至第 20 天时， 完成高效 TIL 细胞的培养。 2. 如权利要求 1 所述的培养方法， 其特征在于所述的步骤 2） 中的培养液， 其配方组 成如下 : 氯化钙 40mg/ml、 氯化钾 300mg/ml、 硫酸镁 120mg/ml、 氯化钠 5000mg/ml、 磷酸 二氢钾 300mg/ml、 碳酸氢钙 1200mg/ml、 氨基酸 1365mg/ml、 维生素 21.4mg/ml、 微量元素 0.93126mg/ml、 。
5、白蛋白 450mg/ml、 胰岛素 8mg/ml、 亚油酸 0.4mg/ml、 油酸 5mg/ml、 谷胱甘肽 2.5mg/ml、 双甘氨肽mg/ml、 次黄嘌呤0.8mg/ml、 硫辛酸0.1mg/ml、 丙酮酸150mg/ml、 葡萄糖 1500mg/ml、 胸腺嘧啶 0.12mg/ml。 3. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于所述的氨基酸的配比如下 ： 8 份丙氨酸、 40份天冬氨酸、 10份胱氨酸、 4份谷氨酸、 12份甘氨酸、 4份组氨酸、 80份异亮氨酸、 4份亮氨 酸、 4份赖氨酸、 20份蛋氨酸、 20份苯丙氨酸、 25份脯氨酸、 4份丝氨酸、 8份苏氨酸、 3份色。
6、氨 酸、 10 酪氨酸、 17 份缬氨酸。 4. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于所述的维生素的配比如下 ： 2 份 D- 生物 素、 120 份氯化胆碱、 10 份叶酸、 35 份硫胺素、 2 份维生素 B2、 25 份维生素 B1、 20 份 D- 泛酸 酯。 5.如权利要求2所述的培养方法， 其特征在于所述的微量元素的配比如下 ： 85000份硫 酸铁、 120 份硫酸铜、 1500 份亚硒酸钠、 6 份偏钒酸铵、 5000 份硫酸锌。 6. 如权利要求 1 所述的培养方法， 其特征在于所述的步骤 2） 中的培养液添加有 25mg/ L 的小球藻生长因子。 权 利 要 求 书。
7、 CN 103468641 A 2 1/5 页 3 一种癌性胸腹水来源的 TIL 细胞的高效扩增方法 技术领域 0001 本 发 明 属 于 细 胞 培 养 领 域， 具 体 涉 及 一 种 肿 瘤 侵 润 淋 巴 细 胞 （Tumor Infiltrating lymphocyte,TIL） 的培养， 即利用各种细胞因子的组合来刺激胸腹水来源的 淋巴细胞， 使其可以高效扩增。 背景技术 0002 肿瘤侵润淋巴细胞 （Tumor Infiltrating lymphocyte,TIL） 是指侵润到肿瘤组织 周围的淋巴细胞， 细胞表型以CD3+CD8+T和CD3+CD4+T细胞为主， 另外还有少。
8、量的NKT细胞和 NK 细胞。由于 TIL 细胞多数与肿瘤细胞发生过接触， 所以理论上可以对肿瘤细胞产生特异 性的杀伤作用。但是， 由于肿瘤微环境中， 存在很强的免疫抑制因子， 所以实际上 TIL 细胞 的功能是受到极大的抑制， 无法发挥对肿瘤细胞的有效杀伤作用。 0003 上个世纪八十年代， Rosenberg 教授首次分离肿瘤组织中的 TIL 细胞， 并通过白细 胞介素 2 的刺激接来解除其免疫抑制状态， 体外扩增后， 用于回输治疗黑色素瘤患者， 并取 得了一定的效果。 0004 TIL细胞的来源主要有两个 ： 1、 手术切除的肿瘤组织或淋巴结 ； 2、 癌性胸腹水。 从 手术样品中分离 。
9、TIL 细胞需要经过机械剪切， 多种蛋白酶的酶解等多个步骤， 方法比较繁 琐， 而且最终能够分离并成功培养的比例不高， 这很大程度上限制了手术样品来源 TIL 的 临床应用。癌性胸腹水来源的 TIL 细胞， 分离的方法相对简单， 也容易在体外培养， 所以在 临床得到了较为广泛的应用。但是， 由于使用传统方法， TIL 在体外的扩增有限， 通常 20 天 左右的时间， 细胞数量仅扩增20-50倍左右， 且TIL细胞中CD3+CD8+T细胞的杀伤能力不高， 极大的影响了 TIL 细胞临床应用的效果。 0005 科研工作者不断探索培养TIL的新方法， 比如在培养中期添加抗CD3单克隆抗体、 使用炎性。
