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1、(10)申请公布号 CN 103468759 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103468759 A *CN103468759A* (21)申请号 201310451445.7 (22)申请日 2013.09.29 C12P 17/16(2006.01) (71)申请人 重庆市中药研究院 地址 400065 重庆市南岸区南山路 34 号 申请人 香港浸会大学 中国医学科学院药用植物研究所 上海中医药大学 (72)发明人 杨大坚 陈新滋 徐宏喜 陈士林 卞兆祥 吕爱平 陈国庆 张毅 (74)专利代理机构 重庆辉腾律师事务所 50215 代理人 武小赟 (54) 发明名称 一种。
2、以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种以蓼大青叶为原料制备靛 玉红的方法， 为将鲜活的蓼大青叶粉碎， 添加吲哚 醌， 发酵超过 12h ； 利用蓼大青叶作为原料直接制 备靛玉红， 不仅是用生物化学方法合成靛玉红， 引 入吲哚醌， 提高了反应的另外一个原料吲哚酮的 生物量， 同时也增加了蓼大青叶中的靛玉红生物 量， 操作简便 ； 本发明在发酵的过程中通过控氧 和添加吲哚醌有效的将反应方向向靛玉红方向发 展 ； 使整个生产产业化可控。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 。
3、说明书5页 (10)申请公布号 CN 103468759 A CN 103468759 A *CN103468759A* 1/1 页 2 1. 一种以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法， 其特征在于 ： 将鲜活的蓼大青叶粉碎， 添加吲哚醌， 发酵超过 12h。 2. 根据权利要求 1 所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法， 其特征在于 ： 包括以 下步骤 ： 1） 在采收 12 内的鲜活蓼大青叶中添加水， 粉碎， 在提取原浆中添加如吲哚醌， 充分 搅拌， 投入密封的发酵罐中， 发酵大于 24h， 得到发酵原料 ； 2） 加热发酵原料， 反应大于 30min 后， 过滤， 收集水液 ； 3） 用氯。
4、仿、 一氯甲烷、 二氯甲烷、 四氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物， 加热， 萃取水液， 收集合并有机相 ； 4） 回收有机相， 纯化得到靛玉红粗品。 3. 根据权利要求 2 所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法， 其特征在于 ： 步骤 1） 所述为在采收 12 内的鲜活大青叶中添加药材重量 2-5 倍的水， 粉碎， 粉碎的浆液能过目 筛， 发酵超过 12h。 4. 根据权利要求 2 所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法， 其特征在于 ： 步骤 1） 在发酵的过程中每间隔 1h, 搅动发酵原料一次。 5. 根据权利要求 2 所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法， 其特征在于 ： 步骤。
5、 1） 在发酵的时间是 24h。 6. 根据权利要求 2 所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法， 其特征在于 ： 步骤 3） 所述的加热反应中充入惰性气体， 排除反应液体中的氧气。 7. 根据权利要求 2 所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法， 其特征在于 ： 步骤 4） 所述的纯化为 ： 将有机相回收至干， 用氯仿、 一氯甲烷、 二氯甲烷、 四氯甲烷或乙酸乙酯中的 一种或几种的混合物加热溶解， 按原料 : 氧化铝 （1:2-4） 的比例拌， 干法湿法装柱， 干法上 样 ； 收集靛玉红的色谱带， 回收， 结晶得到靛玉红纯品。 8. 根据权利要求 2 所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，。
