由法医样品回收精子核酸的方法.pdf

本发明提供一种由样品中的精细胞选择性回收核酸的方法，所述样品含有至少精细胞和上皮细胞的细胞以及含胞外杂质的细胞悬浮液。所述方法需要将样品加入容器中，隔离细胞和其余样品组分，在隔离之前或之后用洗涤溶液洗涤细胞，从容器中取出含杂质的细胞悬浮液，同时保留细胞；选择性裂解第一种细胞类型的细胞；并由裂解的细胞分离核酸。还提供由第二种细胞类型的细胞回收核酸的方法。

权利要求书
1.  一种由含有混合的精细胞和上皮细胞以及含杂质的细胞悬浮液的样品中选择性回收精细胞的DNA的方法，所述杂质包含污染的残留DNA，所述方法包括以下步骤：
在第一个分离步骤中从所述悬浮液中分离混合的细胞；
选择性裂解精细胞；和
由裂解的精细胞回收DNA；
其中所述方法包括以下的至少一个步骤：
(a)在所述第一个分离步骤之前通过将样品与第一种洗涤溶液混合从而洗涤所述样品，由此将残留DNA与细胞表面解离；和
(b)在第二个分离步骤中用第二种洗涤溶液洗涤第一分离步骤的混合细胞，接着将洗涤的混合细胞和第二种洗涤溶液分离，之后进行所述裂解步骤。

2.  权利要求1的方法，其中所述第一种洗涤溶液或第二种洗涤溶液或这二种洗涤溶液独立地包含一种以下洗涤溶液或它们的组合：阳离子盐、MgCl2、KCl、NaCl、聚阴离子、聚阳离子和DNA酶。

3.  权利要求2的方法，其中所述DNA酶的浓度为0.01U至50U。

4.  权利要求1的方法，其中所述细胞在所述第一个或第二个分离步骤或这两个分离步骤中通过磁性粒子、大小排阻过滤或离心分离。

5.  权利要求1的方法，所述方法还包括将回收的核酸纯化至一定纯度，所述纯度足以获得适于基因分型的精子STR谱。

6.  权利要求4的方法，其中所述细胞在所述第一个分离步骤中通过磁性粒子分离，并在所述第二个分离步骤中通过离心分离。

7.  权利要求4的方法，其中所述第一个分离步骤和第二个分离步骤中的至少一个步骤包括：
在容器中混合磁性粒子和样品；
对容器施加磁场，使粒子按所述磁场的方向移动，由此隔离细胞 和样品；和
从细胞悬浮液分离出细胞。

8.  权利要求7的方法，其中所述裂解步骤包括：
中止对容器施加磁场；和
将选择性精子裂解缓冲液与细胞及磁性粒子混合，由此形成含有精子DNA的裂解物。

9.  权利要求8的方法，其中所述回收步骤包括：
对容器施加磁场，由此将粒子和残留的细胞与裂解物隔离；和回收含有精子DNA的裂解物。

10.  权利要求7的方法，其中所述第二个洗涤步骤(b)包括：
中止对样品施加磁场；
将第二种洗涤溶液和混合的细胞混合；
对样品再施加磁场，由此隔离细胞；和
从样品中分离出细胞。

11.  一种由含有混合的精细胞和上皮细胞以及含杂质的细胞悬浮液的样品中选择性回收精细胞的DNA的方法，所述杂质包含污染的残余DNA，所述方法包括以下步骤：
将样品加入至大小排阻滤器上，所述样品任选地包含第一种洗涤溶液；
在第一个分离步骤中通过将细胞隔离在滤器上，并使细胞悬浮液形成滤过液，从而分离混合细胞和细胞悬浮液；
选择性裂解精细胞；和
由精细胞回收DNA；
其中所述方法包括以下步骤中的至少一个步骤：
通过将样品与第一种洗涤溶液混合洗涤样品，形成洗涤过的样品，由此解离或消化细胞表面上的残余DNA，之后将样品加入至大小排阻滤器上；
在第二个分离步骤中用第二种洗涤溶液洗涤分离的混合细胞，接 着分离洗涤后的混合细胞和第二种洗涤溶液，之后进行所述裂解步骤。

12.  权利要求11的方法，其中所述第一种洗涤溶液或第二种洗涤溶液或这两种洗涤溶液独立地包含一种以下洗涤溶液或它们的组合：阳离子盐、MgCl2、KCl、NaCl、聚阴离子、聚阳离子和DNA酶。

13.  权利要求12的方法，其中所述DNA酶的浓度为0.01U至50U。

14.  权利要求11的方法，所述方法还包括纯化回收的核酸至一定纯度，所述纯度足以获得适于基因分型的精子STR谱。

15.  一种由含有混合的精细胞和上皮细胞以及含杂质的细胞悬浮液的样品中选择性回收精细胞的核酸的方法，所述杂质包含污染的残余DNA，所述方法包括以下步骤：
离心样品，所述样品任选地包含第一种洗涤溶液，以形成细胞沉淀和含有悬浮液的上清液，所述上清液包含任何第一种洗涤溶液，由此隔离混合的细胞和悬浮液；
在第一个分离步骤中分离混合的细胞和上清液；
选择性裂解精细胞；和
回收精细胞的DNA；
其中所述方法包括以下步骤中的至少一个：
将样品与第一种洗涤溶液混合从而洗涤样品，形成洗涤过的样品，由此解离或消化细胞表面上的残余DNA，之后离心样品；
在第二个分离步骤中用第二种洗涤溶液洗涤分离的混合细胞，接着离心洗涤后的混合细胞和第二种洗涤溶液，形成沉淀和上清液，由此隔离洗涤后的细胞和悬浮液，并分离混合的洗涤过的细胞和上清液，之后进行所述裂解步骤。

16.  权利要求15的方法，其中所述第一种洗涤溶液或第二种洗涤溶液或这两种洗涤溶液独立地包含一种以下洗涤溶液或它们的组合：阳离子盐、MgCl2、KCl、NaCl、聚阴离子、聚阳离子和DNA酶。