10、因子等。因此， 尽早建立一种高效扩增 TIL 细胞的方法， 已成为国内外学着研究工 作的目标。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种癌性胸腹水来源的 TIL 细胞的高效扩增方法， 即使用肿 瘤患者的胸腹水， 分离得到 TIL 细胞， 在体外通过多种因子的刺激作用， 使 TIL 细胞得到大 量扩增， 并提高其杀伤活性。 0007 申请人在长期的研究中发现， 层粘连蛋白和纤维连接蛋白可以极大的提高 TIL 细胞的增殖速度 ； 而抗 OX-40 单克隆抗体的添加可以有效的刺激 TIL 细胞的活化， 上调 CD3+CD8+T 细胞中行使杀伤功能的穿孔素和颗粒酶的表达， 提高其对肿瘤细胞的杀伤活性。
11、。 申请人将层粘连蛋白、 纤维连接蛋白和抗 OX-40 单克隆抗体三种因子共用引入到 TIL 细胞 的培养中， 从而促成了本发明。 0008 本发明的 TIL 细胞的培养方法， 包括如下的步骤 ： 0009 1) 将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后， 加入到细胞培养瓶中包被 ； 说 明 书 CN 103468641 A 3 2/5 页 4 0010 2) 将从胸腹水分离得到的 TIL 细胞用培养液重悬后， 接种到包被后的培养瓶中 ； 添加 IL-2 刺激 ； 0011 3)培养4天后， 将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养， 并添加抗OX-40 单克隆抗体 ； 0012 4) 持续扩大。
12、培养至第 20 天时， 完成高效 TIL 细胞的培养。 0013 本发明步骤 2） 所述的培养液， 其配方组成如下 : 氯化钙 40mg/ml、 氯化钾 300mg/ ml、 硫酸镁 120mg/ml、 氯化钠 5000mg/ml、 磷酸二氢钾 300mg/ml、 碳酸氢钙 1200mg/ml、 氨基 酸 1365mg/ml、 维生素 21.4mg/ml、 微量元素 0.93126mg/ml、 白蛋白 450mg/ml、 胰岛素 8mg/ ml、 亚油酸 0.4mg/ml、 油酸 5mg/ml、 谷胱甘肽 2.5mg/ml、 双甘氨肽 mg/ml、 次黄嘌呤 0.8mg/ ml、 硫辛酸 0.。
13、1mg/ml、 丙酮酸 150mg/ml、 葡萄糖 1500mg/ml、 胸腺嘧啶 0.12mg/ml。 0014 其中氨基酸的配比如下 ： 8 份丙氨酸、 40 份天冬氨酸、 10 份胱氨酸、 4 份谷氨酸、 12 份甘氨酸、 4 份组氨酸、 80 份异亮氨酸、 4 份亮氨酸、 4 份赖氨酸、 20 份蛋氨酸、 20 份苯丙氨 酸、 25 份脯氨酸、 4 份丝氨酸、 8 份苏氨酸、 3 份色氨酸、 10 酪氨酸、 17 份缬氨酸。 0015 维生素的配比如下 ： 2 份 D- 生物素、 120 份氯化胆碱、 10 份叶酸、 35 份硫胺素、 2 份 维生素 B2、 25 份维生素 B1、 2。
14、0 份 D- 泛酸酯。 0016 微量元素的配比如下 ： 85000 份硫酸铁、 120 份硫酸铜、 1500 份亚硒酸钠、 6 份偏钒 酸铵、 5000 份硫酸锌。 0017 为了获得更好的培养效果， 在培养液中还添加有 25mg/L 的小球藻生长因子 （Chlorella Growth Factor， CGF） 。 0018 本发明所制备出的 TIL 细胞具有增殖速度快、 细胞数量大、 细胞活性高等特点。本 发明的主要特点是 ： 利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对 TIL 进行培养， 这两 种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态， 从而利于细胞接受各种因子的刺激， 并且这 两种蛋白。