6、 其特征在于 ： 步骤 4） 所述的纯化为 ： 将有机相回收至干， 用 50% 的甲醇加热溶解， 浓缩， 冷却结晶， 重复结晶操 作， 得到靛玉红纯品。 权 利 要 求 书 CN 103468759 A 2 1/5 页 3 一种以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法 技术领域 0001 本发明设计一种中药材， 单体成分的提取方法， 更具体的说涉及一种以蓼大青叶 为原料制备靛玉红的方法。 技术背景 0002 蓼大青叶来源于蓼科植物蓼蓝 (Polygonum tinctorium Ait.) 的茎叶， 完整叶片 展开后呈椭圆形， 长 3-8cm ； 蓝绿色或黑蓝色， 先端钝， 基部渐狭， 全缘 ； 叶脉。
7、浅黄棕色， 于下 表面略突起 ； 叶柄扁平， 偶带膜质托叶鞘。 质脆。 气微， 味微涩而稍苦。 蓼蓝全草中含靛玉红 （indirubin） ， 靛蓝 （indigo， indigotin） ， N- 苯基 -2- 萘胺 （N-phenyl-2-naphthylamine） ， - 谷甾醇 （-sitosterol） ， 虫漆蜡醇 （laccerol） ， 其地上部分含山柰酚 -3- 吡喃葡萄糖 苷 （kaempferol-3-O-D-glucopyranoside） ， 吲哚苷 （indican）等， 据报道， 蓼大青叶鲜 品中含有的吲哚苷超过 4% ； 蓼蓝中不含靛红烷 A、 B、 C。 0。
8、003 靛玉红又名炮弹树碱 B， 分子量为 ： 262.26 ； 分子结构式为 ： 0004 0005 靛玉红为一种双吲哚类生物碱 ； 对多种移植性动物肿瘤有抑制作用， 能破坏白血 病细胞 ； 在其作用下， 变性的细胞多呈肿胀、 溶解性坏死。 实验研究发现， 靛玉红还能增强动 物的单核巨噬细胞系统的吞噬能力， 靛玉红为我国首创的新型结构的抗白血病药物。目前 国内用于研究的靛玉红有 3 中来源 ： 即从中药大青叶、 青黛中提取的天然产物， 半合成、 全 合成的靛玉红。 发明内容 0006 研究发现， 吲哚苷分子量 295.28， 分子式 ： C14H17NO6， 分子结构式为 ： 0007 00。
9、08 属于苷类， 碱性条件下较稳定， 在中性或弱酸性条件下， 可被靛素植物体内自身存 在的靛素酶 （indhamlsin） 或其他内源酶生物化学分解成为相同摩尔的游离吲哚酚阳离子 （indoxyl anion） 。蓼大青叶药材仅含有吲哚苷而不含靛红烷。本发明采用蓼大青叶为反 应原料， 以吲哚苷为制备靛玉红的主要前体物质 ； 其化学反应方程式如下 ： 0009 说 明 书 CN 103468759 A 3 2/5 页 4 0010 在现有的用蓼大青叶打靛 （包括发酵法和酒糟法） 中， 吲哚苷其在内源酶的作用 下发生水解反应， 生产吲哚酚阳离子， 在有氧的条件下， 吲哚酚阳离子会氧化为吲哚酚自由 。
10、基， 吲哚酚自由基的生成由原浸泡液中的溶解氧供氧即可， 吲哚酚自由基可能缩合成为靛 蓝 ； 但是进一步氧化生成的吲哚满二酮则需要外界额外供氧。化学反应方程式如下 ： 0011 0012 本发明提供的技术方案， 包括以下步骤 ： 0013 1） 在采收 12 内的鲜活蓼大青叶中添加水， 粉碎， 在提取原浆中添加如吲哚醌， 充分搅拌， 投入密封的发酵罐中， 发酵大于 24h， 得到发酵原料 ； 0014 2） 加热发酵原料， 反应大于 30min 后， 过滤， 收集水液 ； 0015 3） 用氯仿、 一氯甲烷、 二氯甲烷、 四氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物， 加热， 萃取水液， 收集合并有。