17.  权利要求15的方法，所述方法还包括将回收的核酸纯化至一定纯度，所述纯度足以获得适于基因分型的精子STR谱。

说明书由法医样品回收精子核酸的方法
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2007年7月23日申请的美国临时申请号60/961,734的优先权。
发明领域
本发明涉及由含有细胞和非细胞杂质的样品中分离细胞并进一步由具体的细胞类型分离核酸的领域。
更具体地说，本发明涉及以下领域：由样品分离精细胞，所述样品包含胞外杂质和至少一种其它类型的污染细胞(例如上皮细胞)，并由精细胞和非精细胞回收DNA，用于各种目的，包括法医目的。
发明背景
性攻击证据的法医DNA分析经常包括分析精细胞的DNA和诸如上皮细胞的其它细胞的DNA。精细胞一般通过用拭子擦拭粘膜从强奸受害者获得。得自受害者的样品经常包含精子和上皮细胞的混合物。因为上皮细胞可能比样品中的精细胞数目多出至少一个数量级，所以前者可以在纯化精子DNA时引起精细胞DNA污染。因此，经常需要在分析前尽可能干净地分离精细胞和上皮细胞，或精子DNA和上皮细胞DNA。精子和上皮细胞的DNA的分开和分离在由法医标本鉴别攻击者和将攻击者与受害者关联时是必需的步骤。
用于由拭子纯化精子的标准方法基于差异提取。精子DNA与受害者DNA的分离去除了不定性，有利于DNA分析，并使得可以更容易地判读出强奸案例中攻击者的DNA谱。尽管差异提取常用于分离精子和上皮细胞，但标准方案是耗时耗力的，在精细胞裂解前需要上 皮细胞裂解。
通常，首先重悬浮法医标本中的细胞，之后用含有蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液选择性消化受害者的上皮细胞。通过离心将完整精子与溶解的污染DNA和上皮细胞碎片分离，小心除去上清液，彻底洗涤精子沉淀(参见例如Giusti等人，J.Forensic Sci，31：409-417，1986；Gill等人，Nature 318：577-579，1985；Wiegand等人，Int J.Legal Med.，104：359-360，1992；和Yoshida等人，Forensic Sci.Int.，72：25-33，1995)。遗憾的是，离心和小心除去上清液的过程难以自动化，并可能由于多个样品操作步骤而引起精子DNA的损失。
在该程序的一个实例中，Gill等人(出处同上)描述了一种由取自性攻击受害者的阴道拭子分离精子DNA的方法。这些拭子包含精子，也包含极大过量的受害者上皮细胞。通过优先裂解(即通过温育在含有SDS和蛋白酶K的缓冲溶液中的细胞混合物)除去上皮细胞和包含在这些细胞中的DNA。精子核不受该处理的影响，因为它们具有二硫键交联的富巯基蛋白，而其它细胞类型被消化，相应的DNA被溶解。在优先裂解后，离心样品，以分离精子核和受害者的溶解的DNA。除去含有受害者DNA的上清液，并重复洗涤精子沉淀。随后通过用含有SDS、蛋白酶K和DTT(二硫苏糖醇)的缓冲溶液处理裂解精子核，并通过离心将裂解物与污染细胞分离。
对于具有低精子计数的样品，Wiegand等人(出处同上)使用温和裂解条件并取消洗涤步骤尝试改善Gill等人的方法。
许多用于分离精细胞和上皮细胞的建议方法基于过滤。Chen等人(J Forensic Science 43：114-118，1998)和Garvin(PCT/US01/01835)在差异裂解前通过重力或温和真空过滤或通过使用可以承受强真空或离心力而孔的大小没有增加的滤器材料分离精子和上皮细胞。然后将DNA和在滤过液中收集的精子分离。
差异提取，尤其对精细胞分析而言，如下进行：首先裂解上皮细胞，然后由精子提取DNA。为了减少法医分析的时间，最初需要选择 性提取精细胞的DNA。另外，因为选择性上皮细胞裂解条件还引起某些精子裂解，所以在精细胞分离之前裂解上皮细胞减少了样品中存在的精细胞数。需要除去上皮细胞DNA的额外洗涤步骤也促成精细胞的损失。
上皮细胞或其它污染细胞类型(如白细胞)的裂解或存在可能妨碍精确的精子分析。在法医样品中存在的来自受损的非精细胞的DNA可以污染细胞(最有可能通过结合精细胞表面)，其可能限制犯罪者的精确鉴定，尤其是在回收的精细胞数低时。
本发明人发现，尽管存在由异质细胞群中(由各个细胞类型中)差异提取一种核酸类型的技术，但残留的污染核酸仍是保证更精确的提取方法的问题。其中对高度特异性的差异提取存在需要的一种应用是法医，具体地说是性攻击分析。
因为其易碎性，所以性攻击样品中的上皮细胞和其它细胞(例如白细胞)经常在操作、样品处理或储存过程中破碎和裂解。这种残留DNA如果没有除去，则可能在选择性精子裂解过程中污染雄性DNA，尤其是在精细胞数低时。另外，上皮细胞和精细胞表面是高度功能化的，其表面带有被通过离子相互作用以及其它非共价方法结合核酸的分子(例如糖蛋白)。已发现这些细胞表面蛋白结合样品中存在的胞外核酸。
发明概述
本发明通过在精细胞裂解前实施新的洗涤步骤从而减少法医样品中存在的残留DNA和污染细胞(例如白细胞)的数量。
除了基于粒子或珠的方法以外，本发明可以使用经典的离心方法、大小排阻过滤分离样品中的细胞。本发明方法容易改良以适用已有设备例如(Beckman Coulter，Fullerton，CA)或Tecan液体自动化操作系统(例如FreedomServices TecanSystems，San Jose，CA)的自动化和高通量检测。本发明可更广泛地应 用于法医和其它环境，在所述环境中，必须由一种细胞类型以上的混合物中存在的一种细胞类型分离核酸，只要每种细胞类型可被选择性裂解(除了不需要被选择性裂解的最后剩下的细胞类型以外)。
在一个方面，本发明涉及在含有混合的精细胞和上皮细胞的样品以及含有杂质的细胞悬浮液中选择性回收精细胞DNA的方法。所述杂质包括污染的残留DNA和可能存在的其它污染细胞，例如白细胞。在该方面，所述方法需要在第一个分离步骤中分离悬浮液中的混合细胞，选择性裂解精细胞，并由精细胞回收DNA。所述方法还包括两个额外的步骤中的至少一个，其中第一个步骤是用第一种洗涤溶液洗涤样品，所述第一种洗涤溶液在第一个分离步骤之前解离或消化细胞表面的残留DNA。第二个步骤包括洗涤/分离程序，其包括在第二个分离步骤中用第二种洗涤溶液洗涤分离的混合细胞，接着分离洗涤的混合细胞和第二种洗涤溶液，之后实施裂解步骤。如果在样品中存在白细胞，则第一种或第二种洗涤溶液选择性裂解白细胞。应当指出的是，因为可能不进行第二个分离步骤(在此情况下在第一个分离步骤之后没有洗涤步骤)，所以在所述方法中可以仅有一个分离步骤。
本发明人发现，这种简单的一次或多次洗涤有效减少了残留DNA污染的问题，使得不干扰基因分型，而不需要可能引入其它问题的昂贵的、耗时的或操作性的步骤。
又一方面，通过大小排阻过滤、离心或用磁性粒子分离细胞。
另一方面，提供一种用于在含有混合的精细胞和上皮细胞的样品以及含有杂质的细胞悬浮液中选择性回收精细胞的DNA的方法，其中所述杂质包括污染的胞外物质，例如残留DNA和可能的其它污染细胞，例如白细胞。所述方法需要在第一个分离步骤中将样品加入至大小排阻滤器，包括任何的第一种洗涤溶液，通过将细胞隔离(sequestering)在滤器上并使细胞悬浮液形成滤过液，分离混合的细胞和细胞悬浮液；选择性裂解精细胞；并由精细胞回收DNA。所述方法还包括两个额外步骤中的至少一个，其中第一个步骤是样品洗涤，其 包括通过将样品与第一种洗涤溶液混合洗涤样品，以形成洗涤过的样品，之后将样品加入至大小排阻滤器。第二个步骤包括洗涤/分离程序，其包括在第二个分离步骤中用第二种洗涤溶液洗涤分离的混合细胞，接着分离洗涤的混合细胞和第二种洗涤溶液，之后实施裂解步骤。如果在样品中存在白细胞，则第一种或第二种洗涤溶液用作选择性白细胞裂解缓冲液。