15、本身就有对 TIL 细胞增殖的促进作用 ； 而抗 OX-40 单克隆抗体的使用可以刺激 TIL 细胞中 CD3+CD8+T 细胞亚群的共刺激信号， 促进细胞的活化， 提高细胞穿孔素和颗粒酶 的表达， 增强其杀伤能力。到目前为止， 仍未见有将层粘连蛋白、 纤维连接蛋白和抗 OX-40 单克隆抗体联合应用于 TIL 细胞制备的研究报道， 本发明首次提供出一种在 TIL 细胞制备 中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。 0019 具体实施方法 0020 本发明所用的材料描述如下 ： 0021 抗 OX-40 单克隆抗体 ： 鼠抗人 OX-40 单克隆抗体， 购于安迪生物科技 （上海） 。
16、有限 公司 0022 HTB-135 细胞 ： 人胃癌细胞系， 购于中科院细胞库 0023 NCI-H596 细胞 ： 人肺癌细胞系， 购于中科院细胞库 0024 HepG2 细胞 ： 人肝癌细胞系， 购于中科院细胞库 0025 本发明的癌性胸腹水来源的 TIL 细胞的高效扩增方法， 包括如下的步骤 ： 0026 1) 培养瓶的包被 ： 分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白 100 微克， 于 20 毫升的磷酸 盐缓冲液中充分溶解， 将液体用 0.22 微米的无菌滤膜过滤后， 加入到底面积为 175 平方厘 米的培养瓶中， 室温放置 3-5 小时。 0027 2) 细胞接种 ： 收集 400-100。
17、0 毫升的癌性胸腹水， 1500 转 / 分钟， 离心 10 分钟。用 说 明 书 CN 103468641 A 4 3/5 页 5 30ml 无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有 15ml 淋巴细胞分离 液的离心管。2000 转 / 分钟， 离心 15 分钟。取中间白色的 PBMC 细胞层， 生理盐水洗涤 2 次， 用 60 毫升的无血清培养基重悬， 取样计数后， 接种到去包被液的培养瓶中。添加 60000 单位的 IL-2。 0028 3) 转移培养 ： 接种后的细胞在培养到第 5 天时， 转入透气的细胞培养袋中继续培 养， 添加无血清培养基至 400 毫升， 添加 2。
18、00000 单位的 IL-2 和 4 微克的抗 OX-40 单克隆抗 体。 0029 4) 扩大培养 ： 每隔两天根据细胞的数量和状态， 添加适量的无血清培养基， 并按 500 单位 / 毫升的浓度添加 IL-2， 持续扩大培养。 0030 收获细胞 ： 在培养的第20天， 取1毫升的细胞悬液进行细胞计数， 计算TIL细胞的 增殖倍数。离心收集全部培养所得细胞， 取适量细胞进行杀伤实验。 0031 下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。 0032 实验例 1 0033 1） 培养瓶的包被 ： 分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白 100 微克， 于 20 毫升的磷酸 盐缓冲液中充分溶解， 将液。