11、机相 ； 0016 4） 回收有机相， 纯化得到靛玉红粗品。 0017 步骤 1） 所述为在采收 12 内的鲜活大青叶中添加药材重量 2-5 倍的水， 粉碎， 粉 碎的浆液能过目筛， 发酵超过 12h。 0018 步骤 1） 在发酵的过程中每间隔 1h, 搅动发酵原料一次， 中搅拌不仅有在发酵过程 中补充一定氧气的作用， 同时还能控制发酵温度。 。 0019 步骤 1） 在发酵的时间是 18-36h 均可， 但是最优的时间是 24h。 0020 步骤 3） 所述的加热反应中充入惰性气体， 排除反应液体中的氧气。 说 明 书 CN 103468759 A 4 3/5 页 5 0021 步骤 4）。
12、 所述的纯化为 ： 将有机相回收至干， 用氯仿、 一氯甲烷、 二氯甲烷、 四氯甲 烷或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物加热溶解， 按原料 : 氧化铝 （1:2-4） 的比例拌， 干法 湿法装柱， 干法上样 ； 收集靛玉红的色谱带， 回收， 结晶得到靛玉红纯品。 0022 步骤 4） 所述的纯化为 ： 将有机相回收至干， 用 50% 的甲醇加热溶解， 浓缩， 冷却结 晶， 重复结晶操作， 得到靛玉红纯品。 0023 本发明的有益技术效果是 ： 1） 利用蓼大青叶作为原料直接制备靛玉红， 不仅是用 生物化学方法合成靛玉红， 引入吲哚醌， 提高了反应的另外一个原料吲哚酮的生物量， 同时 也增加了蓼大青。
13、叶中的靛玉红生物量， 操作简便。 0024 2） 本发明在发酵的过程中通过控氧和添加吲哚醌有效的将反应方向向靛玉红方 向发展 ； 使整个生产产业化可控。 具体实施方式 0025 实施例 1 不同制备方法中靛玉红的产率考察 0026 1、 传统打靛工艺 0027 采收 7-10 月的蓼大青叶鲜品， 根据文献报道的传统的打靛工艺， 主要的操作为 ： 称取大蓼青叶鲜品 10kg， 粉碎， 过滤， 得到蓼大青叶浸液 ； 选用优质石灰块 2kg, 加清水适量 煮沸溶化后， 过 100 目筛进行滤过， 以去其杂质及石灰渣， 将石灰液质均匀地洒入蓼大青叶 的浸液中， 以木棒不停地搅拌， 使水浸液不停地上下翻。
14、腾。但是在打靛超过 48h 后， 仍然没 出现浸液由青绿浅绿灰绿灰红灰紫青色紫色的现象， 停止捣冲与搅拌。我们 不采用传统工艺倾去上层液， 而是在这步直接检测整个缸内的靛玉红、 靛蓝、 和吲哚苷的含 量 ； 得到打靛法制样组。 0028 2、 传统蓼蓝发酵工艺 0029 采收 7-10 月的蓼大青叶鲜品， 根据文献报道的传统工艺， 主要的操作为 ： 称取大 蓼青叶鲜品 10kg， 将蓼青叶鲜品置于坑中， 用重物压榨， 覆土， 发酵 1 周， 取出粉碎， 直接检 测整个缸内的靛玉红、 靛蓝、 和吲哚苷的含量 ； 得到发酵法制样组。 0030 3、 传统酒糟发酵工艺 0031 采收 7-10 月的。
15、蓼大青叶鲜品， 根据文献报道的传统工艺， 主要的操作为 ： 称取大 蓼青叶鲜品 10kg， 粉碎， 过滤， 得到蓼大青叶浸液 ； 按每千克蓼大青叶鲜品添加酒糟 100g 的 比例添加酒糟 ； 发酵24h后， 充分搅拌蓼大青叶浸液超过48h。 直接检测整个缸内的靛玉红、 靛蓝、 和吲哚苷的含量 ； 得到酒糟发酵制样组。 0032 4、 有氧条件下靛玉红制备方法 0033 采收7-10月的蓼大青叶鲜品， 称取蓼大青叶鲜品10kg， 添加药材重量3倍的水， 粉 碎， 制备得到大青叶原浆， 在原浆中添加吲哚醌 100g， 混合混匀， 常温发酵超过 24h， 每间隔 1h 搅拌一次 ； 得到发酵原料， 。
16、加热到 90； 用充氧设备充氧， 充分搅拌 10h ； 直接检测整个缸 内的靛玉红、 靛蓝、 和吲哚苷的含量 ； 得到有氧靛玉红制备组。 0034 5、 无氧条件下靛玉红的制备方法 0035 采收7-10月的蓼大青叶鲜品， 称取蓼大青叶鲜品10kg， 添加药材重量3倍的水， 粉 碎， 制备得到大青叶原浆， 在原浆中添加吲哚醌 100g， 混合混匀， 密封常温发酵超过 24h， 每 间隔 1h 搅拌一次 ； 用空气压缩机对大青叶原浆充入惰性气体 （氮气） ， 升温至 90 ； 充分搅 说 明 书 CN 103468759 A 5 4/5 页 6 拌 10h ； 直接检测整个缸内的靛玉红、 靛蓝、。