在本发明的又一方面，提供一种用于在包含混合的精细胞和上皮细胞的样品以及包含杂质的细胞悬浮液中选择性回收精细胞的核酸的方法。所述杂质包含污染的残留DNA，并可能包含其它污染细胞，例如白细胞。所述方法需要离心样品，包括任何的第一种洗涤溶液，以形成细胞沉淀和含有悬浮液的上清液，包括任何的第一种洗涤溶液，由此隔离混合的细胞和悬浮液，之后在第一个分离步骤中分离混合的细胞和上清液；选择性裂解精细胞；并回收精细胞的DNA。所述方法还包括两个额外步骤中的至少一个，其中第一个步骤是样品洗涤步骤，其包括将样品与第一种洗涤溶液混合，以形成洗涤过的样品。第二个步骤为洗涤/分离程序，其包括在第二个分离步骤中，用第二种洗涤溶液洗涤分离的混合细胞，之后离心洗涤的混合细胞和第二种洗涤溶液，形成沉淀和上清液，由此隔离洗涤过的细胞和悬浮液，接着分离混合的洗涤过的细胞和上清液，之后实施所述裂解步骤。如果在样品中存在白细胞，则第一种或第二种洗涤溶液可以选择性裂解白细胞。
一方面，第一种洗涤溶液或第二种洗涤溶液或这两种洗涤溶液独立地包含选自以下物质中的一种或它们的组合：阳离子盐，例如MgCl2、NaCl、KCl；聚阳离子，例如聚赖氨酸；聚阴离子，例如肝素，所有这些都可以干扰DNA-细胞表面相互作用。诸如MgCl2的盐溶液还可以通过强加渗透压或破裂白细胞膜和染色质结构裂解白细胞。在多个方面，可以消化外源DNA的DNA酶用作洗涤溶液或其部分。
在本发明的具体方面，样品包含法医标本，其可以包括取自性攻 击受害者的标本。在这类样品中的细胞类型包括至少精子和上皮细胞，有时也包括白细胞。原则上，样品中的核酸可以为DNA或mRNA或总RNA。通常，其为DNA。
在本发明的另一方面，分离的精子核酸可用于下游步骤，包括但不限于定量纯化的核酸，扩增核酸，并分离扩增的短串联重复片段用于基因分型。
附图简述
技术人员将理解，下述附图仅用于阐述目的。附图无意以任何方式限制本发明的范围。
图1是一幅处理流程图，显示了按照本发明的某些实施方案在含有精子和上皮细胞的样品中分离并回收精细胞DNA的步骤。
图2A-2D是用如在实施例1中阐述的本发明方法分离的精子DNA的STR分型谱。用荧光染料标记用于多个基因座的引物，之后扩增多个基因座，并通过电泳分离产物。所用的荧光激发/发射波长和染料为494/522nm，6-FAM(图2A)；538/554nm，VIC(图2B)；546/575nm，NED(图2C)；558/595nm，PET(图2D)。
图3是一幅条图，显示了MgCl2浓度(洗涤溶液)对样品中存在的残留上皮细胞DNA的量的作用。
图4A-4D是用如在实施例3中阐述的本发明方法分离的精子DNA的STR分型谱。用荧光染料标记用于多个基因座的引物，之后扩增多个基因座，并通过电泳分离产物。所用的荧光激发/发射波长和染料为494/522nm，6-FAM(图4A)；538/554nm，VIC(图4B)；546/575nm，NED(图4C)；558/595nm，PET(图4D)。
本发明的某些实施方案的详述
定义
本文使用的术语“核酸”包含DNA分子和RNA分子，以及 DNA/RNA嵌合体和具有非天然碱基和/或糖部分的核酸分子。在具体的法医实施方案中，将来自攻击者精细胞的DNA与受害者的非精细胞(通常为上皮细胞)的DNA分离。
本发明中使用的“样品”可以为含有两种或更多种细胞类型的任何异质细胞混悬液，其中可以选择性裂解至少一种类型的细胞。所述样品还包含悬浮液，例如重构缓冲液，其还含有来自样品的杂质，例如外源DNA。在某些实施方案中，样品由法医标本重构，并可以任选地包括法医标本收集在其上的拭子或棉签(cotton applicator)。要理解的是，在洗涤溶液与样品混合之后，样品还将包含洗涤溶液。因此，不一定另外再提及洗涤溶液。
本文使用的术语“法医标本”是为解决法律问题而获得的标本，包括但不限于谋杀、强奸、伤害、攻击、殴打、偷窃、入室行窃、其它刑事案件、身份测试、生父鉴定试验和混合的应用样品。其在广义上是指包含生物材料标本的基体(substrate)，所述生物材料例如血液、血迹、唾液、皮肤碎片、粪便、粪迹、尿、精细胞、上皮细胞、肌肉组织、骨或肌肉残留物或干枯残留物。在某些实施方案中，“法医标本”包含在生物标本收集在其上的拭子或棉签上并包括这样的拭子或棉签。
本文使用的术语“差异提取”是指用于分离异源细胞群中的各个细胞类型的核酸的提取方法，例如选择性裂解上皮细胞-精细胞混合物中的精细胞。
能用于本发明的实施方案的两种或更多种“细胞类型”可以包括以下的任何两种或更多种，只要细胞混合物中至少一种细胞类型可以被选择性裂解：精细胞、上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肿瘤细胞、神经元、胶质细胞、星形细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、抗原提呈细胞、T-细胞、B-细胞、浆细胞、肌肉细胞、卵细 胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、睾丸细胞、支柱细胞、黄体细胞、宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、滤泡细胞、粘膜细胞、纤毛细胞、非角质化上皮细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。
在某些实施方案中，样品中存在两种以上的细胞类型。在某些法医实施方案中，精细胞和上皮细胞必须是样品中存在的唯一细胞类型。在某些法医实施方案中，精细胞、上皮细胞和白细胞是样品中存在的细胞类型。在其中存在白细胞的实施方案中，第一个洗涤步骤用于选择性裂解白细胞，同时保持精子和上皮细胞完整。
本文使用的“精细胞”可以包括完整的精细胞或基本上完整的精细胞(例如已失去其鞭状体或尾的精细胞)，只要核仍是完整的。
本文使用的术语“细胞混合物”是指至少两种不同的细胞类型的异源收集物。
“细胞悬浮液”是其中存在细胞混合物的缓冲液或液体。细胞悬浮液可以为重构缓冲液，此时细胞混合物最初存在于固体基体上，或者可以为洗涤溶液，此时分离的细胞重悬浮于其中。作为非限制性实例，重构缓冲液可以为1X磷酸缓冲盐水(PBS)。细胞悬浮液是众所周知的，本领域技术人员可容易地选择。对于本发明用途，加入到细胞悬浮液中的溶液，例如洗涤溶液，是细胞悬浮液的组成部分，即便其最初不存在。
本文使用的术语“上清液”描述了在细胞和粒子已沉积至容器底部或侧面之后在容器中存在的液体或缓冲液。上清液可以包含杂质，例如受损细胞的DNA，或拭子纤维，此时细胞混合物最初由固体基体重构，或者包含裂解步骤之后的细胞裂解物，或者洗涤步骤之后用过的洗涤溶液。另外，一旦细胞和粒子已沉积至容器的侧面或底部，则细胞悬浮液可被认为是上清液，并可以包含杂质。因此，细胞悬浮液和上清液的使用和含义相互重叠。
本文使用的“残留或残余DNA”是指在样品悬浮液中的、不存 在于细胞(例如精子-上皮细胞混合物)中的胞外DNA，DNA来自受损细胞或裂解细胞。残留DNA可以结合或缔合在细胞表面，并潜在地污染由所述细胞提取的DNA。在其中存在白细胞的实施方案中，在第一个洗涤步骤中形成残留的白细胞DNA，因为第一个洗涤步骤裂解白细胞。
用于本发明的“容器”可以为任何管(例如0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL体积)、容器或孔，其在顶部开口而所有侧面和底部密封。设计用于自动化设备的试剂柱或槽(cartridges)包括在该定义中。多个孔可以汇在一起形成板，例如96孔板，或任何其它适用于自动化设备的板。