19、体用 0.22 微米的无菌滤膜过滤后， 加入到底面积为 175 平方厘 米的培养瓶中， 室温放置 4 小时。 0034 2） 细胞接种 ： 收集 600 毫升的癌性腹水， 1500 转 / 分钟， 离心 10 分钟。用 30ml 无 血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有 15ml 淋巴细胞分离液的离 心管。2000 转 / 分钟， 离心 15 分钟。取中间白色的 PBMC 细胞层， 生理盐水洗涤 2 次， 用 60 毫升的无血清培养基重悬， 取样计数， 计算细胞数为 2.6107个。将细胞悬液接种到去包 被液的培养瓶中， 添加 60000 单位的 IL-2。其中无血清培养基的。
20、组份如下 ： 氯化钙 40mg/ ml、 氯化钾300mg/ml、 硫酸镁120mg/ml、 氯化钠5000mg/ml、 磷酸二氢钾300mg/ml、 碳酸氢钙 1200mg/ml、 氨基酸 1365mg/ml、 维生素 21.4mg/ml、 微量元素 0.93126mg/ml、 白蛋白 450mg/ ml、 胰岛素 8mg/ml、 亚油酸 0.4mg/ml、 油酸 5mg/ml、 谷胱甘肽 2.5mg/ml、 双甘氨肽 mg/ml、 次 黄嘌呤0.8mg/ml、 硫辛酸0.1mg/ml、 丙酮酸150mg/ml、 葡萄糖1500mg/ml、 胸腺嘧啶0.12mg/ ml、 25mg/L 的小。
21、球藻生长因子。 0035 其中氨基酸的配比如下 ： 8 份丙氨酸、 40 份天冬氨酸、 10 份胱氨酸、 4 份谷氨酸、 12 份甘氨酸、 4 份组氨酸、 80 份异亮氨酸、 4 份亮氨酸、 4 份赖氨酸、 20 份蛋氨酸、 20 份苯丙氨 酸、 25 份脯氨酸、 4 份丝氨酸、 8 份苏氨酸、 3 份色氨酸、 10 酪氨酸、 17 份缬氨酸。 0036 维生素的配比如下 ： 2 份 D- 生物素、 120 份氯化胆碱、 10 份叶酸、 35 份硫胺素、 2 份 维生素 B2、 25 份维生素 B1、 20 份 D- 泛酸酯。 0037 微量元素的配比如下 ： 85000 份硫酸铁、 120 。
22、份硫酸铜、 1500 份亚硒酸钠、 6 份偏钒 酸铵、 5000 份硫酸锌。 0038 上述的培养基是长期优化获得的， 在同样的培养时间内， 本发明的培养液对细胞 的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液， 细胞增殖速度可以提高约 12%。 0039 3） 转移培养 ： 接种后的细胞在培养到第 5 天时， 转入透气的细胞培养袋中继续培 养， 添加无血清培养基至 400 毫升， 添加 200000 单位的 IL-2 和 4 微克的抗 OX-40 单克隆抗 体。 0040 4） 扩大培养 ： 每隔两天根据细胞的数量和状态， 添加适量的无血清培养基， 并按 说 明 书 CN 103468641 A 5 。
23、4/5 页 6 500 单位 / 毫升的浓度添加 IL-2， 持续扩大培养。 0041 收获细胞 ： 在培养的第 20 天， 取 1 毫升的细胞悬液计数， 计算细胞数为 5.4109 个， 增殖倍数为 208 倍。离心收集全部培养所得细胞， 取适量细胞进行杀伤实验。高效 TIL 细胞在效靶比为 10:1 的条件下， 对 HTB-135、 NCI-H596 和 HepG2 细胞系的杀伤分别达到 22.8%、 19.4%、 13.4%。 0042 按照上述步骤， 重复试验 7 次， 高效 TIL 细胞增殖倍数的平均值为 172 倍。在效靶 比为 10:1 的条件下， 高效 TIL 细胞对对 HTB。
24、-135、 NCI-H596 和 HepG2 细胞系杀伤的平均值 为 26.2%、 20.7% 和 15.8%. 0043 实验例 2 0044 1） 培养瓶的包被 ： 分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白 100 微克， 于 20 毫升的磷酸 盐缓冲液中充分溶解， 将液体用 0.22 微米的无菌滤膜过滤后， 加入到底面积为 175 平方厘 米的培养瓶中， 室温放置 5 小时。 0045 2） 细胞接种 ： 收集 400 毫升的癌性胸水， 1500 转 / 分钟， 离心 10 分钟。用 30ml 无 血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有 15ml 淋巴细胞分离液的离 心管。2000。