17、 和吲哚苷的含量 ； 得到无氧靛玉红制备组。 0036 比较上述 5 种方法制备靛玉红的方法， 具体如表 1 所示。 0037 表 1 制备靛玉红的方法中有效成分的比较 0038 0039 注 ： 各组的原药材重量以鲜品计算。 0040 从上述各种靛玉红的制备方法的数据中发现， 采用传统的蓼蓝发酵工艺、 打靛工 艺和酒糟发酵工艺制备靛玉红， 靛玉红在反应原料中含量都比较少， 尤其是采用打靛工艺 制备靛玉红， 靛玉红含量极低。采用有氧发酵， 无氧加热缩合靛玉红的工艺， 产量达到了每 千克鲜药材制备靛玉红 35g， 相对与有氧缩合靛玉红， 产量提高了 1 倍， 具体原因应该是， 当 吲哚酚阳离子大。
18、量游离出来以后， 在有氧的条件下， 可能氧化成为吲哚酚自由基进而缩合 成靛白， 或者进一步氧化成为吲哚酚， 这都会减少母液中的吲哚酚阳离子但是吲哚酮的量 减少。 0041 在本发明中反应前体吲哚苷在鲜活大青叶自源酶的条件下， 很不稳定， 很难单独 分离出吲哚酚阳离子和吲哚酚自由基等反应中间体出来进行量化考察。 但是从反应的目标 产物量的增加， 和反应现象证明反应方向是正确的。 0042 实施例 2 不同发酵时间对靛玉红产量的影响 0043 在蓼大青叶有氧发酵的过程中， 对靛玉红影响最大的两个因素是发酵时间和发酵 温度， 但是由于蓼大青叶采收的时间是 7-10 月， 环境温度一般在 25-35，。
19、 发酵罐内的温度 一般恒定在 35-40 （每间隔 1 小时搅拌一次） ， 如果人工控制反应温度， 则需要添置控温设 备， 不利于工业化生产， 所以在本实施例中仅仅讨论发酵时间对靛玉红产量的影响。 称当年 7-10 月采收的蓼大青叶 6 组， 每组 1kg, 采用实施例 1 中无氧条件下靛玉红的制备方法， 发 酵时间分别是 6h、 12h、 18h、 24h、 36h、 48h 和 72h， 以整反应完毕考察各组的的靛玉红、 靛蓝、 和吲哚苷的含量。具体如表 2 所示。 0044 表 2 不同发酵时间对靛玉红产率的影响比较 0045 说 明 书 CN 103468759 A 6 5/5 页 7。
20、 0046 注 ： 各组的原药材重量以鲜品计算。 0047 从上述各组数据可以知道， 发酵的最佳时间是 18-36h。根据工业化生产的需要可 以优选 24h。 0048 实施例 3 靛玉红的提出纯化 0049 采用实施例 2 中无氧条件下靛玉红的制备方法， 取相当于原药材量 1kg 的的反应 液， 过滤除去残渣， 用 15000rpm 的离心机除杂， 取上清液， 浓缩至 800ml， 加热至 60 ； 加 入 500ml 二氯甲烷萃取 3 次， 合并有机相 ； 回收有相至密度大于 1.1 的浸膏， 浸膏重量为 83.71g ； 0050 将上述浸膏拌样到 300g 氧化铝中， 干燥， 制成粉末。
21、， 制备得到上样样品 ； 称取氧化 铝 1500g， 用二氯甲烷混合装柱， 干法上样， 分别用氯仿、 氯仿 : 乙酸乙酯 （9:1） 、 氯仿 : 乙酸 乙酯 （4:1） 、 氯仿 : 乙酸乙酯 （2:1） 、 氯仿 : 乙酸乙酯 （1:1） 等极性梯度洗脱， 洗脱溶剂的替 换， 以洗脱色带的变化而调整。通过 TLC 检测确认得到靛玉红色带， 结晶纯化， 得到靛玉红 纯度高于 98.5%（内标法） 。采用萃取与氧化铝柱色谱分离相结合的方法， 相对于反应液中 靛玉红的含量， 靛玉红的收率达到 89%。 0051 采用采用实施例 2 中无氧条件下靛玉红的制备方法， 取相当于原药材量 1kg 的的 。
22、反应液， 过滤除去残渣， 用 15000rpm 的离心机除杂， 取上清液， 浓缩至 800ml， 加热至 60 ； 加入 500ml 二氯甲烷萃取 3 次， 合并有机相 ； 回收有相至密度大于 1.1 的浸膏， 浸膏重量为 91.35g ； 0052 将上述经过用 200ml50% 加热甲醇溶解， 缓慢降温， 挥发掉 100ml 的 50% 甲醇溶液， 有暗褐色晶体析出， 待晶体析出完毕， 过滤晶体， 再用 50% 加热甲醇溶解， 缓慢降温结晶， 最 后获得， 得到靛玉红纯度高于 98.5% （内标法） 。采用结晶法与萃取相结合的方法， 相对于反 应液中靛玉红的含量， 靛玉红的收率达到 62%。 说 明 书 CN 103468759 A 7 。