本文使用的术语“响应于磁场的粒子”包括可以捕获(即与其相互作用或结合)细胞或核酸或这二者(在不同的缓冲条件下)并且处于磁场中可迁移的所有粒子(例如珠或不规则形状的粒子)，以实现细胞与悬浮液的隔离。在某些实施方案中，一种以上的粒子可以彼此结合，以形成粒子聚集体。在其它实施方案中，粒子在直径和/或形状上是均一的，例如珠。当磁铁或磁场与容器紧密邻近或接触时，在反应容器中的粒子向着磁场源迁移。包括铁磁粒子、顺磁粒子和超顺磁粒子。响应于磁场的市售可得粒子的非限制性实例是包括以下的粒子：具有超磁核MP-50(6.5μm)、MP-85(＞8μm)的多孔硅(W.R.Grace，Columbia，MD)、固定链霉抗生物素蛋白的氧化铁(Sigma，St.Louis，MO)和氧化铁(III)粉末(5μm)(Sigma，St.Louis，MO)、DNA IQTM硅粒(Promega，Madison，WI)、硅粒(Novagen，San Diego，CA)、硅修饰的磁珠(5μm或1μm)(Bioclone Inc.，San Diego，CA)、超磁硅粒(1μm或0.75μm，G.Kisker GbR，Steinfurt，Germany)，以及具有不同类型的表面官能团的(Invitrogen，Carlsbad，CA)(例如MyOne羧酸珠、WCX、TALON和MyOne甲苯磺酰基活化的)。本文使用的术语“粒子”或“磁性粒子”与“响应于磁场的粒子”具有相同意义，是该较长术 语的简略缩写。
本文使用的“大小排阻过滤”是指其中含有滤器的容器进行离心的一种离心过程。将样品、裂解缓冲液或洗涤溶液施加至滤器，任选地与被隔离在滤器上的细胞混合，并离心。滤器使得小于滤器孔径的组分(在“滤过液”中)与大于滤器孔径的组分(即细胞)分离。适宜的旋管滤器的一个实例是Corning spinX Costar 8160滤器，孔径220nm，可得自Sigma(配件号CLS8160)。还可以使用具有类似孔径的其它旋管滤器。滤器的孔径不应大于2μm，以便阻止上皮细胞进入滤过液中。
本文使用的术语“短串联重复序列”或“STR”是指2-7个核苷酸长的所有序列，其在人基因组的某一节段内是串联重复的。
DNA分型(或“基因分型”)包括分析具有目标特征的基因组DNA的等位基因，通常称为“标记”。今天使用的大部分分型方法被明确设计用于检测和分析已知以至少两种不同形式出现在群体中的DNA标记的一个或多个区的长度和/或序列差异。这样的长度和/或序列变异被称为“多态性”。其中存在这样的变异的任何DNA区域(即“基因座”)被称为“多态性基因座”。
一直在找寻就长度或序列而言足够多态性的遗传标记用于身份鉴定，例如生父鉴定试验和收集用于法医分析的组织样品的鉴别。在过去的若干年中，发现和发展这样的标记和分析这类标记的方法已经历了几个发展阶段。
近些年，作为遗传标记的多态性短串联重复序列(STR)的发现和发展在DNA分型中起了重要作用。在该方案中，基于长度变异可以区分在每个选定的基因座处的扩增的等位基因。采用STR基因座的扩增方案可设计用于生产小产物，一般长60-500个碱基对(bp)，每个基因座的等位基因经常包含在低于100bp的范围内。这允许通过仔细设计PCR引物在相同的凝胶或毛细管电泳上同时电泳分析几个系统，使得来自单个系统的所有潜在扩增产物不与其它系统的等位基因的范围重叠。然后，这些结果可用于例如鉴别人类小孩的亲子关系，鉴别 在犯罪现场或需要鉴别人类残留物的其它地点发现的血液、唾液、精液和其它组织的来源。
本文使用的术语“选择性精子裂解缓冲液”是指能够优先裂解细胞混合物中的精细胞的缓冲液，所述细胞混合物包含精细胞和至少一种其它类型的非精细胞(其不易于被该缓冲液裂解)。本文使用的“优先裂解精细胞”是指精细胞裂解，而非精细胞不裂解。定量地讲，至少80％、85％、90％、95％或99％的精细胞裂解，而至少80％、85％、90％、95％的非精细胞不裂解。在某些实施方案中，仅可忽略不计数量的非精细胞与精细胞一起裂解。这类缓冲液的非限制性实例是880mM NaCl和85mM DTT的组合，并在下文进一步描述，具体地说是在实施例1中。选择性精子裂解缓冲液公开于美国临时申请号60/899,106，该文献整体通过引用结合到本文中。在某些实施方案中，选择性精细胞裂解缓冲液包含至少一种二硫键还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦HCl(TCEP)、巯基乙醇(ME)、谷胱甘肽(GSH))和至少一种盐试剂(例如氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化锂(LiCl)、氯化镁(MgCl2)、硫酸镁(MgSO4)、硝酸钠(NaNO3)、氯化钙(CaCl2)、硫酸钙(CaSO4))。在某些实施方案中，选择性精子裂解缓冲液包含至少一种二硫键还原剂，浓度为至少0.01M、0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.7M或0.8M。在某些实施方案中，选择性精子裂解缓冲液包含至少一种盐试剂，浓度为至少0.1M、0.25M、0.5M、1M、1.5M、2M或更高。
本文使用的术语“洗涤溶液”是指能够除去细胞上清液中包含的残留DNA和其它杂质的试剂。另外，当白细胞与精子和上皮细胞一起存在于样品中时，“洗涤溶液”用作选择性白细胞裂解缓冲液。洗涤溶液可以为但不限于水、1×PBS、盐溶液，诸如以适宜的缓冲液(例如水、1×PBS、Tris-HCl或其它生理学上可接受的溶液)稀释的MgCl2、NaCl和KCl。在某些实施方案中，洗涤溶液为以1×PBS稀释的MgCl2。
在某些实施方案中，洗涤溶液为DNA酶或者包含DNA酶的反 应缓冲液。在某些实施方案中，DNA酶是洗涤溶液的组分。在其中DNA酶为洗涤溶液组分的实施方案中，可以将DNA酶和阳离子盐如MgCl2一起加入。在又一个实施方案中，用阳离子盐的洗涤可以立即接续DNA酶的洗涤(参见例如以下的实施例3)。在实施例3中进行的两次洗涤对应于在图1中步骤2和4的使用。
在某些实施方案中，法医标本直接用洗涤溶液重构。
DNA酶是盐敏感性的，最佳的DNA酶活性出现在低盐溶液(＜20mM)中。当洗涤溶液含高盐浓度时，可以使用额外量的DNA酶补偿减少的酶效力。采用盐洗涤缓冲液后接DNA酶的一系列洗涤不应当干扰所述酶的活性。
在某些实施方案中，第一种或第二种或这两种洗涤溶液含有DNA酶。在具体的法医实施方案中，在洗涤溶液中存在0.01U至10U的DNA酶。在其中盐溶液中存在DNA酶的实施方案中，可以使用高达50U的DNA酶。
在某些实施方案中，洗涤溶液可以包含聚阴离子，例如肝素聚阴离子。聚阴离子的其它实例包括聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯磺酸盐)、聚(2-丙烯氨基-2-甲基-丙烷-磺酸)(PAMPS)或(DuPontTM)。在某些实施方案中，洗涤溶液可以包含聚阳离子，例如聚赖氨酸，或聚阳离子的组合。再者，在某些实施方案中，洗涤溶液可以包含来自非灵长类动物来源的DNA，例如鲑鱼精DNA，以竞争来自精细胞表面的雌性DNA。洗涤溶液可以与样品悬浮液混合，或者可以除去悬浮液，并新鲜加入洗涤溶液。在某些实施方案中，法医标本在洗涤溶液中温育至多24小时，之后将混合的精子和上皮细胞与上清液(其可以包含白细胞裂解物)分离。