25、 转 / 分钟， 离心 15 分钟。取中间白色的 PBMC 细胞层， 生理盐水洗涤 2 次， 用 80 毫升的无血清培养基重悬， 取样计数， 计算细胞数为 3.2107个。将细胞悬液接种到去包 被液的培养瓶中， 添加 80000 单位的 IL-2。 0046 3） 转移培养 ： 接种后的细胞在培养到第 5 天时， 转入透气的细胞培养袋中继续培 养， 添加无血清培养基至 400 毫升， 添加 160000 单位的 IL-2 和 4 微克的抗 OX-40 单克隆抗 体。 0047 扩大培养 ： 每隔两天根据细胞的数量和状态， 添加适量的无血清培养基， 并按 400 单位 / 毫升的浓度添加 IL-。
26、2， 持续扩大培养。 0048 4） 收获细胞 ： 在培养的第20天， 取1毫升的细胞悬液计数， 计算细胞数为5.7109 个， 增殖倍数为 178 倍。离心收集全部培养所得细胞， 取适量细胞进行杀伤实验。高效 TIL 细胞在效靶比为 10:1 的条件下， 对 HTB-135、 NCI-H596 和 HepG2 细胞系的杀伤分别达到 16.3%、 27.6%、 15.5%。 0049 实验例 3 0050 1） 培养瓶的包被 ： 分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白 100 微克， 于 20 毫升的磷酸 盐缓冲液中充分溶解， 将液体用 0.22 微米的无菌滤膜过滤后， 加入到底面积为 175 平方厘。
27、 米的培养瓶中， 室温放置 3 小时。 0051 2） 细胞接种 ： 收集 900 毫升的癌性腹水， 1500 转 / 分钟， 离心 10 分钟。用 30ml 无 血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有 15ml 淋巴细胞分离液的离 心管。2000 转 / 分钟， 离心 15 分钟。取中间白色的 PBMC 细胞层， 生理盐水洗涤 2 次， 用 80 毫升的无血清培养基重悬， 取样计数， 计算细胞数为 3.6107个。将细胞悬液接种到去包 被液的培养瓶中， 添加 80000 单位的 IL-2。 0052 3） 转移培养 ： 接种后的细胞在培养到第 5 天时， 转入透气的细胞培养袋。
28、中继续培 养， 添加无血清培养基至 450 毫升， 添加 180000 单位的 IL-2 和 4 微克的抗 OX-40 单克隆抗 体。 0053 扩大培养 ： 每隔两天根据细胞的数量和状态， 添加适量的无血清培养基， 并按 400 说 明 书 CN 103468641 A 6 5/5 页 7 单位 / 毫升的浓度添加 IL-2， 持续扩大培养。 0054 5） 收获细胞 ： 在培养的第20天， 取1毫升的细胞悬液计数， 计算细胞数为5.5109 个， 增殖倍数为 153 倍。离心收集全部培养所得细胞， 取适量细胞进行杀伤实验。高效 TIL 细胞在效靶比为 10:1 的条件下， 对 HTB-135、 NCI-H596 和 HepG2 细胞系的杀伤分别达到 14.6%、 12.9%、 20.1%。 0055 本发明所制备的高效 TIL 细胞在培养第 20 天时， 增殖倍数超过 150 倍， 是比常规 TIL培养方法增殖倍数的300%以上， 并且高效TIL细胞在较低的效靶比条件下， 即可对常见 的胃癌、 肺癌和肝癌细胞系产生较高的杀伤。 说 明 书 CN 103468641 A 7 。