当聚阴离子或聚阳离子包括在洗涤溶液中时，聚阴离子或聚阳离子的摩尔浓度应当极大地超过外源DNA分子摩尔浓度，以便确保结合至细胞表面的DNA被聚阴离子或聚阳离子替代。典型的法医样品包含约10ng外源DNA(Anal.Chem.2005，77卷，742-749页)。假定洗 涤溶液(含样品)的终体积为500μL，且DNA已被片段化为500bp的平均长度(最大STR扩增子为约500bp)，则DNA的摩尔浓度为约60pM。基于估计的DNA浓度，人们可以选择和优化特定洗涤溶液的最佳聚阴离子或聚阳离子浓度。另外，一旦知道样品中外源DNA的量，人们就还可以确定在给定的消化时间和温度(例如室温，37℃)完全消化外源DNA所需要的DNA酶量。例如，1单位的Turbo DNA酶被定义为于37℃以10分钟完全降解1μg DNA所需要的Turbo DNA酶的量。因此，1单位的Turbo DNA酶应当能够完全降解典型的性攻击样品中存在的所有外源DNA。然而，过量的Turbo DNA酶(例如5单位或更多)可用于实现更短的DNA消化时间和/或室温操作。当另一类DNA酶用于消化性攻击样品中的外源DNA目的时，最佳的消化条件(DNA酶的量、消化时间和温度)可易于经试验优化。
“核酸捕获粒子”可以为响应于磁场的任何粒子，其还可以在特定条件(例如对核酸捕获适宜的缓冲液)下结合样品或上清液中存在的核酸。“核酸捕获粒子”可以优先结合DNA或RNA，或者可以结合所有核酸。例如，核酸结合离液缓冲液中的二氧化硅磁性粒子(美国专利号5,234,809，其整体通过引用结合到本文中)。可与核酸捕获粒子一起用于核酸捕获的缓冲液可以为由异硫氰酸胍(GuSCN)和氯化胍制备的溶液。核酸还可以在含高盐和醇的溶液中被磁性粒子捕获(参见例如美国专利号5,523,231和5,705,628，这二者均整体通过引用结合到本文中)。在某些实施方案中，乙酸钠盐(2.5M，pH 5.2)与70％乙醇联用。其它核酸捕获粒子使用含0.5M至约5.0M盐连同7％-13％聚乙二醇的缓冲液，可以作为具有捕获粒子的反应缓冲液使用。诸如氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁和氯化铯的盐全部都可以使用。
本文使用的术语“洗脱缓冲液”或“洗脱溶液”是指能够破坏或打破核酸与核酸捕获粒子的相互作用的试剂。例如，缓冲液可以为任何低盐溶液(例如三(10mM)-EDTA(0.1mM)(TE)缓冲液)或无DNA酶 的水。通常使用洗脱缓冲液，其是本领域已知的。还可以使用其它低盐缓冲液(中性至略碱性pH)。
具体的实施方案
作为综述和介绍，本发明的方法以图1给出。含有混合的细胞混悬液如法医标本的样品在步骤1提供。然后可以在步骤2用洗涤溶液洗涤样品。如果样品中存在白细胞，则在第一次洗涤步骤(步骤2或4)当中裂解它们，同时保持精子和上皮细胞完整。然后在步骤3通过用户选择的方法分离样品中的细胞，例如通过大小排阻过滤(3.1)、磁性粒子(3.2)、离心(3.3)或本领域已知的任何其它方法。然后在步骤4用洗涤溶液洗涤分离的混合细胞。如果实施步骤2的洗涤，则不需要步骤4的洗涤。同样，如果在步骤4使用洗涤，则不需要步骤2的洗涤。然而，如果需要，二者都可以进行(参见实施例3)。在步骤5，选择性裂解精细胞，例如用在美国临时申请序号60/899,106中公开的精子裂解缓冲液，该文献的完整内容通过引用结合到本文中。选择性精子裂解后接步骤6精细胞裂解物的回收，所述裂解物包含精子DNA。然后任选地在步骤7由精细胞裂解物进一步分离精子DNA。这些步骤依次论述。
样品如果例如作为拭子上的法医标本提供，则在步骤2之前重构，以形成细胞混悬液，例如用含1×PBS的缓冲液。在具体的法医实施方案中，法医标本在用于DNA分离的相同容器中重构。在另一个法医实施方案中，法医标本在不同的容器中重构，并将细胞混悬液转移至DNA分离容器。该容器可以包含磁性粒子或大小排阻滤器，或者都不包含。
拭子本身可以取出放置一边，或者其(或者在取出拭子后留下的拭子碎片)可以使用纤维素消化酶消化。纤维素消化酶的实例包括纤维素酶、β-葡聚糖酶和分离自真菌源的那些，例如黑曲霉(Aspergillusniger)、瑞士木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)。 尽管该类型的酶可以影响细胞表面蛋白上的表位稳定性，但细胞膜、细胞的DNA含量一般不受损害。尽管如此，这样的酶也被认为是杂质，应被除去。本发明方法的第一个洗涤步骤可有助于实现此目的。
在多个实施方案中，法医样品以约1mL重构缓冲液(例如1×PBS)重构，并一般在容器(其可以为或者不为用于细胞分离和差异提取的容器)中温和混合。然后由容器中除去基体(例如拭子)，并离心标本中的细胞。然后将重构缓冲液抽离细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬浮在50μL重构缓冲液中。在另一个实施方案中，约50μL的细胞悬浮液留在细胞沉淀上，其余悬浮液被去除，细胞沉淀重构在原初悬浮液中(即50μL)。
在某些实施方案中，包括多个法医实施方案，一部分细胞混悬液可用于计数最初存在于样品中的细胞数。存在的细胞数可以给予所述方法的用户确定具体的反应组分所用的量和/或浓度的基础。
一旦细胞样品为溶液，则其可以通过混合细胞混悬液和洗涤溶液洗涤(步骤2)。在优选的实施方案中，洗涤缓冲液对细胞混悬液的比率为10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1或3∶1。任选地，在形成细胞混悬液(通过首先提供在溶液中的混合细胞，或者通过重构样品)后，其可被离心和重悬浮在重悬浮缓冲液(例如1×PBS)中，以形成更浓的混悬液。在优选的实施方案中，在本发明方法的整个过程中使用的细胞混悬液的体积在50μL-2mL范围内。
在步骤2，可以如下洗涤样品：将洗涤溶液与细胞混悬液合并，之后混合两种组分。混合可以通过移液管吸打、涡旋或振摇容器完成，例如用轨道振荡器或通过手动旋转。两种组分还可以通过被动扩散混合。细胞混悬液洗涤可以在与精细胞裂解和DNA分离不同的独立容器中或在同一容器中进行。洗涤溶液已在上文描述。如果需要，在洗涤溶液中的样品可以温育至多24小时。
在某些实施方案中，将在拭子、涂抹器或其部分上的法医标本直接重构在洗涤溶液中。在某些法医实施方案中，拭子本身在洗涤溶液 中温育后被移除。在某些法医实施方案中，拭子在洗涤溶液中温育后不移除。在具体的法医实施方案中，法医标本在用于DNA分离的相同容器中重构。在另一个法医实施方案中，法医标本在不同的容器中重构，并将细胞混悬液转移至DNA分离容器。该DNA分离容器可以包含磁性粒子或大小排阻滤器，或者都不包含。
在某些实施方案中，包括多个法医实施方案，可以使用一部分细胞混悬液计数最初存在于样品中的细胞数。存在的细胞数可以给予所述方法的用户确定具体的反应组分所用的量和/或浓度的基础。
可以在步骤3使用多个细胞分离程序，这取决于所述方法的用户的喜好。例如，在细胞混悬液中的细胞可以通过响应于磁场的粒子分离(3.2)，如在美国临时申请序号60/890,460中所完整描述的，该临时申请的拷贝作为附件A附上，并整体通过引用结合到本文中。简而言之，在将含有细胞混悬液的容器处于磁场中时，粒子将细胞推向磁场源，细胞悬浮液连同杂质一起被除去，而粒子和细胞仍留在容器中。细胞悬浮液的去除可以自动化方式完成，或者可以通过吸移或抽吸手动完成，二者均是避免对细胞损伤的温和技术。
尽管离子性相互作用和/或疏水作用有助于细胞/粒子缔合，但细胞和粒子缔合还可以在磁力下粒子物理捕获细胞或临时附着细胞来确立(条件是粒子小于细胞)，或者在磁力下细胞物理捕获或临时附着粒子或粒子聚集体来确立(条件是细胞小于粒子或粒子聚集体)。其它粒子实施方案可以使用基于其它非共价相互作用隔离细胞的粒子。可以使用的某些非共价相互作用为氢键键合、阳离子-π相互作用、π-π相互作用、偶极-偶极相互作用、偶极-诱导-偶极相互作用、电荷-偶极相互作用和范得华相互作用。
隔离精子和上皮细胞的粒子通常具有在0.5-100μm范围内的直径；优选1-10μm，不排除在更宽的范围之外的尺寸。大小范围的确切限制可以针对给定的粒子和细胞的情况通过常规实验确定。
在多个实施方案中，在步骤3.3最初通过离心将细胞与含杂质的 细胞悬浮液隔离(形成细胞沉淀)。然后以自动化方式或手动方式(例如通过吸移)除去细胞悬浮液(即上清液)，从而由样品(包含来自受损的上皮细胞的残留DNA)分离细胞。适用于本发明的设备包括但不限于(Beckman Coulter，Fullerton，CA)或Tecan液体自动化操作系统(例如FreedomServices Tecan Systems，San Jose，CA)。
在其它实施方案中，使用大小排阻过滤由样品分离精子和上皮细胞(步骤3.1)。在多个大小排阻过滤实施方案中，细胞混悬液最初可以用洗涤溶液洗涤，洗涤可以在滤器上或者在另一个容器中直接完成。洗涤溶液/细胞悬浮混合物一旦加至大小排阻滤器，就进行离心。然后除去含有结合细胞的杂质的滤过液。最初存在于样品中的细胞被隔离在滤器上。在多个具体的实施方案中，所用的旋管滤器为CorningspinX Costar 8160滤器，孔径220nm，得自Sigma(件号CLS8160)。还可以使用具有相似孔径的其它旋管滤器。滤器的孔径不应大于2μm，以阻止上皮细胞进入滤过液中。
在某些实施方案中，使用大小排阻过滤由样品和在洗涤溶液中的拭子分离精子和上皮细胞(步骤3.1)。洗涤溶液/细胞混悬液混合物和拭子一旦加至大小排阻滤器，就进行离心。然后除去包含杂质如外源DNA的滤过液。最初存在于样品中的细胞被隔离在滤器上。含捕获细胞的拭子也保留在滤器上。在多个具体的实施方案中，所用的旋管滤器为Corning spinX Costar 8160滤器，孔径220nm，得自Sigma(件号CLS 8160)。还可以使用具有相似孔径的其它旋管滤器。滤器的孔径不应大于2μm，以阻止上皮细胞进入滤过液中。
尽管本文描述了用于分离细胞的离心、大小排阻过滤(使用离心)和粒子捕获，但本发明不限于这些技术。例如，细胞可以通过在美国公开申请号2005/0032097(“′097出版物”)中描述的方法分离，该专利整体通过引用结合到本文中。′097出版物描述了由含有精子和非精细胞的样品分离精子DNA的方法。简而言之，开始用SDS和蛋白酶 K进行非精细胞的选择性裂解，然后使用2μm孔径滤器真空过滤由非精细胞裂解物分离精细胞。然后除去滤过液，并使用还原剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原性谷胱甘肽或其组合消化滤器上的精细胞。然后由溶解的精子分离精子DNA。
在其它方法中，抗体包被的粒子可用于结合与一种细胞类型不同的细胞表面蛋白。另外，流式细胞仪和真空过滤可用于选择性分离细胞。
一旦由其余的细胞悬浮液中分离出细胞，则可以进行再一次细胞洗涤。在多个实施方案中，洗涤溶液为盐溶液，例如以1×PBS稀释的MgCl2。在这些实施方案中，MgCl2的终浓度可以在约20mM-300mM的范围内。该MgCl2浓度范围还可以用于初始洗涤步骤2。在多个实施方案中，得自Applied Biosystems和的TURBOTM DNA酶(Foster City，CA，件号AM2238)或由提供的DNA酶I(目录号AM222)如在洗涤溶液中一样用于消化外源DNA。或者，可以使用其它市售的DNA酶。
在某些洗涤溶液的实施方案中，DNA酶与MgCl2在同上溶液中联用。在其它实施方案中，阳离子盐(例如MgCl2)洗涤(图1中的步骤2或4)立即后接DNA酶洗涤(例如实施图1中的步骤2和4，或者如果省略步骤2，则重复步骤3和4两次)。在又一个实施方案中，DNA酶洗涤(例如图1中的步骤2或4)后接阳离子盐洗涤。
在某些实施方案中，洗涤溶液包含以生理学上可接受的缓冲液稀释的肝素或其它聚阴离子，例如聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯磺酸盐)、聚(2-丙烯氨基-2-甲基-1-丙烷-磺酸)(PAMPS)或(DuPontTM)。在某些实施方案中，洗涤溶液包含聚阳离子，例如聚赖氨酸。再者，在某些实施方案中，洗涤溶液可以包含来自非灵长类动物来源的DNA，以竞争来自精细胞表面的雌性上皮细胞DNA。在多个实施方案中，以一个或多个连续步骤用相同或不同的洗涤溶液进行洗涤。
在某些使用离心的实施方案中，在洗涤步骤之前沉淀细胞，并通过将细胞沉淀重悬浮在洗涤溶液中洗涤细胞沉淀(参见图1，步骤4)，以选择性裂解白细胞(如果存在的话)和破坏任何细胞-杂质，或者可能存在的特定的细胞-核酸相互作用。在某些实施方案中，洗涤溶液包含MgCl2、KCl或NaCl。盐浓度高得足以实现所需的破碎白细胞的功能，并使DNA脱离精子和上皮细胞的表面。一旦完成洗涤，就再离心细胞，以形成洗涤过的细胞沉淀，并除去包含用过的洗涤溶液的上清液。除去上清液可以手动方式或自动化方式进行。如果需要，可以重复细胞洗涤、再离心和洗涤缓冲液去除。如果重复这些步骤，则洗涤缓冲液可以相同或不同。在本发明的方法中，离心通常以18k RCF进行1分钟，其它条件在本发明的范围内。
在某些使用大小排阻过滤的实施方案中，将洗涤溶液加至捕获细胞的滤器。将洗涤溶液在滤器上上下吸打，以使捕获细胞移动，并确保细胞的所有侧面都被洗涤。一旦细胞与洗涤溶液混合，就在大小排阻滤器上使用离心步骤再捕获细胞(现在洗涤的)。废弃含有用过的洗涤溶液的滤过液。这些步骤包括图1中的步骤4。
在某些使用磁性粒子的实施方案中，通过将洗涤溶液与分离的细胞及磁性粒子混合进行洗涤。为完成混合，应当将磁场由其中发生反应的容器附近移开。一旦完成混合，就将磁场再施加至容器，以将细胞和粒子与用过的洗涤溶液隔离。然后除去用过的洗涤溶液。
在某些实施方案中，不管用于细胞分离的方法，使用采用多个组分的洗涤(步骤2或4，图1)。例如，第一种组分可以为MgCl2洗涤或聚阴离子洗涤或聚阳离子洗涤或其组合，第二种组分可以为采用DNA酶的DNA降解步骤。这些组分可以混合后加入样品。
可以使用部分或整体上不裂解精细胞的任何DNA酶。可以加入存在于DNA酶反应缓冲液(例如来自Applied Biosystems和的TurboTM DNA酶)中的DNA酶，并将其与如上所述用于其它洗涤实施方案的隔离细胞混合。将在其缓冲液中的DNA酶加至隔离的细胞， 并混合。在粒子实施方案中，在混合后将磁场撤离容器。然后再施加磁场，或者使用离心步骤，这取决于具体的实施方案，以隔离细胞和现在污染的(即用过的)洗涤溶液。然后通过吸打或抽吸，以自动化方式或手动方式除去任何残留的DNA酶连同DNA酶反应缓冲液(存在降解的DNA)。然后，如果需要，将一种或多种额外的洗涤溶液以连续方式加至隔离的细胞。
在其它实施方案中，在DNA酶处理样品之前和之后实施洗涤步骤。在这些实施方案中，第一个洗涤步骤可以在初始细胞隔离之前和/或之后完成(即在步骤2或4)。在这些实施方案中，进行最少3次连续洗涤。
一旦细胞被洗涤并由用过的洗涤溶液(即细胞悬浮液)中分离(无论什么方法)后，将精细胞裂解(图1，步骤5)。
可在某些实施方案中使用的选择性精子裂解缓冲液公开于共同未决的共同拥有的美国临时申请序号60/899,106，该临时申请整体通过引用结合到本文中。
在某些实施方案中，选择性精细胞裂解缓冲液包含至少一种二硫键还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦HCl(TCEP)、巯基乙醇(ME)、谷胱甘肽(GSH))和至少一种盐试剂(例如氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化锂(LiCl)、氯化镁(MgCl2)、硫酸镁(MgSO4)、硝酸钠(NaNO3)、氯化钙(CaCl2)、硫酸钙(CaSO4))。可以使用其它精子选择性裂解缓冲液，例如10％β-巯基乙醇和2M DTT。
选择性精子裂解缓冲液中的盐试剂的浓度可以为至少0.1M、0.5M、1M、2M或更高。二硫键还原剂的浓度可以为至少0.01M、0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.7M或0.8M。
在具体的实施方案中，用于本发明的选择性精子裂解缓冲液包括但不限于：(1)以1×PBS制备的880mM NaCl和85mM DTT，(2)以1×PBS制备的700mM KCl和85mM DTT，以及260mM MgCl2和(3)以1×PBS制备的85mM DTT。
基于教导用于选择性精子裂解缓冲液的组分，本领域技术人员可以优化裂解精细胞的盐和二硫键还原剂的终浓度，同时使非精细胞基本完整。选择性精子裂解缓冲液的一个非限制性实例是含有200mMDTT和1M KCl的缓冲液。如上所述的二硫键还原剂和盐的其它组合可以于这些相应的浓度使用。在某些实施方案中，一种以上的盐可以与一种二硫键还原剂一起使用。在多个实施方案中，一种以上的二硫键还原剂可以与一种盐一起使用。
在本发明的多个实施方案中，可以通过在容器中上下吸打完成选择性精子裂解缓冲液与隔离细胞的混合。在某些实施方案中，将选择性裂解缓冲液和细胞群合并后，低速涡旋，以便细胞和裂解缓冲液充分相互作用。在某些实施方案中，通过扩散(diffusion)裂解细胞。所用的裂解缓冲液条件和混合类型影响裂解步骤的时程。这些条件可以仅使用普通技术优化，优化取决于本发明方法的具体应用(例如法医或不是法医样品，涉及的细胞类型等)。在某些实施方案中，该步骤和本发明的其它步骤以自动化方式进行。
在多个粒子实施方案中，加入选择性精子裂解缓冲液，之后断开磁场。在某些实施方案中，在断开磁场之后加入选择性裂解缓冲液。
在某些实施方案中，将选择性精子裂解缓冲液的组分与分离的细胞序贯加入，并逐个与细胞混合。或者，加入两种组分才混合(即盐和二硫键还原剂)。在某些实施方案中，首先加入二硫键还原剂。在某些实施方案中，裂解通过被动扩散发生，因此，不用使用者进行混合。在多个实施方案中，混合通过综合应用被动混合和主动混合(例如通过涡旋或吸移)进行。
在多个实施方案中，于任意温度与选择性精子裂解缓冲液进行一定时间的温育，所述时间足以实现适宜的结果。在某些实施方案中，于室温进行温育。或者，于约20-50℃进行温育。温育间隔在约1分钟至4小时或更长的范围内，更具体的典型间隔为5分钟或10分钟。
在粒子实施方案中，可以通过对反应容器再施加磁场，由此隔离 未裂解的细胞(和粒子)，在步骤6由反应容器回收精细胞裂解物。在选择性裂解之后，上清液将包括精细胞裂解物，随后可以由容器中去除。这可以以自动化方式完成，或者通过吸打手动完成。在该阶段可进行任选的洗涤，以进一步减少第一次裂解物的任何核酸，如果需要进行上皮细胞分析，则所述核酸会污染上皮细胞的完整细胞。
在离心实施方案中，在步骤6将选择性精子裂解缓冲液加至洗涤后的细胞沉淀，并混合。同样，在大小排阻过滤实施方案中，将选择性精子裂解缓冲液加至滤器，并上下吸打(或手动或以自动化方式)，以由滤器移出细胞，并确保所有细胞与裂解缓冲液相互作用。一旦裂解完成，就进行离心步骤，并回收含精子裂解物(其包含精子核酸)的上清液(在使用离心的实施方案中)，或回收含精子裂解物(其包含精子核酸)的滤过液(在使用大小排阻的实施方案中)。可以进行单独使用的或作为大小排阻技术的一部分使用的离心，例如以9K RCF离心1分钟(即在Beckman Coulter Microfuge 18离心机中10,000RPM)。对于本发明用途，适于本文定义的容器的任何离心机都可以用于多个方法步骤。
在某些实施方案中，在步骤7由精子裂解物纯化DNA、mRNA或总RNA，准备用于下游应用，例如扩增、测序或STR分析，所有这些都是已知的分析方法。纯化可用于任何容器，或者预分配的试剂槽。纯化方法是本领域众所周知的，参见例如美国专利号5,234,809和5,705,628，所述专利整体通过引用结合到本文中。用硫氰酸胍-苯酚-氯仿、乙醇和固相结合方法提取完全在本发明范围内。可作为用于DNA分离的基体使用的某些固相为磁性粒子、苯乙烯粒子和/或二氧化硅粒子。另外，硝基纤维素可用于分离DNA。纯化可以使裂解物与核酸捕获粒子和对核酸适宜的缓冲液混合，或者在多个实施方案中，与DNA捕获物混合。
在多个粒子实施方案中，用于细胞捕获的粒子还可以在适宜的条件下用于DNA纯化(步骤7)。例如，当磁性二氧化硅粒子用于捕获细 胞时，捕获的细胞可被裂解，释放的DNA可被捕获，并通过相同的捕获粒子基于标准二氧化硅/离液化学纯化(例如美国专利号5,234,809，该专利整体通过引用结合到本文中)。在另一个实施例中，如果使用MyOne羧酸珠或氧化铁磁性粒子进行细胞捕获，则可以使用DNA沉淀化学在细胞裂解后纯化DNA(参见例如美国专利号5,523,231、美国专利号5,705,628，这两个专利整体通过引用结合到本文中)。
在其中用磁性粒子纯化精子核酸的实施方案中，洗脱缓冲液用于浓缩溶液中的核酸，其不适用于固态。洗脱缓冲液的非限制性实例包括去离子水、TE缓冲液和任何其它的低盐缓冲液。另外，在该步骤当中可以将热量加至洗脱反应。
在某些实施方案中，精子裂解物无需进一步纯化就可用于下游反应(例如核酸扩增或测序)。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括在除去精细胞裂解物之后分离和回收上皮细胞的核酸。在某些实施方案中，原始样品包含精子和上皮细胞，上皮细胞的裂解不必是选择性的。例如可以采用基于离液的、高盐的或变性剂的裂解缓冲液，使用本领域众所周知的方法进行非选择性裂解。在多个实施方案中，可以通过对细胞进行加热进行裂解，以便破开细胞。除精细胞以外的上皮细胞的分离和分析也允许鉴别并关联攻击者和受害者。
在本发明的多个实施方案中，为了裂解第二个特定的细胞类型，通过在容器中上下吸打，将选择性裂解缓冲液或一般性裂解缓冲液(取决于原始样品的内容物和核酸回收的具体目的)与隔离细胞混合。在回收精细胞裂解物时，在步骤6隔离并分离上皮细胞。
在某些实施方案中，涡旋第二种裂解缓冲液和细胞群，以便细胞和裂解缓冲液充分相互作用。在某些实施方案中，在不涡旋或主动混合的情况下通过扩散被动裂解细胞。所用的裂解缓冲液条件和混合类型指示裂解步骤进行多长时间。这些条件可被优化，并取决于具体的 应用。
在其它实施方案中，上皮细胞存在于容器中的大小排阻滤器上，将裂解缓冲液加入至滤器顶部。然后可上下吸打裂解缓冲液，以将细胞移离滤器，并破碎细胞，或者使裂解缓冲液在滤器上温育几分钟。然后离心容器，上皮细胞裂解物存在于滤过液中。
在某些实施方案中，用磁性粒子和适宜的缓冲液(适于核酸与粒子的结合)，在另一个容器中或者特别地在预分配试剂槽的区室内纯化上皮细胞裂解物。该步骤以和描述第一种细胞类型的核酸分离的实施方案相似的方式完成。
在使用粒子的实施方案中，可以使用最初用于隔离细胞群的相同粒子由上皮细胞或精子裂解物进一步分离核酸(DNA或RNA，优选DNA)。根据用于在容器中隔离(例如通过加入热量、盐、增加或降低pH等)的磁性粒子类型，通过改变缓冲条件，由初始容器中的粒子纯化DNA。例如，如果隔离粒子是磁性二氧化硅粒子，则可以通过向容器加入5M GuSCN(硫氰酸胍)溶液，由初始容器中的粒子捕获DNA。然后用乙醇洗涤粒子上的DNA。然后可以如上所述进行核酸的洗脱。或者，可以通过其它市售可得的方案，例如由Promega(Madison，WI)以商标名DNA IQTM提供的那些，由细胞裂解物进行DNA分离。
在某些实施方案中，第二种细胞裂解物也以自动化方式或手动如上所述由容器中除去。然后可以将裂解物导入本领域众所周知的下游测定中，例如核酸纯化、扩增、测序或STR分型。
在多个实施方案中，对含有一种以上的细胞类型的样品中进行选择性精子裂解及其核酸回收的组分以试剂盒提供。在粒子实施方案中，特定的试剂盒包括至少一个反应容器、一定量的响应于磁场的粒子(预计其足以隔离含有特定量的细胞的样品中的细胞)、一定量的洗涤溶液(其足以洗涤至少一种细胞类型的细胞)、一定量的选择性裂解缓冲液(其足以裂解第一种类型的细胞)、一定量的一般性或选择性裂解缓冲液(其足以裂解第二种细胞类型的细胞)和使用说明书。在某些 实施方案中，洗涤溶液为以1×PBS稀释的MgCl2，MgCl2终浓度为260mM。在其它实施方案中，洗涤溶液包含以连续方式使用的组分，例如在反应缓冲液中提供的DNA酶，和/或1×PBS、1×MgCl2或聚阴离子或聚阳离子。本发明的方法可以用提供磁场源的现有仪器实施。细胞的隔离可目测识别。
在某些非粒子实施方案中，具体的试剂盒包括至少一个反应容器、任选适合反应容器的大小排阻滤器、足以洗涤至少一种细胞类型的细胞的一定量的洗涤溶液、足以裂解精细胞的一定量的选择性裂解缓冲液、足以裂解上皮细胞的一定量的一般性或选择性裂解缓冲液和使用说明书。在某些实施方案中，洗涤溶液为以1×PBS稀释的MgCl2。在其它实施方案中，洗涤溶液包含以连续方式使用的组分，并可以选自在反应缓冲液中提供的DNA酶、1×PBS、1×MgCl2、聚阴离子和聚阳离子。然而，本发明不限于这些洗涤组分。
参考以下的实施例进一步阐述本发明。然而，应当指出，和上述的实施方案一样，所述实施例是阐述性的，不能被视为以任何方式限制本发明的授予范围。
实施例1-比较差异提取步骤：先有技术的洗涤溶液(1×PBS)对MgCl2洗涤溶液
将500μL MgCl2洗涤溶液(260mM终浓度，在1×PBS中)或1×PBS加至含有50μL异质细胞混悬液的细胞悬浮样品，所述混悬液含有约10,000个上皮细胞、1，000个精细胞和包括残留DNA的杂质。然后将样品和洗涤溶液转移至旋转滤管(Corning spinX Costar 8160，孔径220nm)。所述管在Beckman Coulter Microfuge 18离心机中以14,000RPM离心，此后废弃滤过液。
将含有875mM NaCl2和85mM dTT、以1×PBS稀释的200μL选择性精子裂解缓冲液加至旋转滤管。然后通过混合约5分钟裂解精细胞。所述管在Beckman Coulter Microfuge 18离心机中以14,000RPM 离心，以将精子裂解物和完整上皮细胞分开。
接着，使用Applied Biosystems的专有DNA纯化方法进行精子DNA纯化。还使用市售可得的试剂盒如来自Promega的DNA IQTM纯化DNA。在DNA纯化后，使用Y男人DNA定量试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)定量精子DNA，并使用人DNA定量试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)定量上皮细胞DNA。
对每个扩增反应使用约1ng精子或上皮细胞DNA。使用PCR扩增试剂盒(Applied Biosystems，FosterCity，CA)在PCT System 9700(Applied Biosystems，FosterCity，CA)上按照生产商的方案进行STR扩增。
使用ABI PRISM 3100遗传分析仪进行STR分型，并使用GenMapID3.2分析数据。
精细胞分析的结果连同精子DNA和上皮细胞DNA的对照样品的STR分型在图2A-2D中给出。相应的基因座名称在相应的峰下列出。针对特定的上皮细胞和精细胞峰，峰分别被标记为E或S。由这些图可见，MgCl2洗涤用于消除上皮细胞DNA的污染，和1×PBS洗涤相比尤其如此。针对1×PBS洗涤的上皮细胞组分的STR峰比针对MgCl2洗涤的高。
实施例2-MgCl2洗涤溶液减少上皮细胞样品的外源上皮细胞DNA
业已发现，在0-260mM浓度范围内的MgCl2有效除去表面结合的DNA，相比于使用经典洗涤溶液1×PBS时更是如此(图3)。上皮细胞样品首先用MgCl2洗涤，以1×PBS稀释，然后混合。除去洗涤缓冲液，将细胞与选择性精子裂解缓冲液温育。裂解实施5分钟，此后过滤样品，并纯化和定量滤过液中的DNA。因为裂解缓冲液是选择性的，所以在滤过液中剩下的是最初在样品中存在的残留的上皮细胞DNA。由图3可见，与1×PBS对照相比，用低至30mM的MgCl2 浓度减少残留DNA的量。由图3显而易见，最佳的MgCl2浓度在160mM至260mM之间。
实施例3-比较差异提取步骤：无DNA酶洗涤对DNA酶洗涤
将500μL MgCl2洗涤溶液(260mM终浓度，在1×PBS中)加至含有50μL性交后样品的细胞悬浮样品。在混合并于室温温育5分钟后，将样品和洗涤溶液转移至旋转滤管(Corning spinX Costar 8160，孔径220nm)，将所述管在Beckman Coulter Microfuge18离心机中以14,000RPM离心，此后废弃滤过液。
将含有10单位Turbo DNA酶(AM2238，Applied Biosystems，Foster City，CA)的100μL DNA酶洗涤溶液加入旋转滤管中的两个样品之一。于37℃进行5分钟的DNA酶洗涤。所述管在Beckman CoulterMicrofuge 18离心机中以14,000RPM离心，此后废弃滤过液。两种洗涤溶液(MgCl2和DNA酶)的应用对应于图1的步骤2。
接着，将包含875mM NaCl2和85mM dTT、以1×PBS稀释的200μL选择性精子裂解缓冲液加入旋转滤管。然后通过混合约5分钟裂解精细胞。将所述管在Beckman Coulter Microfuge 18离心机中以14,000RPM离心，以将精子裂解物和完整上皮细胞分开。
接着，使用Applied Biosystems的专有DNA纯化方法进行精子DNA纯化。还使用市售可得的试剂盒如来自Promega的DNA IQTM纯化DNA。在DNA纯化后，使用Y男性人DNA定量试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)定量精子DNA，并使用人DNA定量试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)定量上皮细胞DNA。
对每个扩增反应使用约1ng精子或上皮细胞DNA。使用PCR扩增试剂盒(Applied Biosystems，FosterCity，CA)在PCT System 9700(Applied Biosystems，FosterCity，CA)上按照生产商的方案进行STR扩增。
使用ABI PRISM 3100遗传分析仪进行STR分型，并使用GenMapID3.2分析数据。
精细胞分析的结果在图4A-4D中给出。相应的基因座名称在相应的峰下列出。针对特定的上皮细胞和精细胞峰，峰分别被标记为E或S。由这些图可见，在MgCl2洗涤后的DNA酶洗涤用于消除上皮细胞DNA的污染，和无DNA酶洗涤时的MgCl2洗涤相比尤其如此。针对无DNA酶洗涤的上皮细胞组分的STR峰比针对DNA酶洗涤的高。